Разработка основ технологии получения никотинамидадениндинуклеотида из биомассы хлебопекарских дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат технических наук Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна

• Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна
• кандидат технических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат технических наук Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна

ВВЕДЕНИЕ.

Список принятых в работе сокращений.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Структура и основные физико-химические свойства никотинамидных коферментов.

1.2. Распространение никотинамидных коферментов в животных тканях.

1.3. Области применения никотинамидных коферментов.

1.4. Способы получения никотинамидных коферментов.

1.5. Выделение и очистка никотинамидных коферментов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Реагенты.

2.3. Методы анализа.

2.3.1. Методика определения концентрации НАД+ в растворах и конечном продукте.

2.3.2. Методика определения восстановленных форм никотинамидных коферментов НАДН и НАДРН.

2.3.3. Определение концентрации нуклеиновых компонентов в растворах и содержания нуклеиновых компонентов в готовом продукте.

2.3.4. Количественное определение азотсодержащих веществ в белковых гидролизатах и растворах.

2.3.5. Методика определения неорганического фосфора по Фиске - Суб-бру.

2.3.6. Методика определения хлоридов в растворе.

2.3.7. Определение концентрации соляной кислоты в растворе.

2.3.8. Определение содержание аминокислот методом хроматографии на бумаге.

2.4. Методы исследования.

2.4.1 Методика проведения экстракции нуклеиновых кислот и никотина-мидадениндинуклеотидых коферментов из биомассы пекарских дрожжей.

2.4.2. Методика проведения ультрафильтрации.

2.4.3. Методика выделения никотинамидных коферментов ионным обменом.

2.4.4. Методика выпаривания.

2.4.5. Методика осаждения.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Экстракция никотинамидных коферментов из клеток хлебопекарских дрожжей водными растворами. Количественные закономерности процесса.

3.2. Очистка НАД+ содержащих экстрактов ультрафильтрацией. Количественные закономерности процесса.

3.3. Выделение и очистка НАД+ методом ионного обмена.

3.4. Кристаллизация НАД+ из водно-спиртовых растворов.

3.5. Разработка стадии утилизации отходов, образующихся в производстве НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка основ технологии получения никотинамидадениндинуклеотида из биомассы хлебопекарских дрожжей»

Актуальность темы. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД+) является одним из важнейших коферментов, ответственных за окислительно-восстановительные процессы в клетках. НАД+ используется в медицине, как иммуномодулятор. Он обеспечивает нейротрансмиттерную функцию - передачу нервных импульсов между мозгом и остальными органами тела. Нарушение синтеза некоторых гормонов, например, интерферона, также может быть вызвано недостатком НАД+. Никотинамидные коферменты являются антиокси-дантами, защищают организм от свободных радикалов, токсинов, канцерогенов, загрязнений окружающей среды и изменений в процессе старения. Кроме того, НАДН защищает печень от алкоголя, предотвращая образование алко-гольиндуцированного ингибитора - тестостерона. Он также нормализует уровень холестерина и кровяного давления. НАД+ входит в состав лекарственных препаратов, используемых для лечения болезней связанных с нарушением деятельности центральной нервной системы, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера. Также препараты содержащие НАД+ используют в медицине при лечении заболеваний сердца, желудка и печени. Например, препарат «Энерго-стим», содержащий НАД+, цитохром С и инозин, применяли в терапии животных страдающих токсико-аллергическим миокардом.

В настоящее время НАД+ за рубежом получают микробиологическим и химическим синтезом. Химический синтез является многостадийным процессом с применением дорогостоящих реагентов. В России производство НАД+ в настоящее время отсутствует. Сегодня в мире развиты крупнотоннажные биотехнологические производства, в которых отходом является микробная биомасса, которая может являться потенциальным источником НАД+. В литературе приводится описание методов выделения НАД+ из микробной биомассы, которые не используются в промышленности из-за сложности масштабирования процесса и применения дорогостоящих и труднодоступных реагентов. Для промышленного получения НАД+ наиболее перспективным сырьем являются хлебопекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые выпускаются промышленностыо в больших объемах, а также образуются в значительных количествах в качестве отходов спиртового производства. Так как содержание НАД+ в биомассе дрожжей не превышает 0,3% от воздушно сухих веществ (СВ), организация такого сопутствующего производства не позволит снизить количества образующегося твердого отхода, хотя и повысит рентабельность основного производства.

Поэтому представляется актуальной разработка технологии выделения НАД+ из биомассы хлебопекарских дрожжей с применением дешевых и доступных реагентов (растворы минеральных кислот, солей и щелочей) и технологических операций, которые могут быть реализованы в промышленных условиях с утилизацией образующихся твердых и жидких отходов.

Целью работы явилась разработка малоотходной технологии получения очищенного препарата НАД+ из нативной биомассы хлебопекарских дрожжей.

В задачи данной работы входило: создание научных основ с целью совершенствования технологического процесса получения НАД+ из биомассы хлебопекарских дрожжей включающего экстракцию водными растворами, ультрафильтрацию, одностадийный ионный обмен, осаждение из водно-спиртовых растворов, разработка кинетических схем для создания алгоритма управления технологическим процессом и определить пути утилизации отходов, образующихся в основном производстве, для получения на их основе продуктов нуклеотидной, белковой и углеводной природы технического назначения.

Научная новизна: Впервые показана возможность получения очищенного препарата НАД+ из биомассы хлебопекарских дрожжей с применением стадии ультрафильтрации для очистки от высокомолекулярных примесей, одностадийного ионного обмена на катионите, кристаллизации из водно-спиртового раствора.

Показана принципиальная возможность получения НАД+ из биомассы других дрожжей (p. Candida, Torula) по предлагаемой технологии.

Впервые показана возможность применения миндальной кислоты в качестве ингибитора нуклеаз на стадии экстракции НАД+, что позволило упростить процесс очистки конечного продукта от примесей нуклеотидной природы.

Проведено количественное изучение стадий экстракции НАД+, ультрафильтрации, ионного обмена, кристаллизации из водно-спиртовых растворов, как основы для создания алгоритма управления технологическим процессом получения НАД+.

Практическая значимость: Разработаны основы технологии получения очищенного препарата НАД+ (с содержанием основного вещества не менее 95%) из нативной биомассы хлебопекарских дрожжей. Предложены алгоритмы управления стадиями экстракции НАД+ из биомассы дрожжей, ультрафильтрации, ионного обмена и кристаллизации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: 3-ем Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г); Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ имени Д. И. Менделеева, Москва, ноябрь 2004 г, ноябрь 2005 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и двое тезисных сообщения в материалах научных конференций.

Структура и объем работы: диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Описания методик проведения экспериментов и анализов, 5-ти глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, Заключения, Выводов, Списка литературы (115 наименований, в том числе Ш0 на иностранных языках) и 4 приложений. Работа изложена на 165 стр. машинописного текста и содержит 60 таблиц, 64 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна

ВЫВОДЫ

1. Предложены пути совершенствования технологии получения НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей, включающие в себя экстракцию водным раствором, ультрафильтрацию, выделение целевого продукта ионным обменом, его кристаллизацию и перекристаллизацию из водно-спиртового раствора, сушку готового продукта. Выход НАД с содержание основного вещества 98% составляет 0,048% от массы сухих дрожжей или 22% от его содержания в биомассе.

2. Проведено количественное изучение процесса водной экстракции, подчиняющегося законам специфического кислотно-основного катализа. Предложены кинетические схемы для управления процессом экстракции, на основе которых подобраны оптимальные условия процесса экстракции, обеспечивающие выход НАД не менее 90% от его содержание в клетке.

3. Показано, что добавление миндальной кислоты в концентрации 3,9-10'5 моль/л к экстрагенту позволяет в дальнейшем на стадии ультрафильтрации снизить содержание примесных нуклеиновых компонентов в пермеате в 5,5 раз и упростить дальнейшую очистку препарата НАД.

4. Изучены процессы выделения и очистки НАД методами ультрафильтрации, одностадийного ионного обмена на сорбенте С-150 в Н+ форме с использованием в качестве элюэнтов 50%-ного водного раствора этилового спирта для предварительного удаления примесей углеводной природы и 0,005 Н раствора соляной кислоты, кристаллизации из водно-спиртового раствора при объемном соотношении элюэнт:ионит 10:1. Разработаны алгоритмы управления стадиями ультрафильтрации, сорбции, десорбции, кристаллизации НАД из водно-спиртовых растворов, позволяющие выбрать оптимальные условия их проведения.

5. Предложены способы утилизации основных отходов, образующихся, в технологическом процессе выделения НАД с получением продуктов белковой природы кормового назначения, что позволяет реализовать малоотходную технологию.

6. Проведена технико-экономическая оценка разработанной технологии. В результате нее было установлено, что себестоимость препарата НАД по предложенной технологии составила 4756,63 руб/г НАД, что сопоставимо с ценами препаратов зарубежных фирм.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна, 2007 год

1. Burton R. M., Kaplan N. О. - Arch. Biochem. and Biophyz., 1963, 101, p. 150.

2. В. А. Яковлева. Коферменты.- M.: Медицина, 1973. 13 с.

3. Moore С. Е., Underwood A. L. Anal. Biochim., 1969, 29, p. 149.

4. Caterall W., Hollis D, Walter C. Biochemistry, 1969,8, p. 4032.

5. Jardetzky 0, Wade- Jardetzky N. J. Biol. Chem., 1966,241, p. 85.

6. Windmueller N., Kaplan N. J. Biol. Chem., 1961, 236, p. 2716.

7. Weder G. Nature, 1957, 180, p. 1409.

8. Oliver H. Lovvry, Janet V. Passonneau "The stability of pyridine nucleotides". Journal of Biological Chemistry. 1961, Vol. 236, №10.

9. Chaykin S, Meissner L. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1964, 14, p. 233.

10. Jarmolinsky M. В., Colowick S. P. Biochem. Biophys. Acta, 1956, 20, p. 177.

11. Красновский А. А., Брин Г. П., ДАН СССР, 1968, 153, 212 с.

12. Ludowieg J., Levy А. Biochemistry, 1964, 3, p. 373.

13. Ditmar A., Fondy L. J. Am.Chem. Soc., 1964, 88, p. 91.

14. Wallenfels К. В кн.: The steric course of microbiological reactions.L., 1959, p. 10.

15. Kaplan N. О. В кн.: Enzymes. New York, 1960,3, p. 127.

16. Gutman M, Margalit R. Biochemistry, 1968, 7, p. 2778.

17. Amelunxen D, Grisolia S. J. Biol. Chem., 1962,237, p. 3240.

18. Tucker D., Grisolia S. J. Biol. Chem, 1962, 237, p. 1068.

19. Arancyo M, Cilento G. Biochemistry, 1969, 8, p. 2140.

20. Bates D. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1970, 39, p. 502.

21. Woenckhaus C, JeckR. Lieb. Ann, 1970, 736, p. 126.

22. Colowick S, Kaplan N. J. Biol. Chem, 1951,191, p. 447.

23. Meyerhof O, Ohlmeyer P. Biochem. Z, 1938,297, p. 113.

24. Pfleiderer G, Jeckeel D. Biochem. Z, 1956,328, p. 187.

25. Pfleiderer G, Jeckeel D. Biochem. Z, 1957, 329, p. 104.

26. Walter P„ Kaplan N. J. Biol. Chem, 1963, 238, p. 2823.

27. Anderson В., Kaplan N. J. Biol. Chem., 1959, 234, p. 1226.

28. Miles D., Kaplan N. Lieb. Ann., 1959, 621, p. 166.

29. Ozols R., Marinetti G. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1969, 34, p. 712.

30. Villee C.A. In:"The Molecular control of cellar activity". J.M. Allen (ed) N.Y., 1962,стр. 297.

31. Glock G.E., McLean P. Biochem.J.,1955, стр. 388.

32. Jacobson K.B.,Astrachan L. J. Biol. Chem., 1957, 226, p. 69.

33. Euler H.,Shleank F., Heiwinkel H., Hogberg B. Hoppe-Seyler's Z. physiol.Chem., 1938. p.256, 208.

34. Schlenk F., Glein W. Svensk Kern. Tidskr., 1937,49, p. 181.

35. Burch H.,Lowry O.et al. Biol.Chem., 1963,238, p. 2838.

36. Carruthers C., Suntzeff V. Arch.Biohem.,and Biophys., 1953,45, p. 140.

37. Glock G.E., McLean P. Biochem.J.,1955, p. 388.

38. Jedeikin L. A., Weinhouse S. J. Biol. Chem. 1955, 213, p. 271.

39. Sippel T. 0. Exptl Eye Res., 1962, 1, p. 368.

40. Klingenberg M., Slenezka W. Biochem. Z, 1959, 331, p. 486.

41. Briggs M. H. J.N. Z. Inst.Chem, 1962, 26, p. 84.

42. Racker E. Phisiol. Revs. 1955, 35, p. 1.

43. Singer T. P., Kearney E. B. Advances Enzymol. and Related Subjects Biochem., 1954, 15, p. 79.

44. Wenner Ch. E., Dunn D. E. J. Biol. Chem., 1953, 205, p. 409.

45. Ricci C., Marinello E. Boll. Soc. ital. boil, sperim., 1961, 37, p. 680.

46. Holzer H.,Schultz G., Lynen F. Biohem.Z.,1956,328,p. 252.

47. Mclwain H. Nature, 1949,163, p. 641.

48. Колотилова А.И. Биохимия, 1960,25, с. 407.

49. Великий Н.Н. Исследование роли окислительно-восстановительного состояния никотинамидных коферментов во внутриклеточном метаболизме в тканях животных. АН УССР. Институт биохимии им. А.В. Палладина. Автореферат: Киев, 1987

50. Dolphin D., Poulsen R. Pyridine nucleotide coenzymes: chemical, biochemicaland medical aspects, Wiley, New York, 1987;

51. You K-S., Anderson B. The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press, New York, 1982.

52. Lee H. C., Graeff R. Biochemie, 1995, 77, p. 345.

53. Aarhus R., Dickey D. M. J. Biol. Chem. 1996, 271, p. 8513.

54. Anderson В. M. Pyridine Nucleotide Coenzymes. Academic Press, Inc., New York, 1982, p. 91.

55. Woenckhaus C., Jeck R. Pyridine nucleotide coenzymes: chemical, biochemical and medical aspects, Wiley, New York, 1987, p. 449.

56. Rex A, Hentschke MP, Fink H. Bioavailability of reduced nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) in the central nervous system of the anaesthetized rat measured by laser-induced fluorescence spectroscopy. Pharmacol Toxicol. 2002 Apr; 90(4):220-5.

57. Santaella ML, Font I, Disdier O.M. Comparison of oral nicotinamide adenine di-nucleotide (NADH) versus conventional therapy for chronic fatigue syndrome. P R Health Sci J. 2004 Jun;23(2):89-93.

58. Swerdlow RH. Is NADH effective in the treatment of Parkinson's disease? Drugs Aging. 1998 Oct;13(4):263-8.

59. Sukoan GV, Antelava AV, Kavadze IK, Chikobava EA, Iarovaia EV, Karsanov NV. Cardioprotective effect of energostim in toxic allergic myocarditis. Eksp Klin Farmakol. 2004 Mar-Apr;67(2): 19-23.

60. Birkmayer JG, Nadlinger KF, Hallstrom S. On the safety of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). J Environ Pathol Toxicol Oncol. 2004;23(3): 179-94.

61. Demarin V, Podobnik SS, Storga-Tomic D, Kay G. Treatment of Alzheimer's disease with stabilized oral nicotinamide adenine dinucleotide: a randomized, double-blind study. Drugs Exp Clin Res. 2004;30(l):27-33.

62. Северин С. E., Соловьева Г. А. Практикум по биохимии. М.: Изд-во МГУ. 1989г. С.509.

63. Промышленная микробиология. Под ред. Н. С. Егорова. М.: «Высшая школа», 1989.

64. А. М. Безбородое. Биохимические основы микробиологического синтеза. М.: «Легкая и пищевая промышленность», 1984.

65. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию. Москва «Пищевая промышленность», 1978г, стр.203.

66. SU , патент, № 1693057, кл С 12 Р 19/36.

67. SU, патент, № 510510, кл С 12 Р 19/36.

68. Kiyoshi Nakayama, Sagamihara-shi. Method for producing NAD. Japan, assignor to Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan. Patent. Int. CI. CI 2d 13/06, 1972; U.S. CI. 195-28 N,№ 3,705,080.

69. Чехословакия, патент, № 267244 , кл С 12 Р 19/36.

70. RU, патент, № 2097431, кл С 1.

71. Brazda, F.G. and R.A. Coulson: Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 70,325 (1949).

72. Delia Volpe, R. and E. Albertini: Rev. Biol. (Perugia) 54, 537 (1961).

73. Emmrich, R. and H. Petzold: Arch, exptl. Path. Pharmakol. 217, 10 (1953).

74. Binet, L., F. Bouriere and F. Molimard: Compt.rend. 250, 4083 (1960).

75. Coulson, R.A and F.G. Brazda: Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 65,1 (1947).

76. Fujioka, M. and I. Lieberman: J.Biol. Chem. 239, 1164 (1964).

77. Gershbein, L.L: Int. Z. Vitaminforsch. 35,264 (1965).

78. Kornberg. Methods of Enzymology. 1957, Vol. 3, p. 876.

79. Jeck. Federation of European Biochemists Society Letters. 1974, Vol. 42, p. 161.

80. Synthesis of Nicotinamid Adenine Dinucleotide (NAD) from Adenosine Monophosphate (AMP). Journal of the American Chemical Society. Vol. 102. p. 7805, Dec. 17, 1980.

81. Pollak. Enzyme Immobilization by Condensation Copolymerization into Cross-linked Polyacrylamide Gels. Journal of the American Chemical Society. Vol. 102. pgs. 6324-6336 Dec. 17. 1980.

82. Whitesides G., Walt D.R. Synthesis of nicotinamide cofactors. Pat. No. 4411995, USA, CI C12P 19/36-publ. Oct. 25.

83. Yokoyama S., Shinichiro S. Method for producing reduced-form coenzyme. Pat. No. 4661448, USA, CI C12N 19/36-publ. Apr. 28, 1987.

84. Japanese Patent Application Kokai (Laid-open) No. 101491/1979.

85. Izumi, et al., Collection of Lectures on the Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan in 1983, pp. 358.

86. Izumi, et al., Collection of Lectures on the Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan in 1984, pp. 595.

87. Eguchi, et al., Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 47, pp. 2941-2943, 1984.

88. Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 14, 1987 pp. 147-1971.

89. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 7, No. 9, 1985, pp. 1277-1281.

90. Biotechnology letters 1983, 5 (7), 463-468.

91. Durliat H., Comtat M., Seris J-L. Process for the electrochemical regeneration of pyridine cofactors. Pat. No. 5538867, USA, CL C12P 39/00-publ. Jul 23, 1996.

92. Gonzalez B, Franc.ois J, Renaud M. 1997. A rapid and reliable method for metabolite extraction in yeast using boiling buffered ethanol. Yeast 13: 1347-1356.

93. Goyal A, Chand S. Isolation of NADH from Saccharomyces cerevisiae by ether permeabilization and its purification by affinity ultrafiltration. Indian J Exp Biol. 1996 0ct;34(10):999-1004.

94. Strandjord P. E., Clayzon K. J. The control of inhibitory imparities in NADH in lactate dehydrogenase assays. J. Lab. Clin. Med. 1966, 67, p. 144.

95. Dalziel K. Some observations on the preparation and properties of dihydronicoti-namide- adenine dinucleotide. Biochem. J. 1962, 84, p. 240.

96. Everse J., and Kaplan, N. O., Lactate dehydrogenases: Structure and function. In Advances in Enzymology, N.Y., 1973, pp.61-133.

97. Renderrath К. Thin layer separation methods for nucleic acid derivatives. In Methods in Enzymology. Academic Press., N.Y., 1967, 12A, p. 323.

98. Pastore, E.J., and Friedkin, M., The chromatographic separation and recovery of reduced and oxidized pyridine nucleotides. J.Biol. Chem. 236, p. 2314, 1961.

99. Silverstein, E., Separation and purification of oxidized and reduced nicotine adenine dinucleotides. Anal. Biochem. 12, p.199, 1965.

100. DiSabato, G., Reactions of DPN+ and pyruvate. Biochem. Biophys. Acta 167, p.646, 1968.

101. Horvath J. X., Nigt performance ion-exchange chromatography with narrow bore columns: Rapid analysis of nucleic acid constituents at the subnanomole level. In Methods Biochemical Analysis, 21, D. Glick, Ed., Interscience, New York, N.Y., 1973.

102. Khym, J. X., An analytical system for rapid separation of tissue nucleotides at low pressures on conventional anion exchange. Clin. Chem. 21, p. 1245, (1975).

103. Rajcsanyi , P. M., Csillag, M., and Kriskovics, E., Separation of nucleic acid constituents by column liquid chromatography. Sep. Purif. Methods 3, p. 167, (1974).

104. Singhal, R.P., Separation and analysis of nucleic acids and their constituents by ion exclusion and anion exchange column chromatography. Sep. Purif. Methods 3, p. 339,(1974).

105. Ziegenhorn, J., Senn, M., et al., Molar absorptivities of f3-NADH and p-NAD at 260 nm. Clin. Chem. 22,151 (1976)

106. Burton, R. M., and Kaplan, N. O., The reaction of diphosphopyridine nucleotide and related pyridinium salts with alkali. Arch. Biochem. Biophys. 101, p. 139 (1963).

107. Kelli A. Markham, R. Steven Sikorski. Purification, analysis, and preservation of reduced nicotinamide adenine dinucleotides 2'-phosphate. Anal. Biochemistry 322, p.26, (2003).

108. Крылов И. А, Баурина М. М. и др. Способ получения низкомолекулярных фракций БАВ из клеточных биополимеров.патент РФ). Патент РФ № 5167831 (2001 г).

109. Волкова Н. В.Разработка технологии микробных РНК и ДНК из метанути-лизирующих бактерий. Дис.канд. хим. наук, М,1996. Рукопись.

110. Красноштанова А. А. Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Дис.канд. хим. наук, М.,1995. Рукопись.

111. Бейли Дж, Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с анг. в 2-х частях. 4.2-М.: Мир, 1989.-590 с.

112. Крылов И. А. Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов. Дис. на соискание ученой степени доктора химических наук. -М, 1998. Рукопись.