Разработка новых методов иммуноанализа на примере миоглобина человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Рошке, Виктор Владимирович

• Рошке, Виктор Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рошке, Виктор Владимирович

1. ЕВВДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современное состояние методов насыщающего иммуноанализа.

2.1. Общая характеристика насыщающего иммуноанализа

2.2. Аналитические характеристики:.

- точность.

- чувствительность.

- специфичность.

- достоверность.

2.3. Методическая база насыщающего иммуноанализа:

- очистка лигандов.

- специфичные антитела

- методы разделения свободной и связанной фракций.

- меченый лиганд и разновидности насыщающего иммуноанализа

2.4. Радиоиммуноанализ:.

- йодирование белков.

- введение йода в соединения небелковой природы

- техника радиоиммуноанализа.

2.5. Альтернативные методы насыщающего иммуноанализа:

- энзимоиммуноанализ.

- кофакторный иммуноанализ.

- мембранный иммуноанализ

- флуоресцентный иммуноанализ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка новых методов иммуноанализа на примере миоглобина человека»

- оптимизация системы радиоиммуноанализа. 88

- характеристики качества анализа. 89

- исследование образцов сыворотки доноров и пациентов; возможность применения метода для диагностики острого инфаркта миокарда. 94

4.3. Мембранный иммуноанализ: 101

- получение реаедиошспособных липосом и их вза-модействие с белками. 101

- комплемент-зависимый лизис липосом, сенсибилизированных миоглобином. 109

4.4. Система иммуноанализа на миоглобин с использованием АТР в качестве метки (АТФ-метрический иммуноанализ). 112

- получение и характеризацил меченого АТР миоглобина. ИЗ

- АТФ-метрический иммуноанализ на миоглобин. . . . Ц5

- возможности применения АТФ-метрического иммуноанализа для определения миоглобина и других клинически важных соединений в сыворотке крови. 121

5. ШВОда. 130

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУШ. 131

ВВВДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Иммуноанализ получил широкое распространение в медицине, молекулярной биологии и ряде других областей. Главные достоинства иммуноанализа - высокая чувствительность, специфичность и универсальность - обусловлены свойствами антител и характеристиками их взаимодействия с лигандами (в дальнейшем термином лиганд будет обозначаться анализируемое вещество, антиген или гаптен, специфически взаимодействующее с соответствующим антителом) .

Одним из основных условий разработки любого метода иммуноанализа является наличие меченого лиганда. В иммуноанализе доминирующее положение занимает радиоиммуноанализ, разработанный Берсоном и Ялоу в I960 г. Его широкому распространению и тому, что он применяется повсеместно до настоящего времени способствовали высокая чувствительность и точность детекции радиоизотопной метки и наличие универсальных способов ее введения в лиганда. Однако, недостатки радиоизотопной метки, главным из которых является нестабильность меченого лиганда, стимулировали интенсивные поиски неизотопных, альтернативных меток, Адекватной и универсальной замены радиоактивной метке в иммуноанализе пока не найдбно, но существующие альтернативные методы находят свое применение, каждый для тех конкретных задач и условий, в которых преимущества данного метода реализуются наиболее полно.

Разработка новых методов иммуноанализа является одной из актуальных задач физико-химической биологии.

В качестве главной модели для наших исследований мы выбрали миоглобин человека - дыхательный белок, содержащийся в поперечнополосатой и сердечной мускулатуре. Миоглобин - один из наиболее ранних молекулярных маркеров острого инфаркта миокарда. Рядом авторов было показано, что в норме его концентрация в сыворотке крови составляет 6-85 иг/мл и увеличивается до 500-2000 нг/мл и выше при остром инфаркте миокарда (1-4). Максимальных значений концентрация миоглобина достигает спустя 4-12 часов после приступа, заметное повышение уровня наблюдается уже через 2-3 часа. Диагностика острого инфаркта миокарда по повышению уровня миоглобина в крови обладает высокой надежностью на ранних этапах развития заболевания: в интервале 6-18 часов после приступа достигает 100$ (5).

Проблема диагностики острого инфаркта миокарда остается весьма актуальной, в особенности в случаях с атипичными клиническими симптомами, которые не выявляются традиционным электрокардиографическим обследованием. Повышение уровня ряда сердечных изоферментов в сыворотке крови является более надежным критерием, однако оно наступает на несколько часов позже, чем повышение уровня миоглобина (5).

Очевидно, что для повышения значимости иммуноанализа на мио-глобин, как средства диагностики острого инфаркта миокарда, необходимы быстрые, простые и надежные метода определения его концентрации в сыворотке щюви. Разработанные ранее методы радиоиммунологического определения миоглобина обладали недостаточной скоростью: время анализа составляло 4 часа и более (1-4). В медицинских учреждениях нашей страны метод нашел лишь ограниченное применение вследствие отсутствия соответствующих наборов реактивов отечественного производства.

Б связи с изложенным нам представлялось актуальным создание новых методов иммуноанализа на миоглобин.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в создании на примере миоглобина новых методов иммуноанализа, пригодных для исследовательских и практических целей. В соответствии

- 7 с этим были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать быстрей метод радиоиммуноанализа на миоглобин человека, пригодный для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда.

2. Разработать способ фиксации немембранных белков на поверхности липосом. На примере миоглобина исследовать принципиальную возможность комплемент-зависимого лизиса сенсибилизированных этим антигеном липосом с целью выяснения возможности разработки на этой основе методики иммуноанализа.

3. На примере миоглобина разработать способ мечения лигандов молекулой АТР. Исследовать возможность применения АТР-меченых лигандов для разработки новых неизотопных методов иммуноанализа.

Научная новизна результатов исследования. Разработан радио-иммуноанализ на миоглобин, отличающийся от существующих методов высокой скоростью. Полное время анализа составляет около одного часа.

Разработан новый способ ковалентной фиксации немембранных белков на поверхности липосом, несущих реагент с управляемой алкили-рующей активностью. Показана возможность иммуноспецифичного лизиса липосом с химически фиксированным на поверхности миоглобином. Продемонстрирована принципиальная возможность создания на этой основе системы мембранного иммуноанализа.

Разработана новая неизотопная система АТФ-метрического иммуноанализа. Ее отличительной особенностью является регенерация интакт-ной АТР перед детектированием.

Практическая значимость -результатов работы. На основе быстрого метода радиоиммуноанализа на миоглобин, предложенного в настоящей работе, совместно с хозрасчетным опытным предприятием "Радиопрепарат" Института ядерной физики АН УзССР изготовлены опытные образцы наборов "РИА-миоглобин". Наборы предназначены дал быстрого определения миоглобина в сыворотке крови с целью экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда. Наборы прошли клинические испытания в Институте терапии СО АМН СССР (на базе 1-й клинической больницы скорой помощи г.Новосибирска), в Институте молекулярной и клинической патологии Тартуского государственного университета (на базе городской клинической больницы г.Тарту), в Сибирском филиале Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР, г.Томск. Всего проведено более 1000 анализов. Получены положительные отзывы.

Публикации и апробации работы. Материалы настоящего исследования были доложены на П Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Ташкент, 1980); на международном семинаре "Биолюминесценция и люминесцентные методы анализа" (Новосибирск, 1982).Основные результаты диссертации опубликованы в 5 печатных работах.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Современное состояние метода насыщающего иммуноанализа

Экинз (6, 7) выделяет два основных типа иммунохимического анализа, принципиально отличающихся оптимальными соотношениями реагентов и важнейшими характеристиками: чувствительностью и специфичностью .

Тип I. (анализ проводится при избытке антител). лиганд + антитело лиг.анд• антитело + остаточное антитело

Определение при этом основано на оценке распределения антител между связанной и свободной фракциями.

Тип 2. (анализ проводится при избытке лиганда). лиганд + антитело лиганд «антитело + остаточный лиганд

Определение при этом основано на оценке распределения лиганда между связанной и свободной фракциями.

В приведенных схемах обозначения "антитело" и"лиганд" симметричны. Отсюда вытекает, что принципиально оба типа анализа можно применять как для определения лигандов, так и душ определения антител. Однако, на практике для определения антител обычно применяют анализ типа I, в то время как анализ типа 2 является наиболее распространенным подходом к определению лигандов. В дальнейшем в рамках данной работы будут рассмотрены методы типа 2, получившие в литературе название "иммуноанализ" или "насыщающий иммуноанализ" (8).

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Рошке, Виктор Владимирович

5. вывода

1. Предложена и подробно охарактеризована имг^туноаналитическая система "миоглобин человека - антимиоглобиновая сыворотка". Система высокоспецифична - коэффициенты перекреста при образовании иммунного комплекса для белков человека гемоглобина, альбуми

С rt с на nig G составляют . 4 х10 , менее 2x10" и менее 3x10 , соответственно .

2. Предложен модифицированный метод радиоиммуноанализа на миоглобин, пригодный для экспресс-диагностики инфаркта миокарда. Этот метод отличается от существовавших ранее большой скоростью выполнения анализа. Приготовлены и испытаны в клинике опытные образцы наборов для радиоиммуноанализа на миоглобин на базе отечественных реагентов.

3. Разработан метод получения "алкилирующих" липосом. Алкили-рование такими липосомами дает возможность встраивать в лиготдтте мембраны гидрофильные белки, в частности, миоглобин человека. При добавлении комплемента и антител против миоглобина происходит лизис несущих миоглобин липосом, что создает предпосылки для разработки методов мембранного иммуноанализа на миоглобин.

4 J Разрабонана новая система кофакторного иммуноанализа -АТФ-метрический иммуноанализ. Обработка содержащих аминогруппы антигенов аденозин-5-триметафосфатом приводит к ковалентному присоединению остатков - рррА. Обработка содержащих рррА-метку иммунных комплексов кислотой дает количественный выход АТР. Последний регистрируется с высокой чувствительностью по биолюминесценции с помощью люциферазы. Система АТФ-метрического иммуноанализа апробирована на примере двух клинически важных антигенов - миоглобина и тироксина. АТФ-метрический анализ на миоглобин может служить удобным методом диагностики инфаркта миокарда.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рошке, Виктор Владимирович, 1984 год

1. Stone M.J., Willerson J.Т., Gomez-Sanchez C.E., Waterman M.R. Radioimmunoassay of myoglobin in human serum. J. Clin. Invest., 1975, v. 56, N 5, p. 1334-1339.

2. Stone M.J., Willerson J. Т., Waterman M.R. 1пг Methods in enzymology. /Langone J.J., Vunakis H.Y., Eds. Academic Press, New York, 1982, v. 84D, p. 172-177.

3. Rosano T. G., Kenny M.A. A radioimmunoassay for human serum myoglobin: method development and normal values. -Clin. Chem., 1977, v. 23. N 1, p. 69-75.

4. Miyoshi K., Saito S., Kawai H., Kondo A., Iwasa M, Mayashi Т., Yagita M. Radioimmunoassay for human myoglobin: method and results in patients with skeletal muscle or myocardial disorders. J. Lab. Clin. Med., 1978, v. 92, 1\Г 3, p. 342351.

5. Steirteghem A,C.V., Zweig M.H., Robertson E.A., Bernard R.M., Putzeys G.A., Bieva C.J. Comparision of the effectiveness of four clinical chemical assays in classifying patients with chest pain. Clin. Chem., 1982, v. 28, IT 6, p. 13191324.

6. Ekins R.P. The future development of immunoassay. -In: Radioimmunoassay and related procedures in medicine. IAEA, Vienna, 1978, v. 1, p. 241-275.

7. Ekins R.P. Merits and disadvantages of different labels and methods of immunoassay. In: Immunoassays for the 80s. / Voller A., Bartlett A., Bidwell D., Eds. - University Park Press, Baltimore, 1981, p. 5-16.

8. Ekins R.P., Newman G.B., O'Riordan J.L.H. Theoretical aspects of saturation and radioimmunoassay. In: Radioisotopes in medicine: in vitro studies. / Hays R.L., Goswitz F.H., Murphy B.E.P., Eds. - U.S.AEC, Oak Ridge, Tennessee, 1968, p. 59-100.

9. Ekins R.P., Newman G.B., O'Riordan J.L.H. Saturation assays. In: Statistics in endocrinology. / McArthur W., Colton Т., Eds. - MIT Press, Cambridge, 1967, p. 345-392.

10. Ekins R.P. Basic concepts of saturation analysis techniques. In: Current topics in experimental endocrinology. / Martini L., James Y.H.T., Eds. - Academic Press, Hew York, 1971, v. 1, p. 1-39.

11. Ekins R.P., Newman B. Theoretical aspects of saturation analysis. Acta endocrinol., 1970, v. 64, Suppl. 147, p. 11-36.

12. Rodbard 0., Frazier G.R. Statistical analysis of radioligand assay data. In: Methods in enzymology. /O'Malley B.W., Hardman J,G., Eds. - Academic Press, ITew York, 1975, v. 37B, p. 3-22.

13. Чард Т. Paдиоиммунологические методы. М., Мир, 1981.

14. Stuttgart, 1978, p. 31-42.

15. Rodbard D. , Bridson W., Rayford P.L', Rapid calculation of radioimmunoassay results. J. Lab. Clin. Med., 1969» v. 74, N 5, p. 770-781.

16. Marschuer I., Erhardt P., Scriba P.O. Calculation of the radioimmunoassay standart curve by "spline function". -In: Radioimmunoassay and related procedures in medicine. -IAEA, Vienna, 1974, v. 1, p. 111-122.

17. Midgley A.R. Principles for the assesment of the reliability of radioimmunoassay methods (precision, accuracy, sensitivity, specificity). Acta endocrinol., 1969, v. 3, Suppl. 142, p. 163-184.

18. Ekins R.P. Quality control and assay design. In: Radioimmunoassay and related procedures in medicine, - IAEA, Vienna, 1978, v. 2, p. 39-56.

19. Yalow R.S., Berson S.A. General principles of radioimmunoassay. In: Radioisotopes in medicine: in vitro studies. / Hayes R. L. , Goswitz P. A. , Murphy B.E.P., Eds. - U.S. AEC, Oak Ridge, Tennessee, 1968, p. 7-41.

20. Yallow R.S. In: Statistics in endocrinology. Chapter twenty. Discussion. / McArthur J.W., Colton Т., Eds. - MIT Press, Cambridge, 1970, p. 379-392.

21. Ekins R.P., Newman G.B., Piyasena R., Banks P., Slater D.H. The radioimmunoassay of aldosterone in serum and urine: theoretical and practical aspects. J.Steroid Biochem., 1972, v. 3, If 3, p,289-304.

22. Kabat E.A. Basic principles of antigen antibody reactions. - In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Langone J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v. 70 A, p. 334355.

23. Hunter W.M. Control of specificity in radioimmunoassay. In: Protein and polypeptide hormones. / Margoulies M., Ed. - Excerpta Medica, .Amsterdam, 1968, p. 5-13.

24. Berzofsky J.A., Schechter А. И. The concepts of cros-sreactivity and specificity in immunology. Mol. Immunol., 1981, v. 18, IT 8, p. 751-763.

25. Ekins R.P. In: Protein and polypeptide hormones. / Margoulies M., Ed. - Excerpta Medica, Amsterdam, 1968, p. 575-581.

26. Hunter V/.M. Preparation and assesment of radioactive tracers. Brit. Med. Bull., 1974, v. 30, N 1, p. 18-23.

27. Hjelm M. Components in a model for the production of references materials with special reference to immunoassays. -In: Immunoassays for the 80s. / Voller A., Bartlett A., Bid-well D., Eds. University Park Press, Baltimore, 1981, p. 185-191.

28. Hurn B.A.L., Chautler S.M. Production of reagent antibodies. In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Lango-ne J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v. 70A, p. 104-142.

29. Егоров A.M., Диков M.M. Структура и механизм действия антител. 1. Всес. хим. о-ва, им. Д.И.Менделеева, 1982, т. 27, № 4, стр. 21-28.

30. Sela М. Antigenicity: some molecular aspects. -Science, 1969, v. 166, N 3911, p. 1365-1374.

31. East I.J., Hurrel J.G.R. , Todd P.E.E., Leach S.J. Antigenic specificity of monoclonal antibody to human myoglobin. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N 6, p. 3199-3202.

32. Schlossman S.F.S., Ben-Efrain S., Yarou A., Sober H.A. Immunochemical studies on the antigenic determinants required to elicit delayed and immediate hypersensitivity reactions. -J. Exp. Med., 1966, v. 123, N 6, p. 1083-1095.

33. Erlanger B.F. The preparation of antigenic hapten-carrier conjugates: a survey. In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Langone J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v. 70 A, p. 85-104.

34. Беккер М. Активные группы белков. Их модификация.- В кн.: Иммуносорбенты в очистке белков. / Под ред. Руослах-ти Э. М., Медицина, 1979, стр. 18-30.

35. Jaffe В.М., Smith J.M., Newton W.T., Parker C.W. Radioimmunoassay of prostaglandines. Science, 1971, v. 171, N 3970, p. 494-496.

36. Lauer R.C., Soloman P., ITakanishi K., Erlanger R.P. Antibodies to insect C^g juvenile hormone. - Experienta, 1974, v. 30, II 5, p. 558-560.

37. Bauminger S., Wilchek M. The use of carbodi—imides in the preparation of immunizing conjugates. In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Langone J.J., Eds. - Academic Press, Hew York, 1980, v. 70 A, p. 151-159.

38. Fitzpatrick P.A., Bundy G.L. Hapten mimic elicits antibodies recognizing prostaglandin Eg. Proc. Hatl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, N 6, p. 2689-2693.

39. Hamburger R.U. Chloramphenicol specific antibody.- Science, 1966, v. 152, IT 3719, p. 203-205,

40. Ungar-Waron R., Sela M. Pyridoxal-specific antibodies obtained with a synthetic pyridoxal-polypeptide conjugute. -Biochim. Biophys. Acta, 1966, v. 124, N 1, p. 147-153.

41. V/eliky IT., Wektall H.H. The chemistry and use of cellulose derivatives for the study of biological systems. -Immunochemistry, 1965, v. 2, IT 4, p. 293-322.

42. Riad-Fahmy D., Read G.F., Jouce E.G., Walker R.F. Steriod immunoassays in endocrinology. In: Immunoassays for the 80s. / Voller A., Bartlett A., Bidwell D., Eds. -University Park Press, Baltimore, 1981, p. 205-261.

43. Kochler G., Milstein C. Gontinious cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, v. 256, N 5517, p. 495-497.

44. Ruoslahti E., Uotila M., Engvall E. Radioimmunoassay of оС-fetoprotein with polyclonal and monoclonal antibodies. -In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds.- Academic Press, New York, 1982, v. 84D, p. 3-19.

45. Hadam V/.R. , Hummerich W. Bound / free separation in radioimmunoassay: selection of suitable methods. In: Radioimmunoassay renin-angiotensin. / Krause D.K., Hummerich W., Poulsen K., Eds. - Georg Thierne Publishers, Stuttgart, 1978, p. 27-31.

46. Odell W.D. Use of charcoal to separate antibody complexes from free ligand in radioimmunoassay. In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Langone J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v. 70A, p. 274-279.

47. Desbiquious В., Aurbach G,D. Use of polyethylene glycol to separate free and antibody-bound peptide hormone in radioimmunoassay. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1971, v. 33, N 5, p. 732-738.

48. Chard T. Ammonium sulfate and polyethylene glycol as reagents to separate antigen from antigen antibody complexes. - In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Langone J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v, 70A, p. 280291.

49. Midgley A.R., Hepburn M.R. Use of double antibody method to separate antibody bound from free ligand in radioimmunoassay. In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Langone J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v. 70 A, p. 266-274.

50. Porsgreen A., Sjoquist J. Protein A from S. aureus. I. Pseudoimmune reaction with human #-globulin. J. Immunol., 1966, v. 97, N 6, p. 822-827.

51. Langone J.J. I-labelled protein A: reactivity with IgG and use as a tracer in radioimmunoassay. In: Methods in enzymology. / Vunakis H.V., Langone J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v. 70 A, p. 356-376.

52. Parsons G.H. Antibody-coated plastic tubes in radioimmunoassay. In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds. - Academic Press, New York, 1981, v. 73 B, p.224-239.

53. Heremann J.E. Quantitation of antibodies immobilized , on plastics. In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vu-nakis H.V., Eds. - Academic Press, blew York, 1981, v. 73 B,p. 239-244.

54. Christiansen P., Johansson A., Nielsen V. Quantitation of protein adsorbanse to glass and plastics: investigation of a new tube with low adherence. J. Immunol. Meth., 1978, v. 23, N 1-2, p. 23-28.

55. Криотиансен Т. Иммобилизованные антигены и антитела. -В кн.: Иммуносорбенты в очистке белков. / Под ред. Руослахти Э. Пер. с англ. М.: Медицина, 1979, стр. 31-44.125

56. Langone J.J. J I protein A: a tracer for general use in immunoassay. J. Immunol. Meth., 1978, v. 24, N 3-4, p. 269-285.

57. Smith K.0., Gehle W.D. Semiautomation of immunoassays by use of magnetic transfer devices. In: Methods in enzymology. / Vunakis H.Y., Langone J.J., Eds. - Academic Press, New York, 1980, v. 70 A, p. 388-416.

58. Langone J.J. Applications of immobilized protein A in immunochemical techniques. J. Immunol. Meth., 1982, v. 55, N 3, p. 277-296.

59. Hunter V/.M. The preparation and assesment of iodinated agents. In: Radioimmunoassay methods. / Kirkham K.E., Hunter V/.M., Eds. - Churchill Livingstone, Edinburgh, 1971, p. 3-23.

60. Greenwood F.C., Hunter W.M. The preparation of labelled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochem. J., 1963, v. 89, N 1, p. 114-123.

61. Knight L.C., Welch M.J. Sites of direct and indirecthalogenation of albumin. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 534, N 2 , p. 185-195.

62. Gonteras M.A., Bale \Y. P., Spar I.L. Iodine monochlo-ride (IC1) iodination techniques. In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds. - Academic Press, New York, 1983, v. 92 E, p. 277-292.

63. Bolton A.E. Radioiodination techniques. In: Review 18. - The Radiochemical Centre Amersham, England, 1977.

64. Praker P.J., Speck J.C. Protein and cell membrane ra-dioiodinations with, a sparingly soluble chloramide, 1,3,4,6 -tetrachloro 3d,6ot -diphenylglucoluril. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, v. 80, Ы 4, p. 849-857.

65. Marchalonis J.J. An enzymatic method for the trace iodination of immunoglobulins and other proteins. Biochem. J., 1969, v. 113, N 2, p. 299-305.

66. Thorell J.J., Johansson B.G. Enzymatic iodination of125polypeptides with to high specific activity. Biochim.

67. Biophys. Acta, 1971, v. 251, N 3, p. 363-399.

68. Karonen S.L., Mersky P., Siren M., Senderling V. Anenzymatic solid-phase method for trace iodination of proteins125and peptides with -'I iodide. Anal. Biochem., 1975, v. 67, N 1, p. 1-10.

69. Wood P.Т., Wu W.M., Gerhart J.C. The radioactive labelling of proteins with an iodinated amidination reagent. -Anal. Biochem., 1975, v. 69, N 2, p. 339-349.

70. Gobel C.A., Shapiro B.M. 125I diiodofluorescein isothyocyanate: its synthesis and use as a reagent for labelling protein and cells to high specific radioactivity. - Anal.

71. Biochem., 1980, v. 86, Ж 2, p. 396-406.80. bangone J.J. Radioiodination by use of the Bolton-Hunter and Related reagents. In: Methods in enzymology.bangone J.J., Vunalcis H.V. , Eds. Academic Press, Hew York, 1981, v. 73 B, p. 112-127.

72. Bolton A.E., Hunter W.M. The labelling of proteins125to high specific radioactivities by conjugation to -^-containing acylating agent. Application to the radioimmunoassay.- Biochem. J., 1973, v. 133, N 3, p. 529-539.

73. Hampl R., Dvorak P., Lukesova S., Kozak P., Chrpova M., Starka L. The use of iodinated steroid as radioligand for testosterone radioimmunoassay. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, П 8, p. 771-773.

74. Commerford S.L. In vitro iodination of nucleic acids.- In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds. Academic Press, Hew York, 1980, v. 70 A, p. 247-252.

75. Bolton A.E. Radioimmunoassay. In: Immunoassays for the 80s. / Voller A., Bartlett A., Bidwell D., Eds. -University Park Press, Baltimore, 1981, p. 69-83.

76. Gorril J.E.E., Hunter \7.M. 125I iodination tracers for hapten-specific radioimmunoassays. - In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds. - Academic Press, New York, 1981, v. 73 B, p. 79-112.

77. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Im-munochemistry, 1971, v. 8, N 9, p. 871-874.

78. Van Weeman B.K., Schuurs A. H.W.M. Immunoassay using antigen enzyme conjugates. PEBS lett., 1971, v. 15, N 3, p. 232-236.- 142

79. Van Weemen В.К., Schuurs A.H.V/.M. Immunoassay using hapten-enzyme conjugates. FEBS lett, 1972, v. 24, N 1, p. 77-81.

80. Exley D., Abuknesha R. The preparation and purification of a JJ- D -galactosidase-oestradiol-17j} -conjugate for enzyme immunoassay. FEBS, lett., 1977, v. 79, N 2, p. 301304.

81. Exley D., Abulcnesha R. A highly sensitive and specific enzyme-immunoassay method for oestradiol-17J3 • FEBS lett., 1978, v. 91, N 2, p. 162-165.

82. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Immunochemistry, 1969, v. 6, N 1, p. 43-52.

83. Avrameas S., Ternynck T. Peroxidase labelled antibody and Fab conjugates with enchanced intracellular penetration. Immunochemistry, 1971, v. 8, N 11, p. 1175-1179.

84. Kabakoff D. S. Chemical aspects of enzyme-immunoassay. In: Enzyme-immunoassay. /Maggio E.T., Ed. - CRC Press, Boca Raton, БЧа., 1979, chap. 5, p. 71-104.

85. Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа. I. Всес. хим. о-ва им. Д.И.Менделеева, 1982, т. 27, № 4, стр. 82-89.

86. Kato К., Hamaguchi Y., Fukui Н., Ishikawa Е. Enzyme-linked immunoassay. 1. Novel method for synthesis of the insulin- A- D-galactosidase conjugate and its applicability for- 143 insulin assay. J. Biochem., 1975, v. 78, IT 1, p.235-237.

87. Kato K., Haruyama Y., Hamaguchi Y., Ishikawa E. Comparision of three enzyme-linked procedures for the quantitative determination of guinea pig anti-porcine insulin antibody. J. Biochem., 1978, v. 84, IT 1, p. 93-102.

88. ICitagava T., Aikawa T. Enzyme coupled immunoassay of insulin using a novel coupling reagent . J. Biochem., 1976, v. 79, IT 1, p. 233-236.

89. Jou Y.H., Mazzaferro P.K., Mayers G.L., Bankert E.B. Methods for the attachment of haptens and proteins to erythrocytes. In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds. - Academic Press, ITew York, 1983, v. 92 E, p. 257276.

90. Nakane P.K. , Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 1974, v. 22, IT 12, p. 1084-Ю91.

91. Mattiasson В., Nilsson H. An enzyme immunoelectrode.- PEBS lett., 1977, v. 78, N 2, p. 251-254.

92. Ngo Т. T., Lenhoff H.M. Enzymes as versatile labels and signal amplifiers for monitoring immunochemical reactions.- Mol. Cell. Biochem., 1982, v. 44, N1, p. 3-12.

93. Maggio E.T. Enzymes as immunochemical labels. In: Enzyme-immunoassay. / Maggio E. T., Ed. - CRC Press, Boca Raton, Pla., 1979, chap. 3, p. 53-70.

94. Clark B.R., Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): theoretical and practical aspects. In: Enzyme-immunoassay. / Maggio E.T., Ed. - CRC Press, Boca Raton, Pla., 1979, chap. 8, p. 167-179.

95. Harris C.C., Yolken R.H., Krokan H., Chang Hsu I.

96. Ultrasensitive enzymatic radioimmunoassay: application to detection of cholera toxin and rotavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, U 10, p. 5336-5339.

97. Гаврилова E.M. Гомогенный иммуноферментный анализ. -новое направление иммунохимии. Ж. Воес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева, 1982, т. 27, № стр. 90-97.

98. Rubenstein К.Е., Schneider R.S., Ullman Е.Р. :"Homogeneous" enzyme immunoassay. A new immunochemical technique for quantitative determination of abused drugs. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1972, v. 47, II 4, p. 846-851.

99. Rowley G.L., Rubens.tein K.E., Huisjen J., Ulman E.F. Mechanism by which antibodies inhibit hapten-malate dehydrogenase conjugates. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, IT 10, p. 37593766.

100. Yegorov A.M., Osipov A.P., Mitrochina T.G., Gavrilo-va E.M., Gromov A.I., Sorokina N.Y. Homogeneous coenzyme-immunoassay for quantitation of insulin in solution. Anal, Lett., 1980, v. 15, p. B, p. 171-192.

101. Митрохина Т.Г. Гомогенный иммунофакторный метод определения инсулина на основе ферментативных систем регенерации никотин-амидаденин-динуклеотида.: Автореф. дис. канд. хим. наук. Москва, 1983.

102. Moris D.L., Buckler R.Т. Colorimetric immunoassays- 145 using flavine adenine dinucleotide as a label. In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H. V., Eds. - Academic Press, New York, 1983, v. 92 E, p. 413-425.

103. Митрохина Т.Г., Осипов А.П., Гаврилова Е.М., Сорокина

104. H.В., Егоров A.M. Гомогенный иммунокофакторный метод определения инсулина . Прикл. биохим. микробиол., 1983, т. 19, вып.1. стр. 143-152.

105. Whitehead Т.P., Kricka L.J., Carter T.J.N., Thorpe G.H.G. Analytical luminescence: its potential in the clinical laboratory. Clin. Chem., 1979, v. 25, N 9, p. 15311546.

106. Гаврилова Е.м., Киселёва Н.И., Егоров A.M., Березин И.В. Коньюгаты АТР-инсулин и их использование для иммунокофак-торного анализа. Биохимия, 1981, т. 46, № 2, стр. 306-313.

107. Nakane P. Future trends and application of immunoassays. In: Diagnostic immunology: current and future trends. / Keitges P.W., Nakamura R.M., Eds. - College of American Pathologists, Skokie Illinois, 1980, p. 73-77.

108. Finley P.R., Williams R.J., Lichti D. A. Evaluation of a new homogeneous enzyme inhibitor immunoassay of serum tyrosine with use of a bichromatic analyzer. Clin. Chem., 1980, v. 26, N 12, p. 1723-1726.

109. Chan S.W., Tan C.-T., Hsia J.C. Spin membrane immunoassay: simplicity and specificity. J. Immunol. Meth., 1978, v. 21, N 1-2, p. 185-195.

110. Borsos Т., Langone J.J. Detection of antigens andhaptens by inhibition of passive immune hemolysis. In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds. - Асаdemic Press, New York, 1981, v. 74 C, p. 161-165.

111. Haga M., Stagaki H., Sugawara S., Okano T. Liposome iramunosensor for theophylline. Biochem. Biophys. Res. Common., 1980, v. 95, N 1, p. 187-192.

112. Zuk R.F., Rowley G.L., Ullman E.P. Fluorescence protection immunoassay: a new homogeneous assay technique. -Clin. Chem., 1979, v. 25, N 9, p. 1554-1560.

113. Tan C,T., Chan S.W., Hsia J.C. Membrane immunoassay: a spin membrane immunoassay for thyroxine. In: Methods in enzymology. / Langone J.J., Vunakis H.V., Eds. - Academic Press, New York, 1981, v. 74 C, p. 152-160.

114. Martin P. J., Hubbell Y/.L., Papahandjopoulos J). Immu-nospecifie targeting of liposomes to cells: a novel and efficient. method for covalent attachment of Fab fragments via disulfide bonds. Biochemistry, 1981, v. 20, IT 14, p. 4229-4238.

115. Mazzaferro P.K., Mayers G.L. Comparision of methyl Р-hydroxybenzimidate and 1,3,5-trichlorotriazine in producing sensitive target cells for use in the hemolytic spot assays. -J. Immunol. Meth., 1981, v. 46, IT 3, p. 327-336.

116. Kas J., Rauch P. Labelled proteins, their preparation and applications. In: Topics in current chemistry. / Boschke P.L., Ed. - Springer Verlag, Berlin, 1983, v. 112, p. 163-230.

117. Soini E., Hemmila I. Pluoroimraunoassay: present status and key problems. Clin. Chem., 1979, v. 25, IT 3, p. 353-361.

118. Hemmila I., Soini E., Lovgren T. Time-resolved fluo-roimmunoassay (TR FIA). - Presenius Z. anal. Chem., 1982,v. 311, IT 4, p. 357.

119. Barela T.D., Sherry A.D. A simple, one-step fluoro-metric method for determination nanomolar concentrations of terbium. Anal. Biochem., 1976, v. 71, IT 2, p. 351-357.

120. Leung C.S.-H., Ivleares L. and C.P. Attachment of fluorescent metal chelates to macromolecules using "bifunctio-nal" chelating agents. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977, v. 75, IT 1, p. 149-155.

121. Schall R.P,, Tenoso H.J. Alternatives to radioimmunoassay: labels and methods. Clin. Chem., 1981, v. 27, 1T7, p. 1157-1164.

122. Colin E.J., Hugnes W.L., Jr., Weare J.H. Preparation and properties of serum and plasma proteins. XIII. Crystallization of serum albumins from ethanol-v/hater mixtures. -J. Amer. Chem. Soc., 1947, v. 69, 17, p. 1753-1761.

123. Жатон l.-K., Брандт Д.Ч., Васоалли П. Выделение и характеристика иммуноглобулинов, антител и их полипептидных цепей. В кн.: Методы исследований в иммунологии. / Под ред. Лефковитца И., Перниса Б. - М., Мир, 1981, стр. 58-82.

124. Knorre D.G., Kurbatov Y.А., Samukov V.V. General meth^-od for the synthesis of ATP gamma-derivatives. PEBS lett., 1976, v. 70, N 1, p. 105-108.

125. Гринштейн Д., Виниц M. Химия аминокислот и пептидов. М., Мир, 1965.

126. Туркова Я. Аффинная хроматография. М., Мир, 1980, стр. 190.

127. Hudson L., Hay Р. С. Practical immunology. Black-wel Publication Scientific Ltd , Oxford, 1980, p. 347.

128. Пул А. Антитела к ферментам и их применение. В кн.: Лизосомы, методы исследования. / Под ред. Дингла Д. - М., Мир, 1980, стр. 257-329.

129. Такач В. Электрофорез белков в пластинках полиакрил-амидного геля. В кн.: Методы исследований в иммунологии. J Под ред. Лефковитца Н., Перниса Б. - М., Мир, 1981, стр.95-119.

130. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980.

131. Antonini Е., Brunori М. Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands. / Heuberger A., Tatum E.A. , Eds. ITorth-Holland Press, Amsterdam, 1971.

132. Catheline M., Bouget A., Daubert C., Gouffaul J., Le Gall J. Etude de la myoglobinemie et de son evolution an cours de 1'infarctus du myocarde. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 105,1. N 3, p. 311-315.

133. Kagen L.J. Myoglobin: methods and diagnostic uses. -CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 1978, v. 9, H 4, p. 273-302.

134. Домбровский В.И., Староверов И.И., Ротт Г.М., Поверенный A.M., Цыб А.Ф., Руда М.Я., Чазов Е.И. Иммунохимические методы определения миоглобина в сыворотке крови и моче. Бюл. Всесоюзн. кардиол. научн. центра, 1981, т. 1'а I, стр. 88-94.

135. Higuma IT. Enzyme immunoassay of myoglobin in human serum. Acta Med. Biol., 1980, v. 27, IT 3-4, p. 111-121.

136. Huang L., Kennel S.J. Binding of immunoglobulin G to phospholipid vesicles by sonication. Biochemistry, 1979, v. 18, IT 9, p. 1702-1707.

137. Ошевский С.И., Грачёв М.А., Мустаев А.А. Способ получения аффинных реагентов с управляемой алкилирующей функцией производных олигонуклеотидов по 5'- фосфатному остатку.

138. Биоорган, химия, 1983, т. 9, № 7, стр. 958-965.

139. Steck Т.Ъ. , Dawson G. Topographical distribution of complex carbohydrates in the erythrocyte membrane. J. Biol. Chem., 1974, v. 249, N 7 , p. 2135-2141.

140. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. - М., Наука, 1981.

141. Kaledin V.J., Matienko N. А., Nikolin V.P., Gruntenko Y.V., Budker V*, G., Vakhrusheva Т.Е. Subcutaneously injected radiolabeled liposomes: transport to the lymph nodes in mice. -J. Nat. Cane. Res. Inst. USA, 1982, v. 69, N 1, p. 67-71.

142. Torchilin V.P., Goldmacher V.S., Smirnov V.N. Comparative studies on covalent and noncovalent immobilization of protein molecules on the surface of liposomes. Biochem. Bio-phys. Res. Commun., 1978, v. 85, N 3, p. 983-990.

143. Uemura K., Kinsky S.C. Active vs. passive sensitization of liposomes toward antibody and complement by dinitrophe-nylated derivatives of phosphatidylethanolamine. Biochemistry, 1972, v. 11, N 22, p. 4085-4094.

144. Gordon R.E., Mayer P.R., Kildsing D. 0. Lyophiliza-tion a means of increasing shelf-life of phospholipid bilayer vesicles. - Drug developm. and industr. pharmacy, 1982, v. 8,1. N 4, p. 465-473.

145. Добриков М.И., Шишкин Г.В. Фотоматериалы на основе фотоиммобилизованных ферментов. Зависимость светочувствительности от способа фотоиммобилизации. Автометрия, 1983, № 5, стр. 17-23.

146. Malvano R. Error in RIA: Sources and evaluation. -J. Nucl. Med. All. Sci., 1982, v. 26, N 4, p. 205-226.

147. Гордон А., Форд P. Спутник химика. M., Мир, 1976.1б4* The Sadtler standard spectra. UV spectra v. 1-118 N 1 34084. Philadelphia, Sadtler research laboratories, 19661983.

148. Венкстерн Т.В., Баев А. А. Спектры поглощения минорных компонентов и некоторых олигонуклеотидов рибонуклеиновых кислот. М., Наука, 1967.

149. Ratcliffe J.G., Ratcliffe V/.A. Methods of thyroid hormone analysis. In: Rational diagnosis of thyroid disease./ Hoffer R., Ed. - Verlag H. Egermann, Vienna, 1977, p. 53-76.

150. Chappele E.W., Levin G.V. Use of the firefly biolu-minescent reaction for rapid detection and counting of bacteria. Biochem. Med., 1968, v. 2, Ш 1, p. 41-52.

151. Hunter V/.M. Monoclonal antibodies in clinical chemistry. Proc. Roy. Soc. Edinburgh, 1982, v. 81 B, N 2, p. 293-300.