Разработка методов очистки белков адсорбционной хроматографией на ионообменниках на примере пероксидазы хрена и лизостафина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Смотров, Олег Игоревич
- Специальность ВАК РФ03.02.03
- Количество страниц 123
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смотров, Олег Игоревич
Введение
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1Л. Физико-химические основы очистки белков
1ЛЛ. Осаждение белков солями и органическими растворителями
1.1.2. Хроматографическое разделение белков
1.1.2.1. Ионный обмен
1.1.2.2. Аффинное взаимодействие
1.1.2.3. Ковалентная аффинная хроматография
1.1.2.4. Гидрофобная хроматография
1.1.2.5. Металлохелатная хроматография
1.1.2.6. Хроматография на триазиновых красителях
1.1.2.7. Адсорбционное взаимодействие
1.1.2.8. Гель-фильтрация
1.1.2.9. Жидкофазное распределение белков
1.1.2.10. Ультрафильтрация и диализ
1.2. Лизостафин. Получение, свойства, применение
1.2.1. Открытие лизостафина и других глицилглициновых протеаз
1.2.2. Биосинтез и генетический контроль лизостафина
1.2.3. Лизостафинрезистентность
1.2.4. Методы выделения и очистки лизостафина
1.2.5. Методы определения активности лизостафина
1.2.6. Физико-химические свойства лизостафина
1.2.7. Обоснование применения лизостафина в медицине и ветеринарии
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Штаммы микроорганизмов
2.2. Экспериментальные животные
2.3. Среды и условия культивирования
2.4. Биохимические методы
2.4.1. Использование метода адсорбционной хроматографии на силохроме для получения лизостафина
2.4.2. Использование метода адсорбционной хроматографии на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозе для получения пероксидазы хрена
2.5. Определение ферментативной активности и чистоты
полученных белков
2.6. Определение ионогенных групп каталитического центра лизостафина и лизоцима методом кинетико-термодинамического анализа
Глава 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка метода адсорбционной хроматографии на ионообменниках
3.1.1. Очистка пероксидазы хрена на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах
3.1.2. Очистка лизостафина адсорбционной хроматографией на силохроме
3.1.3. Обсуждение
3.2. Оптимизация условий культивирования Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus
3.2.1. Выбор основы питательной среды
3.2.2. Влияние рН среды и времени культивирования на рост S. simulans и секрецию лизостафина
3.2.3. Оптимизация концентрации питательных веществ при культивировании S. simulans
3.2.4 Особенности культивирования я'/им/ага в биореакторе
3.2.5. Обсуждение
3.3. Разработка кинетико-термодинамического метода определения ионогенных групп каталитического центра ферментов (на примере лизоцима и лизостафина)
3.3.1. Обсуждение
3.4. Использование лизостафина для лечения стафилококковых поражений
у экспериментальных животных
3.4.1. Обсуждение
Заключение
Выводы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
АНион - значение энтальпии ионизации
АМФ - аденозинмонофосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
в/б - внутрибрюшинно
в/в - внутривенно
в/м - внутримышечно
ГКПМ - Государственная коллекция патогенных микроорганизмов
ГНЦ ПМБ - Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДЭАЭЦ - диэтиламиноэтилцеллюлоза КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза КОЕ - колониеобразующая единица
кДж - килоджоуль
МПА - мясо-пептонный агар
НАД+ - никотинадениндинуклеотид
ПГРМ - панкреатический гидролизат рыбокостной муки
ПГКр - панкреатический гидролизат крови ПГМ - панкреатический гидролизат мяса ПГК - панкреатический гидролизат казеина ПЭГ - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота
ТНБС - тринитробензолсульфоксид ФМСФ - фенилметансульфонил фторид ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия FemAB - оперон метициллинрезистентности in vitro - эксперимент «в пробирке», без использования животных in vivo - эксперимент на животных lif— ген, контролирующий лизостафинрезистентность Iss - ген, контролирующий синтез препролизостафина N-AGA-N-NAM - чередующийся сополимер N-ацетилглюкозамин - N-ацетилмурамовая кислота
PAGE - полиакриламидный гель
рАСК1-рАСК5 - плазмиды S. simulans biovar staphyloliticus pi - значение изоэлектрической точки рК - значение рН, при котором заряжено 50% групп RZ - от Reinheitszahl, критерий очистки А403/А275
SDS-Na - додецилсульфат натрия TEA - триэтаноламин
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Микробиология», 03.02.03 шифр ВАК
Сравнительные исследования панкреотических сериновых протеиназ гидробионтов Тихого океана1998 год, доктор биологических наук Пивненко, Татьяна Николаевна
Адсорбция дифильных ионогенных веществ из воды и природа поверхности2001 год, доктор химических наук Хохлова, Татьяна Дмитриевна
Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов2006 год, доктор биологических наук Бондарь, Владимир Станиславович
Получение, свойства и применение рекомбинантной пероксидазы хрена2001 год, кандидат химических наук Григоренко, Виталий Георгиевич
Внеклеточные протеолитические ферменты Streptomyces Spheroides ШТ.351985 год, кандидат биологических наук Крейер, Валериана Георгиевна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов очистки белков адсорбционной хроматографией на ионообменниках на примере пероксидазы хрена и лизостафина»
Введение
Актуальность проблемы:
До середины 1950-х гг. практически единственным широко применяемым методом очистки белков оставалось дробное осаждение сульфатом аммония. Однако к концу 1950-х гг. количество исследований, посвященных разработке новых методов очистки протеинов, значительно возросло. Были опубликованы данные по очистке белков на целлюлозных ионообменниках -КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах, введены новые носители - сефадексы и сефарозы. К началу 1990-х годов был разработан целый ряд тонких методов очистки белков (аффинная хроматография, гидрофобная хроматография, металлохе-латная и хроматография на триазиновых красителях, гель-фильтрация и др.). Эти методы очистки были основаны на различиях белковых характеристик: разности молекулярных масс, растворимости, температурной и рН-устойчивости, зарядов при различных значениях рН, адсорбции на гидрокси-лапатите, сродству к субстратам, ингибиторам, триазиновым красителям и др. Однако существенным ограничением многих из этих методов является невозможность их использования в условиях большого количества балластных примесей - клеток продуцента, их фрагментов, протеаз, содержащихся в культуральной жидкости. Это приводит к необходимости введения дополнительных этапов очистки. Еще одним ограничением для широкого применения ряда хроматографических методов является их высокая специфичность. В частности, использование аффинной хроматографии обеспечивает высокую чистоту фермента, ингибитор которого иммобилизован на носителе. Но, с другой стороны, поскольку химическое строение ингибиторов различно, то для отдельно взятого фермента нужно разрабатывать свою отдельную методику иммобилизации ингибиторов.
Универсальным принципом связывания белка является его адсорбция на сорбенте, основанная на силах Ван-дер-Ваальса. Однако, среди сил слабого взаимодействия, действующих в водном растворе, адсорбция является наиболее слабой. Поэтому разработать сорбент, использующий данный принцип, весьма сложно, и к моменту начала работы был разработан только один метод, использующий адсорбционное связывание - хроматография на гидро-ксилапатите. Однако применение гидроксилапатита ограничено тем, что этот сорбент требует сложного процесса подготовки и не подлежит регенерации. Кроме того, его использование возможно только на последней стадии очистки после удаления большинства балластных соединений.
Поэтому целью нашего исследования была разработка метода очистки белков, лишенного перечисленных выше ограничений, в достаточной степени универсального, масштабируемого и позволяющего получить белки высокой степени чистоты уже на первых стадиях применения.
Основной задачей нашего исследования была иллюстрация работоспособности и универсальности метода на модельных белках, имеющих важное промышленное значение, но в настоящее время получаемых трудоемкими способами. В качестве одного их таких ферментов была выбрана пероксидаза хрена. Этот белок широко используется в биохимических и иммунологических исследованиях и представляет интерес как препарат для лечения лепры и карциномы. Однако выход его ограничивается 0,5-1 г из 100 кг корневищ хрена, и цена достигает нескольких тысяч долларов за 1 г.
Другим модельным ферментом был выбран лизостафин. Определяющим критерием выбора стала его способность к лизису клеточной стенки стафилококков. Он был выделен из культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus [86] и, как было показано, лизировал клетки стафилококковых штаммов, в том числе антибиотикорезистентных. Лизис
бактериальной клетки обусловлен тем, что лизостафин является глициназой и гидролизует пентаглициновые мостики, которые входят в состав клеточной стенки любого (в том числе - резистентного к антибиотикам) стафилококка. На этом основании данный фермент был отнесен к факторам межмикробного антагонизма, обеспечивающим подавление роста других видов стафилококков.
В настоящее время борьба с инфекциями, вызываемыми штаммами ан-тибиотикорезистентных бактерий является актуальной проблемой медицины. Бактерии рода Staphylococcus занимают в этом ряду одно из главных мест. Так, в США ежегодно фиксируется -500 ООО случаев заболеваний, вызываемых стафилококками, из которых около 100 ООО случаев были вызваны анти-биотикорезистентными штаммами. Таким образом, на сегодняшний день представляется важной задача поиска новых лекарственных средств, альтернативных антибиотикам, а также необходимость разработки новых эффективных подходов к лечению стафилококковых инфекций. В этом свете возможность применения лизостафина в клинической и ветеринарной практике выглядит перспективной, тем более что показания для лечения некоторых инфекций, вызываемых стафилококками, уже встречались в литературе. [39]
Описанные методы выделения лизостафина не пригодны для наработки препаративных и промышленных количеств препарата, поскольку существующие методы включают, как правило, очистку в три-четыре этапа; выращивание штамма-продуцента осуществляется на дорогих или малодоступных питательных средах [62]; в целом процесс оказывается экономически высокозатратным.
Таким образом, в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих фермент лизостафин, и работа в данном направлении является актуальной и перспективной для медицины, ветерина-
рии и биотехнологии. Поэтому заключительным этапом нашей работы явилось изучение очищенного с помощью разработанного нами метода лизоста-фина, позволяющее получить важную информацию о его физико-химических и биологических свойствах.
Цель исследования - Разработать адсорбционные хроматографические методы очистки белков на ионообменниках, использовать их для препаративной очистки лизостафина и пероксидазы хрена, изучить некоторые физико-химические и биологические свойства очищенного лизостафина.
Задачи исследования:
1. Разработать методы препаративной адсорбционной хроматографии белков на целлюлозных (КМ- ДЭАЭ-целлюлозах) и кремниевых (силохром С-80) ионообменниках.
2. Использовать эти методы для получения препаративных количеств лизостафина и пероксидазы хрена.
3. Подобрать оптимальные условия культивирования штамма & Ыоуаг $1арку1о1уИсш - продуцента лизостафина.
4. Разработать кинетико-термодинамический метод определения ионо-генных групп, входящих в каталитический центр макромолекулы лизостафина.
5. Показать возможность использования полученного препарата лизостафина для лечения стафилококковых инфекций у домашних и сельскохозяйственных животных.
Научная новизна:
1. Впервые разработан метод адсорбционной хроматографии белков на ионообменниках, применение которого позволяет существенно сократить количество этапов очистки.
2. Впервые предложен кинетико-термодинамический метод для определения ионогенных групп активного центра ферментов, катализирующих гидролиз поверхностных структур клеточной стенки бактерий (лизостафин, ли-зоцим).
Практическая значимость и внедрение результатов:
1. Разработан новый способ получения лизостафина на основе адсорбционного метода очистки, защищенный патентом на изобретение РФ: №2342431.
2. Предложенный метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках может использоваться для очистки препаративных количеств других белков.
3. Предложены эффективные схемы применения лизостафина для лечения стафилококковых инфекций домашних животных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках позволяет получать препаративные количества высокоочищенных препаратов лизостафина и пероксидазы хрена.
2. Разработка условий культивирования штамма-продуцента лизостафи-на 5*. 8тги1ап$ позволяет обеспечить высокий выход целевого продукта.
3. Метод кинетико-термодинамического анализа позволяет определять ионогенные группы активного центра ферментов без использования рентге-ноструктурного анализа.
4. Препарат лизостафина, полученный из культуральной жидкости Я. яшиЬт методом адсорбционной хроматографии на силохроме, эффективен против стафилококковых инфекций у животных.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов ФБУН ГНЦ ПМБ.
Апробация работы. Результаты работы доложены на двух Научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск, 2009 г. и 2010 г.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 6 научных публикациях, включая 3 статьи в реферируемых научных журналах и 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 40 работ отечественных и 95 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 6 таблицами.
Похожие диссертационные работы по специальности «Микробиология», 03.02.03 шифр ВАК
Биосинтез, выделение, свойства и применение бактериальной протеазы ЕСР32, ограниченно расщепляющей актин2000 год, кандидат биологических наук Морозова, Алевтина Владиславовна
Иммунохимическая идентификация В-энтеротоксинобразующих стафилококков, выделяемых из секрета вымени коров1984 год, Муруева, Галина Борисовна
Липазы грибов Cospora lactis и Rhizopus microsporus. Биохимические аспекты1984 год, доктор биологических наук Давранов, Кахрамон
Адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на ионогенных и неионогенных носителях2001 год, кандидат биологических наук Шкутина, Ирина Викторовна
Получение и некоторые свойства менингококковой IgAl-протеазы2006 год, кандидат биологических наук Теймуразов, Марат Георгиевич
Заключение диссертации по теме «Микробиология», Смотров, Олег Игоревич
Выводы
1. Разработан адсорбционный метод выделения белков на силохроме, с помощью которого получен высокоактивный (1535 ед/мг) лизостафин. Метод может быть использован в промышленности.
2. Разработан адсорбционный метод выделения белков на КМЦ и ДЭАЭЦ. позволяющий получать из корней хрена высокоочищенную перок-сидазу с RZ 3,35-3,40. Показано, что метод применим для промышленного получения фермента.
3. Оптимизированы условия культивирования штамма-продуцента S. simulans biovar staphylolyticus. Подобрана экономически выгодная среда на основе ПГРМ. Определено значение рН, концентрации аминного азота и времени культивирования, позволяющие получать лизостафин с активностью до 6 ед/мл. Также предложен источник углерода и силиконовый пеногаси-тель, не оказывающий денатурирующее действие на целевой продукт.
4. Разработан кинетико-термодинамический метод определения ионо-генных групп каталитического центра ферментов, который позволяет идентифицировать их без использования рентгеноструктурного анализа. Этим методом получены данные о каталитически активных группах активного центра, входящих в состав макромолекул лизостафина и лизоцима.
5. Показана возможность использования полученных разработанными методами нативных препаратов лизостафина для лечения стафилококковых заболеваний у домашних и сельскохозяйственных животных (отита у собак и мастита у коров). Показано, что полное выздоровление наступало на 4-6 сутки у всех животных, в том числе тех, которые не были излечены антибиотиками. Это указывает на то, что препарат может быть применен для лечения человека в случае успешных доклинических и клинических испытаний.
Заключение
Из литературного обзора следует, что, несмотря на большое количество методов очистки белков, лишь очень малое их число применимо для первых стадий, когда в культуральной жидкости находятся балласты различной природы. Поэтому разработка таких методов, которые могли бы использоваться на первых стадиях и увеличить выход целевого продукта, является весьма актуальным.
В поиске таких методов мы обратились к адсорбции, поскольку это всеобщее явление, оно касается любого белка и таким методом можно было бы очистить большое количество белков. Адсорбционная хроматография была первым видом хроматографии, используемым в химии для очистки низкомолекулярных соединений. Но для белков до настоящего времени применялась только на примере гидроксилапатита. Основной результат данной работы -новые адсорбционные методы для очистки белков, основанные на взаимодействии за счёт сил Ван-дер-Ваальса. Трудность их разработки заключалась в том, что адсорбционные силы значительно слабее других сил нековалент-ного взаимодействия и нужны были бы сорбенты, на которых эти силы являлись бы определяющими. Кроме того эти сорбенты должны быть дешевыми и уже применяемые в промышленности, но использовались бы в таких условиях, где решающее значение для связывания белков имело бы адсорбционное взаимодействие.
Такими сорбентами были выбраны слабые ионообменники - высокопористый силохром С-80, ДЭАЭ- и КМ-целлюлозы. Эти сорбенты химически довольно устойчивы, инертны, обладают большой ёмкостью и образуют слабые связи с белками, которые при соответствующих условиях будут определяющими. Показано, что на силохроме можно очищать белки с высоким значением изоточки, что возможно ввиду большой разницы между его р1 и рК. На целлюлозных ионообменниках можно чистить белки, которые не несут заряда при данном значении рН. Но необходимо подобрать буфер, состоящий из органической кислоты (ЯСООН или Я803Н) или третичного основания и их солей, чтобы рК этого буфера было вблизи р1 выделяемого белка. Изменяя «Я» (радикал) в этих соединениях можно получить буфер перекрывающий область выделения белков (рН 5-10), и очистить нужный белок
В качестве белков использовали пероксидазу хрена, получаемую в промышленных масштабах, и лизостафин, фермент важный для нашей лаборатории. Существующий способ получения пероксидазы состоит из пяти стадий и даёт выход 0,5 г белка с 1^-2,78. Метод адсорбционной хроматографии позволяет получить 3 г белка в две стадии с Я2-3,35. Что касается лизостафина, то опубликованные данные не дают возможность эффективного сравнения. Однако их можно сравнить с данными по получению других белков.
Применяемая очистка авидина и лизоцима из куриных яиц проходит в 5 и соответственно в 6 стадий. Для адсорбционной хроматографии на силохро-ме потребовалось всего две, причём оба белка были получены в одном цикле, в отличие от прежних методов с выходом 94 и 91%.
Лизостафин, вероятно, найдёт широкое применение в медицине. Поэтому нами были описаны методы культивирования продуцента на различных средах и выбрана оптимальная из них. Кроме того, оказалось, что для крупномасштабного культивирования большое значение имеют выбор пеногаси-теля и источника углерода и энергии. Они также были подобраны.
Свойства пероксидазы - фермента, с которым работали ещё в начале XX века, широко известны. Значительно менее известны свойства лизостафина, хотя и этот фермент интенсивно изучался. И поскольку определение ионо-генных групп, входящих в активный центр фермента имеет важное значение для подробного изучения механизма действия, то было решено их идентефи-цировать. Для этого был предложен метод кинетико-термодинамического анализа каталитического центра. В ходе работы были определены величины рКа и рКь для двух температур, а из уравнения Вант-Гоффа найдена ДНион. Исходя из величины ЛНион и дополнительных данных (первичная структура, данные по химической модификации и др.) определили ионогенные группы. Метод ранее применялся для ферментов с растворимыми низкомолекулярными субстратами, теперь же доказано, что он применим и для субстратов, иммобилизованных на микробной клетке.
В заключение была проведена работа по определению стафилолитиче-ской активности полученного нами нативного белка in vivo на сельскохозяйственных и домашних животных. Это позволило сделать вывод о целесообразности применения разработанного метода очистки даже для препаратов ветеринарного, а впоследствии и медицинского назначения. Очищенный ли-зостафин показал себя как перспективный препарат для лечения тяжёлых стафилококковых поражений.
Можно полагать, что предложенные в данной работе методы очистки белков будут в дальнейшем широко применяться. Кроме того, если лизоста-фин найдет свое применение в медицине, то возможно предложенные методы его культивирования и очистки окажутся в дальнейшем определяющими.
Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Смотров, Олег Игоревич, 2012 год
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Альбертсон Пер-Оке. Разделение клеточных частиц и молекул // М., Мир - 1974.
2. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики // М.: Изд-во МГУ - 1976.
3. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа // М.:Высшая школа - 1977 - стр.234-235.
4. Березин И.В., Угарова Н.Н., Кершенгольц Б.М., Бровко Л.Ю. Очистка пероксидазы хрена ионообменной хроматографией // Биохимия - 1975 - Т. 40 - №2 - С. 297-301.
5. Ванников А.В., Гришина А.Д. Фотохимия полимерных донорно-акцепторных комплексов // М.: Наука - 1984.
6. Даванков В.А., Дж. Навратил, X. Уолтон. Лигандообменная хроматография // Мир - 1989.
7. Дин П. Аффинная хроматография. Методы // Мир - 1988.
8. Жаданова Л.В., Романова Ю.М., Бондаренко В.М., Константинова Г.Е., Шевелев А.Б. Клонирование генов лизоцима и лизостафина Staphylococcus aureus и их экспрессия в клетках Bacillus subtilis II Микробиология - 2001
9. Иванов В.И. Активные красители в биологии // М.: Наука - 1981.
10. Каталог «Sigma». Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук // 2000-2001.
11. Керридж Д., Гиптон К. Биохимическая логика. Количественные задачи для студентов // М. Мир - 1974.
12. Клесов A.A., Рабинович М.Л., Березин И.В. Кинетика ферментативных реакций в гетерогенных с^темах. Зависимость гидролиза бактериаль-
- С. 3-6.
ных клеток Micrococcus lysodeicticus под действием лизоцима от рН // Биоорган. Химия. - 1976 - Т. 2 - С. 795-802.
13. Кривобокова С.С. Биологическое окисление. Исторический очерк // М.: Наука-1971-С. 167.
14. Кучкаев Б.И., Косаревская Е.Н., 2007.
15. Машковский М.Д. Лекарственные средства. ч.П // М.: Медицина -1993.
16. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот // М.: Наука - 1985-С. 221-272.
17. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология // М: ГЭОТАР МЕДИЦИНА - 1999 - С. 185.
18. Рувинский А.О., Шумной В.К. Общая биология // М.: Просвещение -1995.
19. Синай Г .Я., Биргер О.Г. Микробиологические исследования при инфекционных заболеваниях // М.: Медгиз - 1947 - С. 343.
20. Солганик Ю.М. Иммобилизованные протеолитические ферменты в лечении гнойно-некротических процессов // Новосибирск, Наука - 1981.
21. Скоупс. Р. Методы очистки белков // М.: Мир - 1985.
22. Страйер Л. Биохимия // М.: Мир - 1984.
23. Суровцев В.И., Борзенков В.М., Хатюшин Ю.И., Теймуразов М.Г. Способ получения авидина и лизоцима // Патент РФ 2342431 - Б.И. 2008 -№36.
24. Суровцев В.И., Федоров Т.В., Бороздина М.А. Кинетика Михаэлиса-Ментен для определения активности лизостафина // Биохимия - 2003 - Т. 68 - 1798-2001.
25. Торчилин В.П. Иммобилизация а-химотрипсина на растворимых декстранах // Вопросы Мед. Химии - 1982 - Т. 28 - №1 - С. 3-14.
26. Торчинский Ю.М. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков //М., Наука-1971.
27. Туркова Я. Аффинная хроматография // МирД 980.
28. Уильяме В., Уильяме X. Физическая химия для биологов // М. Мир -1976.
29. Уэстли Дж. Ферментативный катализ // М.: Мир - 1972.
30. Федоров Т.В., Суровцев В.И., Плетнев В.З., Бороздина М.А., Гусев В.В. // Биохимия - 2003 - Т. 68 - С. 50-53.
31. Филлипс Д. Молекулы и клетки // М.,"Мир - 1968 - вып.З.
32. Цвет М.С. Хроматографический адсорбционный анализ. Избранные работы // Из-во АНСССР - 1946 - С. 9-29.
33. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа // М.: Наука -1965.
34. Baba Т., Schneewind О. Target cell specificity of a bacteriocin molecule: а С - terminal signal directs lysostaphin to the cell wall of Staphylococcus aureus // EMBO J. - 1996-V. 15-№18-P. 4789-4797.
35. Balusec J., Hajek V. Antagonistic activities of coagulase - positive staphylococci // J.Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. - 1985 - V. 29 - №2 - P. 147 -154.
36. Blake C.C.F., Mair G.A., North A.C.T., Phyllips D.S.,SarmaU.R. // Proc. Roy. Soc. B. - 1967 - V. 167 - P. 365-377.
37. Bochtler M., Odintsov S.G., Marcyjaniak M., Sabala I. // Protein Science -2006 - V. 13-P. 854-861.
38. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantification of microgramm quantities of protein. Utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.
39. Bramley A.J., Foster R. Effects of lysostaphin on Staphylococcus aureus infections of the mouse mammary gland // Res. Vet. Sei. - 1990 - V. 49 - №1 -P. 120-121.
40. Browder H.P., Zygmunt J.R., Young J.R., Tavormun P.A. Lysostaphin: enzymatic mode of action // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1965 - V.19 -P. 383-389.
41. Chi Y., Min J., Jasmin JF., Lisanti MP., Chang YT., Schuster VL. Development of a high-affinity inhibitor of the prostaglandin transporter // J Pharmacol Exp Ther. - 2011 - Nov V. 339(2) - P. 633-41.
42. Cohn E.J., Edsall J.T., Proteins, Amino Acids and Peptides // Reinhold, New York - 1943-P. 602.
43. Cohn E., Strong L.E., Hughes W.L. at al. Preparation and Properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into Fraction of the Proteins and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids // J. Amer. Chem. Soc. - 1946 - V. 68 - P. 459.
44. Daley M.J., Oldham E.R. Lysostaphin: immunogenicity of locally administered recombinant protein used in mastitis therapy // Vet.Immunol.Immunopathol. - V. 31 - №3-4 - P. 301-312.
45. DeHart H.P., Heath H.E., Heath L.S., LeBlanc P.A., Sloan G.L. The lysostaphin - endopeptidase resistance gene (epr) specifies modification of peptidogly-can cross bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. II Appl.Environ. Microbiol. - 1995 - V. 61 - №4 - P. 1475-1479.
46. Dolman, D., Newell, G.A., Thurlow, M.D. // Can. J. Biochem. - 1975 -V. 53 - P. 495-500.
47. Derbyshev V.V., Klykov S.P., Glukhov N.N., Shcherbakov G.Ya. The development of a population under the limitation by the energy supply // -Биотехнология - 2001 - № 2 - P. 89-96.
48. Desbois A.P., Coote P.J. Combination of lysostaphin with an antimicrobial peptide is effective against meticillin-resistant staphylococcus aureus in vivo // J.S JCAAK conferation, chikago, USA - 2011.
49. Eisenberg D., Kauzmann W. The Structure and Properties of Water // Oxford, The Clarendon Press - 1969 - P. 4.
50. Forvard K.R., Ongsansoy E.G., Mathew T.K. A comparison of the rapid thermonuclease test and the lysostaphin susceptibility test in the presumptive identification of Staphylococcus aureus from positive Bactec blood cultures // Di-agn.Microbiol.Infect.Dis. - 1989 - V. 12 - №3 - P. 205-209.
51. Hase C.C., Finkelstein R.A. Microbiological reviews // 1993 - 823-837.
52. Heath H.E., Heath L.S., Nitterauer J.D., Rose K.E., Sloan G.L. Plasmid-encoded lysostaphin endopeptidase resistance of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus II Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1989 - V. 160 - №3 -P. 1106-1109.
53. Heath H.E., Heath L.S., Rose K.E., Sloan G.L. Beta - lactamase is encoded on plasmid pACK3 in Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus II FEMS Microbiol. Lett. - 1991 -V. 61 -№1 - P. 113-116.
54. Heinrich P., Rosenstein R., Bohmer M., Sonner P., Gotz F. The molecular organization of the lysostaphin gene and its sequences repeated in tandem // Mol.Gen.Genet. - 1987 - V. 209 - №3 - P. 563-569.
55. Hofstee B.H. Acceptable hydrophobic groups in the native proteins // J.Biochem.Bioph.Res.Communi. - 1978 - V.63. - № 3 - P.618-621.
56. Holler E., Rupley J.A., Hess G. P. Productive and unproductive lyso-zyme-chitosaccharide complexes. Equilibrium measurements // Biochemistry -1975-V. 14-P. 1088-1092.
57. Homsy R, Pelletier-Lebon P, Tixier JM, Godeau G, Robert L, Hornebeck W. Characterization of human skin fibroblasts elastase activity // J Invest Dermatol. - 1988 - V. 91 - P. 472-477.
58. Huan J.N. Topical use of lysostaphin for Staphylococcus aureus infection of burn wounds in mice // Chung.Hua.Wai.Ko.Tsa.Chih. - 1992 - V. 30 - №5 -P. 270-271.
59. Huan J.N.,Chen Y.L., Ge S.D. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection and its treatment in burned pacients // Chung.Hua.Wai.Ko.Tsa.Chih. -1994 - V. 32 - №4 - P. 244-245.
60. Huan J., Han Y., Chen Y. Effect of lysostaphin on phagocyte function in burn mice // Chung.Hua.Cheng.Hsing.Shao.Shang.Wai.Ko.Tsa.Chih. - 1995 -V. 11 - № 4-P. 255-257.
61. Huber M.M., Huber T.W. Susceptidility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to lysostaphin // J.Clin.Microbiol. - 1989 - V. 27 - №5 - P. 11221124.
62. Iversen O.J., Grov A. Studies of lysostsphin separation and characterisation of three enzymes // Europ. J. Biochem. - 1973 - V. 38 - №2 - P. 293-300.
63. Jmoto T., Johusin L.N., North A.C. // Enzymes, Academic press, New York-1972-vol.7.
64. Kline S.A., de la Harpe J., Blackburn P. // Analytical Biochemistry - 1993 -V. 217 - P. 329-331.
65. Kloos W.E., Ballard D.N., Webster J.A., Hubner R.J., Tomasz A., Couto I., Sloan J.L., Dehart H.P., Fiedler F., Schubert K., De-Lencastre H., Sanches I.S., Heath H.E., Leblanc P.A., Ljungh A. Ribotype delineation and description of Staphylococcus scuiri subspecies and their potential as reservoirs of methicilline resistance and staphylolytic enzyme genes // Int.J. Syst. Bacteriol. - 1997 - V. 47 - №2 -P. 313-323.
66. Kopp U., Roos M., Wecke J., Labischinski H. Staphylococcal peptidogly-can interpeptide bridge biosynthsis: a novel antistaphylococcal target? // Microb. Drug. Resist. - 1996 - V. 2 - №1 - P. 29-41.
67. Kovacs A, Sperling E, Lazar J, Balogh A, Kadas J, Szekrenyes A, Takacs L, Kurucz I, Guttman A. Fractionation of the human plasma proteome for monoclonal antibody proteomics-based biomarker discovery // Electrophoresis - 2011 -V. 32-P. 1916-1925.
68. Labrou NE, Clonis YD. Biomimetic dye affinity chromatography for the purification of bovine heart lactate dehydrogenase // J Chromatogr. A. - 1995.
69. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.
70. Lomo PO, Coetzer TH. Characterization of a multicatalytic proteinase complex (20S proteasome) from Trypanosoma brucei brucei II Lonsdale-Eccles JD.Immunopharmacology - 1997.
71. Lowry O.H., Rosenbrough N.R., Farr A.L. Protein measurement with the Folin phenol 111. Biol. Chem. - 1951 - V. 193.-P. 115-119.
72. Luka Z, Wagner C. Expression and purification of glycine N-methyltransferases in Escherichia coli II Protein Expr Purif. - 2003 - V. 28 -P. 280-2866.
73. Luong JH, Scouten WH. Affinity purification of natural ligands // Curr Protoc. Protein Sci. - 2008.
74. Maidhof H., Reinicke B., Blumel P., Berger-Bachi B., Labischinski H. FemA, which encodes a factor essential for expression methicillin resistance, affect glycine content of peptidoglycan in methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains // J.Bacteriol. - 1991 - V. 173 - №11 -P. 3507-3513.
75. Melamed M. D, Green N. M. Avidin. Purification and composition // Biochem. J - 1963 - V. 89 - P. 591-597.
76. Marova I., Kovar J. Spectrophotometric detection of bacteriolytic activity of diluted lysostaphin solutions // Folia.Microbiol.Praha. - 1993 - V. 38 - №2 -P. 153-158.
77. Marova I., Dadak V. Modified simplified method for isolation of lysostaphin from the culture filtrate of Staphylococcus staphylolyticus II Folia microbiol.
- 1993 - V. 38 - №3 - P. 245-252.
78. Nitterauer J.D., Heath H.E., Heath L.S., LeBlanc P.A., Sloan G.L. Characteristics of extracellular protein production by a plasmidless derivative of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus II FEMS Microbiol. Lett. - 1991 V. 68 -№1 - P. 23-26.
79. Oldham E.R., Daley M.J. Lysostaphin: use of a recombinant bacterial enzyme as a mastitis therapeutic // J. Dairy Sci. - 1991 - V. 74 - №12 - P. 41754182.
80. Park, P.W., Senior R.M., Griffin G.L, Broekelmann T.J., Mudd M.S., Me-cham R.P. Binding and degradation of elastin by the staphylolytic enzyme lysostaphin // Int. J. Biochem., Cell Biol. - 1995 - V. 27, P. 139-146.
81. Peterson E.A. Cellulosic ion-exchangers. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology // Work T.C. and Work E., eds, North-Holland, Amsterdam - 1970 - V. 2 - Pt. 2 - P. 223-392
82. Porath J., Flodin P. Gel Filtration: A Method for Desalting and Group Separation //Nature - 1959 - V. 183 - P. 1657-1659.
83. Recsei P.A., Gruss A.D., Novick R.P. Cloning, sequence, and expression of the lysostaphin gene from Staphylococcus simulans II Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
- 1987- V. 84-№5-P. 1127-1131.
84. Sakurada J., Murai M., Zhijun L., Usui A., Seki K., Kobayashi K., Sumi Y., Jitsukawa H., Masuda S. Efficient adsorption of lysostaphin on bacterial cells of lysostaphin - resistant Staphylococcus aureus mutant // Microbiol.Immunol. -1993 - V. 37 - № 1 - P. 29-34.
85. Schindler C.A., Schuhardt V.T. Lysostaphin a new bacteriolytic agent for the staphylococcus // PNAS USA - 1964 - V. 51 - №3 - P. 414-421.
86. Schindler C.A., Schuchardt V.T. Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for the Staphylococcus // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. - 1964 - V. 51 - №.3 -P. 414-421.
87. Schindler C.A., Schuchardt V.T. Purification and properties of lysostaphin
- a lytic agent for Staphylococcus aureus // Biochim. Biophis. Acta. - 1965 - V. 97
- №2 - P. 242-250.
88. Scott P.T., Rood J.I. Electroporation-mediated transformation of lysosta-phin-treated Clostridium perfringens II Gene. - 1989 - V. 82 - №2 - P. 327-333.
89. Shugar D. The measurement of lysozyme activity and the ultra-violet inac-tivation of lysozyme // Biochim. Biophys. Acta. - 1952 - V. 8 - P. 302-306.
90. Sloan G.L., Smith E. C., Lankaster J. H. // Biochem. J. - 1977 - V. 167 -P. 293-296.
91. Sloan G.L., Robinson J.M., Kloos W.E. Identification of Staphylococcus staphylo-lyticus NRRL B-2628 as a biovar of Staphylococcus simulans II J.Syst.Bacteriol. - 1982 - V. 32 - P. 170-174.
92. Stanley A. Kline, Jon de la Harpe, Peter Blackburn. // Analyt.biochem. -1994-V. 217-P. 329-331.
93. Stranden A.M., Ehlert K., Labischinsky H., Berger-Bachi B. Cell wall monoglycine cross-bridges and methicillin hypersusceptibility in a FemAB null mutant of methicillin- resistant Staphylococcus aureus II J.Bacteriol. - 1997 -V. 179-№1-P. 9-16.
94. Strominger J.L., Ghyisen J.M. // Science - 1967 - V. 156 - P. 213-221.
95. Sugai M., Fujiwara T., Ohta K., Komatsuzawa H., Ohara M., Suginaka H. Epr, which encodes glycylglycine endopeptidase resistance, is homologous to fe-mAB and affects serine content of peptidoglycan cross bridges in Staphylococcus capitis and Staphylococcus aureus // J. Bacteriol. - 1997 - V. 179 - №13 -P. 4311-4318.
96. Sugai M., Fujiwara T., Akiyama T., Ohara M., Komatsuzawa H., Inoue S., Suginaka H. Purification and molecular characterization of glycylglycine endopeptidase produced by Staphylococcus capitis EPK1 // J. Bacteriol. - 1997 - V. 179 -№4-P. 1193-1202.
97. Szweda P, Kotlowski R, Kur J. New effective sources of the Staphylococcus simulans lysostaphin // J Biotechnol. - 2005 - V. 4 - P. 203-13.
98. Thumm G., Götz F. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostaphin immunity factor (Lif) of Staphylocjccus simulans biovar staphylolyticus // Mol. Microbiol. - 1997 - V. 23 - №6 - P. 1251-1265.
99. Thumm G., Götz F. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostaphin immunity factor (Lif) of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus II Mol. Microbiol. - 1997 - V. 23 - №6 - P. 1251-1265.
100. Torchilin V.P. Enzyme stabilization without carriers // En-zym.Microbiol.Technol. - 1979 - V. 1 - P. 74-82.
101. Truger H.R., Buckley C.E. Molecular properties of lysostaphin, a bacteriolytic agent specific for staphylococcus aureus // J.Biol.Chem. - 1970 - V. 245 -P. 4842-4846.
102. Tschierske M., Ehiert K., Stranden A.M., Berger-Bachi B. Lif, the lysostaphin immunity factor, complements FemB in staphylococcal peptidoglycan in-terpeptide bridge formation // FEMS Microbiol. Lett. - 1997 - V. 153 - №2 -P. 261-264.
103. Van-den-Broek P.J., Byes L.F., van-Furth R. Adherence of lysostaphin to and penetration into human monocytes // Scand. J. Immunol. - 1985 - V. 21 - №2 -P. 189-193.
104. Vann J.M., Proctor R.A. Ingestion of Staphylococcus aureus by bovine endothelial cells results in time- and inoculum-dependent damage to endothelial cell monolayers // Infect. Immun. - 1987 - V. 55 - №9 - P. 2155-2163.
105. Wadstrom T., Vesterberg O. Studies on endo-N-acetylglucosaminidase, staphylolytic peptidase and N-acetylmuramyl-L-alanine amidase in lysostaphin and from Staphylococcus aureus II Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B. Microbiol. -1971 - V. 79 - №.2 - P. 248-264.
106. Walanakunakova Ch., Browder H.P. Effect of lysostaphin and its two active components on stable wall-defective forms of Staphylococcus aureus II J. Infect Dis. - 1970- V. 121-№2-P. 124-128.
107. Wallaert B.,Aerts C., Colombel J.F., Voisin C. Human alveolar macrophage antibacterial activity in the alcoholic lung // Am.Rev.Respir.Dis. - 1991 -V. 144-№2-P. 278-283.
108. Williamson C.M., Bramley A.J., Lax A.J. Expression of the lysostaphin gene of Staphylococcus simulans in a eukaryotic system // Appl.Environ.Microbiol. - 1994 - V. 60 - №3 - P. 771-776.
109. Worthington cat. No WC780. Enzyme and related biochemicals. Lyzo-zyme (muramidase) // 1978 - P. 123-124.
110. Zhoy R., Chen S., Recsey P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity // Anal.Biochem. - 1989 - V. 171 - №1 - P. 141-144.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.