Разработка методов характеризации молекулярных и надмолекулярных систем на основе оптической регистрации кинетики их поведения in vitro и in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Пушкарев Аверьян Владимирович

• Пушкарев Аверьян Владимирович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Пушкарев Аверьян Владимирович

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад

Степень достоверности и апробация результатов

Статьи:

Тезисы конференций:

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Молекулярные и надмолекулярные системы in vitro

1.1.1 Антитела и иммуноанализ

1.1.2 ДНК и РНК

1.1.3 Ферменты

1.1.4 Окрашенные метки

1.1.5 Магнитные метки

1.1.6 Флуоресцентные метки

1.2 Методы кинетической характеризации молекулярных и надмолекулярных систем in vitro и in vivo

1.2.1 Методы безмаркерной кинетической характеризации молекулярных и надмолекулярных систем in vitro

1.2.2 Методы кинетической характеризации молекулярных и надмолекулярных систем в лабораторных животных

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2 Создание карбоксильных групп на поверхности микроскопного покровного стекла

2.3 Иммобилизация HBSAg на карбоксилированную поверхность микроскопного покровного стекла

2.4 Получение сенсограмм взаимодействия антител к HBSAg с иммобилизованным антигеном

2.5 Определение кинетических и равновесных параметров антител по сенсограммам

2.6 Конъюгация БСА с хлорамфениколом

2.7 Иммобилизация конъюгата БСА с хлорамфениколом на стеклянные чипы для исследования влияния их рельефа на кинетику реакций

2.8 Проведение атомно-силовой микроскопии и обработка полученных данных

2.9 Регистрация связывания антител к хлорамфениколу со стеклянной поверхностью СКИ методом для исследования влияния рельефа поверхности на кинетику реакций

2.10 Построение калибровочной кривой и расчет предела детекции и динамического диапазона метода регистрации хлорамфеникола

2.11 Приготовление конъюгатов магнитных наночастиц

2.12 Создание иммунохроматографических тест-стрипов

2.13 Методика проведения иммунохроматографического анализа

2.14 Иммобилизация антигена на карбоксилированные покровные стекла и определение кинетических и равновесных констант антител к БЕБ методом спектрально-корреляционной интерферометрии

2.15 Приготовление конъюгатов БСА с хлорамфениколом и биотином

2.16 Создание слоя, реализующего функцию «ДА»

2.17 Создание слоя, реализующего функцию «НЕ»

2.18 Характеризация конъюгатов БСА с хлорамфениколом и биотином с помощью ИФА

2.19 Конъюгация БСА с хлорамфениколом, биотином и флуоресцеином

2.20 Создание слоя, реализующего функцию «И»

2.21 Определение кинетических и равновесных параметров взаимодействия антител с конъюгатом БСА с хлорамфениколом, биотином и флуоресцеином

2.22 Установка для многоканальной регистрации изменения толщины биослоя на базе спектрально-корреляционной интерферометрии

2.23 Создание многоканальный сенсорных чипов

2.24 Процедура регистрации нативной кинетики аутоантител в сыворотке крове человека

Глава 3. Результаты и обсуждения

3.1 Разработка метода характеризации кинетических параметров антител к HBSAg

3.2 Исследование влияние рельефа сенсорной поверхности на кинетические параметры взаимодействия антител с иммобилизованным на ней антигеном

3.2.1 Характеризация стекол методом атомно-силовой микроскопии

3.2.2 Изучение взаимодействия антител к хлорамфениколу с иммобилизованным на стеклянной поверхности антигеном

3.2.3 Влияния структуры поверхности на кинетические параметры взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном

3.2.4 Создание на основе ПНФА2м стекол системы количественной регистрации хлорамфеникола

3.2.5 Регистрация хлорамфеникола в реальных образцах

3.2.6 Стабильность и специфичность созданной биосенсорной системы

3.3 Метод характеризации конъюгатов магнитных наночастиц с антителами

3.3.1 Получение экспериментальных данных для определения кинетических параметров конъюгатов МНЧ

3.3.2 Математическая модель

3.3.3 Метод определения кинетических и равновесных параметров конъюгатов магнитных наночастиц

3.3.4 Валидация предложенного метода определения кинетических и равновесных констант методом спектрально-корреляционной интерферометрии

3.3.5 Определения количества активных антител на поверхности наночастиц

3.3.6 Прогностические способности разработанного метода

3.4 Метод разработки и характеризации биокомпьютерных слоев

3.4.1 Концепция создания и принцип функционирования слоев, реализующих функции «Да» и «НЕ»

3.4.2 Практическое контролируемое создание слоев, реализующих операции «ДА» и «НЕ»

3.4.3 Характеризация созданных слоев

3.4.4 Возможность применения созданных слоев для биосенсорики

3.4.5 Создание и исследование слоя, реализующих функцию «И»

3.5 Разработка метода одновременного определения нативной кинетики аутоантител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе в клинических сыворотках

3.5.1 Создание чипа, позволяющего одновременно регистрировать несколько биомолекулярных реакций

3.5.2 Регистрация нативных кинетических параметров аутоантител в клинических образцах

3.6 Разработка метода регистрации кинетики биораспределения наночастиц in vivo

3.6.1 Разработка и создание экспериментальной установки

3.6.2 Метод регистрации кинетики биораспределения наночастиц in vivo в лабораторных животных

Результаты и выводы

Благодарности

Список используемых сокращений

Список использованной литературы

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов характеризации молекулярных и надмолекулярных систем на основе оптической регистрации кинетики их поведения in vitro и in vivo»

Актуальность темы исследования

Непрерывное развитие биологии, физики, химии и инженерных технологий позволяет создавать все более совершенные биомолекулярные конструкции для быстрой и точной детекции биологических соединений и целевой доставки лекарств. Тем не менее, в области создания таких систем остается большое количество нерешенных задач.

В частности, для регистрации многих биологически активных соединений все еще не существует разработанных биосенсорных молекулярных конструкций или устройств, удовлетворяющих жестким требованиям, необходимым для успешного применения на практике. К таким требованиям относятся: высокая чувствительность, малое время анализа, специфичность, а также простота применения. В то же время, в области терапии требуется создание наноагентов, способных с высокой эффективностью и минимальными побочными для организма последствиями адресно доставить терапевтическое соединение в очаг заболевания. Во всех этих случаях сложность разработки используемых молекулярных конструкций вызвана тем, что для их создания необходимо подобрать оптимальную комбинацию из большого числа составляющих таких как распознающие молекулы, метки, различные покрытия, уменьшающие неспецифическое связывание и т.п.

При выборе оптимальных компонентов необходимо хорошо знать их свойства, а также особенности взаимодействия между собой, многие из которых чаще всего приходится определять экспериментально. Метод (или набор методов) для такой характеризации должен быть с одной стороны достаточно универсальным, чтобы позволять определять с высокой точностью максимальное количество ключевых параметров, с другой стороны - достаточно простым и быстрым, чтобы его практическое использование было удобным и эффективным.

При этом необходимо проводить изучение свойств создаваемой системы на всех уровнях ее сложности. Например, на уровне молекулярных компонентов биосенсорного устройства требуется подбор оптимальных распознающих антител. Однако, на следующем этапе различные способы конъюгации выбранных антител с наночастицами, могут значительно изменить распознающие свойства нанокомплексов. Наряду с этим, значительное влияние может оказывать фоновое окружение исследуемой среды, например, неспецифические компоненты сыворотки. Кроме того, при создании нанопрепаратов для терапевтических применений отдельного исследования требует поведение функционализированных гибридных нанокомплексов в организме лабораторных животных in vivo.

Из всех измеряемых характеристик одними из самых важных являются кинетические, так как от них зависит поведение молекулярных и надмолекулярных структур с течением времени: процессы связывания аналита с селективными рецепторами, распознавания иммунокомплекса мечеными антителами, высвобождения терапевтического компонента наноагентом и т.п.

Таким образом, актуальной задачей, которой и посвящена настоящая диссертационная работа является разработка набора методов характеризации молекулярных и надмолекулярных комплексов методами регистрации их кинетических характеристик для задач биосенсорики in vitro и изучения наноагентов in vivo.

Степень разработанности темы исследования

Для биосенсорики кинетические параметры часто определяются безмаркерными подходами. Они позволяют регистрировать в реальном времени межмолекулярные взаимодействия на поверхности твердой фазы сенсорного чипа без использования каких-либо меток, искажающих изучаемые процессы. Наиболее распространены на сегодняшний день поверхностный плазмонный резонанс и различные волноводные методы. Однако, они крайне неудобны для рутинного использования, так как используют дорогие расходные материалы, что приводит к необходимости очистки и повторного использования сенсорной поверхности, нарушая тем самым чистоту эксперимента. Также часто недостатком существующих подходов, особенно использующих поверхностный плазмонный резонанс является высокая чувствительность к изменению показателя преломления раствора, например, при смене буфера.

Регистрация кинетических параметров in vivo является сложной из-за непрозрачности большинства живых объектов, а также значительно более высокой неоднородности их свойств. Для исследования кинетики in vivo широко применяются магнитные, радиоизотопные и оптические методы. Технологии, основанные на магнетизме и радиоактивности, позволяют регистрировать и точно локализовать метки внутри организма, и потому активно применяются в диагностике и научных исследованиях. Тем не менее, они требуют дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала, а потому часто недоступны для рутинных исследований во многих лабораториях. Также большинство из них не позволяет одновременно детектировать и различать несколько независимых меток. Благодаря простоте применения и возможности спектрального разрешения одновременно нескольких маркеров, особой популярностью пользуются оптические методы. Однако, за счет сильного рассеяния света тканями они не обладают возможностью точной локализации. Также за счет низкой

проникающей способности света, они не позволяют простыми способами регистрировать сигналы под толстым слоем ткани и поэтому требуют дальнейшего развития.

Цели и задачи работы

Цель работы заключалась в разработке набора оптических методов характеризации по кинетическим параметрам молекулярных и надмолекулярных систем на основе белков и наночастиц in vitro и на основе наночастиц in vivo. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• Разработать на основе спектрально-фазовой и спектрально-корреляционной интерферометрии метод определения кинетических характеристик антител к поверхностному антигену гепатита B, а также способ выбора лучших из них по оптимальным характеристикам.

• На полимерной поверхности микроскопного покровного стекла, содержащей активированные карбоксильные группы, охарактеризовать кинетику взаимодействия антител к хлорамфениколу с иммобилизованным антигеном в зависимости от рельефа поверхности.

• Разработать быстрый и простой способ определения кинетических и сорбционных параметров конъюгатов магнитных наночастиц с антителами к стафиллококовому энтеротоксину B.

• Разработать на основе спектрально-фазовой интерферометрии метод, быстрого и простого создания, а также оптимизации сложных белковых биомолекулярных конструкций, способных самостоятельно анализировать состав микроокружения, используя химические соединения в качестве входных переменных и формировать бинарный ответ, руководствуясь законами булевой логики.

• Разработать метод одновременной регистрации нативных кинетических параметров взаимодействия антител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе с антигенами в сыворотке крови человека.

• Разработать метод прижизненной неинвазивной регистрации в реальном времени биораспределения и фармакокинетики наночастиц меченых флуоресцентной меткой в организме лабораторных животных in vivo.

Научная новизна и практическая значимость

1) Впервые на основе спектрально-фазовой и спектрально-корреляционной

интерферометрии разработан метод, позволяющий определять кинетические и равновесные

8

параметры взаимодействия между антителами к поверхностному антигену гепатита B и антигеном, ковалентно иммобилизованным на карбоксилированной поверхности микроскопного покровного стекла. Широкая доступность и низкая цена микроскопных покровных стекол в качестве сенсорных чипов позволяет сделать их одноразовым расходным материалом и, таким образом, повысить простоту применения и надежность метода. Алгоритм обработки полученных экспериментальных данных реализован таким образом, что не требует знания специального программного обеспечения (ПО) и может быть реализован в универсальных программах, например, в Microsoft Excel. При этом предложенный способ иммобилизации позволяет заменять использованный антиген на другие. Таким образом, разработанный метод позволяет осуществлять простую, быструю и точную характеризацию различных антител необходимую для выбора лучших из них для последующего использования в создаваемой биомолекулярной системе.

2) Впервые на микроскопных покровных стеклах с карбоксильными группами и на примере взаимодействия антител к хлорамфениколу с ковалентно иммобилизованным антигеном методом спектрально-фазовой интерферометрии было показано, что кинетические константы их взаимодействия зависят от рельефа поверхности. Совместно с использованием поверхности, с нанесенным поли-ф-нитрофенил акрилатом), позволяющей стабильную ковалентную иммобилизацию белков за одну стадию без необходимости ее активации, разработанный метод позволяет эффективно создавать биосенсорные устройства, используя рельеф сенсорной поверхности в качестве дополнительного параметра для оптимизации.

3) Впервые на основе математического моделирования и иммунохроматографии разработан метод, позволяющий для конъюгатов магнитных наночастиц с антителами к стафилококковому энтеротоксину B, определять кинетические параметры их взаимодействия с антигеном, а также количество антител на поверхности наночастиц, оставшихся активными после конъюгации. Помимо характеризации конъюгатов, метод также продемонстрировал возможность точного прогностического описания взаимодействия конъюгата с антигеном. Аналитический вид разработанной математической модели позволяет не использовать для работы с ней специализированного ПО, ограничиваясь, например, Microsoft Excel. В сочетании с простым методом иммунохроматографии применение модели позволяет быстро и всего за несколько простых иммунохроматографических тестов охарактеризовать конъюгаты наночастиц без применения сложного лабораторного оборудования. Это позволит методу найти широкое применение при создании и изучении конъюгатов магнитных наночастиц для разработки биосенсоров или наноагентов для применения in vivo.

4) Впервые разработан метод, позволяющий эффективно создавать и изучать белковые биокомпьютерные надмолекулярные структуры за счет наблюдения каждой стадии их создания

и функционирования методом спектрально-фазовой интерферометрии в реальном времени в безмаркерном формате. Возможность характеризации каждой стадии процессов их самосборки и функционирования позволяет значительно упростить и ускорить процесс разработки этих сложных структур, являющихся крайне актуальными для применения в биосенсорике или для целевой доставки лекарств.

5) Впервые разработан метод, который позволяет одновременно регистрировать нативную кинетическую константу аутоантител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе в сыворотках крови человека. Нативная кинетическая константа характеризует взаимодействие антитело-антиген в их неискажённой конформации, и отражает степень «агрессивности» антител по отношению к антигену. Метод реализован на базе спектрально-корреляционной интерферометрии, которая использует широкодоступные микроскопные покровные стекла в качестве сенсорных чипов. За счет низкой стоимости для одноразовых применений и широкой доступности стекол, разработанный метод потенциально может быть применен в широкой клинической практике.

6) Разработан оптический метод регистрации кинетических параметров распределения наночастиц, меченных флуорофорами, в организме лабораторных животных, обладающий следующим уникальным сочетанием характеристик: возможность настройки равномерности паттерна освещения, минимизация выгорания флуорофора, возможность работы в ближней ИК области, малое время экспозиции. Применение разработанного метода позволит за счет равномерности освещения минимизации выгорания флуорофора повысить точность получаемых данных, а малое время экспозиции позволит улучшить их разрешение во времени. Возможность эффективной работы в ИК области позволяет регистрировать флуорофор глубоко под кожей, минимизируя фоновый сигнал автофлуоресценции тканей животного.

Методология и методы исследования

В работе использовались следующие основные методы: спектрально-фазовой и спектрально-корреляционной интерферометрии для безмаркерной регистрации в реальном времени межмолекулярных взаимодействий на поверхности микроскопного покровного стекла; регистрации наночастиц по их нелинейному перемагничиванию для определения количества магнитных наночастиц; карбодиимидный метод для получения белковых конъюгатов, конъюгатов наночастица-белок и для ковалентной иммобилизации белков на карбоксилированную стеклянную поверхность; иммунохроматографии; определения общего количества белка бицинхониновой кислотой (англ. BCA protein assay); алгоритмы численного

анализа изображений, реализованные в программном пакете micromanager; атомно-силовая микроскопия.

Положения, выносимые на защиту

1. На основе спектрально-фазовой и спектрально-корреляционной интерферометрии разработаны метод определения кинетических параметров антител к поверхностному антигену вируса гепатита B и методика выбора лучших антител по их оптимальным кинетическим параметрам для биосенсорных применений.

2. На стеклянной поверхности, покрытой поли-ф-нитрофенил акрилатом) и с иммобилизованным хлорамфениколом показано, что кинетическая константа ассоциации антител к хлорамфениколу больше, а константа диссоциации меньше на стекле с меньшим количеством полимера, чем на стекле с большим слоем полимера.

3. На основе иммунохроматографии и математического моделирования разработан метод определения кинетических параметров взаимодействия конъюгата магнитных наночастиц с антителами против стафилококкового энтеротоксина В и антигена. Показана способность метода давать точное прогностическое описание взаимодействия конъюгата с антигеном. Кроме того, разработан метод количественного определения доли молекул антител, остающихся активными после конъюгации с наночастицами.

4. На базе спектрально-фазовой интерферометрии разработан метод, позволяющий в реальном времени на молекулярном уровне наблюдать и кинетически характеризовать на поверхности микроскопного покровного стекла процессы сборки и функционирования белковых биомолекулярных слоев, выполняющих базовые логические операции одной переменной «ДА», «НЕ».

5. На основе спектрально-корреляционной интерферометрии разработан безмаркерный метод, позволяющий одновременно измерять нативные кинетические константы ассоциации аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину в сыворотке крови человека.

6. Разработана экспериментальная установка и на ее основе метод регистрации биораспределения и фармакокинетики наночастиц in vivo путем регистрации их флуоресцентного сигнала в диапазоне длин волн 550-800 нм.

Личный вклад

Автор самостоятельно проводил приготовление и очистку конъюгатов малых молекул (биотина, флуоресцеина, хлорамфеникола) с белками, а также химическую модификацию поверхностей микроскопных покровных стекол (карбоксилирование). Автором были спланированы эксперименты и проведены все измерения методами спектрально-фазовой и спектрально-корреляционной интерферометрии включая стадию иммобилизации белков и их конъюгатов на стеклянную поверхности, а также обработку полученных данных. При этом самостоятельно разработаны методы характеризации антител к поверхностному антигену вируса гепатита B и конъюгатов наночастиц.

Автором была предложена концепция и внутреннее устройство экспериментальной установки для регистрации флуоресценции in vivo, использованной в работе. Также была разработана и реализована электрическая схема, написана прошивка контроллера, собрана и настроена установка. Во время проведения биологических экспериментов, автор получал и проводил обработку полученных данных биораспределения наночастиц, меченых флуорофорами in vivo.

Автор принимал активное участие в разработке концепций методов регистрации кинетических параметров аутоантител в сыворотке крови человека и эффективного создания биокомпьютерных структур на поверхности микроскопного покровного стекла. Также автор активно участвовал в подготовке материалов публикаций, приготовлении конъюгатов магнитных наночастиц с антителами и создании иммунохроматографических тест-полосок.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты работы были представлены на 5 российских и международных конференциях: Международный форум Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, Россия, 23.05.2018 — 25.05.2018), 2018 International inference Laser Optics (ICLO) (St. Petersburg, Russia, 04.06.2018 — 08.06.2018), 60-я Научная конференция МФТИ (Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Россия, 20.11.2017 — 25.11.2017), 2020 International Conference Laser Optics (ICLO) (St. Petersburg, Russia, 02.11.2020 — 06.11.2020), 6th International Conference on Bio-Sensing Technology (Куала-Лумпур, Малайзия, 16.06.2019 — 19.06.2019). По материалам работы опубликовано 9 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, и 6 тезисов докладов в сборниках трудов конференций.

Статьи:

1. Orlov A.V., * Pushkarev A.V., * Znoyko, S.L., Novichikhin, D.O., Bragina, V.A., Gorshkov, B.G., Nikitin, P.I. Multiplex label-free biosensor for detection of autoantibodies in human serum: Tool for new kinetics-based diagnostics of autoimmune diseases //Biosensors and Bioelectronics. - 2020. - Т. 159. - С. 112187, * - равный вклад авторов; IF = 10.618.

2. Ivanov A.E., Pushkarev A.V., Orlov A.V., Nikitin M.P., Nikitin P.I. Interferometric detection of chloramphenicol via its immunochemical recognition at polymer-coated nano-corrugated surfaces //Sensors and Actuators B: Chemical. - 2019. - Т. 282. - С. 984-991; IF = 7.460.

3. Bragina V.A., Znoyko S.L., Orlov A.V., Pushkarev A.V., Nikitin M P. Nikitin P.I. Analytical platform with selectable assay parameters based on three functions of magnetic nanoparticles: demonstration of highly sensitive rapid quantitation of staphylococcal enterotoxin B in food //Analytical chemistry. - 2019. - Т. 91. - №. 15. - С. 9852-9857; IF = 6.986.

4. Orlov A.V.,* Pushkarev A.V.,* Mochalova E.N., Nikitin P.I., Nikitin M P. Development and label-free investigation of logic-gating biolayers for smart biosensing //Sensors and Actuators B: Chemical. - 2018. - Т. 257. - С. 971-979, * - равный вклад авторов; IF = 7.460.

5. Znoyko S.L., Orlov A.V., Pushkarev A.V., Mochalova E.N., Guteneva N.V., Lunin A.V., Nikitin M.P., Nikitin P.I. Ultrasensitive quantitative detection of small molecules with rapid lateral-flow assay based on high-affinity bifunctional ligand and magnetic nanolabels //Analytica Chimica Acta. - 2018. - Т. 1034. - С. 161-167; IF = 6.558.

6. Pushkarev A.V., Orlov A.V., Znoyko S.L., Novichikhin D.O., Bragina V.A., Sizikov A.A., Alipour E., Ghourchian H., Nikitin A.I., Sorokin G.M., Gorshkov B.G. Data on characterization of glass biochips and validation of the label-free biosensor for detection of autoantibodies in human serum //Data in brief. - 2020. - Т. 30. - С. 105648.

7. Orlov A.V., Znoyko S.L., Pushkarev A.V., Mochalova E.N., Guteneva N.V., Lunin A.V., Nikitin M.P., Nikitin P.I. Data on characterization and validation of assays for ultrasensitive quantitative detection of small molecules: Determination of free thyroxine with magnetic and interferometric methods //Data in brief. - 2018. - Т. 21. - С. 1603-1611.

8. Pushkarev A.V., Orlov A.V., Znoyko S.L., Bragina V.A., Nikitin P.I. Rapid and easy-to-use method for accurate characterization of target binding and kinetics of magnetic particle bioconjugates for biosensing //Sensors. - 2021. - Т. 21. - №. 8. - С. 2802; IF = 3.576.

9. Bragina V.A., Orlov A.V., Znoyko S.L., Pushkarev A.V., Novichikhin D.O., Guteneva N.V., Nikitin M.P., Gorshkov B.G., Nikitin P.I., Nanobiosensing based on optically selected antibodies and superparamagnetic labels for rapid and highly sensitive quantification of polyvalent hepatitis B surface antigen //Analytical Methods. - 2021. - Т. 13. - №. 21. - С. 2424-2433; IF = 2.896.

Тезисы конференций:

1. Pushkarev A.V., Shevchenko K.G., Gorshkov B.G., Zhukov N.V., Orlova N.N., Bragina V.A. Fouling-proof real-time optosensors for polyvalency-based characterization of circulating antibodies //2020 International Conference Laser Optics (ICLO). - IEEE, 2020.

2. Pushkarev A.V., Mochalova E.N., Burenin A.G., Guteneva N.V., Nikitin P.I. Multi-parameter label-free biosensing with self-assembled smart biolayers that transform each sensing channel into a multiplex channel //2020 International Conference Laser Optics (ICLO). - IEEE, 2020.

3. Pushkarev A.V., Znoyko S.L., Novichikhin D.O., Orlova N.N., Gorshkov B.G. Novel method of fluorescence imaging for high-sensitive in vivo investigation of biodistribution of various nanoparticles in laboratory animals //2020 International Conference Laser Optics (ICLO). -IEEE, 2020.

4. Pushkarev A.V., Mochalova E.N., Znoyko S.L., Nikitin M.P., Orlov, A.V. Smart biolayers on solid phase: Rational design and investigation by spectral-phase interferometry //2018 International Conference Laser Optics (ICLO). - IEEE, 2018.

5. Пушкарев А.В., Орлов А. В., Мочалова Е.Н., Никитин М.П., Никитин П.И. Создание на твердой фазе молекулярных слоев, реализующих базовые логические операции, и их исследование методом спектрально - фазовой интерферометрии //Международный форум биотехнология: состояние и перспективы развития. - 2018.

6. Пушкарев А.В., Орлов А.В., Никитин П.И., Никитин М.П. Реализация конструкций булевой логики на твердой фазе и их исследование методом спектрально-фазовой интерферометрии //Труды 60й всероссийской конференции МФТИ. - 2017.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Молекулярные и надмолекулярные системы in vitro

Большинство методов обнаружения биологически активных соединений обычно включает две ключевые стадии: распознавание детектируемой молекулы и визуализация факта распознаваний для передачи этой информации пользователю. Многие биологически активные молекулы, регистрация которых крайне востребована в рутинной клинической практике относятся к одному из трех классов: нуклеиновые кислоты (ДНК/РНК), белки/пептиды, малые молекулы. Регистрацию этих классов соединений мы и рассмотрим в данной части обзора.

В случае регистрации ДНК или РНК молекул для распознавания наиболее часто используются комплементарные им молекулы ДНК или РНК. Если же искомое вещество является белком или малой молекулой, то для его распознавания обычно используют методы, в основе которых лежит регистрация взаимодействия антиген-антитело. То есть ключевыми молекулами, от которых зависит распознавание регистрируемого соединения являются ДНК/РНК и антитела.

Распознающие молекулы обеспечивают узнавание регистрируемого соединения, однако полученный комплекс должен быть зарегистрирован пользователем. Визуализация этого взаимодействия происходит либо за счет физико-химических методов, способных детектировать саму реакцию (безмаркерные методы), либо за счет использования маркеров, делающих это взаимодействие видимым для пользователя. При этом часто для достижения высоких аналитических характеристик разрабатываемого метода для регистрации различных соединений используют не только сами молекулы, но и сложные надмолекулярные системы, построенные на их основе. Далее будут рассмотрены распознающие (ДНК/РНК, антитела) и другие молекулярные структуры в применении к регистрации биологически активных соединений.

1.1.1 Антитела и иммуноанализ

Антителами называются антигенраспознающие молекулы, относящиеся к классу иммуноглобулинов и участвующие в адаптивном иммунном ответе организма. Антитела в организме существуют в двух формах: на поверхности В-лимфоцита и в растворимой форме. Наиболее используемыми в медицине и науке являются растворимые антитела, поэтому рассмотрим их подробнее.

Строение молекул иммуноглобулинов было определено методами кристаллографии [1]. Молекулы иммуноглобулинов состоят из двух полипептидных цепей: тяжелой и легкой. Мономерная молекула иммуноглобулина имеет в своем составе две легких и две тяжелых цепи, соединенных дисульфидными связями и образующих форму, напоминающую букву Y [2]. Дисульфидная связь, соединяющая легкую и тяжелую цепи, локализована вблизи С-конца легкой цепи (Рисунок 1.1). Сами тяжелые цепи могут быть соединены различным числом дисульфидных связей. Легкие цепи состоят из двух доменов, а тяжелые из 4-5. Домены имеют глобулярную структуру, образованы несколькими Р-складками и стабилизированы дисульфидными связями. Сродство к антигену и специфичность антител определяются строением антигенсвязывающего центра, образованного вариабельными доменами легких и тяжелых цепей (на Рисунке 1.1 обозначено буквой V). C-домены являются постоянными для всех антител организма и отвечают за эффекторные функции антител. В строении антител выделяют также антигенсвязывающий (Fab) и концевой Fc фрагменты, которые сохраняют свою функциональность независимо друг от друга (например, после расщепления папаином).

Рисунок 1.1. Схема строения молекулы IgG. Адаптировано из [2].

В зависимости от структуры тяжелых цепей выделяют 5 классов молекул иммуноглобулинов: A, D, E, G, M [3]. Всего существует 2 типа легких цепей и 5 типов тяжелых. Иммуноглобулины различных классов могут быть как мономерами, так димерами (IgA) и пентамерами (IgM) (Рисунок 1.2). Различные классы иммуноглобулинов продуцируются на разных стадиях формирования иммунного ответа и выполняют различные функции. Наиболее интересными в практическом применении являются иммуноглобулины IgG, так как они

Fab

Fab'

составляют более 70% всех иммуноглобулинов в сыворотке крови, имеют высокое сродство к антигену и относительно небольшую молекулярную массу.

Рисунок 1.2. Классы (изотипы) иммуноглобулинов: а - IgG, б - ^Е, г - ^М, д - ^А. Синие линии - константные связи, красные - вариабельные домены, зеленые - дисульфидные связи, розовые кружки - участки гликозилирования. Адаптировано из [3].

Наиболее применяемыми на практике являются иммуноглобулины класса О. Они позволяют с высокой специфичностью связывать регистрируемое вещество и потому активно используются в современном иммуноанализе.

Существует несколько основных форматов иммуноанализа (Рисунок 1.3). Обычно, в большинстве практических применений, иммунохимические реакции регистрируются на твердой фазе (сенсорном чипе, планшете) - твердофазный иммуноанализ.

Прямой Прямой «Сэндвич» формат Конкурентный формат

для детекции антигена ДЛЯ детекции антител Для детекции антигена Для детекции антител Непрямой ДЛЯ детекции антигена Прямой для детекции антигена Прямой для детекциии антител

Исходная поверхность • • • • уу • •

Стадия 1 (инкубация с образцом) • • • • • • К* л / У Л. л. • • • * • • у у -Ш

Стадия 2 Л . ■ у у 4 1 1 - -

- - Твердая фаза - Метка • ' Неспецифические молекулы из образца ^^ - Специфические антитела • I " Специфические антигены

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пушкарев Аверьян Владимирович, 2022 год

Список использованной литературы

1. Silverton E.W., Navia M.A., Davies D.R. Three-dimensional structure of an intact human immunoglobulin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. Vol. 74, № 11. P. 5140-5144.

2. Amzel L.M., Poljak R.J. Three-Dimensional Structure of Immunoglobulins // Annu. Rev. Biochem. 1979. Vol. 48, № 1. P. 961-997.

3. Ярилин А. А. Иммунология. Учебник. Москва: "ГЭОТАР-Медиа", 2010.

4. ISOBE N., NAKAO T. Direct enzyme immunoassay of progesterone in bovine plasma // Anim. Sci. J. 2003. Vol. 74, № 5. P. 369-373.

5. Kohl T.O., Ascoli C.A. Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) // Cold Spring Harb. Protoc. 2017. Vol. 2017, № 7. P. pdb.prot093740.

6. Thirumala-Devi K. et al. Development and Application of an Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunoassay for Aflatoxin M 1 in Milk and Milk-Based Confectionery // J. Agric. Food Chem. 2002. Vol. 50, № 4. P. 933-937.

7. Er E. et al. Metal Nanoparticles/MoS 2 Surface-Enhanced Raman Scattering-Based Sandwich Immunoassay for a-Fetoprotein Detection // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2021. Vol. 13, № 7. P. 8823-8831.

8. Chen J. et al. A fluorescent nanosphere-based immunochromatography test strip for ultrasensitive and point-of-care detection of tetanus antibody in human serum // Anal. Bioanal. Chem. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2020. Vol. 412, № 5. P. 1151-1158.

9. Butler J.E. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay // J. Immunoassay. 2000. Vol. 21, № 2-3. P. 165-209.

10. Watson J.D., Crick F.H.C. THE STRUCTURE OF DNA // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1953. Vol. 18. P. 123-131.

11. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. Москва: "Просвещение", 1987.

12. Что такое ДНК и как она работает. //Новая наука. 2021. URL: https://new-science.ru/chto-takoe-dnk-i-kak-ona-rabotaet/ (дата обращения: 05.05.2022).

13. Yang L.F. et al. Aptamer Sandwich Lateral Flow Assay (AptaFlow) for Antibody-Free SARS-CoV-2 Detection // Anal. Chem. 2022.

14. Erlich H.A. Polymerase chain reaction // J. Clin. Immunol. 1989. Vol. 9, № 6. P. 437-447.

15. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction // Science (80-. ). 1991. Vol. 252, № 5013. P. 1643-1651.

16. Bachman J. Reverse-Transcription PCR (RT-PCR) // Methods in Enzymology. 1st ed. Elsevier Inc., 2013. Vol. 530. P. 67-74.

17. Williams P.M., Tucker A.L. Real-time quantitative PCR // PCR Applications. Elsevier, 1999. Vol. 33, № 1 Suppl. P. 365-375.

18. Seifi M. et al. Overview of Real-Time PCR Principles // Polymerase Chain Reaction. InTech, 2012.

19. Mackay I M. Real-time PCR in virology // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30, № 6. P. 1292-1305.

20. Thomson D., Dietzgen R.G. Detection of DNA and RNA plant viruses by PCR and RT-PCR using a rapid virus release protocol without tissue homogenization // J. Virol. Methods. 1995. Vol.

132

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

54, № 2-3. P. 85-95.

Paterlini P. et al. Polymerase Chain Reaction to Detect Hepatitis B Virus DNA and RNA Sequences in Primary Liver Cancers from Patients Negative for Hepatitis B Surface Antigen // N. Engl. J. Med. 1990. Vol. 323, № 2. P. 80-85.

Xu X.-G. et al. Development of multiplex PCR for simultaneous detection of six swine DNA and RNA viruses // J. Virol. Methods. Elsevier B.V., 2012. Vol. 183, № 1. P. 69-74.

Yan L. et al. Isothermal amplified detection of DNA and RNA // Mol. Biosyst. 2014. Vol. 10, № 5. P. 970.

Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, № 12. P. 63e - 63.

Kojima T. PCR amplification from single DNA molecules on magnetic beads in emulsion: application for high-throughput screening of transcription factor targets // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33, № 17. P. e150-e150.

Rubenstein K.E., Schneider R.S., Ullman E.F. "Homogeneous" enzyme immunoassay. A new immunochemical technique // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 47, № 4. P. 846851.

WANG C. et al. Chemiluminescent Immunoassay and its Applications // Chinese J. Anal. Chem. Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, 2012. Vol. 40, № 1. P. 3-10.

Quan Y. et al. Development of an Enhanced Chemiluminescence ELISA for the Rapid Detection of Acrylamide in Food Products // J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59, № 13. P. 6895-6899.

Koczula K.M., Gallotta A. Lateral flow assays // Essays Biochem. / ed. Estrela P. 2016. Vol. 60, № 1. P. 111-120.

O'Farrell B. Lateral Flow Immunoassay Systems // The Immunoassay Handbook. Fourth Edi. Elsevier, 2013. P. 89-107.

Peiris S., McMurtrie J., Zhu H.-Y. Metal nanoparticle photocatalysts: emerging processes for green organic synthesis // Catal. Sci. Technol. Royal Society of Chemistry, 2016. Vol. 6, № 2. P. 320-338.

Lu X. et al. Chemical Synthesis of Novel Plasmonic Nanoparticles // Annu. Rev. Phys. Chem. 2009. Vol. 60, № 1. P. 167-192.

Scaiano J.C., Stamplecoskie K.G., Hallett-Tapley G.L. Photochemical Norrish type I reaction as a tool for metal nanoparticle synthesis: importance of proton coupled electron transfer // Chem. Commun. 2012. Vol. 48, № 40. P. 4798.

Qiu W. et al. Carbon nanotube-based lateral flow biosensor for sensitive and rapid detection of DNA sequence // Biosens. Bioelectron. Elsevier, 2015. Vol. 64. P. 367-372.

Cherkasov V.R. et al. Nanoparticle Beacons: Supersensitive Smart Materials with On/Off-Switchable Affinity to Biomedical Targets // ACS Nano. 2020. Vol. 14, № 2. P. 1792-1803.

Lee K.H., Park H., Hwang M. Immunomagnetic nanoparticle-based assays for detection of biomarkers // Int. J. Nanomedicine. 2013. Vol. 8. P. 4543.

Denmark D.J. et al. Readiness of Magnetic Nanobiosensors for Point-of-Care Commercialization // J. Electron. Mater. 2019. Vol. 48, № 8. P. 4749-4761.

Wu K. et al. Giant Magnetoresistance Biosensors in Biomedical Applications // ACS Appl. Mater.

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

Interfaces. 2022. Vol. 14, № 8. P. 9945-9969.

Storm J.-H. et al. Detection of body noise with an ultra-sensitive SQUID system // Meas. Sci. Technol. 2019. Vol. 30, № 12. P. 125103.

Nikitin P.I., Vetoshko P.M., Ksenevich T.I. New type of biosensor based on magnetic nanoparticle detection // J. Magn. Magn. Mater. 2007. Vol. 311, № 1. P. 445-449.

Guteneva N. V. et al. Three-dimensional modular biosensor for express determination of several cardiac markers // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). IEEE, 2020. P. 1-1.

Orlov A. V. et al. Magnetic Immunoassay for Detection of Staphylococcal Toxins in Complex Media // Anal. Chem. 2013. Vol. 85, № 2. P. 1154-1163.

Bennet M.A. MULTI-PARAMETER QUANTITATIVE MAPPING OF MICROFLUIDIC DEVICES. 2011. № January.

Jares-Erijman E.A., Jovin T.M. FRET imaging // Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21, № 11. P. 13871395.

Wellman M., Abizaid A. Growth Hormone Secretagogue Receptor Dimers: A New Pharmacological Target // eneuro. 2015. Vol. 2, № 2. P. ENEUR0.0053-14.2015.

Vira S. et al. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling // Anal. Biochem. Elsevier Inc., 2010. Vol. 402, № 2. P. 146-150.

Choi S. et al. A rapid, simple measurement of human albumin in whole blood using a fluorescence immunoassay (I) // Clin. Chim. Acta. 2004. Vol. 339, № 1-2. P. 147-156.

Pugachov D.E. et al. Fluorinated tetraketone derivatives of N-substituted carbazoles and their Eu(III) complexes for fluorescence immunoassay // Chem. Heterocycl. Compd. 2018. Vol. 54, № 5. P. 528-534.

Poudineh M. et al. A fluorescence sandwich immunoassay for the real-time continuous detection of glucose and insulin in live animals // Nat. Biomed. Eng. 2021. Vol. 5, № 1. P. 53-63.

McGrath J., Jimenez M., Bridle H. Deterministic lateral displacement for particle separation: a review // Lab Chip. Royal Society of Chemistry, 2014. Vol. 14, № 21. P. 4139-4158.

Bünzli J.-C.G. Lanthanide Luminescence for Biomedical Analyses and Imaging // Chem. Rev. 2010. Vol. 110, № 5. P. 2729-2755.

Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan,Aequorea // J. Cell. Comp. Physiol. 1962. Vol. 59, № 3. P. 223-239.

Gerdes H.-H., Kaether C. Green fluorescent protein: applications in cell biology // FEBS Lett. 1996. Vol. 389, № 1. P. 44-47.

Müller-Taubenberger A., Anderson K.I. Recent advances using green and red fluorescent protein variants // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. Vol. 77, № 1. P. 1-12.

Shaner N.C., Steinbach P.A., Tsien R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins // Nat. Methods. 2005. Vol. 2, № 12. P. 905-909.

Filonov G.S. et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging // Nat. Biotechnol. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 29, № 8. P. 757-761.

Griesbeck O. et al. Reducing the Environmental Sensitivity of Yellow Fluorescent Protein // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 31. P. 29188-29194.

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

Chan W.C.W. et al. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. Vol. 13, № 1. P. 40-46.

Tian P. et al. Graphene quantum dots from chemistry to applications // Mater. Today Chem. Elsevier Ltd, 2018. Vol. 10. P. 221-258.

Jamieson T. et al. Biological applications of quantum dots // Biomaterials. 2007. Vol. 28, № 31. P.4717-4732.

Zhang C.-Y. et al. Single-quantum-dot-based DNA nanosensor // Nat. Mater. 2005. Vol. 4, № 11. P. 826-831.

Nagl S., Schaeferling M., Wolfbeis O.S. Fluorescence Analysis in Microarray Technology // Microchim. Acta. 2005. Vol. 151, № 1-2. P. 1-21.

Homola J. Surface Plasmon Resonance Sensors for Detection of Chemical and Biological Species // Chem. Rev. 2008. Vol. 108, № 2. P. 462-493.

Pattnaik P. Surface Plasmon Resonance: Applications in Understanding Receptor-Ligand Interaction // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. Vol. 126, № 2. P. 079-092.

Cush R. et al. The resonant mirror: a novel optical biosensor for direct sensing of biomolecular interactions Part I: Principle of operation and associated instrumentation // Biosens. Bioelectron. 1993. Vol. 8, № 7-8. P. 347-354.

Heideman R.G., Lambeck P.V. Remote opto-chemical sensing with extreme sensitivity: design, fabrication and performance of a pigtailed integrated optical phase-modulated Mach-Zehnder interferometer system // Sensors Actuators B Chem. 1999. Vol. 61, № 1-3. P. 100-127.

Nikitin P.I. et al. Optical picoscopes: new opportunities for biosensing and for molecular technologies / ed. Matvienko G. et al. 2007. P. 67331M.

Nikitin P.I. et al. Spectral-phase interference method for detecting biochemical reactions on a surface // Quantum Electron. 2000. Vol. 30, № 12. P. 1099-1104.

Orlov A. V. et al. Development of immunoassays using interferometric real-time registration of their kinetics. // Acta Naturae. 2014. Vol. 6, № 1. P. 85-95.

Nekrasov N. et al. Spectral-Phase Interferometry Detection of Ochratoxin A via Aptamer-Functionalized Graphene Coated Glass // Nanomaterials. 2021. Vol. 11, № 1. P. 226.

Nikitin P.., Valeiko M.., Gorshkov B.. New direct optical biosensors for multi-analyte detection // Sensors Actuators B Chem. 2003. Vol. 90, № 1-3. P. 46-51.

Orlov A.V. et al. Ultrasensitive interferometric and magnetic analytical systems for simultaneous express detection of multiple disease biomarkers // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). IEEE, 2020. P. 1-1.

Nikitin P.I. et al. Picoscope, a new label-free biosensor // Sensors Actuators B Chem. 2005. Vol. 111-112. P. 500-504.

Drummond D.C. et al. Pharmacokinetics and in vivo drug release rates in liposomal nanocarrier development // J. Pharm. Sci. 2008. Vol. 97, № 11. P. 4696-4740.

Kim D.H. et al. Noninvasive Assessment of Exosome Pharmacokinetics In Vivo: A Review // Pharmaceutics. 2019. Vol. 11, № 12. P. 649.

Hoshyar N. et al. The effect of nanoparticle size on in vivo pharmacokinetics and cellular interaction // Nanomedicine. 2016. Vol. 11, № 6. P. 673-692.

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

Varga Z. et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies // Cancer Biother. Radiopharm. 2016. Vol. 31, № 5. P. 168-173.

Merkel O.M. et al. In Vivo SPECT and Real-Time Gamma Camera Imaging of Biodistribution and Pharmacokinetics of siRNA Delivery Using an Optimized Radiolabeling and Purification Procedure // Bioconjug. Chem. 2009. Vol. 20, № 1. P. 174-182.

Kampa N. Renal Scintigraphy in Dogs. 2006. № May. 54 p.

Ritt P., Sanders J., Kuwert T. SPECT/CT technology // Clin. Transl. Imaging. 2014. Vol. 2, № 6. P. 445-457.

Shi S. et al. Copper-64 Labeled PEGylated Exosomes for In Vivo Positron Emission Tomography and Enhanced Tumor Retention // Bioconjug. Chem. 2019. Vol. 30, № 10. P. 2675-2683.

Schluep T. et al. Pharmacokinetics and tumor dynamics of the nanoparticle IT-101 from PET imaging and tumor histological measurements // Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. Vol. 106, № 27. P. 11394-11399.

Majetich S.A. Magnetic Nanoparticles and Their Applications in medicine // Nanostructured Materials. Elsevier, 2007. Vol. 1. P. 439-485.

Zelepukin I. V. et al. Nanoparticle-based drug delivery via RBC-hitchhiking for the inhibition of lung metastases growth // Nanoscale. Royal Society of Chemistry, 2019. Vol. 11, № 4. P. 16361646.

Nikitin M.P. et al. Enhancement of the blood-circulation time and performance of nanomedicines via the forced clearance of erythrocytes // Nat. Biomed. Eng. Springer US, 2020. Vol. 4, № 7. P. 717-731.

Takahashi Y. et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection // J. Biotechnol. Elsevier B.V., 2013. Vol. 165, №

2. P. 77-84.

Etrych T. et al. Fluorescence optical imaging in anticancer drug delivery // J. Control. Release. 2016. Vol. 226. P. 168-181.

del Rosal B., Benayas A. Strategies to Overcome Autofluorescence in Nanoprobe-Driven In Vivo Fluorescence Imaging // Small Methods. 2018. Vol. 2, № 9. P. 1800075.

Pushkarev A.V. et al. Data on characterization of glass biochips and validation of the label-free biosensor for detection of autoantibodies in human serum // Data Br. Elsevier Inc., 2020. Vol. 30. P.105648.

Bragina V.A. et al. Nanobiosensing based on optically selected antibodies and superparamagnetic labels for rapid and highly sensitive quantification of polyvalent hepatitis B surface antigen // Anal. Methods. Royal Society of Chemistry, 2021. Vol. 13, № 21. P. 2424-2433.

Valsesia A. et al. Use of Nanopatterned Surfaces To Enhance Immunoreaction Efficiency // Anal. Chem. 2008. Vol. 80, № 5. P. 1418-1424.

Gogolides E., Ellinas K., Tserepi A. Hierarchical micro and nano structured, hydrophilic, superhydrophobic and superoleophobic surfaces incorporated in microfluidics, microarrays and lab on chip microsystems // Microelectron. Eng. Elsevier B.V., 2015. Vol. 132. P. 135-155.

Song L. et al. High-efficiency immunoassay platforms with controllable surface roughness and oriented antibody immobilization // J. Mater. Chem. B. Royal Society of Chemistry, 2015. Vol.

3, № 38. P. 7499-7502.

94. Yuan S. et al. Surface modification of polycaprolactone substrates using collagen-conjugated poly(methacrylic acid) brushes for the regulation of cell proliferation and endothelialisation // J. Mater. Chem. 2012. Vol. 22, № 26. P. 13039.

95. Ivanov A.E. et al. Interferometric detection of chloramphenicol via its immunochemical recognition at polymer-coated nano-corrugated surfaces // Sensors Actuators B Chem. Elsevier, 2019. Vol. 282. P. 984-991.

96. O'Shaughnessy B., Vavylonis D. Irreversible adsorption from dilute polymer solutions // Eur. Phys. J. E. 2003. Vol. 11, № 3. P. 213-230.

97. Duque L. et al. Immobilization of Biomolecules to Plasma Polymerized Pentafluorophenyl Methacrylate // Biomacromolecules. 2010. Vol. 11, № 10. P. 2818-2823.

98. Unusan N. Occurrence of chloramphenicol, streptomycin and tetracycline residues in ultra-heat-treatment milk marketed in Turkey // Int. J. Food Sci. Nutr. 2009. Vol. 60, № 5. P. 359-364.

99. Guo L. et al. Comparsion of an immunochromatographic strip with ELISA for simultaneous detection of thiamphenicol, florfenicol and chloramphenicol in food samples // Biomed. Chromatogr. 2015. Vol. 29, № 9. P. 1432-1439.

100. Oliveri Conti G. et al. Determination of illegal antimicrobials in aquaculture feed and fish: An ELISA study // Food Control. Elsevier Ltd, 2015. Vol. 50. P. 937-941.

101. Reybroeck W. Residues of antibiotics and chemotherapeutics in honey // J. Apic. Res. Taylor & Francis, 2018. Vol. 57, № 1. P. 97-112.

102. Pushkarev A. V. et al. Rapid and Easy-to-Use Method for Accurate Characterization of Target Binding and Kinetics of Magnetic Particle Bioconjugates for Biosensing // Sensors. 2021. Vol. 21, № 8. P. 2802.

103. Saha B., Evers T.H., Prins M.W.J. How Antibody Surface Coverage on Nanoparticles Determines the Activity and Kinetics of Antigen Capturing for Biosensing // Anal. Chem. 2014. Vol. 86, № 16. P. 8158-8166.

104. Bragina V.A. et al. Analytical Platform with Selectable Assay Parameters Based on Three Functions of Magnetic Nanoparticles: Demonstration of Highly Sensitive Rapid Quantitation of Staphylococcal Enterotoxin B in Food // Anal. Chem. 2019. Vol. 91, № 15. P. 9852-9857.

105. A.V. Orlov, A.V. Pushkarev, S.L. Znoyko, D.O. Novichikhin, V.A. Bragina B.G.G. and P.I.N. Multiplex label-free biosensor for detection of autoantibodies in human serum: tool for new kinetics-based diagnostics of autoimmune diseases. // Biosens. Bioelectron.

106. Oh S. et al. Analytes kinetics in lateral flow membrane analyzed by cTnI monitoring using magnetic method // Sensors Actuators B Chem. Elsevier B.V., 2011. Vol. 160, № 1. P. 747-752.

107. Orlov A. V. et al. A new real-time method for investigation of affinity properties and binding kinetics of magnetic nanoparticles // J. Magn. Magn. Mater. Elsevier, 2015. Vol. 380. P. 231235.

108. Canovi M. et al. Applications of Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Characterization of Nanoparticles Developed for Biomedical Purposes // Sensors. 2012. Vol. 12, № 12. P. 1642016432.

109. Björke H., Andersson K. Measuring the affinity of a radioligand with its receptor using a rotating cell dish with in situ reference area // Appl. Radiat. Isot. 2006. Vol. 64, № 1. P. 32-37.

110. Yoshimoto K. et al. Direct Observation of Adsorption-Induced Inactivation of Antibody Fragments Surrounded by Mixed-PEG Layer on a Gold Surface // J. Am. Chem. Soc. 2010. Vol.

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

132, № 23. P. 7982-7989.

Liu Z. et al. The effect of report particle properties on lateral flow assays: A mathematical model // Sensors Actuators B Chem. Elsevier B.V., 2017. Vol. 248. P. 699-707.

Byzova N.A. et al. Less is More: A Comparison of Antibody-Gold Nanoparticle Conjugates of Different Ratios // Bioconjug. Chem. 2017. Vol. 28, № 11. P. 2737-2746.

van der Heide S., Russell D.A. Optimisation of immuno-gold nanoparticle complexes for antigen detection // J. Colloid Interface Sci. Elsevier Inc., 2016. Vol. 471. P. 127-135.

Tripathi K., Driskell J.D. Quantifying Bound and Active Antibodies Conjugated to Gold Nanoparticles: A Comprehensive and Robust Approach To Evaluate Immobilization Chemistry // ACS Omega. 2018. Vol. 3, № 7. P. 8253-8259.

Puertas S. et al. Designing novel nano-immunoassays: antibody orientation versus sensitivity // J. Phys. D. Appl. Phys. 2010. Vol. 43, № 47. P. 474012.

Zhang L. et al. Direct quantification of surface coverage of antibody in IgG-Gold nanoparticles conjugates // Talanta. Elsevier B.V., 2019. Vol. 204, № January. P. 875-881.

Kozlowski R., Ragupathi A., Dyer R.B. Characterizing the Surface Coverage of Protein-Gold Nanoparticle Bioconjugates // Bioconjug. Chem. 2018. Vol. 29, № 8. P. 2691-2700.

Filbrun S.L., Driskell J.D. A fluorescence-based method to directly quantify antibodies immobilized on gold nanoparticles // Analyst. Royal Society of Chemistry, 2016. Vol. 141, № 12. P. 3851-3857.

Olson B.J.S.C. Assays for Determination of Protein Concentration // Curr. Protoc. Pharmacol. 2016. Vol. 73, № 1. P. A.3A.1-A.3A.32.

Geng S.B. et al. Facile Preparation of Stable Antibody-Gold Conjugates and Application to Affinity-Capture Self-Interaction Nanoparticle Spectroscopy // Bioconjug. Chem. 2016. Vol. 27, № 10. P. 2287-2300.

Nikitin M.P. et al. Biocomputing based on particle disassembly // Nat. Nanotechnol. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 9, № August. P. 716-722.

Orlov A.V. et al. Development and label-free investigation of logic-gating biolayers for smart biosensing // Sensors Actuators, B Chem. 2018. Vol. 257. P. 971-979.

Pushkarev A.V. et al. Smart Biolayers on Solid Phase: Rational Design and Investigation by Spectral-Phase Interferometry // 2018 International Conference Laser Optics (ICLO). IEEE, 2018. Vol. 407, № 14. P. 563-563.

Mochalova E.N. et al. Intelligent nanoparticle-based agents for biomedical applications: Rapid design using a lateral flow assay // Proc. - Int. Conf. Laser Opt. 2018, ICLO 2018. IEEE, 2018. Vol. 88, № 21. P. 569.

Znoyko S.L. et al. Ultrasensitive quantitative detection of small molecules with rapid lateral-flow assay based on high-affinity bifunctional ligand and magnetic nanolabels // Anal. Chim. Acta. Elsevier, 2018. Vol. 1034. P. 161-167.

Orlov A.V. et al. Data on characterization and validation of assays for ultrasensitive quantitative detection of small molecules: Determination of free thyroxine with magnetic and interferometric methods // Data Br. Elsevier Inc., 2018. Vol. 21. P. 1603-1611.

Pushkarev A. V. et al. Multi-parameter label-free biosensing with self-assembled smart biolayers that transform each sensing channel into a multiplex channel // 2020 International Conference

Laser Optics (ICLO). IEEE, 2020. Vol. 14. P. 1-1.

128. Pushkarev A.V. et al. Fouling-proof real-time optosensors for polyvalency-based characterization of circulating antibodies // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). IEEE, 2020. P. 1-1.

129. Micro-Manager. URL: https://micro-manager.org/ (дата обращения: 05.05.2022).

130. ImageJ. URL: https://fiji.sc/ (дата обращения: 05.05.2022).

131. Pushkarev A. V. et al. Novel method of fluorescence imaging for high-sensitive in vivo investigation of biodistribution of various nanoparticles in laboratory animals // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). IEEE, 2020. P. 1-1.