Разработка новых липидных зондов на основе производных дипиррометена для исследования мембран тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Болдырев, Иван Александрович

• Болдырев, Иван Александрович
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Болдырев, Иван Александрович

Введение

1 Обзор литературы. Флуоресцентные липидные зонды для исследования латеральной и трансбислойной структуры мембран

1.1 Исследование латеральной структуры мембраны.

1.2 Латеральная подвижность компонентов мембран.

1.3 Исследование параметров мембран по глубине.

1.4 Локализация флуорофоров в бислое.

1.4.1 Тушение флуоресценции.

1.4.2 Использование FRET

1.4.3 Использование ЯМР.

1.4.4 Резюме.

1.5 Перспективы применения флуоресцентных зондов в мембра-нологии.

2 Результаты и их обсуждение

2.1 Выбор флуорофора.

2.2 Структура зондов

2.3 Схема синтеза.

2.4 Спектральные свойства зондов.

2.5 Положение Ме4-ВОБ1РУ-8-флуорофора в бислое.

2.5.1 Определение положения флуорофоров в мембране тушением флуоресценции йодидом натрия.

2.5.2 Определение глубины погружения флуорофора методом параллакса.

2.6 Латеральная упаковка и спектральные свойства зондов в монослое

2.7 Анизотропия флуоресценции и упорядоченность ацильных цепей бислоя

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка новых липидных зондов на основе производных дипиррометена для исследования мембран»

Открытие рафтов в составе мембран позволило по-новому взглянуть на известную проблему современной мембранологии - зависимость функционирования мембранных белков от липидного состава мембран. Известно, что механические взаимодействия бислоя (липидного окружения) с молекулой белка могут быть опосредованы изменением напряжения изгиба мембраны, стремлением бислоя и белка уменьшить гидрофобное несоответствие (разницу между протяженностью гидрофобного участка белка и толщиной гидрофобной области бислоя), а также изменением профиля латерального давления.

Для каждого из перечисленных механизмов известны примеры, однако их сложно формализовать. Например, может быть установлено, что изменение конформации белка было вызвано изменением профиля латерального давления, но неизвестно каким был этот профиль до и после изменения конформации. Инструментом для изучения свойств мембраны на разном расстоянии от поверхности бислоя может быть набор флуоресцентных липидных зондов, у которых флуорофор находится на разной глубине внутри мембраны. Латеральное давление внутри бислоя определяется подвижностью метиленовых групп жирнокислотных цепей. Мерой этой подвижности выступает анизотропия флуоресценции метки.

Разработка набора флуоресцентных липидных зондов предназначенных для изучения свойств мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя - актуальная задача мембранологии. Их применение позволит составить более точное представление о строении различных доменов мембран и свойствах мембранных фаз. При изучении влияния свойств мембран на функционирование мембранных белков новый набор зондов позволит получить качественно новую информацию о состоянии системы. Например, станет возможным следить за изменением профиля латерального давления одновременно с наблюдением за активностью белка.

Задачей настоящего исследования была разработка набора флуоресцентных липидных зондов для изучения свойств биологических и модельных мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя. С этой целью необходимо было подобрать флуорофор, синтезировать набор зондов на его основе, исследовать спектральные характеристики новых зондов и их поведение в мембране. Кроме того, важно было показать применимость нового набора зондов для решения поставленных задач.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Болдырев, Иван Александрович

Выводы

• Синтезирован представительный набор липидных зондов с малополярным высокочувствительным флуорофором Ме4-ВОБ1РУ-8, который в мембране располагается на разном расстоянии от ее поверхности.

• Двумя независимыми методами установлено, что флуорофор каждого зонда полностью погружен в бислой и располагаются так глубоко, как позволяет ацильная цепь, несущая флуорофор.

• Разработана новая процедура корректировки эффекта внутренней фильтрации при тушении эмиссии флуорофора, погруженного в бислой, проникающими тушителями; предложенная методика существенно повышает точность измерений.

• В опытах на модельных системах различного состава показано, что синтезированный набор зондов чувствителен к изменению подвижности ацильных цепей по глубине мембраны.

4. Экспериментальная часть

4.1. Материалы и методы

Использовали ацетил хлорид (Fluka), пробковую (субериновую) и себациновую кислоты, монометиладипат, эфират трехфтористого бора, гексафторфосфат (бензотриазол- 1-илокси)трис- (диметиламино)фосфония (ВОР), 4-аминопиридин, 1-метилимидазол, 4-пирролидинопиридин (Aldrich), триэтиламин, дициклогексилкарбодиимид (Sigma), силикагель 60 и ТСХ пластинки DC-Alufolien Kieselgel-60 (Merck). Использовали 2,4-диметилпиррол производства Aldrich или получали его как описано ранее. 2,4-диметилпиррол перед применением перегоняли. Остальные реактивы производства Реахим (Россия). Метанол перегоняли над метила-том магния, хлороформ и хлористый метилен над пятиокисью фосфора. Остальные растворители использовали после обычной очистки. Для колоночной хроматографии применяли силикагель Kieselgel 60 (Merck, Германия), для ТСХ — пластинки с флуоресцентным индикатором Kieselgel 60 F254 и без индикатора Kieselgel 60 (Merck). Обнаружение при ТСХ: фосфорномолибденовой кислотой (А), молибденовым синим (Б) и УФ-облучением (В). Сфингозин-1-фосфохолин, l-0-ß галактозил-сфингозин и лизофосфатидилхолин (из яичного фосфатидилхолина) были получены, как описано ранее [198]; лизофосфатидилхолин содержал практически только остатки пальмитиновой и стеариновой кислот в соотношении ~5:2. Монометиловые эфиры себациновой (т.кип. 170 — 173°С/2 мм) и пробковой (т. кип. 188 — 192°С/20 мм) кислот получали по методу [199]. Из них хлорангидриды (III, IV) получали реакцией с тионил-хлоридом в сухом хлороформе в присутствии ДМФА. Хлорангидрид монометиладипата (II) получали обработкой моноэфира избытком тио-нилхлорида при комнатной температуре в течение 14 ч. Монометиловый эфир янтарной кислоты получали метанолизом янтарного ангидрида. Хлорангидриды (I—IV) использовали без очистки, после упаривания в токе аргона в течение 3 ч при 20°С/12 мм или соупаривания с толуолом на роторном испарителе.

Масс-спектры снимали на MALDI-времяпролетном спектрометре «UltraFlex» (Bruker Daltonics, Германия): Ш-лазер, 337 нм, матрица — 2,5-дигидроксибензойная кислота. УФ-спектры веществ регистрировали на спектрофотометре СФ-256 (Ломо-фотоника, Санкт-Петербург); спектры флуоресценции — на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония). Спектры 1Н-ЯМР (<5, м.д. относительно Me4Si) регистрировали на спектрометре Bruker WM 500 (Германия).

4.2. Синтез

Метиловые эфиры а;-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил)алкановых кислот (VI-IX). К хлориду монометилового эфира кислоты (I-IV) (4.84 ммоль) в 20 мл сухого хлороформа при 0 °С добавляли по каплям за 10 мин 2,4-диметилпиррол (0.5 мл, 4.84 ммоль). Смеси давали нагреться до комнатной температуры, раствор образовавшегося дипиррометена использовали без дополнительной обработки.

К раствору дипиррометена (VI-IX), полученному на предыдущей стадии, прибавляли 2 мл триэтиламина, перемешивали 10 мин, добавляли 1.5 мл (~12 ммоль) свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора и оставляли на 4 ч при комнатной температуре. Смесь упаривали и хроматографи-ровали на силикагеле в градиенте петролейный эфир-хлористый метилен 1:0 —j- 8:2. Эфиры Ме4-ВСЮ1РУ-8-алкановых кислот (X-XIII) выделяли с выходом 23-28% в виде темно-красных аморфных соединений; контроль ТСХ: Rf 0.12-0.14 (гексан - хлористый метилен, 4:6; В), УФ (в этаноле), 498 нм {е = 8"9 • 104). Получены:

Метил-5-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил) пентаноат (XI), MALDI-MS, m/z: 362.10 [М]+, 343.06 [М - F]+. 1Н-ЯМР (CDC13): 1.26 (2Н, м, СН2), 1.66 (2Н, м, СОСН2СН2), 2.35 (2Н, м, СОСН2), 2.42 (6Н, с, ССН3), 2.51 (6Н, с, ССН3), 2.97 (2Н, т, ССН2), 3.67 (ЗН, с, ОСН3), 6.05 (2Н, с, аром.).

Метил-7-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-s-индацен-8-ил)гептаноат (XII), MALDI-MS, m/z: 390.06 [М]+, 371.00 [М - F]+; 1Н-ЯМР (CDC13): 1.39 (2Н, м, СН2), 1.49 (2Н, м, ССН2СН2 СН2), 1.65 (4Н, м, СОСН2СН2, ССН2СН2), 2.32 (2Н, т, СОСН2), 2.41 (6Н, с, ССНз), 2.51 (6Н, с, ССНЗ), 2.94 (2Н, т, ССН2), 3.67 (ЗН, с, ОСН3), 6.05 (2Н, с, аром.).

Метил-9-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)нонаноат (XIII) MALDI-MS, m/z: 418.12[М]+, 399.14 [М - F]+; 1Н-ЯМР (CDCI3): 1.25 (6Н, м, СОСН2СН2 (СН2)з), 1-48 (2Н, м, ССН2 СН2СН2), 1.62 (4Н, м, СОСН2СН2, ССН2СН2), 2.30 (2Н, м, СОСН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.51 (6Н, с, ССН3), 2.93 (2Н, т, ССН2), 3.67 (ЗН, м,

ОСН3), 6.05 (2Н, с, аром.) о;-(4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-ивдацен-8-ил)алкановые кислоты (Х1У-ХУП) готовили непосредственно перед применением. Раствор 0.128 ммоль эфира (УШ-Х) в 5 мл изопропанола перемешивали с 2 мл водного 0.1 N КОН в атмосфере аргона при ^ 20 °С, отслеживая ТСХ в системе бензол-АсОЕ^АсОН, 80:19:1, превращение метилового эфира (УШ-Х) с Rf ~0.8 в кислоту (Х1-ХШ) с Rf ~0.5. После почти полного превращения (1-2 ч) смесь нейтрализовали 2 мл 0.1 N НС1 и выпаривали досуха. Остаток экстрагировали этилацетатом, экстракт высушивали ^2804 и упаривали. Полученные с выходом 86 - 95% в аморфном виде Ме4-ВОБ1РУ-8-алкановые кислоты, индивидуальные по данным ТСХ, использовали далее без дополнительной очистки.

1-Ацил-2-[а;-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил)-ацил]-8п-глицеро-3-фосфохолины (ВЗ-,В5-,В7-,В9-РС). Растворяли 10 мг (~20 мкмоль) яичного лизофосфатидилхолина (XVIII), 50 мкмоль кислоты (ХГУ-ХУН), 9 мг (95 мкмоль) 4-амииопиридина и 14 мг (95 мкмоль) 4-пирролидинопиридина в 3 мл сухого хлороформа при интенсивном перемешивании в атмосфере аргона. Добавляли 20 мг (95 мкмоль) БСС в виде 30%-пого раствора в ССЦ, перемешивали ~1 ч и оставили на ночь при 20 °С. Из смеси хроматографией на силикагеле в системе СНС1з-МеОН, от 5:1 до 1:1, выделяли оранжево-красные стеклообразные фосфатидилхолины, выход 20-25%, В,/ 0.35-0.4 в системе СНС1з-МеОН-вода, 65:25:4 (А, Б, В); хроматографическая подвижность одинакова с подвижностью яичного фосфатидилхолина. Получены: 1-Ацил-2-[5-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-зиндацен-8-ил)пентаноил]-зп-глицеро-3-фосфохолин (В5-РС), MALDI-MS, m/z: 826.44 [M + H]+, 806.36 [М - F]+ (показаны главные пики, где ацил = пальмитоил). 1Н-ЯМР (CDCI3/CD3OD, 2:1): 0.84 (ЗН, т, СН2СН3), 1.22 (24Н, уш. м, СН2), 1.52 (2Н, м, СН2), 1.64 (2Н, м, СН2), 1.79 (2Н, м, СН2), 2.22 (2Н, т, СН2), 2.31 (2Н, т, СН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.45 (6Н, с, ССН3), 2.97 (2Н, т, ССН2), 3.16 (9Н, с, NCH3), 3.61 (2Н, м, CH2N), 4.04 (2Н, уш. м, СН2ООС), 4.10 (1Н, м, СН2ОР), 4,27 (2Н, уш. м, CH2CH2N), 4.34 (1Н, м, СН2ОР), 5.21 (1Н, м, СНООС), 6.05 (2Н, с, аром).

1-Ацил-2-[7-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)гептаноил]-зп-глицеро-3-фосфохолин (В7-РС), MALDI-MS, m/z: 854.44 [М + Н]+, 834.4 [М - F]+ (показаны главные пики, где ацил = пальмитоил). 1Н-ЯМР (CDC13/CD30D, 2:1): 0.83 (ЗН, т, СН2СН3), 1.21 (26Н, уш. м, СН2), 1.37 (2Н, м, СН2), 1.49 (2Н, м, СН2), 1.54 (2Н, м, СН2), 1.61 (4Н, м, СН2), 2.26 (2Н, т, СН2), 2.31 (2Н, т, СН2), 2.39 (6Н, с, ССН3), 2.45 (6Н, с, ССН3), 2,94 (2Н, т, ССН2), 3.17 (9Н, с, NCH3), 3.59 (2Н, м, CH2N), 4.01 (2Н, уш. м, СН2ООС), 4.11 (1Н, м, СН2ОР), 4.26 (2Н-, уш. м, CH2CH2N), 4.35 (1Н, м, СН2 ОР), 5.19 (1Н, м, СНООС), 6.18 (2Н, с, аром).

1-Ацил-2-[9-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил)нонаноил]-зп-глицеро-3-фосфохолин (В9-РС), MALDI-MS, m/z: 882.48 [М + Н]+, 862.43 [М - F]+ (показаны-главные пики, где ацил = пальмитоил). 1Н-ЯМР (CDC13/CD30D, 2:1): 0.84 (ЗН, т, СН2СН3), 1.23 (28Н, уш. м, СН2), 1.32 (4Н, уш. м, СН2) 1.48 (2Н, уш. м, СН2), 1.58 (6Н, уш. м, СН2), 2.28 (4Н, уш. м, СН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.45, (6Н, с, ССН3), 2.95 (2Н, уш. м, ССН2), 3.19 (9Н, с, NCH3), 3.64 (2Н, м, CH2N), 4.03 (2Н, уш. м, СН2ООС), 4.14 (1Н, уш. м, СН2ОР), 5.22 (1Н,уш. м, СНООС), 6.06

2Н, с, аром).

N-[7 - (4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)гептаноил]сфингозин-1-фосфохолин (B7-SM). К раствору 3.5 мг (9 мкмоль) Ме4-В0Б1РУ-гептановой кислоты (XVI) и 5 мкл триэтиламина в 0.5 мл сухого хлористого метилена и 1 мл изопропанола прибавили ВОР (5 мг), перемешивали 1 час при 20°С, затем добавили 7 мг (9 мкмоль) сфингозин-1-фосфохолина (XIX), 0.5 мл хлористого метилена и 1 мл изопропанола. Перемешивали в течение ночи в атмосфере аргона, из смеси хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-метанол, 1:0 —> 1:1, выделяли 5 мг (65%) сфингомиелина (B7-SM) в виде оранжевого стекла, Rj 0.40 в системе хлороформ-метанол 4N NH4OH, 65:35:8 (А, Б, В); хроматографическая подвижность одинакова с подвижностью сфингомиелина бычьего мозга. MALDI-MS, m/z: 823.87 [М + Н]+, 803.81 [М - F]+. 1Н-ЯМР (CDCI3/CD3OD, 2:1): 0.84 (ЗН, т, СН2СН3), 1.22 (22Н, уш. м, СН2), 1.37 (2Н, уш. м, СН2), 1.51 (2Н, уш. м, СН2), 1.62 (4Н, уш. м, СН2), 1.98 (2Н, уш. м, СН2), 2.17 (2Н, уш. м, СН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.45 (6Н, с, ССН3), 2.96 (2Н, уш. м, ССН2), 3.17 (9Н, с, NCH3), 3.59 (4Н, уш. м, СН и CH2CH2N), 4.27 (2Н, м, СНСН2ОР), 5.41 (1Н, уш. м, СН=), 5.68 (1Н, уш. м, СН=), 6.06 (2Н, с, аром.).

М-[7-(4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)гептаноил]-1-О-/3-галактозилсфингозин (B7-GC). К раствору 6.3 мг (16.7 мкмоль) Ме4-В001РУ-гептановой кислоты (XVI) и 10 мкл 1-метилимидазола в 2 мл сухого СН2С12 добавляли 8 мг ВОР (18 мкмоль), перемешивали 1.5 ч, прибавляли 8 мг (17.3 мкмоль) 1-0-/3-галактозилсфингозина (XX) и 1 мл изопропанола. Смесь перемешивали в течение ночи в атмосфере аргона, потом хроматографией на сили-кагеле в хлороформе с 5-20% метанола выделяли 7.6 мг (55%) липида (B7-GC). Аморфное оранжево-красное вещество), Rf 0.6 в системе хлороформ-МеОН АсОН, 78:20:3; вещество имеет одинаковую с природным галактозилцерамидом хроматографическую подвижность. УФ (в этаноле), 498 нм (е = 8.1 • 104). MALDI-MS m/z: 820.4 [М + Н]+, 800.42 [М - F]+. 1Н-ЯМР (CDCI3/CD3OD, 4:1): 0.81 (ЗН, т, СН2СН3), 1.18 (20Н, уш. м, СН2), 1.26 (2Н, уш. м, СН2), 1.32 (2Н, уш. м, СН2), 1.46 (2Н, уш. м, СН2), 1.57 (4Н, уш. м, СН2), 1.94 (2Н, уш. м, СН2СН=), 2.13 (2Н, т, СН2), 2.36 (6Н, с, ССН3), 2.43 (6Н, с, ССН3), 2.89 (2Н, т, ССН2), 3.45 (1Н, уш. м, СН, Gal), 3.49 (1Н, уш. м, СН, Gal), 3.51 (1Н, уш. м, СН2, Gal), 3.53 (1Н, уш. м, СН2, Gal Н-5), 3.72, 3.75 (2Н, два уш. м, С-ОСН2), 3.85 (1Н, с, СН, Gal), 3.93 (1Н, уш. м, СН), 4.03 (1Н, уш. м, CHN), 5.38 (1Н, м, СН=), 5.62 (1Н, м, СН=), 6.01 (2Н, с, аром.).

4.3. Приготовление липосом

Липосомы готовили так чтобы оптическая плотность образцов, обусловленная поглощением зондов, не превышала 0.05. Если не указано иное, концентрация зондов на основе BODIPY в образце 0.1% мольн., на основе AV - 0.5% мольн. Использовали один из способов:

А: Растворы липидов в хлороформе или в смеси хлороформ-метанол (1:1) и раствор зонда в этаноле смешивали в необходимой пропорции в пробирке или небольшой колбе. Растворитель удаляли на роторном испарителе или продувкой тока аргона. Остаток высушивали в вакууме (1-2 мм Hg, 2-3 часа). К полученной липидной пленке добавляли PBS и оставляли на ночь.

Затем каждый образец 8 раз замораживали в жидком азоте и оттаивали при перемешивании при 35°С. Полученные неоднородные по размерам мо-ноламеллярные липосомы использовали сразу после приготовления.

Б: Липидную пленку готовили как в А. К пленке добавляли PBS + 0.1% EDTA. Далее образец 5 раз замораживали в жидком азоте и оттаивали при перемешивании при 35°С. Полученную суспензию 20 раз продавливали через фильтр с размером пор 100 нм (Nucleopore, США) с помощью мини-экструдера (Avanti Polar Lipids, США). Полученные однородные мо-ноламеллярные липосомы со средним размером 100 нм хранили при +4оС и использовали в течение 5 суток.

4.4. Спектральные измерения

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-256 (Ломо-фотоника, Санкт-Петербург). Стационарные флуоресцентные измерения проводили на флуориметре F-4000 (Hitachi Ltd, Япония) в термо-статируемых кюветах 10x10. Если не указано иное, Me4-BODIPY-8 зонды возбуждали при 497 нм. Эмиссию регистрировали при 505 нм. Ширина щелей на возбуждении и испускании - 5 нм. AV-зонд возбуждали при 373 нм. Эмиссию регистрировали при 434 нм. Ширина щелей на возбуждении и испускании 5 и 10 нм соответственно. В экспериментах с липосомами поляризаторы устанавливали перпендикулярно друг-другу (Еxpoi = 0° и Етро; = 90°) для того чтобы максимально отфильтровать шум от рассеяния света липосомами. Спектр флуоресценции концентрованного раствора зонда (5% в хлороформе) снимали в трех стеклянных капиллярах (внутренний диаметр 0.5 мм), помещенных в кварцевую кювету, заполненную толуолом.

4.5. Тушение флуоресценции

4.5.1. По Штерну-Фольмеру

Зонд встраивали в липосомы по методу Б (общая концентрация ли-пидов - 0.4 мг/мл), затем последовательно добавляли к суспензии липосом 1.5 М раствор Nal, содержащий 10 тМ ЫагЯгОз в PBS. После уравновешивания системы (~40-60 минут) регистрировали интенсивность флуоресценции.

4.5.2. По методу параллакса

В качестве матричного липида использовали РОРС. Зонд и о;-йод меченные фосфолипиды I7-PC и Ill-PC встраивали в липосомы по методу А (общая концентрация липидов - 0.15 мг/мл, концентрация йод-липида 5% мольн.)

Расстояние от центра бислоя до флуорофора (ZCF) определяли по формуле:

Zcf = Lei + HnÄ/тгС - L22l}/2L2i

Здесь Fi и F2 - относительные интенсивности флуоресценции в присутствии I7-PC и Ill-PC соответственно, Lei - расстояние от центра бислоя до атома йода в I7-PC, L21 ~ расстояние между атомами йода в I7-PC и Ill-PC, С - концентрация тушителя в молекулах на единицу площади. Пояснения на рис. 1.7. Эксперименты проводили при комнатной температуре (24°С). При этой температуре бислой находится в жидкокристаллической фазе, и площадь на молекулу принимаем равной 70Ä. Тогда С = 0.05/70. Для определения расстояний Lei и L12 использовали рассчитанную с помощью молекулярной динамики модель бислоя из РОРС в жидкокристаллическом состоянии [185] (в модели площадь на молекулу была равна 70А). Для упрощения принимаем, что атомы йода в I7-PC и Ill-PC находятся там же, где находится восьмой и двенадцатый атомы углерода sn-2 ацильной цепи фосфолипида. Тогда:

La = 8.8 ± 2.3 A, L12 = 4.3 ± 2.7 А

4.6. Измерение анизотропии флуоресценции

Измерение анизотропии флуоресценции проводили в диапазоне температур от 17 до 37 °С с шагом 0.2 0.3 °С. Температуру измеряли внутри кюветы. После стабилизации показаний температуры измеряли интенсивность флуоресценции при разной ориентации поляризаторов. Экспериментальные данные зависимости анизотропии флуоресценции от температуры были сглажены с помощью стандартной процедуры.

4.7. Измерения в монослоях

Параметры поведения в мослоях зондов, индивидуальных и в смесях с другими липидами, регистрировали в атмосфере аргона на компьютеризированной Ленгмюровской установке (весах); измеряли изотермы сжатия, т.е. поверхностное давление (тг) как функцию площади в поперечном сечении на одну молекулу (А), с одновременной регистрацией интенсивности флуоресценции как функции длины волны при фиксированной величине7г. Детально процедура измерения изотерм сжатия приведена в работе [200]. Флуоресцентные измерения проводили, как описано ранее [166]. Вкратце: монослой, содержащий ВСЮ1РУ-зонд, возбуждали под углом 90° неполя-ризованным лучом аргонового лазера (488 нм); испускаемый перпендикулярно к разделу фаз свет отводили с помощью волоконного световода в монохроматор эмиссии.

3. Заключение

Получен и предложен к применению новый набор флуоресцентных фосфатидилхолиновых зондов, несущих на ацильном остатке 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ильный (Ме4-ВОБ1РУ-8) флуорофор на различном расстоянии от полярной головки; также синтезированы сфингомиелиновый и галактозилцереброзидный зонды. Зонды отличаются высокой чувствительностью и фотоустойчивостью. В малых концентрациях (до 1% мольн.) они мало нарушают упаковку мембраны.

Ме4-ВОБ1РУ-8-флуорофор зондов погружен в бислой на максимальную глубину, допускаемую несущим ацилом. Это свойство данного флуо-рофора дает возможность дифференцированно изучать с помощью полученного набора зондов структуру мембран по глубине.

Возможности такого зондирования были продемонстрированы путем регистрации анизотропии флуоресценции в больших униламеллярных везикулах (БУВ). Данные анизотропии флуоресценции зондов показали различные профили подвижности микроокружения флуорофора в БУВ различного состава при разных температурах, что свидетельствует о чувствительности полученного набора зондов как инструмента исследования мембранных систем.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Болдырев, Иван Александрович, 2008 год

1. Jensen М., Mouritsen O.G. Lipids do influence protein function: the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochim. Biophys. Acta., 1666:205-226, 2004.

2. Senisterra G., Epand R.M. Role of membrane defects in the regulation of the activity of protein kinase C. Arch. Biochem. Biophys., 300:378-383, 1993.

3. Stubbs C.D., Slater S.J. The effects of non-lamellar forming lipids on membrane protein-lipid interactions. Chem. Phys. Lipids, 81:185-95, 1996.

4. Cornell R.B., Arnold R.S. Modulation of the activities of enzymes of membrane lipid metabolism by non-bilayer-forming lipids. Chem. Phys. Lipids, 81:215-227, 1996.

5. Attard G.S., Templer R.H., Smith W.S., Hunt A.N., Jackowski S. Modulation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase by membrane curvature elastic stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:9032-9036, 2000.

6. Li L., Storm P., Karlsson O.P., Berg S., Wieslander A. Irreversible binding and activity control of the 1,2-diacylglycerol 3-glucosyltransferase from acholeplasma laidlawii at an anionic lipid bilayer surface. Biochemistry, 42:9677-86, 2003.

7. Karlsson O.P., Rytomaa M., Dahlqvist A., Kinnunen P.K., Wieslander A. Correlation between bilayer lipid dynamics and activity of the diglucosyldiacylglycerol synthase from Acholeplasma laidlawii membranes. Biochemistry, 35:10094-102, 1996.

8. Schwarz D., Kisselev P., Pfeil W., Pisch S., Bornscheuer U., Schmid R.D. Evidence that nonbilayer phase propensity of the membrane is important for the side chain cleavage activity of cytochrome P450SCC. Biochemistry, 36:14262-70, 1997.

9. Botelho A.V., Gibson N.J., Thurmond R.L., Wang Y., Brown M.F. Conformational energetics of rhodopsin modulated by nonlamellar-forming lipids. Biochemistry, 41:6354-6368, 2002.

10. Brown M.S., Goldstein J.L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell, 89:331-40, 1997.

11. Brown A.J., Sun L., Feramisco J.D., Brown M.S., Goldstein J.L. Cholesterol addition to ER membranes alters conformation of SCAP, the SREBP escort protein that regulates cholesterol metabolism. Mol. Cell, 10:237-45, 2002.

12. Streicher-Scott J., Lapidus R., Sokolove P.M. The reconstituted mitochondrial adenine nucleotide translocator: effects of lipid polymorphism. Arch Biochem Biophys, 315:548-54, 1994.

13. Van der Heide T., Poolman B. Osmoregulated ABC-transport system of Lactococcus lactis senses water stress via changes in the physical state of the membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:7102-6, 2000.

14. Van der Heide T., Stuart M.C., Poolman B. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J., 20:7022-32, 2001.

15. Yang F.Y., Hwang F. Effect of non-bilayer lipids on the activity of membrane enzymes. Chem. Phys. Lipids, 81:197-202, 1996.

16. Chang H.M., Reitstetter R., Gruener R. Lipid-ion channel interactions: increasing phospholipid headgroup size but not ordering acyl chains alters reconstituted channel behavior. J. Membr. Biol., 145:13-9, 1995.

17. Perozo E., Kloda A., Cortes D.M., Martinac B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat. Struct. Biol., 9:696-703, 2002.

18. Keller S.L., Bezrukov S.M., Gruner S.M., Tate M.W., Vodyanoy I., Parsegian V.A. Probability of alamethicin conductance states varies with nonlamellar tendency of bilayer phospholipids. Biophys. J., 65:23-27, 1993.

19. Lundbaek J.A., Maer A.M., Andersen O.S. Lipid bilayer electrostatic energy curvature stress and assembly of gramicidin channels. Biochemistry, 36:5695-5701, 1997.

20. Rao N.M., Sundaram C.S. Sensitivity of phospholipase C (Bacillus cereus) activity to lipid packing in sonicated lipid mixtures. Biochemistry, 32:8547-52, 1993.

21. Pilot J.D., East J.M., Lee A.G. Effects of phospholipid headgroup and phase on the activity of diacylglycerol kinase of escherichia coli. Biochemistry, 40:14891-7, 2001.

22. Curran A.R., Templer R.H., Booth P.J. Modulation of folding and assembly of the membrane protein bacteriorhodopsin by intermolecular forces within the lipid bilayer. Biochemistry, 38:9328-36, 1999.

23. Bogdanov M., Dowhan W. Phospholipid-assisted protein folding: phosphatidylethanolamine is required at a late step of the conformational maturation of the poly topic membrane protein lactose permease. EMBO J., 17:5255-64, 1998.

24. Bogdanov M., Umeda M., Dowhan W. Phospholipid-assisted refolding of an integral membrane protein, minimum structural features for phosphatidylethanolamine to act as a molecular chaperone. J. Biol. Chem., 274:12339-45, 1999.

25. Maier O., Oberle V., Hoekstra D. Fluorescent lipid probes: some properties and applications (a review). Chem. Phys. Lipids, 116:3-18, 2002.

26. London., E. How principles of domain formation in model membranes may explain ambiguities concerning lipid raft formation in cells. Biochim. Biophys. Acta., 1746:203-20, 2005.

27. Munro S. Lipid rafts: elusive or illusive? Cell, 115:377-88, 2003.

28. Shaw A.S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nature Immunol., 7:1139-1142, 2006.

29. Haverstick D.M., Glaser M. Visualization of Ca2+-induced phospholipid domains. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:4475-4479, 1987.

30. Haverstick D.M., Glaser M. Visualization of domain formation in the inner and outer leaflets of a phospholipid bilayer. J. Cell Biol., 106:1885-1892, 1988.

31. Veateh S.L., Keller S.L. Miscibility phase diagrams of giant vesicles containing sphingomyelin. Phys. Rev. Lett., 94:148101, 2005.

32. Serna J.B., Perez-Gil J., Simonsen A.C., Bagatolli L.A. Cholesterol rules: direct observation of the coexistence of two fluid phases in native pulmonary surfactant membranes at physiological temperatures. J. Biol. Chem., 279:40715-40722, 2004.

33. Veatch S.L., Keller S.L. Separation of liquid phases in giant vesicles of ternary mixtures of phospholipids and cholesterol. Biophys. J., 85:30743083, 2003.

34. Kahya N., Scherfeld D., Bacia K., Poolman B., Schwille P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem., 278:28109-28115, 2003.

35. Veatch S.L., Keller S.L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Phys. Rev. Lett., 89:268101, 2002.

36. Nag K., Pao J.S., Harbottle R.R., Possmayer F., Petersen N.O., Bagatolli L.A. Segregation of saturated chain lipids in pulmonary surfactant films and bilayers. Biophys. J., 82:2041-2051, 2002.

37. Feigenson G.W., Buboltz J.T.,. Ternary phase diagram of dipalmitoyl-PC/ dilauroyl-PC/cholesterol: nanoscopic domain formation driven by cholesterol. Biophys. J.: 80:2775-2788, 2001.

38. Dietrich C., Bagatolli L.A., Volovyk Z.N., Thompson N.L., Levi M., Jacobson K., Gratton E. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys. J., 80:1417-1428, 2001.

39. Bagatolli L.A., Gratton E. A correlation between lipid domain shape and binary phospholipid mixture composition in free standing bilayers: a twophoton fluorescence microscopy study. Biophys. J., 79:434-447, 2000.

40. Bagatolli L.A., Gratton E. Two photon fluorescence microscopy of coexisting lipid domains in giant unilamellar vesicles of binary phospholipid mixtures. Biophys. J., 78:290-305, 2000.

41. Bagatolli L.A., Gratton E., Khan T.K., Chong P.L. Two-photon fluorescence microscopy studies of bipolar tetraether giant liposomes from thermoacidophilic archaebacteria sulfolobus acidocaldarius. Biophys. J., 79:416-425, 2000.

42. Bagatolli L.A., Gratton E. Two-photon fluorescence microscopy observation of shape changes at the phase transition in phospholipid giant unilamellar vesicles. Biophys. J., 77:2090-2101, 1999.

43. Korlach J., Schwille P., Webb W.W., Feigenson G.W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:8461-8466, 1999.

44. Parasassi T., Gratton E., Yu W.M., Wilson P., Levi M. Two-photon fluorescence microscopy of laurdan generalized polarization domains in model and natural membranes. Biophys. J., 72:2413-2429, 1997.

45. Veatch S.L., Keller S.L. Seeing spots: complex phase behavior in simple membranes. Biochim. Biophys. Acta., 1746:172-185, 2005.

46. Bagatolli L.A., Gratton E. Direct observation of lipid domains in free standing bilayers using two-photon excitation fluorescence microscopy. J. Fluorescence, 11:141-160, 2001.

47. Bagatolli L.A., Sanchez S.A., Hazlett T., Gratton E. Giant vesicles laurdan and two-photon fluorescence microscopy: evidence of lipid lateral separation in bilayers. Methods Enzymol, 360:481-500, 2003.

48. Bagatolli L.A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim. Biophys. Acta., 1758:1541-56, 2006.

49. Kahya N., Brown D.A., Schwille P. Raft partitioning and dynamic behavior of human placental alkaline phosphatase in giant unilamellar vesicles. Biochemistry, 44:7479-7489, 2005.

50. Kahya N., Scherfeld D., Schwille P. Differential lipid packing abilities and dynamics in giant unilamellar vesicles composed of short-chain saturated glycerol-phospholipids sphingomyelin and cholesterol. Chem. Phys. Lipids, 135:169-180, 2005.

51. Bacia K., Schuette C.G., Kahya N., Jahn R., Schwille R SNAREs prefer liquid-disordered over "raft"(liquid-ordered) domains when reconstituted into giant unilamellar vesicles. J. Biol. Chem., 279:37951-55, 2004.

52. Scherfeld D., Kahya N., Schwille P. Lipid dynamics and domain formation in model membranes composed of ternary mixtures of unsaturated and saturated phosphatidylcholines and cholesterol. Biophys. J., 85:37583768, 2003.

53. Baumgart T., Hess S.T., Webb W.W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature, 425:821-824, 2003.

54. De Vequi-Suplicy C.C., Benatti C.R., Lamy M.T. Laurdan in fluid bilayers: Position and structural sensitivity. J. Fluorescence, 16:431-439, 2006.

55. Jones M.E., Lentz B.R. Phospholipid lateral organization in synthetic membranes as monitored by pyrene-labeled phospholipids: effects of temperature and prothrombin fragment 1 binding. Biochemistry, 25:567574, 1986.

56. Garda H.A., Bernasconi A.M., Brenner R.R. Possible compensation of structural and viscotropic properties in hepatic microsomes and erythrocyte membranes of rats with essential fatty acid deficiency. J. Lipid Res, 35:1367-1377, 1994.

57. Lentz B.R., Barenholz Y., Thompson T.E. Fluorescence depolarization studies of phase transitions and fluidity in phospholipid bilayers. 2twocomponent phosphatidylcholine liposomes. Biochemistry, 15:45294537, 1976.

58. Lentz B.R., Barenholz Y., Thompson T.E. Fluorescence depolarization studies of phase transitions and fluidity in phospholipid bilayers. 1. single component phosphatidylcholine liposomes. Biochemistry, 15:4521-4528, 1976.

59. Lentz B.R. Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions within liposome bilayers. Chem. Phys. Lipids, 64:99-116, 1993.

60. Parasassi T., Conti F., Glaser M., Gratton E. Detection of phospholipid phase separation, a multifrequency phase fluorimetry study of 16-diphenyl-135-hexatriene fluorescence. J. Biol Chem., 259:14011-14017, 1984.

61. Wolber P.K., Hudson B.S. Fluorescence lifetime and time-resolved polarization anisotropy studies of acyl chain order and dynamics in lipid bilayers. Biochemistry, 20:2800-2810, 1981.

62. Mateo C.R., Lillo M.P., Gonzalez-Rodriguez J., Acuna A.U. Lateral heterogeneity in human platelet plasma membrane and lipids from the time-resolved fluorescence of trans-parinaric acid. Eur. Biophys. J., 20:5359, 1991.

63. Velez M., Lillo M.P., Acuna A.U., Gonzalez-Rodriguez J. Cholesterol effect on the physical state of lipid multibilayers from the platelet plasma membrane by time-resolved fluorescence. Biochim. Biophys. Acta., 1235:343-350, 1995.

64. Bagatolli L.A., Maggio B., Aguilar F., Sotomayor C.P., Fidelio G.D. Laurdan properties in glycosphingolipid phospholipid mixtures: a comparative fluorescence and calorimetric study. Biochim. Biophys. Acta., 1325:80-90, 1997.

65. Bagatolli L.A., Parasassi T., Fidelio G.D., Gratton E. A model for the interaction of 6-lauroyl-2-(NN-dimethylamino)naphthalene with lipid environments: implications for spectral properties. Photochem. Photobiol, 70:557-564, 1999.

66. Parasassi T., Conti F., Gratton E. Time-resolved fluorescence emission spectra of Laurdan in phospholipid vesicles by multifrequency phase and modulation fluorometry. Cell Mol Biol, 32:103-108, 1986.

67. Parasassi T., Stasio G., Ravagnan R., Rusch R.M., Gratton E. Quantitation of lipid phases in phospholipid vesicles by the generalized polarization of laurdan fluorescence. Biophys. J., 60:179-189, 1991.

68. Parasassi T., Stefano M.D., Loiero M., Ravagnan G., Gratton E. Influence "of cholesterol on phospholipid bilayers phase domains as detected by laurdan fluorescence. Biophys. J., 66:120-132, 1994.

69. Krasnowska E.K., Gratton E., Parasassi T. Prodan as a membrane surface fluorescence probe: partitioning between water and phospholipid phases. Biophys. J., 74:1984-1993, 1998.

70. Krasnowska E.K., Bagatolli L.A., Gratton E., Parasassi T. Surface properties of cholesterol-containing membranes detected by prodan fluorescence. Biochim. Biophys. Acta., 1511:330-340, 2001.

71. Ipsen J.H., Mouritsen O.G., Zuckermann M.J. Theory of thermal anomalies in the specific heat of lipid bilayers containing cholesterol. Biophys. J., 56:661-7, 1989.

72. Harris F.M., Best K.B., Bell J.D. Use of laurdan fluorescence intensity and polarization to distinguish between changes in membrane fluidity and phospholipid order. Biochim. Biophys. Acta., 1565:123-8, 2002.

73. Zhang Y., Frangos J., Chachisvilis M. Laurdan fluorescence senses mechanical strain in the lipid bilayer membrane. Biochem. Biophys. Res. Com, 347:838-841, 2006.

74. Anderson R., Jacobson K. A role for lipid shells in targeting proteins to caveolae, rafts, and other lipid domains. Science, 296:1821-5, 2002.

75. Bellve K.D., Leonard D., Standley C., Lifshitz L.M., Tuft R.A., Hayakawa A., Corvera S., Fogarty K.E. Plasma membrane domains specialized for clathrin-mediated endocytosis in primary cells. J. Biol. Chem., 281:1613946, 2006.

76. Chen Y., Lagerholm B.C., Yang B., Jacobson K. Methods to measure the lateral diffusion of membrane lipids and proteins. Methods, 39:147-53, 2006.

77. Nenasheva T.A., Mashanov G.I. Visualizing single fluorophores in live cells. Biofizika, 51:454-65, 2006.

78. Mashanov G.I., Nenasheva T.A., Peckham M., Molloy J.E. Cell biochemistry studied by single-molecule imaging. Biochem. Soc. Trans., 34:983-8, 2006.

79. Pucadyil T.J., Chattopadhyay A. Effect of cholesterol on lateral diffusion of fluorescent lipid probes in native hippocampal membranes. Chem. Phys. Lipids, 143:11-21, 2006.

80. Przybylo M., Sykora J., Humpolickova J., Benda A., Zan A., Hof M. Lipid diffusion in giant unilamellar vesicles is more than 2 times faster than in supported phospholipid bilayers under identical conditions. Langmuir, 22:9096-9, 2006.

81. White S.H., Ladokhin A.S., Jayasinghe S., Hristova K. How membranes shape protein structure. J. Biol Chem., 276:32395-8, 2001.

82. Tristram-Nagle S., Nagle J.F. Lipid bilayers: thermodynamics, structure, fluctuations, and interactions. Chem. Phys. Lipids, 127:3-14, 2004.

83. Seddon J.M., Templer R.H. Polymorphysm of lipid-water systems in: R.Lipowski and E. Sackmann (Eds.) Handbook of biological physics. Elsevier science B.V., 1995.

84. Cantor R.S. Lateral pressure in cell membranes: a mechanism for modulation of protein function. J. Phys. Chem. B, 101:1723-1725, 1997.

85. Marsh D. Lateral pressure in membranes. Biochim. Biophys. Acta., 1286:183-223, 1996.

86. Epand R.M. Lipid polymorhysm and proteun-lipid interactions. Biochim. Biophys. Acta., 1376:353-368, 1998.

87. Gawrisch K, Holte L.L. NMR investigations of non-lamellar phase promoters in the lamellar phase state. Chem. Phys. Lipids, 81:105-116, 1996.

88. Templer R.H., Castle S.J., Curran A.R., Rumbles G., Klug D.R. Sensing isothermal changes in lateral pressure ■ in model membranes using di-pyrenyl phosphatidylcholine. Faraday Discuss, 111:41-53 discussion (6978), 1998.

89. Laan E.B., Dalbey R.E., Demel R.A., Killian J.A., Kruijff B. Effect of nonbilayer lipids on membrane binding and insertion of the catalityc domain of leader peptidase. Biochemistry, 40:9677-9684, 2001.

90. Cantor R.S. Lipid composition and lateral pressure profile in bilayers. Biophys. J., 76:2625-2639, 1999.

91. Cantor R.S. Size distribution of barrel-stave aggregates of membrane peptides: influence of the bilayer lateral pressure profile. Biophys. J., 82:2520-2525, 2002.

92. Harries D., Ben-Shaul A. Conformational chain statistics in a model lipid bilayer: comparison between mean field and Monte Carlo calculations. J. Chem. Phys., 106:1609-1619, 1997.

93. Venturoli M., Smith B. Simulating the self assembly of model membranes. Phys. Chem. Comm., 10, 1999.

94. Lindahl E., Endholm O. Spatial and energetic-entropic decomposition of surface tension in a lipid bilayer by molecular dynamics simulations. J. Chem. Phys., 113:3882-3893, 2000.

95. Gullingsrud J., Shulten K. Gating of MscL studied by steered molecular dynamics. Biophys. J., 85:2087-2099, 2003.

96. Cantor R.S. The lateral pressure profile in membranes: a physical mechanism of general anesthesia. Toxicol. Lett., 100:451-458, 1998.

97. Cantor R.S. The influence of membrane lateral preddures on simple geometric models of protein comformational equilibria. Chem. Phys. Lipids, 101:45-56, 1999.

98. Cantor R.S. Solute modulation of conformational equlibria in intrinsic membrane proteins: apparent. Biophys. J., 77:2643-2647, 1999.

99. Szleifer I.I., Ben-Shaul A., Gelbart W.M. Chain packing statistics and thermodynaics of amphiphile monolayers. J. Phys. Chem. B, 94:50815089, 1990.

100. Kruijff B. Lipids beyond the bilayer. Nature, 386:129-130, 1997.

101. Kruijff B. Lipid polymorphism and biomembrane function. Curr. Opin. Chem. Biol., 1:564-569, 1997.

102. Bezrukov S.M. Functional consequences of lipid packing stress. Curr. Opin. Colloid Iterface Sci, 5:237-243, 2000.

103. Cullis P.R., Hope M.J., Tilcock C.P. Lipid polymorphism and the roles of lipid in membranes. Chem. Phys. Lipids, 40:127-144, 1986.

104. Marsh D., Watts A., Smith I.C. Dynamic structure and phase behavior of dimyristoylphosphatidylethanolamine bilayers studied by deuterium nuclear magnetic resonance. Biochemistry, 22:3023-3026, 1983.

105. Perly B., Smith I.C., Jarrell H.C. Effects of replacement of double bond by a cyclopropane ring in phosphatidylethanolamines:a 2H NMR studyof phase transitions and molecular organisation. Biochemistry, 24:10551064, 1985.

106. Cantor R.S. The lateral pressure profile in membranes: a physical mechanism of general anesthesia. Biochemistry, 36:2339-2344, 1997.

107. Buck M. Trifluoroethanol and colleagues: cosolvent come of age. resent studies with peptides and proteins. Q. Rev. Biophys31:297-355, 1998.

108. Hamada D., Chiti F., Guijarro J.I., Kataoka M., Taddei. N., Dobson C.M. Evidence concerning rate-limiting steps in protein folding from effects of trifluoroethanol. Nat. Struct. Biol, 7:58-61, 2000.

109. Yiu C.P., Mateu M.G., Fersht A.R. Protein folding transition states: elicitation of hammond effects by 2,2,2-trifluoroethanol. Chembiochem., 1:49-55, 2000.

110. Cheng K.H., Ruymgaart L., Liu L.I., Somerharju P., Sugar LP. Intramolecular excimer kinetics of fluorescent dipyrenyl lipids: 1. DMPC/cholesterol membranes. Biophys. J., 67:902-913, 1994.

111. Cheng K.H., Ruymgaart L., Liu L.I., Somerharju P., Sugar I.P. Intramolecular excimer kinetics of fluorescent dipyrenyl lipids: 2. DOPE/DOPC membranes. Biophys. J., 67:914-921, 1994.

112. Cheng K.H., Somerharju P. Effects of unsaturation and curvature on the transverse distribution of intramolecular dynamics of dipyrenyl lipids. Biophys. J., 70:2287-2298, 1996.

113. Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectoscopy 2nd edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, 1999.

114. Blatt E., Sawyer W. Depth-dependent fluorescent quenching in micelles and membranes. Biochim. Biophys. Acta., 822:43-62, 1985.

115. Thulborn K.R., Sawyer W.H. Properties and the locations of a set of fluorescent probes sensitive to the fluidity gradient of the lipid bilayer. Biochim. Biophys. Acta., 511:125-140, 1978.

116. Moro F., Goni F.M., Urbaneja M.A. Fluorescence quenching at interfaces and the permeation of acrylamide and iodide across phospholipid bilayers. FEBS Lett., 330:129-32, 1993.

117. Bartlett D., Glaser M., Welti R. Membrane penetration depth and lipid phase preference of acyl-labeled dansyl phosphatidylcholines in phosphatidylcholine vesicles. Biochim. Biophys. Acta., 1328:48-54, 1997.

118. Chattopadhyay A., London E. Spectroscopic and ionization properties of n-(7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-yl)-labeled lipids in model membranes. Biochim. Biophys. Acta., 938:24-34, 1988.

119. Huster D., Muller P., Arnold K., Herrmann A. Dynamics of lipid chain attached fluorophore 7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-yl (NBD) in negatively charged membranes determined by NMR spectroscopy. Eur. Biophys. J., 32:47-54, 2003.

120. Johnson I.D., Kang H.C., Haugland R.P. Fluorescent membrane probes incorporating dipyrrometheneboron difluoride fluorophores. Anal. Biochem., 198:228-237, 1991.

121. Davenport L., Shen B., Joseph T.W., Straher M.P. A novel fluorescent coronenyl-phospholipid analogue for investigations of submicrosecond lipid fluctuations. Chem. Phys. Lipids, 109:145-56, 2001.

122. Chalpin D.B., Kleinfeld A.M. Interactions of fluorescence quenchers with the n-(9-anthroyloxy) fatty acid membrane probes. Biochim. Biophys. Acta., 731:465-474, 1983.

123. Cranney M., Cundall R.B., Jones G.R., Richards J.T., Thomas B.W. Fluorescence lifetime and quenching studies on some interesting diphenylhexatriene membrane probes. Biochim. Biophys. Acta., 735:418425, 1983.

124. Langner M., Hui S. Iodide penetration into lipid bilayer as a probe of membrane lipid organization. Chem. Phys. Lipids, 60:127-132, 1991.

125. Luisetti J., Mohwald H., Galla H.J. Monitoring the location profile of fluorophores in phosphatidylcholine bilayers by the use or paramagnetic quenching. Biochim. Biophys. Acta., 552:519-30, 1979.

126. Constantinides P.P., Wang Y.Y., Burke T.G., Tritton T.R. Transverse location of anthracyclines in lipid bilayers. paramagnetic quenching studies. Biophys Chem, 35:259-64, 1990.

127. Lala A.K., Koppaka V. Transverse location of new fluorene based depth dependent fluorescent probes in membranes-quenching studies with 9,10-dibromostearic acid. Photochem. Photobiol., 49:763-7, 1989.

128. London E., Feigenson G.W. Fluorescence quenching in model membranes. 1. characterization of quenching caused by a spin-labeled phospholipid. Biochemistry, 20:1932-8, 1981.

129. Chattopadhyay A., London E. Parallax method for direct measurement of membrane penetration depth utilizing fluorescence quenching by spinlabeled phospholipids. Biochemistry, 26:39-45, 1987.

130. Kaiser R.D., London E. Determination of the depth of bodipy probes in model membranes by parallax analysis of fluorescence quenching. Biochim. Biophys. Acta., 1375:13-22, 1998.

131. Kachel K., Asuncion-Punzalan E., London E. The location of fluorescence probes with charged groups in model membranes. Biochim. Biophys. Acta., 1374:63-76, 1998.

132. Cadenhead D.A., Kellner B.M.J., Miller-Landau F. A comparison of a spin-label and a fluorescent cell membrane probe using pure and mixed monomolecular films. Biochim. Biophys. Acta., 382:253-259, 1975.

133. Lee T.D., Birrell G.B., Keana J.F.W. A new series of minimum steric perturbation nitroxide lipid spin probes. J. Am. Chem. Soc., 100:16181619, 1978.

134. Vogel A., Scheidt H.A., Huster D. The distribution of lipid attached spin probes in bilayers: application to membrane protein topology. Biophys. X, 85:1691-1701, 2003.

135. Ladokhin A.S. Distribution analysis of depth-dependent fluorescence quenching in membranes: a practical guide. Methods Enzymol., 278:46273, 1997.

136. Barenholz Y., Cohen T., Korenstein R., Ottolenghi M. Organization and dynamics of pyrene and pyrene lipids in intact lipid bilayers. photo-induced charge transfer processes. Biophys. J., 59:110-124, 1991.

137. Koppel D.E., Fleming P.J., Strittmatter P. Intramembrane positions of membrane-bound chromophores determined by excitation energy transfer. Biochemistry, 18:5450-7, 1979.

138. Davenport L., Dale R.E., Bisby R.H., Cundall R.B. Transverse location of the fluorescent probe l,6-diphenyl-l,3,5-hexatriene in model lipid bilayer membrane systems by resonance excitation energy transfer. Biochemistry, 24:4097-108, 1985.

139. Podo F., Blasie J.K. Nuclear magnetic resonance studies of lecithin bimolecular leaflets with incorporated fluorescent probes. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 74:1032-6, 1977.

140. Molotkovsky J.G., Manevich Y.M., Babak V.I., Bergelson L.D. Perylenoyl- and anthrylvinyl-labeled lipids as membrane probes. Biochim. Biophys. Acta., 778:281-288, 1984.

141. Hoff B., Strandberg E., Ulrich A.S., Tieleman D.P., Posten C. 2H-NMR study and molecular dynamics simulation of the location, alignment, and mobility of pyrene in POPC bilayers. Biophys. J., 88:1818-27, 2005.

142. Jose J., Burgess K. Benzophenoxazine-based fluorescent dyes for labeling biomolecules. Tetrahedron, 62:11021-11037, 2006.

143. Treibs A., Haberle H. Concerning the synthesis and the electron spectrum of ms-substituted porphine. Liebigs Ann. Chem., 718:183-207, 1968.

144. Karolin J., Johansson L.B.-A., Strandberg L., Ny T. Fluorescence and absorption spectroscopic properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) derivatives in liquids lipid membranes and proteins. J. Am. Chem. Soc., 116:7801-7806, 1994.

145. Ulrich G., Ziessel R. Convenient and efficient synthesis of functionalized . oligopyridine ligands bearing accessory pyrromethene-BF2 fluorophores. J. Org. Chem., 69:2070-83, 2004.

146. Meltola N.J., Wahlroos R., Soini A.E. Hydrophilic labeling reagents of dipyrrylmethene-BF2 dyes for two-photon excited fluorometry: syntheses and photophysical characterization. J. Fluorescence, 14:635-47, 2004.155. www.invitrogen.com.

147. Rosenwald A.G., Pagano R.E. Intracellular transport of ceramide and its metabolites at the golgi complex: insights from short-chain analogs. Adv. Lipid Res., 26:101-118, 1993.

148. Bergstrom F., Hagglof P., Karolin J., Ny Т., Johansson L.B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:12477-81, 1999.

149. Lala A.K. Fluorescent and photoactivable probes in depth-dependent analysis of membranes. Chem. Phys. Lipids, 116:177-88, 2002.

150. Newton B.F. Site of action of polymixin on pseudomonas aeruginosa: antagonism by cations. J. Gen. Microbiol., 10:491-499, 1954.

151. Молотковский Ю.Г. Флуоресцентные липидные зонды: свойства и применение. Биоорган, химия, 25:855-867, 1999.

152. Birks J.B. Photophysical processes. In Photophysics of aromatic molecules. Willey-Interscience, 1970.

153. Birks J.B. Eximers. Rep. Prog. Phys, 38:903-974, 1975.

154. Birks J.B. The photophysics of aromatic eximers. In The Exiplex. Academic press, 1975.

155. Pagano R.E., Chen C.S.,. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Ann. N. Y. Acad. Sci., 845:152-160, 1998.

156. Dahim M.N., Mizuno X.M., Momsen W.E., Momsen M.M., Brockman H.L. Physical and photophysical characterization of a BODIPY phisphatidylcholine as a membrane probe. Biophys. J., 83:1511-1524, 2002.

157. Bergstrom F., Mikhalyov I., Hagglof P., Wortmann R., Ny T., Johansson L.B. Dimers of dipyrrometheneboron (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc., 124:196-204, 2002.

158. Mikhalyov I., Gretskaya N., Bergstrom F., Johansson L. Electronic ground and exited state properties of dipyrromethenboron difluoride (BODIPY) dimers with application to biosciences. Phys. Chem. Chem. Phys., 4:56635670, 2002.

159. Burghardt T.P., Lyke J.E., Ajtai K. Fluorescence emission and anisotropy from rhodamine dimmers. Biophys. Chem., 59:119-131, 1996.

160. Kubista M., Sjoback R., Eriksson S. Experimental correction for the innerfilter effect in fluorescence spectra. Analyst, 119:417-419, 1994.

161. Matsuzaki K., Murase O., Sugishita K., Yoneyama S., Akada K., Ueha M., Nakamura A., Kobayashi S. Optical characterisation of liposomes byv right angle light scattering and turbidity measurments. Biochim. Biophys.

162. Acta., 1467:219-226, 2000.

163. White G., Pencer J., Nickel B.G., Wood J.M., Hallett F.R. Optical changes in unilamellar visicles experiencing osmotic stress. Biophys. J., 71:27012715, 1996.

164. Holland J.F., Teets R.E., Kelly P.M., Timnick A. Correction of right-angel fluorescence measurements for the absorption of excitation radiation. Anal Chem., 49:706-710, 1977.

165. Yappert M.C., Ingle J.D. Correction of polycromatic luminescence signals for inner-filter effects. Appl. Spectrosc., 43:759-767, 1989.

166. Christman D.R., Crouch S.R., Timnick A. Precision and accuracy of absorption-corrected molecular fluorescence measurements by the cell shift method. Anal Chem., 53:2040-2044, 1981.

167. Riesz J., Gilmore J., Meredith P. Quantitative photoluminescence of broad band absorbing melanins: a procedure to correct for inner filter and reabsorption effects. Spectrochim Acta A, 61:2153-60, 2005.

168. Borissevitch I.E. More about the inner-filter effect: corrections of SternVolmer fluorescence quenching constants are necessary at very low optical absorbtion of the quencher. J. Luminescence, 81:219-224, 1999.

169. Subbarao N.K., MacDonald R.C. Experimental method to correct fluorescence intensities for the inner filter effect. Analyst, 118:913-916, 1993.

170. Marsh D. Membrane water-penetration profiles from spin labels. Eur. Biophys. J., 31:559-562, 2002.

171. Sankaram M.B., Thompson T.E. "Modulation of phospholipids acyl chain order by cholesterol. A solid-state 2H Nuclear magnetic resonance study. Biochemistry, 29:10676-10684, 1990.

172. Lagane B., Mazeres S., Grimellec C., Cezanne L., Lopez A. Lateral distribution of cholesterol in membranes probed by means of a pyrene-labelled cholesterol: effect of acyl chain unsaturation. Biophys. Chem, 95:7-22, 2002.

173. Bergelson L.D., Molotkovsky J.G., Manevich Y.M. Lipid-specific probes in studies of biological membranes. Chem. Phys. Lipids, 37:165-195, 1985.

174. Menger F.M., Keiper J.S., Caran K.L. Depth-profiling with giant vesicle membranes. J. Am. Chem. Soc., 116:7801-7806, 2002.

175. Eftink M.R., Ghiron C.A. Fluorescence quenching studies with proteins. Anal Biochem., 114:199-227, 1981.

176. Heller H., Schaefer M., Schulten K. Molecular dynamics simulation of a bilayer of 200 lipids in the gel and in the liquid-crystal phases. J. Phys. Chem. B, 97:8343-8360, 1993.

177. Smaby J.M., Momsen M.M., Brockman H.L., Brown R.E. Phosphatidylcholine acyl unsaturation modulates the decrease in interfacial elasticity induced by cholesterol. Biophys. J., 73:1492-1505, 1997.

178. Thulborn K.R., Tilley L.M., Sawyer W.H., Treloar F.E. The use of n-(9-anthroyloxy) fatty acids to determine fluidity and polarity gradients in phospholipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta., 558:166-78, 1979.

179. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175:720-31, 1972.

180. Shinitzky M., Dianoux A.C., Gitler C., Weber G. Microviscosity and order in the hydrocarbon region of micelles and membranes determined with fluorescent probes. I. Synthetic micelles. Biochemistry, 10:2106-13, 1971.

181. Cullis P.R., Fenske D.B., Hope M.J. Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes. New York: Elsevier Science B.V., 1996.

182. Villalain J. Location of cholesterol in model membranes by magic-angle-sample-spinning nmr. Eur. J. Biochem., 241:586-593, 1996.

183. Mcintosh T.J. Structure and the physical properties of the lipid membrane. Current topics membr., 48:23-47, 1999.

184. Tilley L., Thulborn K.R., Sawyer W.H. An assessment of the fluidity gradient of the lipid bilayer as determined by a set of n-(9-anthroyloxy) fatty acids (n 2, 6, 9, 12, 16). J. Biol. Chem., 254:2592-2594, 1979.

185. Xu H., Huang C. Scanning calorimetric study of fully hydrated asymmetric phosphatidylcholines with one acyl chain twice as long as the other. Biochemistry, 26:1036-1043, 1987.

186. Lala A.K., Dixit R.R., Koppaka V. Depth-dependent photolabelling ofmembrane hydrophobic core with 9-diazofluorene-2-butyric acid. Biochim. Biophys. Acta., 978:333-336, 1989.

187. Hutterer R., Schneider F.W., Hof M. Anisotropy and lifetime profiles for n-anthroyloxy fatty acids: a fluorescence method for the detection of bilayer interdigitation. Chem. Phys. Lipids, 86:51-64, 1997.

188. Молотковский Ю.Г., Дмитриев П.И., Никулина Л.Ф., Бергельсон Л.Д. Синтез новых флуоресцентномеченых фосфатидилхолинов. Биоорган. химия, 5:588-594, 1979.

189. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В. Препаративная биохимия липи-дов. М.: Наука, 1981.

190. Durham L.J., McLeod D.J., Cason J. Methyl hydrogen hendecanedioate. Org. syntheses, 38:55-56, 1958.

191. Momsen W.E., Smaby J.M., Brockman H.L. The suitability of nichrome for measurement of gas-liquid interfacial tension by the wilhelmy method. J. Colloid Interface Sci., 135:547-552, 1990.