Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Орлов, Алексей Владимирович

• Орлов, Алексей Владимирович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Орлов, Алексей Владимирович

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Антитела в иммуноанализе

1.2. Типы и форматы иммуноанализа

1.3. Основные количественные характеристики иммуноанализа

1.4. Методы изучения межмолекулярных взаимодействий

1.5. Твердофазный иммуноферментный анализ

1.6. Иммунохроматографический анализ

1.7. Иммуноанализ с использованием технологии микрочипов

1.8. Основные методы детекции, применяемые в иммуноанализе

1.9. Использование магнитных частиц в иммуноанализе

1.10. Свойства магнитных частиц

1.11. Методы детекции магнитных частиц

Глава 2. Разработка и верификация метода изучения взаимодействий между биомолекулами в режиме реального времени с помощью спектрально-корреляционной интерферометрии

2.1. Материалы и методы

2.2. Результаты исследования обратимых изменений толщины сополимеров 1\Г,1\Г-диметилакриламида и N-акрилоил-ш-аминофенилборной кислоты

2.3. Влияние пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином

Глава 3. Количественный мониторинг каждой стадии иммуноанализа с помощью метода СКИ и амплификация СКИ-сигнала за счет использования магнитных наночастиц

3.1. Материалы и методы

3.2. Оптимизация процесса иммобилизации антител

3.3. Кинетическая характеризация каждой стадии иммуноанализа

Глава 4. Разработка метода магнитного иммуноанализа на поверхности непрозрачных волоконных фильтров для детекции стафилококковых токсинов в цельном молоке

4.1. Материалы и методы

4.2. Характеризация твердой фазы

4.3. Изучение аналитических свойств метода

4.4. Исследование возможности увеличения объема пробы

Глава 5. Разработка иммунохроматографического экспресс-анализа с использованием магнитных наномаркеров для детекции онкомаркера ПСА в сыворотке крови человека

5.1. Материалы и методы

5.2. Оптимизация условий магнитной иммунохроматографии

5.3. Изучение аналитических характеристик магнитной иммунохроматографии

Результаты и выводы

Благодарности

Список используемых сокращений

Список использованной литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров»

Введение

Актуальность проблемы

В последние годы значительное внимание исследователей во всем мире уделяется разработке биофизических методов для высокочувствительной количественной регистрации биомолекул и их взаимодействий между собой. В частности, высокая востребованность со стороны таких отраслей, как фармацевтическая промышленность, медицинская диагностика, экологический мониторинг и др., диктует необходимость разработки точных и скоростных методов обнаружения белковых молекул в биологических образцах сложного состава (кровь, сыворотка, слюна, молоко и т.д.). Исследования в данном направлении требуют междисциплинарного подхода и чрезвычайно важны, поскольку их результаты могут использоваться для решения широкого круга научных и прикладных задач.

Одним из наиболее популярных методов детекции биомолекул является иммуноанализ. Традиционные количественные методы иммуноанализа, такие как иммуноферментный анализ, характеризуются длительным временем получения результата (не менее 2 ч). Относительно быстрые методы, позволяющие получить результат в течение 10 мин, например иммунохроматографический анализ, как правило, дают только качественную оценку в терминах "да/нет".

Перспективным подходом для увеличения чувствительности и сокращения времени иммуноанализа является использование магнитных наночастиц (МЧ) в качестве детектируемых меток. Одним из преимуществ таких меток является возможность их использования в непрозрачных или сильно рассеивающих средах, например, в сочетании с трехмерными твердыми фазами, где применение традиционных окрашенных, флуоресцентных и ферментных маркеров сильно ограничено.

Выбор метода детекции применяемых меток - один из факторов, оказывающих существенное влияние на эффективность иммуноанализа. Методы регистрации МЧ на основе гигантского магнитного сопротивления (ГМС), как

правило, характеризуются невысоким соотношением сигнал/шум, требуют съемных электрических контактов со считывающим устройством и весьма затратны для однократных применений. Кроме того, ГМС-детекторы преимущественно используются в сочетании с магнитными кластерами, соизмеримыми по размеру с чувствительным элементом сенсора, что приводит к слабой зависимости сигналов от концентрации аналита и высокому неспецифическому связыванию. Одна из наиболее чувствительных методик регистрации МЧ, основанная на использовании криогенных сверхпроводящих квантовых интерференционных магнетометров, является достаточно дорогостоящей и труднодоступной для рутинного использования в медицинской диагностике и экологическом мониторинге. Таким образом, разработка методов анализа, использующих магнитные частицы в качестве меток в сочетании с методами регистрации таких меток, обеспечивающими высокую чувствительность, доступность и высокое отношение сигнал/шум, является перспективным направлением в разработке новых подходов в биосенсорике и иммуноанализе.

Одним из этапов разработки иммуноанализа является оптимизация его условий: выбор антител, способа их иммобилизации, времени инкубации и концентрации иммунореагентов, а также состава буферных и стабилизирующих растворов. Влияние каждого из этих параметров можно оценить с помощью методов, использующих различные метки, лишь на завершающей стадии иммуноанализа. Безметочные оптические методы могут значительно повысить эффективность разработки протокола иммуноанализа за счет количественного мониторинга в режиме реального времени взаимодействий между биомолекулами на каждой стадии анализа, а также сокращения времени и числа операций. Таким образом, развитие безметочных методик для изучения в реальном времени межмолекулярных взаимодействий также является актуальной задачей.

Цели и задачи работы

Цель работы состояла в разработке биофизических методов, основанных на использовании магнитных наночастиц в качестве детектируемых меток, для

высокочувствительной количественной регистрации биомолекул и их взаимодействий между собой. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

• Разработка и верификация методики количественной оценки взаимодействия биомолекул между собой и с магнитными наночастицами путем мониторинга в режиме реального времени каждого этапа иммуноанализа с помощью спектрально-корреляционной интерферометрии.

• Изучение с помощью метода спектрально-корреляционной интерферометрии конформационных изменений при смене состава водного окружения слоя сополимеров N,N1-дим етил акр и лам ида и Ы-акрилоил-ш-аминофенилборной кислоты, иммобилизованных на стеклянной поверхности.

• Изучение влияния магнитных наночастиц на предел детекции метода спектрально-корреляционой интерферометрии при их использовании для амплификации сигнала по сравнению с безметочной регистрацией.

• Разработка метода детекции биомолекул, основанного на использовании объемных волоконных фильтров в качестве твердой фазы иммуноанализа и магнитных наномаркеров.

• Разработка метода детекции биомолекул, основанного на принципе иммунохроматографии с использованием МЧ в качестве меток в сочетании с методом регистрации нелинейных магнитных материалов на комбинаторных частотах.

Научная новизна и практическая значимость

Разработан метод регистрации биомолекул, обладающий оригинальным сочетанием аналитических характеристик: а) широким линейным диапазоном, составляющим более 3 порядков концентрации аналита; б) малой продолжительностью анализа; в) возможностью анализировать образцы практически любого объема, причем чувствительность метода растет при увеличении объема образца; г) отсутствием пробоподготовки для биологических образцов сложного состава, например, цельного молока. Данные свойства метода

продемонстрированы на примере детекции токсинов, продуцируемых бактериями Золотистого стафилококка. Новизна метода заключается в применении объемных волоконных фильтров в качестве твердой фазы анализа в сочетании с использованием магнитных наномаркеров, регистрируемых со всего объема фильтров методом детекции нелинейных магнетиков на комбинаторных частотах. Применение фильтров обеспечивает большую реакционную поверхность твердой

■у

фазы - 20 см в объеме около 35 мкл, а также эффективное взаимодействие и быстрое концентрирование антигена на твердой фазе с иммобилизованными антителами непосредственно в ходе анализа. Применяемый подход для регистрации МЧ характеризуется высоким отношением сигнал/шум, поскольку окружающие диа- и парамагнитные материалы, такие как компоненты крови, стекло, вода, пластик и т.д., не вносят вклад в детектируемый сигнал.

Разработан количественный метод иммунохроматографического анализа с использованием магнитных наномаркеров для регистрации в сыворотке крови человека онкомаркера - простатического специфического антигена (ПСА). Данный метод совмещает преимущества лабораторных методов и экспресс-тестов на основе сухой химии: он обладает высокой чувствительностью и позволяет получать количественные результаты при простоте использования и коротком времени получения результата.

Оба разработанных метода иммуноанапиза могут найти практическое применение в области диагностики заболеваний и биобезопасности как в лабораторных, так и домашних условиях, а также для контроля пищевой продукции, экологическом мониторинге, в ветеринарии и т.д.

Разработана методика для количественного изучения взаимодействия биомолекул с целью мониторинга каждой стадии иммуноанапиза. Методика основана на принципе спектрально-корреляционной интерферометрии с использованием в качестве сенсорных чипов стандартных микроскопных покровных стекол. Методика успешно испытана на примере изучения влияния пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином, а

также для изучения обратимых конформационных изменений полимерных структур на поверхности стекла. Полученные результаты подтверждены независимыми методами: вискозиметрией, эллипсометрией, сканирующей электронной микроскопией, иммуноферментным анализом. Продемонстрирована возможность количественного мониторинга каждого этапа иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц в качестве меток. Оригинальность разработанного подхода заключается в возможности регистрации в реальном времени взаимодействия между биомолекулами непосредственно на стеклянной поверхности без нанесения дополнительных проводящих или диэлектрических пленок. Разработанная методика может найти применение как для развития новых методов иммуноанализа, так и для широкого круга приложений, требующих количественной оценки динамики межмолекулярных взаимодействий.

На примере детекции кардиомаркера сердечного тропонина I (сТн1) показано, что применение магнитных наночастиц в качестве меток приводит к усилению сигнала спектрально-корреляционной интерферометрии, причем использование магнитных наномаркеров приводит к увеличению чувствительности по сравнению с безметочной регистрацией примерно в 100 раз. Динамический диапазон составил около 3 порядков величины концентрации. Благодаря высокой чувствительности и широкому динамическому диапазону, разработанный метод может рассматриваться в качестве привлекательного инструмента с широкодоступными и низкозатратными расходными материалами (одноразовыми сенсорными чипами) для проведения иммуноанализа в реальном времени в таких областях, как диагностика заболеваний, регистрация патогенов в продуктах питания, мониторинг окружающей среды.

Положения, выносимые на защиту

1. На основе спектрально-корреляционной интерферометрии развита методика количественной оценки взаимодействия между биомолекулами. Эффективность методики экспериментально продемонстрирована на примере исследования

влияния пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином.

2. С помощью спектрально-корреляционной интерферометрии показаны обратимые изменения конформации привитых на стеклянную поверхность сополимеров Ы,Ы-диметилакриламида и М-акрилоил-т-аминофенилборной кислоты при смене состава водного окружения.

3. Установлено, что магнитные наночастицы диаметром ~ 50 нм, используемые для амплификации сигнала при детекции сердечного тропонина I с помощью спектрально-корреляционой интерферометрии, вызывают улучшение предела детекции более чем в 100 раз по сравнению с безметочной регистрацией. Показано, что в результате такой амплификации достигается предел детекции сердечного тропонина I на уровне 0,1 нг/мл и динамический диапазон — около 3 порядков величины концентрации.

4. Разработан метод регистрации биомолекул с использованием магнитных наночастиц в качестве меток, регистрируемых по нелинейному перемагничиванию на комбинаторных частотах, с применением в качестве твердой фазы объемных волоконных фильтров с развитой площадью поверхности. Характерные особенности разработанного метода продемонстрированы на примере определения в цельном молоке стафилококковых токсинов, энтеротоксина А (СЭА) и токсина синдрома тканевого шока (ТСТШ). Показано, что за счет концентрирования токсинов на волоконной твердой фазе с иммобилизованными антителами чувствительность метода растет с увеличением объема пробы. При времени анализа 2 ч и объеме пробы 30 мл достигнут предел детекции для ТСТШ - 4 пг/мл и для СЭА - 10 пг/мл. Установлено, что при времени анализа 25 мин пробы объемом 150 мкл предел детекции ТСТШ составляет 0,1 нг/мл, СЭА - 0,3 нг/мл. Продемонстрирована близкая к линейной зависимость регистрируемых сигналов от изменения концентрации аналита в диапазоне более 3 порядков величины.

5. Разработан количественный экспресс-метод детекции онкомаркера -простатического специфического антигена (ПСА) - в сыворотке крови человека

на основе иммунохроматографического анализа с использованием магнитных наномаркеров. Показано, что предел количественной детекции ПСА составляет 25 пг/мл, динамический диапазон - более 3 порядков величины концентраций.

Апробация результатов

Результаты работы были представлены на 13 российских и международных конференциях: International Conference on the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers (Minneapolis, Minnesota, U.S.A., 22-26 May 2012; Rostock, Germany, 25-29 May 2010), European Magnetic Sensors and Actuators Conference (Prague, Czech Republic, 1-4 July 2012; Bodrum, Turkey, 4-7 July 2010), Conference on Optical Chemical Sensors and Biosensors (Barcelona, Spain, 1-4 April 2012; Prague, Czech Republic, 28-31 March 2010), III Международный Симпозиум «Актуальные проблемы биофотоники - 2011» (Санкт-Петербург - Нижний Новгород, 16-22 июля 2011), Московский международный симпозиум по магнетизму (Москва, 2125 августа 2011), Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий RUSNANOTECH (Москва, 26-28 октября 2011; 1-3 ноября 2010), Научная конференция МФТИ (Москва-Долгопрудный, 10-30 ноября 2011; 27-30 ноября 2009), III Евразийский конгресс «Медицинская физика - 2010» (Москва, 21-25 июня 2010).

Публикации

По материалам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, и 16 тезисов докладов в сборниках трудов конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, одной главы литературного обзора, четырех глав результатов и обсуждения экспериментов, заключения, списка цитируемой литературы, в который входит 169 источников. Работа изложена на 131 странице, содержит 49 рисунков и 5 таблиц.

Глава 1. Обзор литературы

Иммуноанализ - это биохимический метод выявления различных веществ, основанный на специфическом взаимодействии определяемого соединения с соответствующими антителами. Разнообразные методы иммуноанализа нашли широкое применение в таких областях, как диагностика заболеваний, ветеринария, мониторинг окружающей среды, контроль качества продуктов питания, разработка лекарственных препаратов.

Принцип иммуноанализа основан на том, что антитела селективно связываются с мишенями (антигенами) даже в присутствии значительного количества нецелевых молекул, находящихся в таких многокомпонентных биологических образцах, как кровь, моча, слюна и т.д. Образовавшийся комплекс антитела с анализируемым веществом, как правило, выявляется с помощью специальных меток: радиоактивных, ферментных, флуоресцентных, магнитных и др. Хронологически первым был разработан радиоиммунный анализ (РИА). Данный метод, предложенный в конце 50-х годов, был основан на использовании

125 1

в качестве метки изотопа I . Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, за что один из его авторов (Коэа1уп Уа1ош) в 1977 г. была удостоена Нобелевской премии.

1.1. Антитела в иммуноанализе

Основные характеристики иммуноанализа, такие как специфичность, чувствительность и универсальность, во многом основаны на следующих свойствах антител:

• способность взаимодействовать с широким спектром природных и искусственных химических веществ, биологических молекул, клеток и вирусов,

• специфичность в отношении вещества, с которым взаимодействует антитело,

• высокое сродство между антителом и мишенью.

Получение антител, обладающих указанными свойствами, является одним из ключевых этапов разработки методов иммуноанализа.

1.1.1. Структура и функции антител

Антитела или иммуноглобулины (Ig) представляют собой гликопротеины, используемые иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных веществ, таких как бактерии, вирусы и другие агенты, называемые антигенами. У млекопитающих существует пять классов антител: IgG, IgA, IgM, IgE и IgD. Кроме того, выделяют четыре подкласса IgG человека (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), четыре подкласса IgG мыши (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3), два подкласса IgA человека. Непосредственно для иммуноанализа особое значение имеют классы IgG и IgM.

Антитела в организме выполняет две ключевые функции: антиген-связывающую и эффекторную. Каждой из этих функций соответствует определенный участок молекулы антитела. Молекула антитела в зависимости от класса может состоять из одной или нескольких повторяющихся структурных единиц, каждая из которых по пространственной структуре напоминает букву Y. Основным иммуноглобулином сыворотки здорового человека является IgG, который составляет 70-75 % всей фракции иммуноглобулинов2'3'4 и состоит из одной Y-образной структурной единицы.

Молекула IgG имеет молекулярную массу -150 кДа и состоит из четырех полипептидных цепей: двух идентичных легких цепей по ~ 25 кДа (L-цепей) и двух идентичных тяжелых цепей по ~ 50 кДа каждая (Н-цепей), которые связаны дисульфидными связями (рис 1.1). Различия между классами иммуноглобулинов определяются Н-цепями. У иммуноглобулинов человека выделяют 5 разновидностей Н-цепей: а, Р, s, у и р.. L-Цепи имеют две разновидности: к и А,.

В молекуле IgG выделяют 3 фрагмента, которые образуются при расщеплении протеазой папаином: два Fab-фрагмента («fragment antigen binding» - антиген-связывающий фрагмент) и один Fc-фрагмент («fragment crystallizable» -кристаллизуемый фрагмент). Каждый Fab-фрагмент состоит из одной L-цепи и N-

концевой части Н-цепи, соединенных дисульфидными связями. Каждый из РаЬ-фрагментов обладает способностью связывать антиген, обеспечивая, таким образом, бивалентность молекулы Участок антигена, с которым

взаимодействует БаЬ-фрагмент антитела, называется эпитопом. Бс-фрагмент состоит из С-концевой части двух Н-цепей. Бс-фрагмент несет множество эффекторных функций (взаимодействие с системой комплемента, связывание с клеточными рецепторами моноцитов макрофагов и т.д.). При расщеплении молекулы ^О протеазой пепсином образуется два фрагмента: бивалентный Р(аЬ')2-фрагмент и Бс-фрагмент. Стоит отметить, что животные из семейства верблюдовых (лат. СатеНЛае) - верблюды, ламы, викунии - имеют антитела, не содержащие легких цепей5"6.

ГТМНП

1

ЯаЬ

7

Рисунок 1.1. Схематическое изображение структуры молекулы .

Среди всех классов иммуноглобулинов характеризуются самым

высоким выходом при иммунизации и наибольшей аффиностью связывания с эпитопом антигена. В совокупности с их стабильностью в процессах получения и очистки, наличием нескольких функциональных сайтов, которые могут использоваться для химической модификации, данные характеристики делают наиболее популярным инструментом при разработке методов иммуноанализа.

Еще один класс иммуноглобулинов, используемых в иммуноанализе, это 1§М. Антитела данного класса составляют 5 - 10% от общего количества иммуноглобулинов в сыворотке крови. Молекула ^М представляет собой пентамер, состоящий из пяти структурных У-образных субъединиц, соединенных между собой дисульфидными связями и 1-цепью (рисунок 1.2). Каждая из тяжелых цепей ^М состоит из пяти доменов. Функция ^М заключается в нейтрализации вирусов, агглютиниции бактерий и активации системы комплемента. Они играют важную роль в активации фагоцитоза и элиминации возбудителя из кровеносного русла.

£

Рисунок 1.2. Схематическое изображение структуры молекулы ^М .

Поскольку каждая молекула 1§М имеет 10 сайтов связывания антигена, то антитела данного класса могут эффективно использоваться для агглютинации и усиления сигнала в иммуноанализе. Однако 1§М, как правило, характеризуется более низкой аффинностью и сложностью в очистке и фракционировании по сравнению с ^в8. Кроме того, в ряде случаев большая молекула 1§М испытывает стерические затруднения при взаимодействии с антигеном.

Остальные классы иммуноглобулинов (1§А, ^О, ^Е) редко используются в иммуноанализе из-за сложности в их получении и низкой аффинности. Краткое сравнение различных классов иммуноглобулинов человека представлено в таблице 1.

Таблица 1.1. Классы иммуноглобулинов человека .

Концен- Общая .. Кол-во „.

Молекулярная %

трацияв молекуляр- ' доменов

масса Н-цепн „ гликозилирова-

сыворотке ная масса . .. . тяжелой

г / \ 1 тт л (кДд) НИН

(мг/мл) (кда) цепи

Время полужизнн в

сыворотке (дней)

1§С1 1§С2

5-10 1.8-3.5

ДОЗ 0.6-1.2 ДО4 0.3-0.6 1ЙМ 0.5-2.0 0.8-3.4 1«А2 0.2-0.6

0.003-0.3

0.0001* 0.0007

146 146 170 146 900 160 160 165 185

51 51 60 51 67 56 53 60 70

4 4 4

4

5 4 4

4

5

3^1 3^ 3^ 3-4 12-16 10-15 10-15 14-17 13-16

12-21 12-21 7-8 11-21 10 5,8 5,8

1.1.2. Поликлональные антитела

Поликлональные антитела получают путем иммунизации животных, как правило, млекопитающих: мышей, кроликов, крыс, овец, коз, лошадей, хомяков, морских свинок и др. Для получения поликлональных антител антиген вводится в организм животных. В результате иммунного ответа в сыворотке появляются иммуноглобулины, специфичные к введенному антигену. Такая сыворотка, насыщенная иммуноглобулинами называется антисывороткой. В таблице 1.2. представлены средние объемы антисывороток, получаемых с помощью различных видов животных. Для лабораторных исследований, если требуются небольшие объемы антисыворотки (< 100 мл), обычно используются поликлональные антитела кролика. В случае необходимости получить большие объемы антисыворотки, как правило, используют козьи или овечьи поликлональные антитела. Поликлональные антитела могут быть получены также в куриных яйцах101112,13.

Таблица 1.2. Средние объемы антисывороток, получаемых с помощью

и

__различных видов животных

Вид животного Объем (мл/забор) Объем (мл/месяц)

Мышь 0,1-0,2 0,2-0,4

Морская свинка 1 -2 3-5

Кролик 25 50-70

Овца 800 2000-2500

Лошадь 3000 6000-8000

Корова 4000 8000-10000

При первичной иммунизации животного, начиная с 3-7 дня, в сыворотке начинает возрастать концентрация иммуноглобулинов14. Данный рост наблюдается от нескольких дней до 2 недель, после чего уровень антител в сыворотке снижается (рисунок 1.3). На данной стадии основная доля иммуноглобулинов представлена классом ^М. При повторной иммунизации через 3-4 недели после первого введения антигена можно получить значительно более высокие уровни антител обладающих большей аффинностью к

антигену. Пиковая концентрация иммуноглобулинов при этом достигается через 10-14 дней после второго введения антигена. Таким образом, стандартный

протокол иммунизации для получения поликлональной антисыворотки содержит два этапа введения антигена с интервалом в 4 недели и забор крови через 10 дней после второго введения. Если концентрация специфических антител в антисыворотке при этом оказывается недостаточной, то процедуру введения антигена продолжают повторять с интервалом в 1 месяц.

с; СУ ь-

н X

го

8

а.

1 4

00 о

Иммунизации: 0-й и 28-й день

Рисунок 1.3. Получение поликлональных антител с использованием двух этапов иммунизации

Поликлональные анитела представляют собой смесь иммуноглобулинов образовавшихся в результате функционирования многочисленных клеточных клонов и неоднородны по изотипу и аффинности. Кроме того, поликлональные антитела взаимодействуют с различными эпитопами антигена. С целью стандартизации и повышения аффинности поликлональных антител антисыворотка может быть очищена с помощью аффинной хроматографии.

1.1.3. Моноклоналъные антитела

В то время как поликлональные антитела продуцируются в разных клонах иммунных клеток, моноклональные антитела получают из одной клеточной линии, то есть из клеток, произошедших от одной ютетки-предшественницы. Технология получения моноклональных антител основана на слиянии клеток млекопитающих, которые продуцируют антитела, с опухолевыми клетками, обладающими способностью безостановочно делиться15. В результате этого слияния получается так называемая гибридома, которая непрерывно вырабатывает антитела. Впервые получение моноклональных антител было описано в 1975 году в работе G. Köhler и С. Milstein16, за что эти ученые удостоились Нобелевской премии по физиологии 1984 года.

Получение моноклональных антител включает в себя иммунизацию животного, выделение иммунных клеток из селезенки и их слияние с раковыми клетками, например, клетками миеломы (рисунок 1.4). Из полученной в результате слияния библиотеки гибридом с помощью методов скрининга отбираются клоны, вырабатывающие наиболее специфичные и аффинные антитела.

Выделение моноклональных антител

Клонирование антител ообразующих гибридом

Рисунок 1.4. Схема получения моноклональных антител

Моноклональные антитела идентичны между собой, не содержат посторонних антител, однородны по изотипу, распознают один и тот же эпитоп антигена и обладают одинаковой аффинностью.

1.1.4. Рекомбинантные антитела

С помощью генно-инженерных методов возможно экспрессировать Н-и L-цепи иммуноглобулинов, как индивидуальные белки, и создавать рекомбинантные антитела. В настоящее время существеут широкое разнообразие различных подходов для получения рекомбинантных антител18'19'20,21,22'23'24'25. При этом технология получения рекомбининтных антител за счет манипуляций с нуклеотидной последовательностью позволяет изменять основные характеристики антител: аффинность, специфичность, валентность, потенциальную иммуногенность и т.д. . Фрагменты антител, не содержащих

27

олигосахариды, могут быть получены с помощью бактерий, например, Е. coli . В том случае, если требуется получение полноразмерных молекул антител, содержащих Fc-фрагмент или имеющих в своем составе олигосахариды, то обычно используются клетки млекопитающих, например клеточная линия

28 29 30 31

яичника китайского хомячка ' , дрожжей , насекомых , растении, таких как Nicotiana или Arabidopsis ' ' , или хлоропласты водорослей .

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Орлов, Алексей Владимирович, 2014 год

Список использованной литературы

1 Yalow R. S., Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man // The Journal of Clinical Investigation. 1960. V. 39. № 7. P. 1157-75.

2 Schroeder Jr H. W., Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins // Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2010. V. 125. № 2. P. S41-S52.

3 Volkov V. V., Kayushina R. L., Lapuk V. A., Shtykova E. V., Varlamova E. Y., Malfois M., Svergun D. I. Solution structures of human immunoglobulins IgG and IgM and rheumatoid factor IgM-RF // Crystallography Reports. 2003. V. 48. № 1. P. 98-105.

4 Padlan E. A. Anatomy of the antibody molecule // Molecular immunology. 1994. V. 31. № 3. P. 169-217.

5 Ungar-Waroni H., Elias E., Gluckman A. and Trainin Z. Dromedary IgG: purification, characterization and quantitation in sera of dams and newborns // Israel J. Vet. Med. 1987. V. 43. P. 198-203.

6 Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E. B., Bendahman N. and Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains //Nature. 1993. V. 363. P. 446^148.

7 Johnson I. D. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Edition. Life Technologies Corporation, 2010.

8 Ehrenstein M. R., Notley C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator // Nature Reviews Immunology. 2010. V. 10. P. 778-786.

9 Kerr M.A., Thorpe R. Immunochemistry LabFax, 1st Edition. Academic Press,

1994.

10 Jensenius J. C., Andersen I., Hau J., Crone M. and Koch C. Eggs: conveniently packaged antibodies. Methods for purification of yolk IgG // J. Immunol. Methods. 1981. V. 46. P. 63-68.

11 Schade R., Calzado E. G., Sarmiento R., Chacana P. A., Porankiewicz-Asplund J. and Terzolo H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine // Altern. Lab. Anim. 2005. V. 33. P. 129-154.

12 Dias da Silva W. and Tambourgi D. V. IgY: a promising antibody for use in immunodiagnostics and in immunotherapy // Vet. Immunol. Immunopathol. 2010. V. 135. P. 173-180.

13 Spillner E., Braren I., Greunke K., Seismann H., Blank S., du Plessis D. Avian IgY antibodies and their recombinant equivalents in research, diagnostics and therapy // Biologicals. 2012 V. 40. № 5. P. 313-322.

14 Howard G. C., Bethell D. R. Basic Methods in Antibody Production and Characterization. CRC Press, 2000.

15 Bartal A.H., Hirshaut Y. Methods of hybridoma formation. Humana Press,

1987.

16 Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity//Nature. 1975. V. 256. № 5517. P. 495^97.

17 Buchwalow I.B., Böcker W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. Chapter 1. Antibodies for immunohistochemistry. Springer-Verlag, 2010.

18 Souriau C., Hudson P. J. Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy// Expert opinion on biological therapy. 2001. V. 1. № 5. P. 845-855.

19 Arbabi-Ghahroudi M., Tanha J., MacKenzie R. Prokaryotic expression of antibodies // Cancer and Metastasis Reviews. 2005. V. 24. № 4. P. 501-519.

20 Buchner J., Rudolph R. Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli // Nature Biotechnology. 1991. V. 9. №2. P. 157-162.

21 Cowell L. G., Kepler Т. B. The nucleotide-replacement spectrum under somatic hypermutation exhibits microsequence dependence that is strand-symmetric and distinct from that under germline mutation // The Journal of Immunology. 2000. V. 164. № 4. P. 1971-1976.

22 Donzeau M., Knappik A. Recombinant monoclonal antibodies // Methods Mol. Biol. 2007. V. 378. P. 14-31.

23 Honegger A. Trobleshooting antibody fragments // URL: http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Introduction/VirtualSeminars/AE2003/source/sl ide01.htm.

24 Maynard J., Georgiou G. Antibody engineering // Annual review of biomedical engineering. 2000. V. 2. № 1. P. 339-376.

25 Winter G., Griffiths A. D., Hawkins R. E., Hoogenboom H. R. Making antibodies by phage display technology // Annual review of immunology. 1994. V. 12. № 1. P. 433-455.

26 Альтшулер E., Серебряная Д. В., Катруха А. Г. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности // Усп. биол. химии. 2010. Т. 50. С. 203-258.

Charlton К. A. Expression and Isolation of Recombinant Antibody Fragments in E. Coli. In: Lo B.K.C. Antibody Engineering: Methods and Protocols. SpringerVerlag, 2004.

ло

Yazaki P. J., Wu A. M. Expression of Recombinant Antibodies in Mammalian Cell Lines. In: Lo B.K.C. Antibody Engineering: Methods and Protocols. SpringerVerlag, 2004.

29 Jostock Т., Li J. Expression of IgG Antibodies in Mammalian Cells. In: Kontermann R., Dübel S. Antibody Engineering, Vol. 1, 2nd edn. Springer-Verlag, 2010.

1A

Orcutt K. D., Wittrup, K. D. Yeast Display and Selections. In: Kontermann R., Dübel S. Antibody Engineering, Vol. 1, 2nd edn. Springer-Verlag, 2010.

31 Guttieri M. C., Liang M. Human Antibody Production Using Insect-Cell Expression Systems. In: Lo, B.K.C. Antibody Engineering: Methods and Protocols. Springer-Verlag, 2004.

32 Floss D. M. and Conrad U. Expression of Complete Antibodies in Transgenic Plants. In: Kontermann R., Dübel S. Antibody Engineering, Vol. 1, 2nd edn. SpringerVerlag, 2010.

33 Stöger E., Schillberg S. Twyman R. M., Fischer R. and Paul Christou P. Antibody Production in Transgenic Plants. In: Lo B.K.C. Antibody Engineering: Methods and Protocols. Springer-Verlag, 2004.

34 De Buck S., Peck I., De Wilde C., Marjanac G., Nolf J., De Paepe A. and Depicker A. Generation of single-copy T-DNA transformants in Arabidopsis by the CRE/loxP recombination-mediated resolution system // Plant Physiol. 2007. V. 145. P. 1171-1182.

35 Tran M. and Mayfield S. P. Expression of Full Length Monoclonal Antibodies (mAb). in Algal Chloroplast In: Kontermann R., Dübel S. Antibody Engineering, Vol.

1, 2nd edn. Springer-Verlag, 2010.

36 Geyer C. R., McCafferty J., Dübel S., Bradbury A. R. M., Sidhu S. S. Chapter

2. Recombinant Antibodies and In Vitro Selection Technologies. In: Proetzel G., Ebersbach H. Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 901. Springer-Verlag, 2012.

37

Liddell E. Chapter 3.1. Antibodies. In: Wild D. G. Immunoassay handbook. Elsevier Science, 2013.

o n _

Uotila M., Ruoslahti E., & Engvall E. Two-site sandwich enzyme immunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein // Journal of immunological methods. 1981. V. 42. № l. p. 11-15.

39 Pei X Zhang. В., Tang J., Liu В., Lai .W., Tang D. Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels: A review // Anal. Chim. Acta. 2013. V. 758. P. 1-18.

40 Christophe A. Marquett, Loic J. Blum. State of the art and recent advances in immunoanalytical systems // Biosensors and Bioelectronics. 2006. V. 21. P. 1424-1433.

41 Smith D. S., Eremin S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules // Analytical and bioanalytical chemistry. 2008. V. 391(5). P. 1499-1507.

42 Chaloner-Larsson G., Anderson R., Egan A. A WHO Guide to Good Manufacturing Practice (GMP) Requirements-Part 2: Validation. World Health Organization, 1997.

43 Guidance for Industry Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology ICH Harmonised Tripartite Guideline; Validation Of Analytical Procedures: Text And Methodology. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 2005.

44 Marshall W. J., Marshall W. J., Bangert S. K. Clinical Chemistry. Elsevier Health Sciences, 2008.

45 Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов. ГОСТ Р 53022.3-2008.

Л/Г

Darling R. J, Brault P. A. Kinetic exclusion assay technology: characterization of molecular interactions // Assay Drug Dev. Technol. 2004. V. 2. № 6. P. 647-657.

47 Liedberg B, Nylander C, Lundstrom I. Biosensing with surface plasmon resonance-how it all started // Biosens Bioelectron. 1995. V. 10. № 8. P. i-ix.

P. I Nikitin, M. V. Valeiko, B. G. Gorshkov. New direct optical biosensors for multi-analyte detection // Sensors and Actuators B: Chemical. 2003. V. 90. № 1-3. P. 46-51.

49 Nix В., Wild D. Immunoassays. Practical approach. Oxford University Press,

2000.

50 Novotny L., Hecht В. Principles of nano-optics. 2 edition. Cambridge University Press, 2012.

51 Abdulhalim I., Zourob M., Lakhtakia A. Surface Plasmon Resonance for Biosensing: A Mini-Review//Electromagnetics. 2008. V. 28. P. 214-242.

52 Бенуэлл К. Основы молекулярной спектроскопии. M.: Мир, 1985.

53 Е. Kretschmann. Die Bestimmung optischer Konstanten von Metallen durch Anregung von Oberflächenplasmaschwingungen // Z. Physik. 1971. V. 241. P. 313-324.

54 Кабашин A.B., Никитин П.И. Интерферометр с использованием поверхностного плазмонного резонанса для сенсорных применений // Квантовая электроника. 1997. N. 24. № 7. С. 671-672.

55 Nikitin P.I., Beloglazov A.A., Kochergin V.E., Valeiko M.V., Ksenevich T.I. Surface plasmon resonance interferometry for biological and chemical sensing // Sensors and Actuators B. 1999. V. 54. P. 43-50.

56 Nikitin P.I., Grigorenko A.N., Beloglazov A.A., Valeiko M.V., Savchuk A.I., Savchuk O.A., Steiner G., Kühne С., Huebner A., Salzer R. Surface plasmon resonance interferometry for micro-array biosensing // Sensors and Actuators A. 2000. V. 85. P. 189-193.

57 Grigorenko A. N., Beloglazov A. A., Nikitin P. I., Kühne C., Steiner G., Salzer R. Dark-field surface plasmon resonance microscopy // Optics Communications. 2000. V. 174. P. 151-154.

со

Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. V. 8. P. 871-874.

59 Van Weemen B. K., Schuurs A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates // FEBS Letters. 1971. V. 15. № 3. P. 232-236.

60 Wong R., Tse H. Lateral Flow Immunoassay. Humana Press, 2009.

61 N. A. Byzova, E. A. Zvereva, A. V. Zherdev, S. A. Eremin, P. G. Sveshnikov,

B. B. Dzantiev. Pretreatment-free immunochromatographic assay for the detection of streptomycin and its application to the control of milk and dairy products // Analytica Chimica Acta. 2011. V. 701. P. 209- 217.

62 Vasiliskov V., Tirnofeev E., Surzhikov S., Drobyshev A., Shick V., Mirzabekov A. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization // BioTechnique. 1999. V. 27. P. 592-606.

Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell, A., Voloshchuk S., Chupeeva V., & Mirzabekov A. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Analytical Biochemistry. 2000. V. 278. № 2. P. 123-131.

64 Rubina A. Y., Kolchinsky A., Makarov A. A., Zasedatelev A. S. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics // Proteomics. 2008. V. 8. № 4. 817-831.

65 Kingsmore S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. P. 310 -320.

66 Wingren C., Borrebaeck C. A. K. Progress in miniaturization of protein arrays - a step closer to high-density nanoarrays // Drug Discov Today. 2007. V. 12. P. 813 -819.

67 Wingren C., Borrebaeck C. A. K. Chapter 5. Antibody-Based Microarrays. In: Appasani K. Bioassays. Humana Press, 2007.

68

Ellmark P., Ingvarsson J., Carlsson A., Lundin B. S., Wingren C., Borrebaeck

C. A. K. Identification of protein expression signatures associated with Helicobacter pylori infection and gastric adenocarcinoma using recombinant antibody microarrays // Mol. Cell Proteomics. 2006. V. 5. № 9. P. 1638 - 1646.

69 Gao W. M., Kuick R., Orchekowski R. P., et al. Distinctive serum protein profiles involving abundant proteins in lung cancer patients based upon antibody microarray analysis // BMC Cancer. 2005. V. 5. P. 110.

70 Sanchez-Carbayo M , Socci N. D., Lozano J. J., Haab B. B., Cordon-Cardo C. Profiling bladder cancer using targeted antibody arrays // Am. J. Pathol. 2006. V. 168. № l.P. 93-103.

*71

Geierstanger B. H., Saviranta P., Brinker A. Antibody microarrays using resonance light-scattering particles for detection // Methods Mol. Biol. 2006. V. 328. P. 31-50.

Angenendt P., Nyarsik L., Szaflarski W/, et al. Cell-free protein expression and functional assay in nanowell chip format // Anal. Chem. 2004. V. 76. № 7. P. 1844 -1849.

73 Angenendt P., Lehrach H., Kreutzberger J., Glokler J. Subnanoliter enzymatic assays on microarrays // Proteomics. 2005. V. 5. № 2. P. 420 - 425.

74 Bruckbauer A., Zhou D., Kang D. J., Korchev Y. E., Abell C., Klenerman D. An addressable antibody nanoarray produced on a nanostructured surface // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. №21. P. 6508-6509.

75 Ghatnekar-Nilsson S., Dexlin L., Wingren C., Montelius L., Borrebaeck C. A. K . Design of atto-vial based recombinant antibody arrays combined with a planar waveguide detection system // Proteomics. 2007. V. 7. № 4. P. 540 - 547.

76 Poetz O., Schwenk J. M., Kramer S., Stoll D., Templin M. F., Joos T. O. Protein microarrays: catching the proteome // Mech. Ageing Dev. 2005. V. 126. № 1. P. 161-170.

77 Szodoray P., Alex P., Brun J. G., Centola M., Jonsson R. Circulating cytokines in primary Sjogren's syndrome determined by a multiplex cytokine array system // Scand. J. Immunol. 2004. V. 59. № 6. P. 592 - 599.

78 Warren E. N., Elms P. J., Parker C. E., Borchers C. H. Development of a protein chip: a MS-based method for quantitation of protein expression and modification levels using an immunoaffinity approach // Anal. Chem. 2004. V. 76. № 14. P. 4082-4092.

70

Bernard A., Michel B., Delamarche E. Micromosaic immunoassays // Anal. Chem. 2001. V. 73. № l.p. 8-12.

»A

Juncker D., Schmid H., Delamarche E. Multipurpose microfluidic probe // Nat. Mater. 2005. V. 4. № 8. P. 622 - 628.

81 Nath P., Roy S., Conlisk T., Fleischman A. J. A system for micro/nano fluidic flow diagnostics // Biomed. Microdevices. 2005. V. 7. № 3. P. 169 - 177.

82

Padhye N. V., Doyle M. P. Production and characterization of a monoclonal antibody specific for enterohemorrhagic Escherichia coli of serotypes 0157:H7 and 026:H11 // J. Clin. Microbiol. 1991. V. 29. P. 99-103.

83 Imberty A., Goldberg R., Catesson A. M. Tetramethylbenzidine and phenylenediamine-pyrocatechol for peroxidase histochemistry and biochemistry: Two new, non-carcinogenic chromogens for investigating lignification process // Plant science letters. 1984. V. 35. №. 2. P. 103-108.

84

Ellens D. J., Gielkens A. L. A simple method for the purification of 5-aminosalicylic acid. Application of the product as substrate in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Journal of immunological methods. 1980. V. 37. № 3. P. 325-332.

85

Ozinskas A. J. Principles of fluorescence immunoassay // Topics in fluorescence spectroscopy. Springer US, 2002. P. 449-496.

o/r

Gan S. D., Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay //Journal of Investigative Dermatology. 2013. V. 133. №. 9. P. el2.

on

Benito-Peña E. et al. Development of a novel and automated fluorescent immunoassay for the analysis of P-lactam antibiotics //Journal of agricultural and food chemistry. 2005. V. 53. №. 17. P. 6635-6642.

88 Schirpenbach C. et al. Automated ehemiluminescence-immunoassay for aldosterone during dynamic testing: comparison to radioimmunoassays with and without extraction steps //Clinical chemistry. 2006. V. 52. №. 9. P. 1749-1755.

89 Leutwyler W. K., Burgi S. L., Burgl H. B. Semiconductor clusters, nanocrystals, and quantum dots // Science. 1996. V. 271. P. 933.

90 Goldman E. R., Mattoussi H., Anderson G. P., Medintz I. L., Mauro J. M. Fluoroimmunoassays using antibody-conjugated quantum dots // Methods Mol. Biol. 2005. V.303.P. 19-34.

91 Jena B. K., Raj C. R. Electrochemical biosensor based on integrated assembly of dehydrogenase enzymes and gold nanoparticles //Analytical chemistry. 2006. V. 78. №. 18. P. 6332-6339.

92 Nagasaki Y., Kobayashi H., Katsuyama Y., Jomura T., Sakura T. Enhanced immunoresponse of antiboy/mixed-PEG co-immobilized surface construction of high performance immunomagnetic ELISA system // Journal of Colloid and Interface Science. 2007. V. 309. P. 524-530.

93 Choi J. W., et al. An integrated microfluidic biochemical detection system for protein analysis with magnetic bead-based sampling capabilities // Lab. Chip. 2001. V. 2. № l.P. 27-30.

94 Gundersen S. G., Haagensen I., Jonassen T. O., Figenschau K. J., de Jonge N., Deelder A. M. Magnetic bead antigen capture enzyme-linked immunoassay in microtitre trays for rapid detection of schistosomal circulating anodic antigen // J. Immunol. Methods. 1992. V. 148. P. 1-8.

95 Gehring A. G., Irwin P. L., Reed S. A., Tua S., Andreotti P. E., Akhavan-Tafti Enzyme-linked immunomagnetic chemiluminescent detection of Escherichia coli // Immunol. Methods. 2004. V. 293. P. 97-106.

96 Bean C. P. Hysteresis loops of mixtures of ferromagnetic micropowders // J. Appl. Phys. 1955. V. 26. № 11. P. 1381-1383.

97 Morozov V. N., Groves S., Turell M. J., Bailey. Three minutes-long electrophoretically assisted zeptomolar microfluidic immunoassay with magnetic-beads detection // Journal of the American Chemical Society. 2007. V. 129. №42. P. 1262812629.

98

Nikitin P., Ksenevich T., Nikitin M., Gorshkov B. Opto-magnetic assays based on magnetic nanoparticles and optical label-free biosensors // Proceedings of Ninth European Conference on Optical Chemical Sensors and Biosensors, EUROPT(R)ODE IX, Dublin. 2008. P. OA4.2.

99 Dittmer W. U., Evers T. H., Hardeman W. M., Huijnen W., Kamps R., de Kievit P., Neijzen J. H. M., Nieuwenhuis J. H., Sijbers M. J. J., Dekkers D. W. C., Hefti M. H., Martens M. F. W. C. Rapid, high sensitivity, point-of-care test for cardiac troponin based on optomagnetic biosensor // Clin. Chim. Acta. 2010. V. 411. P. 868873.

100 Mulvaney S. P., Cole C. L., Kniller M. D., Malito M., Tamanaha C. R., Rife J. C., Stanton M. W., Whitman L. Rapid, femtomolar bioassays in complex matrices combining microfluidics and magnetoelectronics // J. Biosens. Bioelectron. 2007. V. 23. P.191-200.

101 Mulvaney S. P., Myers K. M., Sheehan P. E., Whitman L. J. Attomolar protein detection in complex sample matrices with semi-homogeneous fluidic force discrimination assays // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24. P. 1109-1115.

102 Shlyapnikov Y. M., Shlyapnikova E. A., Simonova M. A., Shepelyakovskaya A. O., Brovko F. A., Komaleva R. L., Grishin E. V., Morozov V. N. Rapid Simultaneous Ultrasensitive Immunodetection of Five Bacterial Toxins // Anal. Chem. 2012. V. 84. P. 5596-5603.

103 Rife J. C., Miller M. M., Sheehan P. E., Tamanaha C. R., Tondra M., Whitman L. J. Design and performance of GMR sensors for the detection of magnetic microbeads in biosensors // Sens. Actuators A. 2003. V. 107. P. 209-218.

104 Baselt D. R., Lee G. U., Natesan M., Metzger S. W., Sheehan P. E., Colton R. J. A biosensor based on magnetoresistance technology // Biosens. Bioelectron. 1998. V. 3.P. 731-739.

105 De Palma R., Reekmans G., Liu C., Wirix-Speetjens R., Laureyn W., Nilsson O., Lagae L. Magnetic bead sensing platform for the detection of proteins // Anal. Chem. 2007. V. 79. № 22. P. 8669-8677.

106 Taton K., Johnson D., Guire P., Lange E., Tondra M. J. Lateral flow immunoassay using magnetoresistive sensors // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2009. V. 321. № 10. P. 1679-1682.

107 Srinivasan В., Li Y. P., Jing Y., Xu Y. H., Yao X. F., Xing C., Wang J. P. A Detection System Based on Giant Magnetoresistive Sensors and High-Moment Magnetic Nanoparticles Demonstrates Zeptomole Sensitivity: Potential for Personalized Medicine // Angew. Chem. 2009. V. 48. №15. P. 2764-2767.

108 Osterfeld S. J., Yu H., Gaster R. S., Caramuta S., Xu L., Han S. J., Hall D. A., Wilson R. J., Sun S. H., White R. L., Davis R. W., Pourmand N., Wang S. X. Multiplex protein assays based on real-time magnetic nanotag sensing // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2008. V. 105. № 52. P. 20637-20640.

109 Hall D. A., Wang S. X., Murmann В., Gaster R. S.. Portable biomarker detection with magnetic nanotags //Circuits and Systems (ISCAS), Proceedings of 2010 IEEE International Symposium on. - IEEE, 2010. - C. 1779-1782.

110 Мак A. C., Osterfeld S. J., Yu H., Wang S. X., Davis R. W., Jejelowo O. A., Pourmand N. Sensitive giant magnetoresistive-based immunoassay for multiplex mycotoxin detection // Biosens. Bioelectron. 2010. V. 25. P. 1635-1639.

111 Koets M, van der Wijk Т., van Eemeren J. T. W. M., van Amerongen A., Prins M. W. J. Rapid DNA multi-analyte immunoassay on a magneto-resistance biosensor // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24. P. 1893-1898.

112 Берковский Б. M., Медведев В. Ф., Краков М. С. Магнитные жидкости // Химия. 1989. С. 5-13.

113 Carvalho H.R., Bruno A. C., Louro S. R. W., Costa Ribeiro P. Application of an RF-SQUID to Detect Magnetic Particles Used in Immunoassays // Applied Superconductivity IEEE Transactions on. 2007. V. 17. P. 820-822.

1,4 Kotitz R., Fannin P. C., Trahms L. Time domain study of Brownian and Neel relaxation in ferrofluids // J. Magn. Magn. Mat. 1995. V. 149. P. 42-46.

115 Eberbeck D., et al. Quantification of specific bindings of biomolecules by magnetorelaxometry // J. Nanobiotechnology. 2008. V. 6. P. 4.

116 H. L. Grossman, W. R. Myers, V. J. Vreeland, R. Bruehl, M. D. Alper, C. R. Bertozzi, and John Clarke. Detection of bacteria in suspension by using a superconducting quantum interference device // PNAS. 2004. V. 101. № 1. P. 129-134.

117 Baibich M., et al. Giant Magnetoresistance of (001)Fe/(001)Cr Magnetic Superlattices // Phys. Rev. Lett. 1988. V. 61. P. 2472-2475.

1,8 Millen R. I, Kawaguchi Т., Granger M. C., Porter M. D. Giant Magnetoresistive Sensors and Superparamagnetic Nanoparticles: A Chip-Scale Detection Strategy for Immunosorbent Assays // Anal. Chem. 2005. V. 77. № 20. P. 6581-6587.

119 Ludwig F., Mauselein S., Heim E., Schilling M. Magnetorelaxometry of magnetic nanoparticles in magnetically unshielded environment utilizing a differential fluxgate arrangement // Review of Scientific Instruments. 2005. V. 76. № 10. P. 106102-3.

120 Gaster R. S., Hall D. A., Nielsen С. H., Osterfeld S. J., Yu H., Mach К. E., Wilson R. J., Murmann В., Liao J. C., Gambhir S. S., Wang S. X. // Nat. Med. 2009. V. 15. P. 1327-1332.

121 Никитин П.И., Ветошко П.М. Измеритель магнитной восприимчивости // Патент Российской Федерации N 2177611, приоритет от 9 марта 2000 года.

122 Никитин П.И., Ветошко П.М. Способ анализа смеси биологических и/или химических компонентов с использованием магнитных частиц и устройство для

его осуществления // Патент Российской Федерации N 2166751, приоритет от 9 марта 2000 года. European patent EP 1262766. Issue date: 11 November, 2009. U.S. Patent No: 7,732,220. Issue date: 8 June, 2010.

123 Nikitin P. I., Vetoshko P. M., Ksenevich Т. I. New Type of Biosensors Based on Magnetic Nanoparticle Detection // J. Magn. Magn. Mater. 2007. V. 311. № 1. P. 445-449.

124 Nikitin P.I., Vetoshko P.M., Ksenevich T.I. Magnetic Immunoassays // Sens. Lett. 2007. V. 5. № 1. P. 296-299.

125 Григоренко A.H., Никитин П.И., Рощепкин Г.В. Смешивание частот в бистабильной системе при наличии шума // ЖЭТФ. 1997. Т. 112. № 8. С. 628.

126 Nikitin М. P., Torno М., Chen Н., Rosengart A., Nikitin P. I. Quantitative real-time in vivo detection of magnetic nanoparticles by their non-linear magnetization // J. Appl. Phys. 2008. V. 103. № 7. P. 07A304.

127 Nikitin M. P., Vetoshko P. M., Brusentsov N. A., Nikitin P. I. Highly Sensitive Room Temperature Method of Non-Invasive in vivo Detection of Magnetic Nanoparticles // J. Magn. Magn. Mater. 2009. V. 321. № 10. P. 1658-1661.

128 Nikitin M. P., Yuriev M. V., Brusentsov N. A., Vetoshko P. M., Nikitin P. I. Non-Invasive In Vivo Mapping and Long-Term Monitoring of Magnetic Nanoparticles in Different Organs of Animals // AIP Conf. Proc. 2010. V. 1311. P. 452-457.

129 Nikitin P. I., Goshkov B. G., Valeiko M. V., Nikitin S. I. Multichannel optical biosensors for label free high-throughput screening // Proc. SPIE. 2001. V. 4578. P. 126-135.

130 Никитин П. И., Горшков Б. Г., Валейко М. В., Рогов С. И. Спектрально-фазовый метод регистрации биохимических реакций на поверхности // Квантовая Электроника. 2000. Т. 30. № 12. С. 1099-1104.

131 Nikitin P. I., Gorshkov В. G., Nikitin Е. P., Ksenevich Т. I. Picoscope, a new label-free biosensor // Sens. Act. В. 2005. V. 111-112. P. 500-504.

132 Nikitin P. I., Svetoch I. E., Nikitin M. P., Ksenevich T. I., Gorshkov B. G., Konov V. I., Aksinin V. I. Optical Picoscopes - New Opportunities for Biosensing and for Molecular Technologies // Proc. SPIE. 2007. V. 6733. P. 67331M.

133 A. E. Ivanov, N. Solodukhina, M. Wahlgren, L. Nilsson, A. A. Vikhrov, M. P. Nikitin, A. V. Orlov, P. I. Nikitin, M. V. Kuzimenkova, V. P. Zubov. Reversible conformational transitions of a polymer brush containing boronic acid and its interaction with mucin glycoprotein // Macromolecular Bioscience. 2011. V. 11. № 2. P. 275-284.

134 Alexander E. Ivanov, Igor Yu. Galaev, Bo Mattiasson. Interaction of sugars, polysaccharides and cells with boronate-containing copolymers: from solution to polymer brushes // Journal of Molecular Recognition. 2006. V. 19. № 4. P. 322-331.

135 Rollins B. J. Chemokines // Blood. 1997. V. 90. P. 909-928.

136 Красникова T. JI., Арефьева Т. И., Кухтина H. Б. Хемокины, рецепторы хемокинов и атерогенез // Успехи совр. биологии. 2003. Т. 123. С. 506-514.

137 Т. Л. Красникова, П. И. Никитин, Т. И. Ксеневич, Б. Г. Горшков, А. В. Орлов, М. В. Сидорова, А. А. Азьмуко, Т. И. Арефьева, E. Н. Мамочкина, E. Е. Ефремов, Ж. Д. Беспалова. Влияние пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином // Доклады Академии Наук. 2011. Т. 433. № 4. С. 559-562.

138 Красникова Т. Л., Арефьева Т. И., Мелехов М. Г., Кухтина Н. Б., Сидорова М. В., Молокоедов А. С., Бушуев В. Н., Беспалова Ж. Д., Чазов Е. И. Пептид последовательности 66-77 моноцитарного хемотаксического белка-1 — ингибитор воспаления у экспериментальных животных. ДАН. 2005. Т. 404. № 4. С. 551-554.

139 Е. И. Чазов, Т. Л. Красникова, Ж. Д. Беспалова, Н. Б. Кухтина, М. Г. Мелехов, Т. И. Арефьева, М. В. Сидорова, А. С. Молокоедов, Т. Е. Гвоздик, Б. М. Мартьянов, В. В. Поздеев, В. Б. Сергиенко, Т. Л. Бушуева. Ингибирование

миграции моноцитов и гранулоцитов in vivo пептидом последовательности 65-76 моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) // ДАН. 2006. Т. 411. № 2. С. 270-272.

140 Edwards P. R., & Leatherbarrow R. J. Determination of association rate constants by an optical biosensor using initial rate analysis // Analytical biochemistry. 1997. V. 246. № l.P. 1-6.

141 Handel Т. M., Johnson Z., Crown S. E, Lau E. K., Proudfoot A. E. Regulation of protein function by glycosaminoglycans~as exemplified by chemokines 11 Annu. Rev. Biochem. 2005. V. 74. P. 385-410.

142 Lau E. K., Paavola C. D., Johnson Z., & Gaudry J. P. Geretti E., Borlat F., Kungl A. J., Proudfoot A. E., Handel Т. M. Identification of the glycosaminoglycan binding site of the CC chemokine, MCP 1: Implications for structure and function in vivo // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 21. P. 22294-22305.

143 Davies C. Part 1. Principles. Chapter 6. Concepts. In: David W. The Immunoassay Handbook. Elsevier Ltd, 2005.

144 Ershov P. V., Gnedenko О. V., Molnar A. A., Lisitsa A. V., Ivanov A. S., Archakov A. I. Kinetic and thermodynamic analysis of dimerization inhibitors binding to HIV protease monomers by surface plasmon resonance //Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2012. V. 6. № 1. P. 94-97.

145 Cunningham B.T. Label-free optical biosensors: An introduction. In: Cooper M.A. Label-Free Biosensors: Techniques and Applications. Cambridge University Press, 2009.

146 Gauglitz G., Brecht A., Kraus G., Nahm W. Chemical and biochemical sensors based on interferometry at thin (multi-) layers // Sens. Act. B. 1993. V. 11. P. 21-27.

147 Dancil K. S., Greiner D. P., Sailor M. J. Chemical and biochemical sensors based on interferometry at thin multi- layers // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 7925-7930.

148 Orlov A. V., Khodakova J. A., Nikitin M. P., Shepelyakovskaya A. O., Brovko F. A., Laman A. G., Grishin E. V., Nikitin P. I. Magnetic immunoassay for detection of staphylococcal toxins in complex media // Anal. Chem. 2013. V. 85. № 2. P. 1154— 1163.

149 Буренин А. Г., Никитин M. П., Орлов А. В., Ксеневич Т. И., Никитин П. И. Детекция пиретроидов с помощью спектрально-корреляционной интерферометрии // Прикл. Биохим. Микробиол. 2013. Т. 49. № 3. С. 312-318.

150 Appendix С. Predefined models. In: BIAevaluation 3.0 Software Handbook. Biacore AB, 1997.

151 Adams J. 3., Bodor G. S., Davila-Roman V. G., Delmez J. A., Apple F. S., Ladenson J. H., & Jaffe A. S. Cardiac troponin I. A marker with high specificity for cardiac injury // Circulation. 1993. V. 88. № 1. P. 101-106.

152 Katrukha A. G., Bereznikova A. V., Esakova Т. V., Pettersson K., Lovgren Т., Severina M. E., Pulkki K., Vuopio-Pulkki L. M., Gusev N. B. Troponin I is released in bloodstream of patients with acute myocardial infarction not in free form but as complex// Clin. Chem. 1997. V. 43. № 8. P. 1379-1385.

153 Thygesen K., Mair J., Giannitsis E., Mueller C., Lindahl В., Blankenberg S., Huber K., Plebani M., Biasucci L. M., Tubaro M., Collinson P., Venge P., Hasin Y., Galvani M., Koenig W., Hamm C., Alpert J. S., Katus H., Jaffe A. S. How to use high-sensitivity cardiac troponins in acute cardiac care // Eur. Heart J. 2012. V. 33. № 18. P. 2252-2257.

154 Peri G., Introna M., Corradi D., Iacuitti G., Signorini S., Avanzini F., Pizzetti F., Maggioni A.P., Moccetti Т., Metra M., Cas L. D., Ghezzi P., Sipe J. D., Re G., Olivett G., Mantovani A., Latini R. A prototypical long pentraxin, is an early indicator of acute myocardial infarction in humans // Circulation. 2000. V. 102. P. 636-641.

155 NICE clinical guideline 95. Chest pain of recent onset. Assessment and diagnosis of recent onset chest pain or discomfort of suspected cardiac origin. NICE, 2010.

156 Morrow D. A., Cannon C. P., Jesse R. L., Newby L. K., Ravkilde J., Storrow А. В., Wu A. H. В., Christenson R. H. National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndromes // Clin. Chem. 2007. V. 53. P. 552574.

157 Katrukha A.G. Antibody selection strategies in cardiac troponin assays. In: Wu A.H.B. Cardiac Markers. 2nd edition. Humana Press, 2003.

158 de Lemos J. A. Increasingly Sensitive Assays for Cardiac TroponinsA Reviewlncreasingly Sensitive Assays for Cardiac Troponins // JAMA. 2013. V. 309. № 21. P. 2262-2269.

159 Schreiber S., Savla M., Pelekhov D. V., Iscru D. F., Selcu C., Hammel P. C., & Agarwal G. Magnetic force microscopy of superparamagnetic nanoparticles // Small. 2008. V. 4. № 2. P. 270-278.

160 Martin V. M., Siewert C., Scharl A., Harms Т., Heinze R., Ohl S., Radbruch A., Miltenyi S., Schmitz J. Immunomagnetic enrichment of disseminated epithelial tumor cells from peripheral blood by MACS // Exp. Hematol. 1998. V. 26. P. 252-264.

161 Bingisser R., Cairns C., Christ M„ Hausfater P., Lindahl В., Mair J., Panteghini M., Price C., Venge P. Cardiac troponin: a critical review of the case for point-of-care testing in the ED // A. J. of Emergency Med. 2012. V. 30. P. 1639-1649.

162 Дирюгина Е.Г., Буренин А.Г., Никитин М.П., Орлов А.В., Никитин П.И. Детекция в реальном времени аутоантител в сыворотке крови с помощью безметочной биосенсорной системы Пикоскоп // Труды МФТИ. 2012. Т. 4. № 3. С. 11-17.

163 Iandolo J. J., Tweten R. K. In: Harshman S. Methods in Enzymology. Academic Press, 1988.

164 Laemmli U. K. Most commonly used discontinuous buffer system for SDS electrophoresis //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

165 Tompson N. E., Bergdoll M. S., Meyer R. F., Bennett R. W., Miller L., Macmillan J. D. In: Macario A. J. L., Macario E. C. Monoclonal antibodies against bacteria. Academic press, 1985.

166 Rubina A. Y., Filippova M. A., Feizkhanova G. U., Shepeliakovskaya A. O., Sidina E. I., Boziev К. M., Laman A. G., Brovko F. A., Vertiev Y. V., Zasedatelev A. S., Grishin E. V. Simultaneous Detection of Seven Staphylococcal Enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application // Anal. Chem. 2010. V. 82. P. 8881-8889.

167 Esser P. The Surface/Volume Ratio in Solid Phase Assays // Nunc Technical Bulletin No. 10b. 2010. P. 1-5.

168 Edelstein R. L., Tamanaha C. R., Sheehan P. E., Miller M. M., Baselt D. R., Whitman L. J., Colton R. J. The BARC biosensor applied to the detection of biological warfare agents. Biosens // Bioelectron. 2000. V. 14. P. 805-813.

169 G. A. Posthuma-Trumpie, J. Korf, A. van Amerongen, Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey // Anal. Bioanal. Chem. 2009. V. 393. P. 569-582.