Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Фатеев, Илья Владимирович

• Фатеев, Илья Владимирович
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Фатеев, Илья Владимирович

Список сокращений

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Модифицированные нуклеозиды в терапии онкологических заболеваний

2.2 Химический синтез аналогов пуриновых нуклеозидов (кладрибина, флударабина)

2.2.1 Химический синтез кладрибина и его аналогов

2.2.2 Химический синтез флударабина

2.3 Нуклеозидфосфорилазы - ферменты нуклеинового обмена

2.3.1 Нуклеозидфосфорилазы пуринового типа

2.3.1.1 Высокомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

2.3.1.2 Низкомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

2.3.2 Нуклеозидфосфорилазы пиримидинового типа

2.3.2.1 Уридинфосфорилаза

2.3.2.2 Тимидинфосфорилаза Е. coli и пиримидиннуклеозидфосфорилаза 26 Bacillus stearothermophilus

2.4 Применение нуклеозидфосфорилаз в синтезе модифицированных нуклеозидов

2.5 Механизм биологической активности кладрибина, флударабина и рибавирина

2.5.1 Механизм противоопухолевого действия кладрибина

2.5.2 Механизм противоопухолевой активности флударабина в терапии 37 злокачественных заболеваний системы кроветворения

2.5.3 Биологическая аективность рибавирина

2.6 Новые ингибиторы нуклеозидфосфорилаз

2.6.1 Модификации оснований

2.6.2 Модификации пентозного кольца

2.6.3 Замена кольца пентозы циклическим или ациклическим заместителем

2.6.4 Бисубстратные аналоги ингибиторов

2.6.5 Ингибиторы переходного состояния

2.6.6 Ингибиторы высокомолекулярной ПНФ (Е. coli)

2.6.7 Ингибиторы нуклеозидфосфорилаз в терапии злокачественных 51 поражений системы кроветворения и иммунодефицитных состояний

3 Обсуждение результатов 53 3.1 Разработка биотехнологии получения субстанций фармпрепаратов кладрибина и 54 флудары

3.1.1 Синтез 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (кладрибина)

3.1.1.1 Синтез 2-хлораденина (2-С1 Ade)

3.1.1.2 Выбор донора 2' -дезоксирибозы в синтезе кладрибина

3.1.1.3 Масштабирование реакции ферментативного синтеза кладрибина из 60 2-хлораденина и тимидина

3.1.2 Синтез 5'-фосфата 6-амино-9-Р-Б-арабинофуранозил-2-фтор-9-Н-пурина 61 (флудары)

3.1.2.1 Синтез 6-амино-9-р-0-арабинофуранозил-2-фтор-9-Н-пурина 62 (флударабина)

3.1.2.2 Синтез 5'-фосфата флударабина

3.2 Синтез аналогов рибавирина и видарабина

3.2.1 Синтез 5-метилрибавирина и 5-метил-2'-дезоксирибавирина

3.2.2 Синтез аналогов рибавирина на основе 1,2,4-аминотриазола (23)

3.2.3 Разработка методов синтеза аналогов видарабина

3.3 Изучение субстратно-специфических свойств нуклеозидфосфорилаз

3.4 Изучение противовирусной активности синтезированных соединений

4 Экспериментальная часть

5 Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов»

В настоящее время в мировой клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности - противоопухолевой (онкологические заболевания системы кровообращения), противовирусной (гепатит С, герпес и др.), иммуносупрессорной (рассеянный склероз, трансплантация костного мозга). Терапевтический эффект использования препаратов на основе модифицированных нуклеозидов при лечении злокачественных поражений системы кроветворения достигает 80% полных ремиссий после одного курса монохимиотерапии. Модифицированные нуклеозиды успешно сочетаются с препаратами последнего поколения на основе моноклональных антител (Rituximab и САМРАТН-1Н). Ведутся работы по изучению комплексной терапии рассеянного склероза и опухолевых поражений системы кроветворения кладрибином и стволовыми клетками.

В России зарегистрированы для клинического использования множество препаратов на основе аналогов модифицированных нуклеозидов, например флудара ("Fludara", Shering AG, Jonson&Jonson), рибавирин (ICN Pharma). Стоимость курса лечения кладрибином (50-70 мг) составляет 3500 долларов США, а курс лечения флударабином (1.3-1.5 г) обойдется пациенту в 6500 долларов США, поэтому в широкой клинической практике они практически не используются.

Все вышеперечисленные препараты получены методами многостадийного химического синтеза, имеющего ряд принципиальных недостатков - большие затраты сырья и реагентов, необходимость утилизации экологически небезопасных токсических отходов химического производства. Это не соответствует тенденциям современной биоиндустрии, особенно с учетом требований по охране окружающей среды.

Учитывая все вышеизложенное, очевидна крайняя необходимость создания современных отечественных технологий получения лекарственных препаратов на основе модифицированных нуклеозидов для широкого применения в практической медицине.

В настоящей работе предлагается эффективный биотехнологический способ получения субстанций лекарственных препаратов (кладрибина и флудары) и синтеза модифицированных аналогов нуклеозидов с использованием генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз, что позволяет значительно упростить общую технологическую схему производства, повысить эффективность процесса. Разработанные технологии синтеза модифицированных нуклеозидов хорошо воспроизводятся, легко масштабируются и могут быть внедрены на предприятиях медико-биологического профиля.

Микробиологическое трансгликозилирование (т.е. перенос остатка рибозы с природного основания на химически модифицированное) нуклеозидфосфорилазами в составе целых клеток бактерий является эффективным методом синтеза модифицированных нуклеозидов. Этот подход к синтезу пуриновых нуклеозидов обладает рядом существенных преимуществ в сравнении с химическими способами получения указанных соединений, а именно: а) стерео- и региоспецифичностью реакций, в результате которых образуются исключительно N9-$-изомеры; б) доступностью биокатализатора, обусловленной использованием целых микробных клеток без выделения индивидуальных ферментов; в) высокими выходами целевых соединений [1-4].

Активно ведутся работы в области создания новых лекарственных препаратов, обладающих более высокой специфичностью и меньшей токсичностью: около 10 модифицированных нуклеозидов находятся на завершающих стадиях медико-биологических испытаний. Применение микробиологического трансгликозилирования возможно не только для разработки способа синтеза уже известных нуклеозидов, но и для получения принципиально новых соединений для последующего тестирования их биологической активности, что и является вторым направлением исследований диссертационной работы.

2 Обзор литературы

2.1 Модифицированные пуриновые нуклеозиды в терапии онкологических

Нуклеозиды с антиметаболической активностью составляют один из важнейших классов биологически активных веществ. Они нашли широкое применение в онкологии, вирусологии, энзимологии и в последние годы используются для генно-инженерных работ. На протяжении последних лет большое внимание уделяется созданию и изучению свойств новых модифицированных нуклеозидов, перспективных в качестве противоопухолевых и противовирусных соединений.

Цитотоксические аналоги нуклеозидов широко применяются в современной клинической практике в качестве препаратов первого выбора для терапии ряда злокачественных заболеваний человека. Нуклеозиды, обладающие противоопухолевыми свойствами, созданы на основе природных соединений пуринового и пиримидинового ряда. Они применяются в онкологии для терапии как солидных опухолей, так и для лечения злокачественных поражений системы кроветворения. Соединения данного типа нацелены на различные внутриклеточные процессы, действуют как антиметаболиты, заменяя природные нуклеозиды в процессе синтеза ДНК и РНК и как ингибиторы ряда клеточных ферментов. В настоящее время преимущественно используются пять пуриновых модифцированных нуклеозидов, одобренных FDA (кладрибин (1), монофосфат флударабина (флудара) (2), меркаптопурин (3), тиогуанин (4) и дезоксиформицин (5)): заболеваний

О II

НО— Р-О— но— он он он флудара, (2) кладрибин, (1) он

R = SH, Ri=R2=H, 6-меркаптопурин (3) дезоксиформицин (5)

R = SH, Ri=NH2, R2=H, б-тиогуанин (4)

На различных стадиях клинических испытаний находятся более десяти новых модифицированных нуклеозидов, среди которых необходимо упомянуть следующие наиболее перспективные: клофарабин (6), иммуциллин-Н (7), неларабин (8), 8-хлораденозин. Выяснение механизма действия аналогов нуклеозидов и синтез новых соединений создают основу для дальнейшего расширения спектра новых современных терапевтических препаратов для онкологии.

ОН он он он клофарабин, (6) иммуциллин H, (7) неларабин, (8)

Кладрибин (2-хлор-2'-дезоксиаденозин) (1) - препарат, обладающий противоопухолевой активностью по отношению к Т-клеткам лимфоцитов. Он применяется для лечения волосатоклеточного лейкоза, хронического лейкоза лимфоцитов и рассеянного склероза.

Кладрибин относится к новым антиметаболитам, активно применяемым в химиотерапии злокачественных опухолей. По сравнению со многими другими лекарствами, он обладает более выраженным терапевтическим эффектом (до 80% полных ремиссий после одного курса монохимиотерапии), также проявляет активность при остром миелолейкозе у взрослых и детей, макроглобулинемии Вальденстрема, Т-клеточных кожных лимфомах [5].

Довольно пристальное внимание уделяется кладрибину в исследованиях, посвященных разработке новых средств лечения рассеянного склероза - хронического прогрессирующего заболевания нервной системы. Оно возникает в молодом и среднем возрасте (15 - 40 лет). Особенностью болезни является одновременное поражение нескольких различных отделов нервной системы, что приводит к появлению у больных разнообразной неврологической симптоматики. Это довольно распространенное заболевание. В мире насчитывается около 2 млн больных рассеянным склерозом, в России - около 150 тыс [6].

Было показано, что иммунодепрессанты 2-го поколения, в том числе и кладрибин, способны селективно подавлять активность Т-лимфоцитов. У большинства пациентов не только замедлялось прогрессирование рассеянного склероза, но и уменьшалось количество активных очагов. Препараты хорошо переносятся и имеют по сравнению с другими лекарственными средствами этой же группы относительно низкую токсичность, хотя в ряде случаев наблюдаются побочные эффекты в виде угнетения функции костного мозга и тромбоцитопении, реже — токсического миокардита [7].

За последнее десятилетие был синтезирован ряд аналогов кладрибина, но по активности и селективности наиболее близкими к нему оказались 2-бром-2,-дезоксиаденозин (9) и 2-йод-Т-дезоксиаденозин (10), 8-бром-2-хлор-2'-дезоксиаденозин (11) [8]:

NH? хл> N но

0. он

Х=Вг (9), I (10)

NH-> N

С1 но

N -О.

N -N7

ОН 11

Вг

Высокой активностью обладает 6,6^^-диметил-2-8-метил-2>-дезоксиаденозин (12), в то время как 2-8-метил-6-К-метил-2,-дезоксиаденозин (13) малоактивен, а 2-8-метил-2л-дезоксиаденозин (14) почти неактивен.

HO—, П

OH

X= NMe2 (12), NHMe (13), NH2 (14) Синтезирован также ряд аналогов нуклеозидов, с модифицированным гетероциклом [9]:

Структурные модификации кладрибина представляют интерес, как в определении их биологической активности, так и в изучении механизма действия модифицированных нуклеозидов, обладающих противоопухолевой активностью.

Разработка и введение в клиническую практику 5'-фосфата флударабина (2) (компании «Schering AG»), является перспективным и может служить базой для создания новых излечивающих программ [10, 11]. Высокая эффективность аналогов пуриновых нуклеозидов убедительно показана при лечении различных вариантов неходжкинских лимфом (НХЛ), в том числе высокоагрессивных и прогностически неблагоприятных форм [12, 13].

ОН

ОН

15)

Х=С, Y=N (16) X=N, Y=C (17)

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Фатеев, Илья Владимирович

Выводы.

1. Разработаны эффективные биотехнологии получения субстанций кладрибина и флудары с использованием генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз, перспективные для внедрения на предприятиях медико-биологического профиля. Фармацевтические субстанции охарактеризованы данными физико-химических анализов, на основании которых были разработаны проекты ФСП в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XI. Созданы лабораторные регламенты получения субстанций кладрибина и флудары в соответствии с требованиями ОСТ 64-02-003-2002.

2. Впервые с использованием реакции трансгликозилирования синтезированы восемь новых аналогов рибавирина и видарабина, модифицированных по гетероциклическим основаниям. Соединения переданы для проведения биологического тестирования на противовирусную активность на клеточных моделях и экспериментальных животных (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского) и для проведения оценки терапевтического потенциала при лечении различных форм рассеянного склероза (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава).

3. Исследована субстратная специфичности нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду модифицированных гетероциклических оснований с целью получения новых модифицированных нуклеозидов. Впервые показана принципиальная возможность синтеза модифицированных нуклеозидов, имеющих объемные гетероциклические заместители в 6-положении пуринового основания с помощью пуриннуклеозидфосфорилазы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Фатеев, Илья Владимирович, 2008 год

1. Зинченко А.И., Барай В.Н., Брошевская Л. А., Бейгельман JI.H., Михайлов С.Н., Карпейский М.Я., Михайлопуло И.А. // 2'-, 3'- и 5'-С-метилпроизводные уридина в реакции микробиологического трансгликозилирования//Биохимия. 1988. С. 731-733.

2. Hennen W. J. and Wong С. H. // A new method for the enzymatic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. // J. Org. Chem. 1989. V. 54. N 19. P. 4692-4695.

3. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V. // Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylases. // Bioschem N 20 P. 3615-3621.

4. Sircar. J.C., Gilbertsen. R.B.// Purine nucleoside phosphorylase (PNP) inhibitors: potentially selective immunosuppressive agents. // Drugs of the Future. 1988. V.13. N 7. P. 653-668.

5. Гершанович. М.П. // Новые антиметаболиты в химиотерапии злокачественных опухолей. // Материалы Второй ежегодной Российской онкологической конференции «Современные тенденции развития лекарственной терапии опухолей». 8-10 декабря 1998 г, М.

6. Гусев Е.И. Демина Т.Л. Бойко А.Н. // Рассеянный склероз. // М.: Нефть и газ, 1997. С. 463.

7. Siva A. et.al. (Eds.). // Frontiers in multiple sclerosis // London: Martin Dunitz, 1999. V. 2. P. 282.

8. Z. Kazimierczuk. J.A. Vilpo. F. Seela. // 2-Cloro-2'-deoxyadenosine: synthesys and antileukemic activity of 8-substrated derivates. // Nucleosides & nucleotides. 1995. V. 14. N 6. P. 1403-1414.

9. Z. Kazimierczuk. J.A. Vilpo. F. Seela. // Base-modified related to 2-chloro-2'-deoxyadenosine. // Helv. Chim. Acta. 1992. V. 75. P. 2289-2297.

10. Vargo F. Demeter J. // Progress in treatment of non-Hodgkin's lymphomas. // Magy Onkol. 2001. V. 45. P. 45-50.

11. Cheson B.D. // Perspectives on purine analogues. // Hematol. Cell. Ther. 1996. V. 38. N 2. P. 109-116.

12. Fidias P. Chabner B.A. Grossbard M.L. // Purine analogs for the treatment of low-Grade lymphopoliferative disorders.//Oncologist. 1996. V. l.P. 125-139.

13. Ogura M. // Recent progress in the treatment of malignant lymphoma. // Gun To Kagaku Ryoho, 2001. V. 28. P. 1213-1235.

14. Venner H. // Synthese der den naturlichen entsprechenden 2-deoxy-nucleoside des adenins. guanins und Hypoxanthins. // Chem. Ber. 1960. V. 93. P. 140-149.

15. Christensen L.F., Broom A.D., // Synthesis and biological activity of selected 2.6-Disubstituted-(2-deoxy-a- and -P-D-erythro-pentofuranosyl)purines. // J. Med. Chem. 1972. V. 15. N 7. P.324-356.

16. Ikehara M., Tada H.J. // Studies of nucleosides and nucleotides. // J. Amer. Chem. Soc. 1965. V. 87. P. 606-610.

17. Janeba Z., Francom P., Robins M.J. // Efficient Syntheses of 2-Chloro-2'-deoxyadenosine (Cladribine) from 2*-Deoxyguanosine. // J. Org. Chem. 2003. V. 68. N 3. P. 989 -992.

18. Montgomery J. and Hewson K. // Nucleosides of 2-Fluoroadenine // J. Med. Chem. 1969. V. 12. N 3-4. P. 498-504.

19. Reist E. Benitez A. Goodman L. Baker B. and Lee W. // Potential Anticancer Agents. LXXVI. Synthesis of Purine Nucleosides of p-D-Arabinofuranose // J. Org. Chem. 1962. V. 27. N 9. P. 32743279.

20. Bauman J.G. and Wirsching R.C. // Process for the Preparation of Fludarabine Phosphate from Guanosine. // US Patent № 5602246. 11.02.1997. Int. CI.6 C07H 1/00.

21. Nygaard P. // Utilization of preformed purine bases and nucleosides in metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. (Munch-Peterson A ed.) pp. 27-93, 95148, Academic Press, London 1983

22. Bzowska A,, Kulikowska E., Shugar D. // Purine nucleoside phosphorylases: properties,, functions and clinical aspects // Pharmacology and Therapeutics. 2000. V. 88. P. 349-425.

23. Friedkin M. // Deoxiribozide-1- phosphate: II. Theisolation of the crystalline deoxiriboze-1-phosphate//J. Biol Chem. 1950. V. 184. P. 449-459.

24. Friedkin M., Kalckar H.// Nucleoside phosphorilases.// Enzimes. 1961. V. 5. P. 237-256.

25. Williams S.R., Goddard J.M. and Martin D.W. Jr.// Human purine nucleoside phosphorylase cDNA sequence and genomie clone characterization.// Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 5779-5787.

26. Koellner G., Luic M., Shugar D., Saenger W., Bzowska A. // Crystal structure of calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 A resolution. // J. Mol. Biol. 1997 Jan 17;265(2):202-16.

27. Kalccar H.M. // Differential spectrophotometry of purine com pounds by means of specific enzymes. Determination of hydroxypurine compounds. // J Biol Chem. 1947. V. 167. P. 429-443.33. http://arginine.chem.cornell.edu/Structures/UP.html

28. Avraham Y., Grossowicz N., Yashphe J. // Regulation of the synthesis and activity of thymidine phosphorylase in Lactobacillus casei. // Biochim. Biophys. Acta. 1990 Sep 3;1040(2):287-293.

29. Desgranges C., Razaka G., Rabaud M., Bricaud H. // Catabolism of thymidine in human blood platelets: purification and properties of thymidine phosphorylase. // Biochim. Biophys. Acta. 1981 Jul 27; 654(2):211-218.

30. Schwartz M. // Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Properties and kinetics. // Eur. J. Biochem. 1971 Jul 29;21(2): 191-198.

31. Krenitsky T.A., Tuttle J.V. // Correlation of substrate-stabilization patterns with proposed mechanisms for three nucleoside phosphorylases. // Biochim. Biophys. Acta. 1982 May 3;703(2):247-249.

32. Krenitsky T.A. // Pentosyl transfer machanisms of the mammalian nucleoside phosphorylase. // J. Biol. Chem. 1968 Jun 10;243(ll):2871-2875.

33. Iltzsch M.H., el Kouni M.H., Cha S. // Kinetic studies of thymidine phosphorylase from mouse liver. // Biochemistry. 1985 Nov 19;24(24):6799-807.

34. Hamamoto Т., Noguchi Т., Midorikawa Y. // Purification and characterization of purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus TH 6-2. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996 Jul;60(7):l 179-80.

35. Scocca J.J. // Purification and substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylase from Haemophilus influenzae. // J. Biol. Chem. 1971 Nov;246(21):6606-10.

36. Ashok K.P., Smriti Т., Virinder S.P. // Nucleoside sinthesis mediated by glycosyl transfering enzimes. //Bioorganic Chemistry. 1999. V. 27. P. 135-154.

37. Nasr M., Litterst, С. and McGowan J. // Computer-assisted structureactivity correlations of dideoxynucleoside analogs as potential anti-HW drugs. //Antivir. Res. 1990. V. 14. P. 125-148.

38. DeClercq E. // HIV inhibitors targeted at the reverse transcriptase. // AIDS Res. Human Retroviruses. 1992. V. 8. P. 119-134.

39. Schinazi R.F., Mead J.R. and Feorino P.M. // Insights into HIV chemotherapy. // AIDS Res. Human Retroviruses. 1992. V. 8. P. 963-990.

40. Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М. // Место и роль флударабина в терапии больных неходжкинскими лимфомами. // РМЖ. 2002. V. 24. Р. 1119-1125.

41. Schinazi R.F., Liotta D.C., еа al. // 2'-Fluoronucleosides. // US Patent № 6348587. 25.02.1999. Int. CI.7 C07H 21/02.

42. Walker R.T., DeClercg E., and Eckstein F.// (Eds.) Nucleoside Analogues: Chemistry, Biology and Medicinal Applications. 1979. V. 26 NATO Advanced Studies Institutes Series, Plenum, New York.

43. Hutchinson D.W. // New approaches to the synthesis of antiviral nucleosides. // Trends Biotechnol. 1990. V. 8. P. 348-353.

44. Бокуть С.Б., B.H. Барай. А.И. Зинченко. // Использование бариевых солей пентозо-1-фосфорных кислот в ферментативном синтезе риботимидина и бромвинилдезоксиуридина. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1995. Т. 31. Вып. 3. С. 308-310.

45. Дудчик Н.В., Барай В.Н., Бокуть С.Б. и др.// Докл. АН Беларуси.1992 V. 36. Р. 1030-1033.

46. Drueckhammer D.G., Hennen W.J., Pederson R.L., Barbas C.F., Gautheron C.M., Krach Т., and Wong C.-H. // Enzyme catalysis in synthetic carbohydrate chemistry. // Synthesis. 1991. P. 499525.

47. Utagawa Т. // Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics. // J. Molec. Cat. B: Enzymatic. 1999. V. 6. P. 215-222.

48. Krenitsky H.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V., Rideout J.L., and Elion G.B. // An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides. // Carbohydr. Res. 1981. V. 97. P. 139-146.

49. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., Kvasyuk E.I., and Mikhailopulo I.A. // Synthesis of 9-(P-D-arabinofuranosyl)guanine using whole cells of Escherichia coli. // Applied and Microbiology Biotechnology. 1990. V. 32. P. 658-661.

50. Komatsu H., Awano H., Fukazawa N., Ito K. // Process for selectively producing 1-phosphorylated sugar derivative anomer and process for producing nucleoside. // EP 1178051 A2, 13.02.2001. Int. CI.7: C07F 9/655.

51. Mikami Y., Matsumoto S., Yoshinaka S., Sunaga Y., Hasegawa A. // Method of preparing purine nucleoside compound. // European Patent № 0896065B1. 29.07.1998. Int. CI.7 C12P 19/40.

52. Barai V.N., Zinchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Zhernosek E.V., De Clercq E., Mikhailopulo I.A. // Chemo-enzymatic synthesis of 3-deoxy-P-D-ribofuranosyl purines. // Helv. Chim. Acta. 2002. V. 85. P. 1893-1900.

53. Morris P.E. Jr., Elliot A.S., Walton S.P// Synthesis and biological activity of novel class of purine nucleoside phosphorylase inhibitors. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19. P. 379-404.

54. Utagawa Т., Morisawa H., Yoshinaga F., Yamazaki A., Mitsugi K., and Hirose Y. // Microbiological synthesis of adenine arabinoside. //Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49. P. 1053-1058.

55. Kulikowska E., Bzowska A. and Shugar D. // Properties of two unusual, and fluorescent substrates of purine nucleoside phosphorylases: 7-methylguanosine and 7-methylinosine. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 874. P. 355-363.

56. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Bokut S.B., Dudchik N.V., Barai V.N., Kalinichenko E.N., Rosemeyer H., and Seela F. // 1-Deaza and 3-deazapurines in the reaction of microbiological transglycosilation. //Biotechnol. Lett. 1992. V. 14. P. 885-890.

57. Shirae H., Yokozeki K., and Kubota K., // Enzymatic production of ribavirin. // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 605-607.

58. Averett D.R., Koszalka G.W., Fyfe J.A., Roberts G.B., Purifoy D.J.M., Krenitsky T.A., // 6-Methoxypurine arabinoside as a selective and potent inhibitor of varicella-zoster virus. // Antimicrob Agents Chemother, 1991, 35, P 851

59. Utagawa Т., Morisawa H., Yamanaka S., Yamazaki A., and Hirose Y. // Enzymatic synthesis of virazole by purine nucleoside phosphorylase of Enterobacter aerogenes. // Agric. Biol. Chem. 1986. V. 50. P. 121-126.

60. Kalinichenko E.N., Barai V.N., Bokut S.B., Romanova V.V., Zinchenko A.I., Hermann G., and Michailopulo I.A. // Microbiological synthesis of 5-ethyl- and (E)-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine. //Biotechnol. Lett. 1989. V. 11. P. 621-626.

61. Utagawa Т., Morisawa H., Nakamutsu A., Yamazaki A., and Yamanaka S. // A new and facile synthesis of purine 2'-amino-2'-deoxyribosides by a combination of chemical and enzymatic reactions. //Nucleic Acids Symp Ser 1980. V. 119. P. 101-104.

62. Morisawa H., Utagawa Т., Yamanaka S., and Yamazaki A. // Microbial Synthesis of Purine 2'-Amino-2'-deoxyribosides // Chem. Pharm. Bull. 1981. V. 29. P. 3191-3195.

63. Komatsu H., Awano H., // First stereoselective synthesis of 2-deoxy-alpha-D-ribosyl-l-phosphate: novel application of crystallization-induced asymmetric transformation. // J. Org. Chem., 2002,67, 5419

64. Komatsu H., Ikeda I. // Synthesis of 2-deoxy-beta-D-ribose 1-phosphate, NMR comparison and its enzymatic activity for structural elucidation of synthetic alpha-isomer. // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids, 2003,22, 1685

65. Komatsu H., Araki Т. // Chemo-enzymatic synthesis of 2\3'-dideoxy-3'-fluoro-b- -d-ribose 1-phosphate // Tetrahedron Lett., 2003,44, P 2899

66. Komatsu H., Araki T. // Efficient chemo-enzymatic syntheses of pharmaceutically useful unnatural 2'-deoxynucleosides. //Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2005, 24, P 1127

67. Araki Т., Ikeda I., Matoishi K., Ade R., Oikawa Т., Matsuba Y., Ishibashi H., Nagahara K., Fukuiri Y. // Method for producing cytosine nucleoside compounds // US Patent 6858721 (Mitsui Chemicals Inc.), Febrary 22, P 2005

68. Tsuboi, K.K., Hudson, P.B.// Enzymes of the human erythrocyte: purine nucleoside phosphorylase, specific properties. // J Biol Chem 1957. 234. P 889-897.

69. Holguin-Hueso J. and Cardinaud R. // Enzymic synthesis of 9- and 7-(2'-beta-D -deoxyribosyl) xanthine. // FEBS Lett. 1972. V. 20. P. 171-173.

70. Betbeder D., Hutchinson D.W. and Richards A.O'L. // The stereoselective enzymatic synthesis of 9-B-d-2'-deoxyribofuranosyl 1-deazapurine. //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 4217-4222.

71. Slater M.J., Gowrie C., Freeman G.A. and Short S.A. // Enzymatic synthesis and antiviral activity of 2'-deoxy-2'-fluoro-ribavirin. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 6. P. 2787-2790.

72. Burns C.L., St. Clair M.H., Frick L.W., Spector Т., et al // Novel 6-alkoxypurine 2',3'-dideoxynucleosides as inhibitors of the human immunodeficiency virus. // J. Med. Chem. 1993. 36. P. 378-384.

73. Freeman G.A., Shaver S.R., Rideout J.L. and Short S.A. // 2-Amino-9-(3-azido-2,3-dideoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-6-substituted-9H-purines: synthesis and anti-HIV activity. // Bioorg. Med. Chem. 1995. V. 3. P. 447-458.

74. Carson D.A. and Wasson D.B. // Synthesis of. 2',3'-dideoxynucleosides by enzymatic transglycosylation. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 155. P. 829-834.

75. Чудинов M.B., Константинова И.Д., Рыжова О.И., Есипов Р.С., Юркевич A.M., Швец В.И., Мирошников А.И. // Новый эффективный способ синтеза 5-замещенных производных 1,2,4-триазол-З-карбоксамида и рибавирина. //Химфарм журнал, 2005, 43, с.29-34.

76. Czuczman M.S., Fallon A., Mohr A. et al. // Rituximab in combination with CHOP or fludarabine in low-grade lymphoma. // Semin. Oncol. 2002. V. 29. N 2. P. 36—40.

77. Абдулкадыров K.M. Самускевич И.Г. Бессмельцев С.С. и др. // Диагностика и лечение больных неходжкинскими лимфомами низкой степени злокачественности. // Пособие для врачей. СПб. 2000.

78. Поддубная И.В. // Обоснование лечебной тактики при неходжкинских лимфомах. // Совр. Онкол. 2002. Вып. 1. С. 3-7.

79. Huang. P.; Sandoval. A.; Van Den Neste. Е.; Keating. М. J.; Plunkett. W. // Inhibition of RNA transcription: A biochemical mechanism of action against chronic lymphocytic leukemia cells by fludarabine. // Leukemia. 2000. V. 14. N. 8. P. 1405-1413.

80. Catapano С. V., Perrino F. W., Fernandes D., J. Primer // RNA chain termination induced by 9-p-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine 5'-triphosphate. A mechanism of DNA synthesis inhibition. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N. 10. P. 7179-85.

81. Li L., Liu X.-M., Glassman A.B., Keating M.J., Stros M., Plunkett W., Yang L.-Y. // Fludarabine triphosphate inhibits nucleotide excision repair of cisplatin-induced DNA adducts in vitro, // Cancer Research. 1997. V. 57. N. 8. P. 1487-1494.

82. Johnson S.A. and Thomas W. // Therapeutic potential of purine analogus combinations in the treatment of lymphoid malignancies. // Hematol. Oncol. 2000. V. 18. P. 141-153.

83. Волкова M.A. // Флударабин новая эра в терапии хронического лимфолейкоза. // Новое в онкологии: Сб. научных трудов. // Под ред. И.В. Поддубной. Н.А. Огнерубова. Воронеж (Воронежский Университет). 1998. Вып. 3. С. 6-11.

84. Adkins J.C., Peters D.H., Markham А. // Fludarabine. An update of is pharmacology and use in the treatment of haematological malignancies. // Drugs. 1997. V. 53. P. 1005-1037.

85. Tondini C., Balzarotti M., Rampinelli I. et al. // Fludarabine and cladribine in relapsed/refractory low-grade non-Hodgkin's lymphoma: a phase II randomized study. // Ann. Oncol. 2000. V. 11. P. 231-233.

86. Tinmouth A., Zanke В., Imrie K.R. // Fludarabine in alkylator-resistant follicular non-Hodgkin's lymphoma. // Leuk. Lymphoma. 2001. V. 41. P. 137-145.

87. Lazzarino M., Orlandi E., Montillo M. et al. // Fludarabine. cyclophosphamide, and dexamethasone (FluCyD) combination is effective in pretreated low-grade non-Hodgkin's lymphoma. //Ann. Oncol. 1999. V. 10. P. 59-64.

88. Alas S., Bonavida В., Emmanouilides С. // Potentiation of fludarabine cytotoxicity on non-Hodgkin's lymphoma by pentoxifylline and rituximab. // Anticancer Res. 2000. V. 20. N 5A. P. 29612966.

89. Keating M.J., Flinn I., Jain V. et al. // Therapeutic role of alemtuzumab (Campath-IH) in patients who have failed fludarabine: results of a large international study. // Blood. 2002. V. 99. P. 3554-3561.

90. Bocchia M., Bigazzi C., Marconcini S. et al. // Favorable impact of low-dose fludarabine plus epirubicin and cyclophosphamide regimen (FLEC) as treatment for low-grade non-Hodgkin's lymphomas. //Haematologica. 1999. V. 84. P. 716-720.

91. Wiedmann E., Boehrer S., Chow K.U. et al. // Treatment of aggressive, or progressing indolent peripheral T- and NK-cell neoplasias by combination of fludarabine. cyclofosphamide and doxorubicin// Onkologie. 2001. V. 24. P. 162-164.

92. Kazmers I.S., Mitchell B.S. and Dadonna P.E. // Inhibition of purine nucleoside phosphorylase by 8-aminoguanosine: selective toxicity for T lymphoblasts. // Science 1981. V. 214: P. 1137-1139.

93. Галегов Г. А., Львов H. Д., Петрова И. Г., Флорентьев В. Л. // Рибавирин как антивирусный химиопрепарат: химия, молекулярный механизм действия, возможности практического применения. // Вопросы медицинской химии. 1986. Т. XXXII, №1. С. 10-19.

94. Willis R.C., Robin R.K. and Seegmiller J.E. // An in vivo and in vitro evaluation of 1-P-D-ribofuranosil-1.2.4-triazole-3-carboxoamidine: An inhibitor of human lymphoblast purine nucleoside phosphorilase. //Mol Pharmacol 1980. V. 18: P. 287-295.

95. Stoeckler J.D., Cambor C., Kuhns V., Chu S.H., Parks R.E. Jr. // Inhibitors of purine nucleoside phosphorilase. C(8) and C(5') substitutions. // Biochem Pharmacol 1982. V. 31. P. 163171.

96. Montgomery J.A. // Purine nucleoside phosphorylase: a target for drug design. // Med Res Rev 1993. V. 13. P. 209-228.

97. Schramm V.L. // Enzymatic transiton-state analysis and transiton-state analogues. // Methods Enzymol 1999. V. 308. P. 301-355.

98. Evans G.B., Furneaux R.H., Gainsford G.J., Schramm V.L., Tyler P.C. // Synthesis of transition state analogue inhibitors for purine nucleoside phosphorilase and N-riboside hydrolases. // Tetrahedron 2000. V. 56. P. 3053-3062.

99. Giblett E.R., Ammann A.J.,Wara D.W., Sandman R. // Nucleoside-phosphorylase deficiency in a child with severely defective T-cell immunity and normal B-cell immunity. // Lancet. 1975 V. 19. P. 1010-1013.

100. Coben A., Doyle D., Martin. D.W. Jr. and Ammann A.J. // Abnormal purine metabolism and purineoverproduction in a patient deficient in purine nucleoside phosphorylase. // N Engl J Med. 1976. V. 295. P. 1449-1454.

101. Borel J.F., Karger.// Chemistry of the natural cyclosporin metabolites. // Progress in Allergy, Cyclosporin. 1986. V. 38. New York.

102. Weinblatt M.E., Coblyn J.S., Fraser P.A., Anderson R.J., Spragg J., Trentham D.E. and Austen K.F. // Ciclosporin A treatment of refractory rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum. 1987. V. 30. P. 11-17.

103. Dougados M. and Amor B. // Cyclosporin A in rheumatoid arthritis: Preliminary clinical results of an open trial. // Arthritis Rheum. 1987. V. 30. P. 83-87.

104. Assan R., Feutren G., Debray Sachs M., Quiniou Debrie M.C., Laborie C., Thomas G., Chatenoud L. and Bach J.F. // Metabolic and immunologic effects of с cyclosporine in recept ly Diagnosed type 1 diabetes mellitus. // Lancet. 1985. V. 1. P. 67-71.

105. Fox I.H., Pallella T.D. and Kelley W.N. // Hyperuricemia: A marker for cell energy crisis. // N Engl J Med. 1987. V.317. P. 111-112.

106. Schimandie C.M., Tanigoshi L., Mole L.A. and Sherman I.W. // Purine nucleoside phosphorylase of the malarial parasite, Plasmodium lophurae. // J Biol Chem. 1985. V. 260. P. 44554460.