Получение, свойства и применение рекомбинантной пероксидазы хрена тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Григоренко, Виталий Георгиевич

• Григоренко, Виталий Георгиевич
• кандидат химических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат химических наук Григоренко, Виталий Георгиевич

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И НОВЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ НАТИВНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЕРОКСИДАЗ.

1.1. Введение.

1.2. Кристаллические структуры пероксидаз.

1.3. Кислотно-основной катализ пероксидаз.

1.4. Металл-связывающие сайты.

1.5. Архитектура активного центра ПХ.

1.5.1 Структура дистальной области ПХ и система водородных связей.

1.5.2. Структура проксимальной области ПХ и система водородных связей.

1.5.3. Сайт связывания ароматических субстратов.

1.6. Роль белкового окружения в пероксидазном катализе.

Глава 2. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗ.

2.1 Использование пероксидаз в )й1ушуноферментном анализе.

2.2. Биохимический анализ физиологически активных веществ.

2.3. Использование пероксидаз в биосенсорах.

2.4. Применение пероксидаз в биотрансформациях.

2.5. Использование пероксидаз для биоотбеливания в целлюлозно-бумажной промышленности.

Глава 3. ВЫДЕЛЕНИЕ, РЕНАТУРАЦИЯ И ОБРАЗОВАНИЕ

ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ, ЭКСПРЕССИРОВАННЫХ В КЛЕТКАХ E.coli В ТЕЛАХ ВКЛЮЧЕНИЯ.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Реагенты.

4.2. Методы исследования.

4.2.1 Клонирование рекомбинантных форм ПХ.

4.2.2 Получение рекомбинантного конъюгата ПХ с БПЖК.

4.2.3 Экспрессия рекомбинантной ПХ в клетках E.coli.

4.2.4 Протоколы рефолдинга и очистки рекомбинантной ПХ.

4.2.5 Физико-химические свойства рекомбинантных форм ПХ.

4.2.6 Адсорбционные и электрохимические измерения.

4.2.7 Расчет структурных изменений в мутантных формах пероксидазы хрена.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА

В КЛЕТКАХ E.coli: ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ, РЕФОЛДИНГА, РЕАКТИВАЦИИ И ОЧИСТКИ.

5.1. Экспрессия ПХ в периплазматическую область клеток E.coli BL21(DE3).

5.2. Оптимизация системы рефолдинга ПХ из тел включения при экспрессии в цитоплазматическую область клеток E.coli BL21(DE3)pLysS.

5.3. Свойства рекомбинантной ПХс 6xHis на С-конце.

5.4. Получение и свойства мутантных форм ПХ.

Глава 6. АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ

РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ ПХ.

6.1 Амперометрическое определение Н2О2.

6.2 Стабильность сигнала биосенсора.

6.3 Разработка биферментных биосенсоров.

Глава 7. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО КОНЪЮГАТА

ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА С БПЖК.

7.1 Клонирование и экспрессия рекомбинантного конъюгата ПХ-БПЖК в клетках E.coli.

7.2 Физико-химические и иммунологические свойства рекомбинантного конъюгата ПХ-БПЖК.

V. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение, свойства и применение рекомбинантной пероксидазы хрена»

Изофермент С пероксидазы хрена (ЕС 1.11.1.7)- гликопротеин, молекулярная масса 44 кДа, относится к суперсемейству растительных пероксидаз [1,2], содержит простетическую группу протопорфирин-IX, два иона Са2+. ПХ катализирует одноэлектронное окисление большого числа органических и неорганических субстратов пероксидом водорода. ПХ нашла широкое применение в аналитической биохимии и биотехнологиии в качестве маркера антител, ДНК и низкомолекулярных соединений (аналитов).

В последние годы прогресс, достигнутый в клонировании и гетерологической экспрессии генов ПХ, открывает новые возможности по изучению структурно-функциональных взаимосвязей методами белковой инженерии.

Для получения рекомбинантной ПХ широкое распространение нашла система экспрессии в клетках E.coli. Существуют и другие способы экспрессии, такие как экспрессия в клетках насекомых [59], позволяющая получать фермент в активной, растворимой и гликозилированной форме, а также экспрессия в дрожжах [60]. Однако, эти системы экспрессии достаточно дороги и трудоемки, кроме того, система экспрессии в клетках насекомых не поддается масштабированию, поэтому они и не нашли такого широкого распространения, как экспрессия в клетках E.coli.

Рекомбинантная ПХ экспрессируется в клетках E.coli в нерастворимой, неактивной форме в телах включения. Процесс рефолдинга и реактивации апо-пероксидазы простетической группой многостадийный и достаточно трудоемкий.

Для прикладного применения, такого как, например, использования в биосенсорах, необходим более эффективный и надежный способ получения рекомбинантной ПХ. Таким образом, одной из основных задач данной работы был поиск путей оптимизации ранее описанных протоколов рефолдинга, реактивации и очистки рекомбинантной ПХ, а также исследование возможности периплазматической экспрессии для получения растворимого, активного фермента.

Высокая каталитическая активность ПХ в реакции восстановления пероксида водорода позволяет использовать пероксидазу в качестве высокоэффективного биоэлектрокатализатора, участвующего в прямом переносе электрона между электродом, активным центром фермента и субстратом. В присутствии субстрата при некотором потенциале электрода наблюдается пропорциональность между измеряемым током восстановления и концентрацией Н2О2. При этом эффективность прямого (безмедиаторного переноса электрона) является одним из важнейших условий разработки амперометрических биосенсорных систем на основе ПХ. Из всего вышеизложенного органически вытекает следующая цель настоящей работы -модификация поверхности рекомбинантной ПХ методами сайт-направленного мутагенеза функциональными группами для обеспечения эффективной ориентированной иммобилизации молекулы ПХ на поверхности электродов. В работе была предложена стратегия введения коротких олигогистидиновых последовательностей в поверхностные участки ПХ, что с одной стороны должно было обеспечить эффективную очистку рекомбинантного фермента с использованием металл-хелатной хроматографии (Ni-NTA агароза), и в то же время способствовать эффективной адсорбции соответствующих мутантов на поверхности золотых электродов (известно, что гистидины необратимо сорбируются на золоте).

Пероксидаза хрена нашла широкое применение в качестве фермента-маркера для иммуноферментного анализа. Химическое коньюгирование белков и гаптенов, приводят к частичной инактивации фермента и гетерогенности конъюгатов, что в свою очередь, оказывает влияние на специфичность и чувствительность анализа.

С развитием генной инженерии появилась возможность создавать рекомбинантные конъюгаты фермента маркера с антителами и белковыми антигенами. Такие конъюгаты обладают рядом преимуществ по сравнению с химически полученными, в частности, они гомогенны по составу, имеют 1:1 стехиометрию и воспроизводимы. Кроме того, рекомбинантные конъюгаты сохраняют 100 % как ферментативную, так и иммунологическую активность.

Достижения последних лет в гетерологической экспрессиии ПХ в клетках E.coli и реактивации рекомбинантной пероксидазы хрена дают возможность получения рекомбинантных конъюгатов с пероксидазой в качестве фермента-маркера и применения их в иммуноферментном анализе. Целью данного этапа работы было получение рекомбинантного конъюгата пероксидазы хрена с белком-переносчиком жирных кислот из серца человека (БПЖК) (human heart-type fatty acid binding protein, FABP). БПЖК - является новым высокоспецифичным маркером инфаркта миокарда. Получение рекомбинантного конъюгата ПХ с БПЖК позволит создать новые экспресс-системы для диагностики инфаркта миокарда.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Григоренко, Виталий Георгиевич

V. выводы

1. При экспрессии рекомбинантной пероксидазы хрена в переплазму клеток E.coli штамм BL21(DE3) с экспрессионным вектором pETpelHRPhis образуется растворимый, функционально активный фермент с общим выходом около 0,5 мг белка с 1 литра культуры клеток.

2. Цитоплазматическая система экспрессии рекомбинантной ПХ в клетках E.coli штамм BL21(DE3)pLysS с экспрессионным вектором pETHRPhis обеспечивает высокий уровень экспрессии ПХ в форме тел включения (целевой продукт составляет около 30% суммарного клеточного белка клетки). Введение гексагистидиновой последовательности (6xHis) в С- концевую область ПХ позволило эффективно осуществить метал-хелатную хроматографию для выделения и очистки рекомбинантного препарата фермента.

3. На основе данных о влиянии различных реагентов (мочевина, имидазол, глутатион,.) на свойства ПХ, была разработана новая схема рефолдинга и реактивации рекомбинантной ПХ из тел включения, позволяющая получить активный холо-фермент, с выходом 8-10 мг с 1 литра культуры E.coli.

4. Показано, что введение гексагистидиновых последовательностей в N- и С-концевые области фермента, а также замена посредством сайт направленного мутагенеза аминокислотных остатков двух внутренних поверхностных участков (57-61) и (211-216) на гистидиновые соответственно, с разной степенью влияет на каталитические свойства рекомбинантной ПХ.

5. Золотые электроды, модифицированные рекомбинантными формами ПХ, проявляют высокий и стабильный амперометрический сигнал биоэлектрокаталитического восстановления Н2О2 вследствие эффективного прямого переноса электронов между поверхностью золота и активным центром фермента, что служит основой для создания универсального сенсора на Н2О2, а также для создания биферментных сенсоров, основанных на со-иммобилизации ПХ и соответствующих Н2О2- образующих оксидаз (лизин-оксидаза, глюкоз-оксидаза,.).

6. Рекомбинантный конъюгат пероксидазы хрена с белком-переносчиком жирных кислот из сердца человека (БПЖК) обладает как каталитическими свойствами ПХ, так и иммуногенными свойствами БПЖК, что позволяет использовать его в иммуноферментном анализе. Выход целевого продукта составил 12 мг с 1 литра культуры E.coli.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Григоренко, Виталий Георгиевич, 2001 год

1. Welinder, K.G. (1992) Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases. Curr. Opin. Struct. Biol., 2:388-393.

2. Dunford, H.B. and Stillman, J.S. (1976) On the function and mechanism of action of peroxidases, Coordination Chemistry Reviews, 19, 187-251

3. English, A.M., Tsaprailis, G. (1995) Catalytic structure-function relationships in heme peroxidases. Adv.Inorg. Chem., 43:79-125

4. Welinder, K.G. Covalent structure of the glycoprotein horseradish peroxidase (EC1.11.1.7). FEBSLett., 1976. 72: p. 19-25.

5. Dunford, H.B. Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties, in Peroxidase in chemistry and Biology, J. Everse, K.E. Everse, and M.B. Grisham, Editors. 1992, CRC Press: Boca Raton, Florida, p. 1-24.

6. Kim, B.B. Pisarev, Y.Y. Egorov, A.M. A comparative study of peroxidases from Horseradish and Arthromyces Ramosus as labels in luminol-mediated chemiluminescent assay. Anal.Biochem., 1991. 199: p. 1-6.

7. Chiswell, D.J. and Ortlepp S.A. (1989) DNA sequence coding for HRP enzyme. European patent No EP0299682

8. Ortlepp, S.A., Pollard-Knight, D. and Chiswell, D.J. (1989) Expression and characterization of a protein specified by a synthetic horseradish peroxidase gene in Escherichia coli. J. Biotech., 11, 353-364.

9. Newmyer, S.L., Sun, J., Loehr, T.M., De Montellano P.R.O. Rescue of the horseradish peroxidase His-170->Ala mutant activity by imidazole: Importance of proximal ligand tethering. Biochemistry, 1996.35(39): p. 12788-12795.

10. Newmyer, S.L., De Montellano, P.R.O. Rescue of the catalytic activity of an H42A mutant of horseradish peroxidase by exogenous imidazoles. Journal of Biological Chemistry, 1996. 271(25): p. 14891-14896.

11. Tanaka, M., Ishimori, K., Morishima, I. The distal glutamic acid as an acid-base catalyst in the distal site of horseradish peroxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996. 227(2): p. 393-399.

12. Howes, B.D., Rodriguezlopez, J.N., Smith, А.Т., Smulevich, G. Mutation of distal residues of horseradish peroxidase: Influence on substrate binding and cavity properties. Biochemistry, 1997.36(6): p. 1532-1543.

13. Holzbaur, I.E., English, A.M., Ismail, A.A. Infrared spectra of carbonyl horseradish peroxidase and its substrate complexes: Characterization of pH-dependent conformers. Journal of the American Chemical Society, 1996. 118(14): p. 3354-3359.

14. Gilfoyle, D.J., Rodriguezlopez, J.N., Smith, A.T. Probing the aromatic-donor-binding site of horseradish peroxidase using site-directed mutagenesis and the suicide substrate phenylhydrazine. European Journal of Biochemistry, 1996. 236(2): p. 714-722.

15. Gazaryan, I.G., Galkin, A.G., Doseeva, V.V., Tishkov, V.I. Production and catalytic properties of Phe41->His and Phel43->Glu single-point mutants of horseradish peroxidase expressed in E-coli. Biochemistry Moscow, 1995. 60(10): p. 1187-1192.

16. Nagano, S., Tanaka, M., Watanabe, Y., Morishima, I. Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1995.207(1): p. 417-423.

17. Nagano, S., Tanaka, M., Ishimori, K., Watanabe, Y., Morishima, I. Catalytic roles of the distal site asparagine-histidine couple in peroxidases. Biochemistry, 1996. 35(45): p. 14251-14258.

18. Ozaki S., De Montellano, P.R.O. Molecular engineering of horseradish peroxidase: Thioether sulfoxidation and styrene epoxidation by Phe-41 leucine and threonine mutants. Journal of the American Chemical Society, 1995. 117(27): p. 7056-7064.

19. Tarns J.W., Welinder, K.G. Deglycosylation of Horseradish Peroxidase, in Biochemical, Molecular, and Physiological Aspects of Plant Peroxidases, J. Lobarzewski, et al., Editors. 1991, Printed by Imprimerie Nationale: Geneve, p. 111-114.

20. Egorov, A.M., Kim, B.B., Pisarev, Y.Y., Kapeliuch, Yu.L., Gazaryan I.G. Fundamental and applied aspects of reaction of enhanced chemiluminescence. in Bioluminescence and Chemiluminescence: Status Report. 1993. Chichester: John Wiley & Sons.

21. Banci, L. Structural properties of peroxidases. J. Biotechnol., 1997, 53,253-263.

22. Patterson, W.R., Poulos, T.L. (1995) Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase. Biochemistry, 34: 4331-4341

23. Schuller, D.J., Ban N, Van Huystee, R.B., McPherson, A., Poulos, T.L. (1996) Crystal structure of peanut peroxidase. Structure, 4:311-321.

24. Gajhede, M., Schuller, D.J., Henriksen, A., Smith, A.T. and Poulos, T.L. (1997) Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. Nature Structural Biology, 4, 12, 1032-1038.

25. Henriksen, A., Welinder, K.G., Gajhede, M. (1998) Structure of barley grainperoxidase refined at 1.9 A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH. J. Biol. Chem., 273, 2241-2248.

26. Savenkova, M.I., Newmyer, S.L., Ortiz de Montellano, P.R. Rescue of His42-Ala horseradish peroxidase by a Phe41-His mutation. Engineering of surrogate catalytic histidine. J.Biol.Chem. 1996, 271, 24598-24603.

27. Tanaka, M., Ishimori, K., Mukai, M., Kitagawa, Т., Morishima, I. Catalytic activities and structural properties of horseradish peroxidase distal His42-Glu or Gin mutant. Biochemistry, 1997, 36, 9889-9898.

28. Tanaka, M., Nagano, S., Ishimori, K., Morishima, I., (1997) Hydrogen bond network in distal site of peroxidases: Spectroscopic properties of Asn70-Asp horseradish peroxidase mutant. Biochemistry, 36, 9791-9798.

29. Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T., Thorneley, R.N.F., (1996) Role of Arg38 in horseradish peroxidase. A critical residue for substrate binding and catalysis. J. Biol. Chem., 271, 4023-4030.

30. Folkes, L.K., Candeas, L.P. (1997) Interpretation of the reactivity of peroxidase compounds I nad II with phenols by Marcus equation. FEBS Lett., 412, 305-308.

31. Nie, G.J., Aust, S.D. (1997) Spectral changes of lignin peroxidase during reversible inactivation. Biochemistry, 36, 5113-5119.

32. Smulevich, G. et.al. (1994) Characterization of recombinant horseradish peroxidase С and three site directed mutants, F41V, F41W and R38K by resonance Raman spectroscopy. Biochemistry, 33, 7398-7400.

33. Veitch, N.C. & Williams, R.J.P. (1990) Two dimensional 'H-NMR studies of horseradish peroxidase С and its interaction with indole-3-propionic acid. Eur. J. Biochem., 189, 351-362.

34. Ruzgas Т., Gorton L., Emneus J., Marco-Varga G. (1995) Kinetic models of horseradish peroxidase action on a graphite electrode, J. Electroanal. Chem., 391,41-49.

35. Lindgren A., Tanaka M., Ruzgas Т., Gorton L., Gazaryan I., Ishimori K., Morishima I. (1999) Direct electron transfer catalysed by recombinant forms of horseradish peroxidase: insight into the mechanism. Electrochem. Commun., 1, 171-175.

36. Presnova, G., Grigorenko, V., Egorov, A., Ruzgas Т., Lindgren A., Gorton L., Borchers, Т., (2000), Direct heterogeneous electron transfer of recombinant horseradish peroxidases on gold. Faraday Discuss., 116, 281-289

37. Ferapontova, E.E., Grigorenko, V.G., Egorov, A.M., Borchers, Т., Ruzgas Т., Gorton L., (2001) Direct Electron Transfer in the SystemGold Electrode -Recombinant Horseradish Peroxidases. J.Electroan. Chem.

38. Lindbladh, C.; Mosbach, K.; Bulow, L. (1993), Use of genetically prepared enzyme conjugates in enzyme immunoassay.Trends Biochem. Sci., 8, 279-283.

39. Porstman. Т.; Kiessig, S. T. J. (1992) Enzyme immunoassay techniques. An overview.

40. J. Immunol. Methods, 150, 5-21.

41. Wittkowski, A.; Daunert, S.; Kindy, M. S.; Bachas, L. G. (1993), Enzyme-linked immunosorbent assay for an octapeptide based on a genetically engineered fusion protein. Anal. Chem., 65, 1147-1151.

42. Schreiber, A.; Specht, В.; Pelsers, M. M. A. L.; Glatz, J.F.C.; Borchers, Т.; Spener, F. (1998) Recombinant human heart-type fatty acid-binding protein as standard in immunochemical assays. Clin. Chem. Lab. Med., 36,283-288.

43. Grigorenko VG, Chubar ТА, Kapeliuch YuL, Borchers T, Spener, F. and Egorov, A.M., (1999) New approaches for functional expression of recombinant horseradish peroxidase С in Escherichia Coli., Biocatalysis and Biotransformation, 17, 359-379.

44. Grigorenko, V., Andreeva, I., Borchers, Т., Spener, F. and Egorov A.M. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. (2001) Anal.Chem., 73, 11341139.

45. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorf, J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods in Enzymology, 185, 60-89.

46. George, P. (1953) The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome с peroxidase and horseradish peroxidase. Biochemical Journal, 54, 267-271.

47. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254

48. Fuhrhop, J.-H. and Smith, K.M. (1975) Laboratory Methods. In Porphyrins and Metalloproteins (ed. K.M. Smith). Elsevier, Amsterdam, pp 757-869.

49. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

50. Hartmann, C., Ortiz de Montellano, P.R. (1992) Baculovirus expression and characterization of catalytically active horseradish peroxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, 297, 61 -72.

51. Morawski В., Lin Z„ Cirino P., Joo H„ Bandara G, Arnold F.H. (2000) Functional expression of horseradish peroxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichiapastoris. Protein. Eng., 13(5), 377-84.

52. Freedman, R.B. (1995) The formation of protein disulphide bonds. Current Opinion in Structural Biology, 5, 85-91.

53. Skerra, A. and Pliickthun, A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science, 240, 1038-1041.

54. Le, H. V. and Trotta, P .P. (1991) Purification of secreted recombinant proteins from Escherichia coli. Bioprocess Technology, 12,163-181.

55. Gillet, D., Ducancel, F., Pradel, E., Leonetti, M., Menez, A. and Boulain, J.C. (1992) Insertion of a disulfide-containing neurotoxin into E. coli alkaline phosphatase: the hybrid retains both biological activities. Protein Engineering, 5, 273-278.

56. Ouzzine, M., Boyd, A. and Hulmes, D.J. (1996) Expression of active, human lysyl oxidase in Escherichia coli. FEBS Letters, 399, 215-219.

57. Berezin, I.V., Ugarova, N.N., Kershchengolts, B.M., Brovko, L.I.U. (1975) Effect of prosthetic group of horseradish peroxidase on enzyme stability (in Russian) Biokhimiia 40, 297-301

58. Hargrove, M.S., Krzywda, S., Wilkinson, A.J., Dou, Y., Ikeda-Saito, M. and Olson, J.S. (1994) Stability of myoglobin: a model for the folding of heme proteins. Biochemistry, 33, 11769-11775.

59. Tams J.W. and Welinder K.G. (1995) Mild chemical deglycosylation of horseradish peroxidase yields a fully active, homogeneous enzyme. Analytical Biochemistry, 228, 48-55

60. Smith, A.T. Santana, N., Dacey, S., Edwards, M., Bray, R.C., Thorneley, R.N.F. and Burke, J.F. (1990) Expression of a synthetic gene for horseradish peroxidase

61. С in Escherichia coli and folding and activation of the recombinant enzyme with2+

62. Ca and heme. Journal of Biological Chemistry, 265, 1335-13343.

63. Howes, B.D., Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T. and Smulevich, G. (1997) Mutation of distal residues of horseradish peroxidase: influence on substrate binding and cavity properties. Biochemistry, 36, 1532-1543.

64. Dalton, D.A., Diaz del Castillo, L., Kahn, M.L., Joyner, S.L. and Chatfield, J.M. (1996) Heterologous expression and characterization of soybean cytosolic ascorbate peroxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, 328, 1-8.

65. Phelps, С., Antonini, E. (1969) The combination of carbon monoxide-haem with apoperoxidase. Biochemical Journal, 114, 719-724.

66. Rubtsova, M.Y., Kovba, G.V. and Egorov, A.M. (1998) Chemiluminescent biosensors based on porous supports with immobilized peroxidase. Biosensors & Bioelectronics, 13, 75-85.

67. Nakane P.K., Pierce G.B. (1967) Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens. J. Cell Biol., 33, 307-318.

68. Avrameas S., Uriel J. (1966) Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. CR Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545.

69. Miles L.E. (1968) Labelled antibodies and immunological assay systems. Nature, 219, 186-189.

70. Engvall E., Perlmann P. (1971) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8, 871-874.

71. Frey A., DiGanzio J, Zurakowski D. (1998) A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J. Immunol. Methods, 221, 35-41.

72. Farr A.J., Nakane P.K. (1981) Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review. J. Immunol. Method, 47, 129-144.

73. Ishikawa E., Imagawa M., Hashida S., Yoshitake S., Hamaguchi Y., Ueno T. (1983) Enzyme-labeling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining. J. Immunoassay, 4, 209-327.

74. Pundir C.S., Kuchhal N.K., Bhargava A.K. (1998) Determination of urinary oxalate with oxalate oxidase and peroxidase immobilized on to glass beads. Biotechnol. Appl. Biochem., 27, 103-107.

75. Kuhlmann W.D., Pesche P. (1986) Glucose oxidase as label in histological immunoassays with enzyme-amplification in a two-step technique: coimmobilized horseradish peroxidase as secondary system enzyme for chromogen oxidation. Histochemistry, 85, 13-17.

76. Trivedi R.C., Rebar L., Berta E., Stong L. (1978) New enzymatic method for serum uric acid at 500 nm. Clin. Chem., 24, 1908-1911.

77. Ternaux J.P., Chamoin M.C. (1994) Enhanced chemiluminescent assays for acetylcholine. J. Biolumin. Chemilumin., 9, 65-72.

78. Guo J.A., Mo P.S., Li G.X. (1990) Immobilization of glucose oxidase and peroxidase and their application in flow-injection analysis for glucose in serum. Appl. Biochem. Biotechnol., 23, 15-24.

79. Elekes O., Moscone D., Venema K., Korf J. (1995) Bi-enzyme reactor for electrochemical detection of low concentrations of uric acid and glucose. Clin. Chim. Acta., 239, 153-165.

80. May S.W. (1999) Applications of oxidoreductases. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 370-375.

81. Zhao J., Henkens R.W., Crumbliss A.L. (1996) Mediator-free amperometric determination of toxic substances based on their inhibition of immobilized horseradish peroxidase. Biotechnol. Prog., 12, 703-708.

82. Ruzgas Т., Csoregi E., Emneus J., Gorton L., Marko-Varga G. (1996) Peroxidase-modified electrodes: Fundamentals and application. Anal. Chim. Acta, 330, 123-138.

83. Ferri Т., Poscia A., Santucci R. (1998) Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. Part II: Amperometric detection of hydrogen peroxide.,

84. Bioelectrochem. Bioenerg., 45, 221-226.

85. Wang B, Li B, Wang Z, Xu G, Wang Q, Dong S (1999) Sol-gel thin-film immobilized soybean peroxidase biosensor for the amperometric determination of hydrogen peroxide in acid medium. Anal. Chem., 71, 1935-1939.

86. Adam W, Lazarus M, Saha-Moller CR, Weichold O, Hoch U, Haring D, Schreier P (1999) Biotransformations with peroxidases. In: Adv Biochem Engineering Biotechnology, Th Scheper, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 63,73-108.

87. Doerge DR, Divi RL, Churchwell MI (1997) Identification of the colored guaiacol oxidation product produced by peroxidases. Anal. Biochem., 250, 1017.

88. Colonna S., Gaggero N., Richelmi C., Pasta P. (1999) Recent biotechnological developments in the use of peroxidases. Trends Biotechnol., 17, 163-168.

89. Thomas J.A., Morris D.R., Hager .LP. (1970) Chloroperoxidase. Formation of peroxide and halide complexes and their relation to the mechanism of the halogenation reaction. J. Biol. Chem., 245, 3129-3142.

90. Dawson J,H, (1988) Probing structure-function relations in heme-containing oxygenases and peroxidases. Science, 240,433-439.

91. Ortiz De Montellano P.R. (1992) Catalytic sites of hemoprotein peroxidases. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32, 89-107.

92. Ricard J., Job D. (1974) Reaction mechanisms of indole-3-acetate degradation by peroxidases. A stopped-flow and low-temperature spectroscopic study. Eur. J. Biochem., 44, 359-374.

93. Smith A.M., Morrison W.L., Millham P.J. (1982) Oxidation of indole-3-acetic acid by peroxidase: involvement of reduced peroxidase and compound III with superoxide as a product. Biochemistry, 21,4414-4419.

94. Nakajima R., Yamazaki I. (1979) The mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by horseradish peroxidases. J. Biol. Chem., 254, 872-878.

95. Mottley C, Mason RP (1986) An electron spin resonance study of free radical intermediates in the oxidation of indole acetic acid by horseradish peroxidase. J. Biol. Chem., 261, 16860-16864.

96. Dordick J.S., Klibanov A.M., Martella M.A. (1986) Horseradish peroxidase catalyzed hydroxylations: mechanistic studies. Biochemistry, 25, 2946-2951.

97. Kauffmann C., Petersen B.R., Bjerrum M.J. (1999) Enzymatic removal of phenols from aqueous solutions by Coprinus cinereus peroxidase and hydrogen peroxide. J. Biotechnol., 73, 71-74.

98. Al-Kassim L., Taylor K.E. (1994) Enzymatic removal of selected aromatic contaminants from wastewater by a fungal peroxidase from Coprinus macrorhizus in batch reactors. J. Chem. Tech. Biotechnol., 61, 179-182.

99. Sakharov I.Yu., Castillo J.A., Areza J.C., Galaev I.Yu. (2000) Purification and stability of peroxidase of African oil palm Elaies guineensis. Bioseparation, 9, 125-132.

100. Ferrari R.P., Laurenti E., Trotta F. (1999) Oxidative 4-dechlorination of 2,4,6-trichlorophenol catalyzed by horseradish peroxidase. J. Biol. Inorg. Chem., 4, 232-237.

101. Kim S.J., Shoda M. (1999) Purification and characterization of a novel peroxidase from Geotrichum candidum dec 1 involved in decolorization of dyes. Appl. Environ. Microbiol., 65,1029-1035.

102. Peterhans, A.; Mecklenburg, M.; Meussdoerffer, F.; Mosbach, K. (1987) A simple competitive enzyme-linked immunosorbent assay using antigen-beta-galactosidase fusions. Anal. Biochem., 163, 470-475.

103. Ann. N. Y. Acad. Sci., 646, 125-135.

104. Lindbladh, C.; Persson, M.; Bulow, L.; Stahl, S.; Mosbach, K. (1987) The design of a simple competitive ELIS A using human proinsulin-alkaline phosphatase conjugates prepared by gene fusion. Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 607-614.

105. Gillet, D.; Ezan, E.; Ducancel, F., Gaillard, C.; Ardouin, Т.; Istin, M.; Menez, A.; Boulain, J.-C.; Grogent, J.-M. (1993) Enzyme immunoassay using a rat prolactin-alkaline phosphatase recombinant tracer. Anal. Chem., 65, 1779-1784.

106. Lewis, J. C.; Daunert, S. (1999) Dual detection of peptides in a fluorescence binding assay by employing genetically fused GFP and BFP mutants. Anal. Chem., 71,4321-4327.

107. Lindbladh, С.; Mosbach, К.; Bulow, L. (1991) Preparation of a genetically fused protein A/luciferase conjugate for use in bioluminescent immunoassays. J. Immunol. Methods, 137, 199-207.

108. Gillet, D.; Ducancel, F.; Pradel, E.; Leonetti, M.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1992) Insertion of a disulfide-containing neurotoxin into E. coli alkaline phosphatase: the hybrid retains both biological activities. Protein Eng., 5, 273278.

109. Chanussot, C.; Bellanger, L.; Ligny-Lemaire, C.; Seguin, P.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1996) Engineering of a recombinant colorimetric fusion protein for immunodiagnosis of insulin. J. Immunol. Methods, 197, 39-49.

110. Kerschbaumer, R. J.; Hirschl, S.; Schwager, C.; Ibl, M.; Himmler, G. (1996) pDAP2: a vector for construction of alkaline phosphatase fusion-proteins. Immunotechnology, 2, 145-150.

111. Karlsson, R.; Michaelsson, A.; Mattsson, L. (1991) Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. J. Immunol. Methods, 145, 229-240.

112. A.M. Egorov, E.M. Gavrilova and I.Yu. Sakharov (2000) Applications of peroxidases in modern biotechnology, In Integrated Plant Systems, H. Greppin et al., eds. University of Geneva, pp. 1-18

113. Krueger, J.K., Stock, A.M., Schutt, C.E., Stock, J.B. 1990. Inclusion bodies from proteins produced at high levels in E.coli, pp. 136-142. L.M. Gierasch and J. King (eds.), Protein folding, American Association for Advances in Science, Washington.

114. Marston, F.A.O. 1986. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in E.coli. Biochem. J. 240: 1-12.

115. Mitraki, A., King, J. 1989. Protein folding intermediates and inclusion body formation. Bio/Technol. 7: 690-697.

116. Schein, C.H. 1989. Production of soluble recombinant proteinsin bacteria. Bio/Technol. 7: 1141-1147.

117. Taylor, G., Hoare, M., Gray, D.R., Marston, F.A.O. 1986. Size and density of protein inclusion bodies. Bio/Technol. 4: 553-557.

118. Anfmsen, C.B. 1973. Principles that govern the folding of protein chains. Science 181:223-230.

119. Achareya, A.S., Taniuchi, H. 1982. Implication of the structure and stability of disulfide intermediates of lysozyme on the mechanism of renaturation. Mol. Cell. Biochem. 44: 129-148.

120. Greighton, Т.Е. 1986. Disulfide bonds as probes of protein folding pathways, pp. 83-106. In: C.W.H. Hirs (ed.), Methods in Enzymology, vol. 131. Academic Press, New York.

121. Greighton, Т.Е. 1990. Protein folding. Biochem. J. 270: 1-16.

122. Freedman, R.B., Hillson, D.A. 1980. Formation of disulfide bonds, pp. 157-212. In: R.B. Freedman and H.C. Hawkins (eds.), The enzymology of post-translational modification of proteins, vol. 1. Academic Press, London.

123. Gierasch, L.M., King, J. 1990. Protein folding. American Association for Advances in Science, Washington.

124. Harrison, S.C., Durbin, R. 1985. Is there is a single pathway for the folding of a polypeptide chain? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4028-4030.

125. Jaenicke, R. 1988. Is there a code for protein folding?, pp. 16-36. In: R. Huber and E.L. Winnaker (eds.), Protein structure and protein engineering, vol. 39. Springer-Verlag, Berlin.

126. Jaenicke, R. 1991. Protein folding: local structure, domains and assemblies, pp. 387-396. In: I. Jornvall and G. Gustavsson (eds.), Methods ion protein sequence analysis. Birkhauser Verlag, Basel.

127. Jaenicke, R. 1991. Protein folding: local structure, domains, subunits and assemblies. Biochemistry 30: 3147-3161.

128. King, J. 1986. Genetic analysis of protein folding pathways. Bio/Technol. 4: 297-303.

129. King, J. 1989. Deciphering the rules of protein folding. Chem. Eng. News 67: 32-54.

130. Kim, P.S., Baldwin, R.L. 1982. Specific intermediates in the folding reaction of small proteins and the mechanism of protein folding. Ann. Rev. Biochem. 51: 459-489.144145146147148149150,151.152.153.154.155.156.157.

131. Ahmed, A.K., Schaffer, S.W., Wetlaufer, D.B. 1975. Nonenzymatic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers. J. Biol. Chem. 250: 8477-8482.

132. Saxena, V.P., Wetlaufer, D.B. 1970. Formation of three-dimensional structure in proteins. Biochemistry 9: 5015-5022.

133. Odorzynski, T.W., Light, A. 1979. Refolding of the mixed disulfide of bovine trypsinogen and glutathione. J. Biol. Chem. 254: 4291-4295. Anderson, W.L., Wetlaufer, D.B. 1976. The foldingpathwayof reduced lysozyme. J. Biol. Chem. 251: 3147-3153.

134. Grigorenko V, Andreeva I, Borchers T, Spener F, Egorov A. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. Anal Chem. 2001 Mar 15; 73(6), 1134-9.