Полиферментные системы для получения модифицированных нуклеозидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Чувиковский, Дмитрий Вячеславович

• Чувиковский, Дмитрий Вячеславович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Чувиковский, Дмитрий Вячеславович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Пуриновые и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы. Строение и механизм катализа. (Литературный обзор)

1.1 Общие сведения

1.2. Высокомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.2.1. Пространственная структура

1.2.2. Строение активного центра

1.2.3. Механизм катализа

1.3. Низкомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.3.1. Пространственная структура

1.3.2. Строение активного центра

1.3.3. Механизм катализа

1.4. Уридинфосфорилаза

1.4.1. Пространственная структура

1.4.2. Строение активного центра

1.4.3. Механизм катализа

1.5. Тимидинфосфорилаза Е. coli и пиримидиннуклеозидфосфорилаза Bacillus stearothermophilus.

1.5.1. Пространственная структура

1.5.2. Строение активного центра

1.5.3. Механизм катализа

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Полиферментные системы для получения модифицированных нуклеозидов»

В настоящее время в химической и фармацевтической промышленностях находят все более широкое применение энзиматические реакции в качестве альтернативы традиционным методам органической химии.

Одна из таких областей, в которой использование регио- и стереоспецифичности ферментов позволяет избежать многостадийного органического синтеза - это синтез модифицированных нуклеозидов.

В силу своего сходства с природными нуклеозидами модифицированные аналоги могут избирательно ингибировать ферменты нуклеинового обмена, что используется для лечения различных вирусных и раковых заболеваний.

Как правило, для синтеза модифицированных нуклеозидов используют нуклеозидфосфорилазы, выделяемые из бактерии Е. coli, которые обладают низкой субстратной специфичностью. Вопросам строения и механизма катализа этих ферментов посвящен литературный обзор диссертации.

Целью данной работы было получение полиферментных систем на основе рекомбинантных ферментов нуклеозидфосфорилаз (НФ) Е. coli и разработка биотехнологических методов синтеза лекарственных препаратов на основе модифицированных нуклеозидов (кладрибина, флударабина и рибавирина). Конкретные задачи состояли в следующем:

- создание штаммов-продуцентов тимидинфосфорилазы (ТФ), уридинфосфорилазы (УФ) и пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) Е. coli;

- выделение и очистка рекомбинантных ферментов;

- сравнение каталитических параметров рекомбинантных и природных ферментов;

- подбор условий синтеза с помощью рекомбинантных ферментов субстанций препаратов на основе модифицированных нуклеозидов -рибавирина, кладрибина и флударабина;

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Чувиковский, Дмитрий Вячеславович

Выводы

1. Осуществлено клонирование генов пуриннуклеозидфосфорилазы, тимидинфосфорилазы и уридинфосфорилазы Е. coli в экспрессионные векторы серии рЕТ. Получены конститутивные штаммы-суперпродуценты нуклеозидфосфорилаз на основе штамма Е. coli BL21(DE3).

2. Разработаны эффективные методы выделения и очистки рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз.

3. Показано, что кинетические параметры рекомбинантных ферментов незначительно отличаются от кинетических параметров природных ферментов.

4. Подобраны оптимальные условия реакций трансгликозилирования с использованием полученных полиферментных систем.

5. Разработаны новые биотехнологические способы получения субстанции лекарственных средств на основе модифицированных нуклеозидов (кладрибина, рибавирина и флударабина).

Благодарности

Автор благодарен А. И. Мирошникову за предоставленную возможность выполнить эту работу, A. JI. Каюшину и М. Д. Коростелевой за синтез олигонуклеотидов, Р. С. Есипову, А. И. Гуревичу и С. Н. Михайлову за плодотворные обсуждения, Т. И. Муравьевой и Н. Г. Пановой за помощь в проведении экспериментов. Отдельная благодарность И. Д. Константиновой за помощь в проведении экспериментов, плодотворные обсуждения и помощь в подготовке этой работы.

1.6. Заключение.

Два семейства ферментов НФ-I и НФ-П имеют совершенно разные аминокислотные последовательности, третичные и четвертичные структуры. Однако, несмотря на это, организация субстратов в активном центре и конформация связанных нуклеозидов в этих двух семействах очень похожи. Кроме того, есть основания предполагать сходство каталитического механизма ТФ, УФ Е. coli и ПНФ млекопитающих.

Строение сайтов связывания рибозы (дезоксирибозы) и фосфата, а также аминокислоты, участвующие в связывании фосфата и сахара, похожи во всех трех ферментах. Поэтому нет ничего удивительного в том, что во всех НФ связанный нуклеозид находится в необычной высокоэнергетической конформации, ослабляющей гликозидную связь и облегчающей образование переходного состояния. Общим для всех ферментов является также образование неспецифических п-к связей с гетероциклическим основанием.

Общей чертой, объединяющей УФ и ПНФ, является предоставление соседней субъединицей аминокислот, участвующих в формировании активного центра.

Несмотря на сходство активных центров ферментов семейств НФ-I и НФ-П, что, вероятно, обусловлено катализом реакции фосфоролиза, совершенно различная укладка полипептидной цепи говорит скорее о том, что они имеют разное эволюционное происхождение.

С другой стороны, структурное сходство ферментов семейства НФ-1, несмотря на различия в аминокислотных последовательностях, скорее всего, говорит о наличии общего эволюционного предшественника.

Глава 2.

Получение системы для синтеза модифицированных нуклеозидов на основе нуклеозидфосфорилаз Е. coli.

Использование ферментов для синтеза модифицированных нуклеозидов значительно упрощает схему синтеза по сравнению с химическими методами - отпадает необходимость использования защитных групп, не образуются регио- и стереоизомеры, уменьшается количество стадий, значительно увеличивается выход реакций [78-82].

Из-за низкой субстратной специфичности и высокой стабильности для синтеза модифицированных нуклеозидов используются бактериальные НФ, как правило, выделенные из бактерии Е. coli. [83-84]. Помимо НФ, используют ферменты N-дезоксирибозилтрансферазы, получаемые из бактерий рода Lactobacillus, однако их использование ограничено синтезом 2'-дезоксирибо (2',3-дидезоксирибо) модифицированных нуклеозидов [8590].

Помимо использования выделенных и очищенных НФ, успешно используются НФ в составе целых бактериальных клеток, полученных методами селекции [91-106]. Значительно увеличивает стабильность клеток обработка их глутаральдегидом, после которой клетки могут быть повторно использованы до десяти раз при температуре 50-60°С без потери энзиматической активности [96, 107].

Из-за высокой стоимости рибозо-1-фосфата и низкой стабильности этого соединения, в качестве донора рибозы (пентозы) используют какой-либо природный нуклеозид, который сначала фосфорилируется с образованием соответствующего гетероциклического основания и пентозо-1-фосфата, который, в свою очередь, переносится на модифицированный гетероцикл с образованием модифицированного нуклеозида. В общем виде реакция приобретает вид реакции трансгликозилирования. Для этого необходимо присутствие в реакционной среде каталитических количеств неорганического фосфата (рис. 23). в, н2ро4

Н2Р04"

Н0<

ОН R OH R OH OH R

Н2РО4" L В, В

Рис. 23. Принципиальная схема реакции трансгликозилирования. Bi, В2 -гетероциклические основания. R - ОН или Н.

Синтез модифицированных нуклеозидов с использованием интактных клеток не позволяет получить больше, чем несколько грамм целевого нуклеозида на литр. Для крупномасштабного получения нуклеозидов необходимы большие количества чистых ферментов. Клонирование этих ферментов позволит многократно увеличить их количество в клетке-продуценте, и, таким образом, упростить процесс получения больших количеств чистых ферментов.

С этой целью было осуществлено клонирование генов ПНФ, ТФ и УФ Е. coli в экспрессионных плазмидах, позволяющих достигнуть высокого уровня биосинтеза рекомбинантных ферментов в культурах клеток.

2.1. Клонирование и экспрессия генов нуклеозидфосфорилаз Е. coli.

Для клонирования ферментов их гены были амплифицированы с хромосомной ДНК Е. coli с помощью полимеразной цепной реакции. Для амплификации гена УФ использовались синтетические праймеры У1 и У2 (содержащие сайты рестрикции Ndel и Sail), П1 и П2 (Ncol и EcoRI) для ПНФ и Т1 и Т2 0Ndel и Sail) для ТФ (рис. 24). a)

Ndel У1

5'-GGAATTCATATGTCCAAGTCTGATGTTTTTC

GAGGAGTTGTATATGTCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTCGGCCTCACTAAAAACGATTTACAAGGGGCTACGCT TGCCATCGTCCCTGGCGACCCGGATCGTGTGGAAAAGATCGCCGCGCTGATGGATAAGCCGGTTAAGCTGGCAT CTCACCGCGAATTCACTACCTGGCGTGCAGAGCTGGATGGTAAACCTGTTATCGTCTGCTCTACCGGTATCGGC GGCCCGTCTACCTCTATTGCTGTTGAAGAGCTGGCACAGCTGGGCATTCGCACCTTCCTGCGTATCGGTACAAC GGGCGCTATTCAGCCGCATATTAATGTGGGTGATGTCCTGGTTACCACGGCGTCTGTCCGTCTGGATGGCGCGA GCCTGCACTTCGCACCGCTGGAATTCCCGGCTGTCGCTGATTTCGAATGTACGACTGCGCTGGTTGAAGCTGCG AAATCCATTGGCGCGACAACTCACGTTGGCGTGACAGCTTCTTCTGATACCTTCTACCCAGGTCAGGAACGTTA CGATACTTACTCTGGTCGCGTAGTTCGTCACTTTAAAGGTTCTATGGAAGAGTGGCAGGCGATGGGCGTAATGA ACTATGAAATGGAATCTGCAACCCTGCTGACCATGTGTGCAAGTCAGGGCCTGCGTGCCGGTATGGTAGCGGGT GTTATCGTTAACCGCACCCAGCAAGAGATCCCGAATGCTGAGACGATGAAACAAACTGAAAGCCAAGCGGTGAA AATCGTGGTGGAAGCGGCGCGTCGTCTGCTGTAATTCTCTTCTCCTGTCT

CGCCGCGCAGCAGACGACATTAAGCAGCTGCGCA-5 ' У2 Sail b)

Ncol П1

5'-AAAACCATGGCTACCCCACACATTAATGC

AAAACAATGGCTACCCCACACATTAATGCAGAAATGGG CGATTTCGCTGACGTAGTTTTGATGCCAGGCGACCCGCTGCGTGCGAAGTATATTGCTGAAACTTTCCTTGAAG ATGCCCGTGAAGTGAACAACGTTCGCGGTATGCTGGGCTTCACCGGTACTTACAAAGGCCGCAAAATTTCCGTA ATGGGTCACGGTATGGGTATCCCGTCCTGCTCCATCTACACCAAAGAACTGATCACCGATTTCGGCGTGAAGAA AATTATCCGCGTGGGTTCCTGTGGCGCAGTTCTGCCGCACGTAAAACTGCGCGACGTCGTTATCGGTATGGGTG CCTGCACCGATTCCAAAGTTAACCGCATCCGTTTTAAAGACCATGACTTTGCCGCTATCGCTGACTTCGACATG GTGCGTAACGCAGTAGATGCAGCTAAAGCACTGGGCATTGATGCTCGCGTTGGTAACCTGTTCTCCGCTGACCT GTTCTACTCTCCGGACGGCGAAATGTTCGACGTGATGGAAAAATACGGCATTCTCGGCGTGGAAATGGAAGCGG CTGGTATCTACGGCGTGGCTGCAGAGTTTGGCGCGAAAGCCCTGACCATCTGCACCGTGTCTGACCACATCCGC ACTCACGAGCAAACCACTGCCGCTGAGCGTCAGACCACCTTCAACGACATGATCAAAATCGCACTGGAA TCCGTTCTGCTGGGCGATAAAGAGTAATTGTGTTTCGCTGCAA CAAGACGACCCGCTATTTCTCATTATCTTAAGGC-5' П2 EcoRI c)

Ndel T1

5'-GGAATTCATATGTTGTTTCTCGCACAA

ATGTTGTTTCTCGCACAAGAAATTA TTCGTAAAAAACGTGATGGTCATGCGCTGAGCGATGAAGAAATTCGTTTCTTTATCAACGGTATTCGCGACAAC ACTATCTCCGAAGGGCAGATTGCCGCCCTCGCGATGACCATTTTCTTCCACGATATGACAATGCCTGAGCGTGT CTCGCTGACCATGGCGATGCGAGATTCAGGAACCGTTCTCGACTGGAAAAGCCTGCATCTGAATGGCCCGATTG TTGATAAACACTCCACCGGTGGCGTCGGCGATGTGACTTCGCTGATGTTGGGGCCGATGGTCGCAGCCTGCGGC GGCTATATTCCGATGATCTCTGGTCGCGGCCTCGGTCATACTGGCGGTACGCTCGACAAACTGGAATCCATCCC TGGCTTCGACATTTTCCCGGATGACAACCGTTTCCGCGAAATTATTAAAGACGTCGGCGTGGCGATTATCGGTC AGACCAGTTCACTGGCTCCGGCTGATAAACGTTTCTACGCGACCCGTGATATTACCGCAACCGTGGACTCCATC CCGCTGATCACCGCCTCTATTCTGGCGAAGAAACTTGCGGAAGGTCTGGACGCGCTGGTGATGGACGTGAAAGT GGGTAGCGGCGCGTTTATGCCGACCTACGAACTCTCTGAAGCCCTTGCCGAAGCGATTGTTGGCGTGGCTAACG GCGCTGGCGTGCGCACCACCGCGCTGCTCACCGACATGAATCAGGTACTGGCCTCCAGTGCAGGTAACGCGGTT GAAGTTCGTGAAGCGGTGCAGTTCCTGACGGGTGAATATCGTAACCCGCGTCTGTTTGATGTCACGATGGCGCT GTGCGTGGAGATGCTGATCTCCGGCAAACTGGCGAAAGATGACGCCGAAGCGCGCGCGAAATTGCAGGCGGTGC TGGACAACGGTAAAGCGGCAGAAGTCTTTGGTCGTATGGTAGCGGCACAAAAAGGCCCGACCGACTTCGTTGAG AACTACGCGAAGTATCTGCCGACAGCGATGCTGACGAAAGCAGTCTATGCTGATACCGAAGGTTTTGTCAGTGA AATGGATACCCGCGCGCTGGGGATGGCAGTGGTTGCAATGGGCGGCGGACGCCGTCAGGCATCTGACACCATCG ATTACAGCGTCGGCTTTACTGATATGGCGCGTCTGGGCGACCAGGTAGACGGTCAGCGTCCGCTGGCGGTTATC CACGCGAAAGACGAAAACAACTGGCAGGAAGCGGCGAAAGCGGTGAAAGCGGCAATTAAACTTGCCGATAAAGC ACCGGAAAGCACACCAACTGTCTATCGCCGTATCAGCGAATAA GGCATAGTCGCTTATTCAGCTGTTTT-5' T2 Sail

Рис. 24. Нуклеотидные последовательности генов УФ (а), ПНФ (Ь) и ТФ (с). Показаны также праймеры и сайты рестрикции.

После обработки соответствующими рестриктазами амплифицированные фрагменты генов были клонированы в векторах рЕТ20Ь (УФ и ТФ), и pET23d (ПНФ). Секвенированием было показано, что в клонированных фрагментах мутации отсутствуют.

Особенностью экспрессионной системы рЕТ является наличие сильного Т7-промотора для РНК-полимеразы фага Т7 и трансляционного усилителя, полученного из гена 10 капсидного белка фага Т7 [108]. В некоторых случаях синтезируемые чужеродные белки агрегируют в нерастворимые тельца включения и поэтому необходимы дополнительные процедуры для получения их в нативной форме. Иногда изменение условий культивирования клеток штамма-продуцента позволяет избежать образования нерастворимых телец включения. Однако мы полагали, что использование системы Е. coli BL21(DE3)/pET не должно быть причиной образования нерастворимых агрегатов собственных растворимых белков Е. coli даже в случае их суперпродукции.

В качестве клеток хозяина для экспрессии генов мы использовали штамм Е. coli BL21(DE3), в состав хромосомы которого входит ген Т7-РНК полимеразы.

Для достижения высокого уровня экспрессии генов, чья транскрипция регулируется промотор-операторной системой, индукция биосинтеза должна быть осуществлена только после накопления большого числа клеток в культуре. При использовании системы с Т7-РНК-полимеразой, синтез которой находится под контролем /ас-оператора (в клетках Е. coli BL21(DE3)), нежелательную конститутивную транскрипцию в клетках на стадии роста можно ингибировать добавлением в питательную среду глюкозы, присутствие которой усиливает взаимодействие /ас-оператора с /яс-репрессором [109-110]. Кроме этого, нежелательную экспрессию клонированного гена можно ингибировать, используя в качестве клеток-хозяина штамм Е. coli BL21(DE3)/pLysS, содержащий в плазмиде pLysS ген

Т7-лизоцима, продукт которого способен подавлять активность Т7-РНК-полимеразы [111-112].

Мы сравнили эффективность биосинтеза нуклеозидфосфорилаз в различных условиях, как с индукцией, так и без индукции (рис. 25). Результаты показали, что ни содержание глюкозы, ни присутствие Т7-лизоцима не смогли полностью ингибировать конститутивный синтез НФ. В то же время, конститутивный биосинтез ПНФ и УФ оказался выше по сравнению с индуцированным биосинтезом в присутствии ингибиторов.

ПНФТФУФ

1~1 2 3 4 1"б 7 8 9 10^ fTl 12 13 14 IS' • - t : ^ iptg ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ pLysS ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

0,1% glu * + * * ♦

Рис. 25. Гель-электрофореграмма в 15% ПААГ в денатурирующих условиях тотальных клеточных лизатов клеток-продуцентов рекомбинантных белков. 1-5 - ПНФ; 6-10 - ТФ; 11-15 - УФ; IPTG - синтез в присутствии IPTG (во всех остальных случаях синтез проходил без индуктора); pLysS - в качестве клеток продуцентов использовался штамм BL21(DE3)/pLysS (во всех остальных случаях - BL21(DE3)); 0,1% Glu - синтез в присутствии 0,1 % глюкозы.

Результаты определения активности НФ в тотальных клеточных лизатах по окончании инкубации показали, что уровень удельной активности в лизате клеток с индуцированным IPTG биосинтезом НФ выше на 10-15% по сравнению с активностью в лизате клеток с конститутивным синтезом (рис. 26).

ПНФ

УФ

ТФ в 5 20 1 i | г { 1 Б 5

5 П 10

I I 5

Q V о Ь 2 л * i °

3 4 5 6 7 6 9 время инкубации,ч

4 5 6 7 3 время инкубации, ч

100 75 50 25 0

4 5 6 7 8 время инкубации.ч

Рис, 26. Зависимость удельной активности НФ в тотальном клеточном лизате от времени инкубации. Синим цветом показан неиндуцированный биосинтез НФ. красным - биосинтез, индуцированный [PTG. Индукция была на третьем часу инкубацни после достижения культурами клеток плотности А60о=0,5.

Следует обратить внимание на разную динамику накопления НФ при индуцированном и неиндуцированном биосинтезе. При конститутивном биосинтезе удельная активность НФ возрастала постоянно на всем протяжении времени инкубации. Такая же зависимость наблюдалась и для индуцированного биосинтеза ТФ, тогда как для индуцированного биосинтеза ПНФ и УФ наблюдалось резкое увеличение удельной активности до максимальных значений в течение первых часов индукции, которые затем уже практически не менялись.

Столь высокое содержание рекомбинантного белка обычно наблюдается лишь в случае агрегации его в нерастворимых тельцах включения, однако в наших примерах присутствие таких агрегатов нуклеозидфосфорилаз мы не обнаружили. Более того, высокий уровень экспрессии нуклеозидфосфорилаз в клетке не вызывал никакого детектируемого лизиса клеток. Большое количество целевых ферментов, образующихся в ходе конститутивного синтеза, позволило исключить стадию индукции биосинтеза в схеме культивирования клеток-продуцентов.

После разрушения клеток продуцента ультразвуком ферменты практически целиком обнаруживаются в растворимой фракции. Небольшое количество, оставшееся после центрифугирования в дебрисе, по-видимому, связано с неполным разрушением клеток-продуцентов.

2.2. Выделение рекомбинантных ферментов.

На первой стадии выделения НФ клетки-продуценты осаждались с помощью центрифугирования. Клетки ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 5 мМ ЭДТА, разрушали с помощью проточного дезинтегратора и центрифугировали полученный лизат. Затем из супернатанта с помощью сульфата аммония 25% насыщения высаливали примесные белки. Высаливание фосфорилаз происходило при 80% насыщении сульфатом аммония. Полученный осадок растворяли в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 1 мМ ЭДТА и очищали с помощью ультрафильтрации на мембране ХМ-50 в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 2 мМ меркаптоэтанола. Сконцентрированную фракцию очищали на колонке ДЭАЕ-Сефацел, элюируя буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 2 мМ ЭДТА в градиенте концентрации NaCI 0-0.5 М. Для обессоливания раствор фермента хроматографировали на колонке G-50 в буфере, содержащем 20 мМ КН2Р04 рН 7.3 и 1 мМ ЭДТА, и лиофилизовали. Эта схема позволила получить из 10 граммов клеток 200250 мг ферментов, ферментативная активность которых составляла для ПНФ 40 ед.акт./мг, для УФ 60 ед.акт./мг и 160 ед.акт./мг для ТФ. Содержание белка и ферментативная активность на каждой стадии выделения и очистки приведены в таблице 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Чувиковский, Дмитрий Вячеславович, 2005 год

1. Nygaard P. Utilization of preformed purine bases and nucleosides. In metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganisms (Munch-Peterson A ed.) pp. 27-93, 95-148, Academic Press, London 1983

2. Giblett E.R., Ammann A.J., Wara D.W., Sandman R., Diamond L.K. Nucleoside-phosphorylase deficiency in a child with severely defective T-cell immunity and normal B-cell immunity. Lancet. 1975 May 3;l(7914):1010-3.

3. Sorscher E.J., Peng S., Bebok Z, Allan P.W., Bennett L.L. Jr, Parker W.B. Tumour cell bystander killing in colonic carcinoma utilizing the Escherichia coli DeoD gene to generate toxic purines. Gene Ther. 1994 Jul;l(4):233-8.

4. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Properties of purine nucleoside phosphorylase (PNP) of mammalian and bacterial origin. Z. Naturforsch С. 1990 Jan-Feb;45(l-2):59-70.

5. Pinedo H.M., Peters G.J. Fluorouracil: biochemistry and pharmacology. J. Clin. Oncol. 1988;6:1653-54.

6. Maehara Y., Sakaguchi Y., Kusumoto Т., Kusumoto H., Sugimachi K. Species differences in substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylase. J. Surg. Oncol. 1989 Nov;42(3): 184-6.

7. Takebayashi Y., Yamada К., Maruyama I., Fujii R., Akiyama S., Aikou T. The expression of thymidine phosphorylase and thrombomodulin in human colorectal carcinomas. Cancer Lett. 1995 May 25;92(l):l-7.

8. Miyadera K., Dohmae TV., Takio K., Sumizawa Т., Haraguchi M., Furukawa Т., Yamada Y., Akiyama S. Structural characterization of thymidine phosphorylase purified from human placenta. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995 Jul 26;212(3): 1040-5.

9. Furukawa Т., Yoshimura A., Sumizawa Т., Haraguchi M., Akiyama S., Fukui K., Ishizawa M., Yamada Y. Angiogenic factor. Nature. 1992 Apr 23;356(6371):668.

10. Usuki K., Saras J., Waltenberger J., Miyazono K., Pierce G., Thomason A., Heldin C.H. Platelet-derived endothelial cell growth factor has thymidine phosphorylase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 May 15; 184(3): 1311-6.

11. Asai K., Hirano Т., Kaneko S., Moriyama A., Nakanishi K., Isobe /., Eksioglu Y.Z., Kato T. A novel glial growth inhibitory factor, gliostatin, derived from neurofibroma. J. Neurochem. 1992 Jul;59(l):307-17.

12. Haraguchi M, Miyadera K., Uemura K., Sumizawa Т., Furukawa Т., Yamada K., Akiyama S., Yamada Y. Angiogenic activity of enzymes. Nature. 1994 Mar 17;368(6468):198.

13. Devereux J., Haeberli P., Smithies O. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11; 12(1 Pt l):387-95.

14. Walton L., Richards C.A., Elwell L.P. Nucleotide sequence of the Escherichia coli uridine phosphorylase (udp) gene. Nucleic Acids Res. 1989 Aug 25;17(16):6741.

15. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Koszalka G. W., Krenitsky T.A., Ealick S.E. The crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase: a comparison with the human enzyme reveals a conserved topology. Structure. 1997 Oct 15;5(10): 1373-83.

16. Pugmire M.J., Ealick S.E. Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases. Biochem. J. 2002 Jan l;361(Pt 1): 1-25.

17. Seeger С, Poulsen С, Dandanell G. Identification and characterization of genes (xapA, xapB, and xapR) involved in xanthosine catabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1995 0ct;177(19):5506-16.

18. Senesi S., Falcone G., Mura U., Sgarrella F., Ipata P.L. A specific adenosine phosphorylase, distinct from purine nucleoside phosphorylase. FEBSLett. 1976 May l;64(2):353-7.

19. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y., Mikami Y. Purification and characterization of a second thermostable purine nucleoside phosphorylase in Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric. Biol. Chem. 1989 53:32193224.

20. Jensen K.F., Nygaard P. Purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Purification and some properties. Eur. J. Biochem. 1975 Feb 3;51(l):253-65.

21. Kierdaszuk В., Modrak-Wojcik A., Shugar D. Binding of phosphate and sulphate anions by purine nucleoside phosphorylase from E. coli: ligand-dependent quenching of enzyme intrinsic fluorescence. Biophys. Chem. 1997 Jan 31;63(2-3):107-18.

22. Kim В.К., Cha S., Parks R.E. Jr. Purine nucleoside phosphorylase from human erythrocytes. IT. Kinetic analysis and substrate-binding studies. J. Biol. Chem. 1968 Apr 25;243(8): 1771-6.

23. Krenitsky T.A. Purine nucleoside phosphorylase: kinetics, mechanism, and specificity. Mol. Pharmacol. 1967 Nov;3(6):526-36.

24. Zoltewicz J.A., Clark D.F., Sharpless T.W., Grahe G. Kinetics and mechanism of the acid-catalysed hydrolysis of some purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc. 1970 Mar 25;92(6):1741-9.

25. Schramm V.L. Enzymatic transition-state analysis and transition-state analogs. Methods Enzymol. 1999;308:301-55.

26. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions, and clinical aspects. Pharmacol. Ther. 2000 Dec;88(3):349-425.

27. Koellner G., Luic M., Shugar D., Saenger W., Bzowska A. Crystal structure of calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 A resolution. J. Mol. Biol. 1997 Jan 17;265(2):202-16.

28. Bzowska A., Luic M., Schroder W., Shugar D., Saenger IV., Koellner G. Calf spleen purine nucleoside phosphorylase: purification, sequence and crystal structure of its complex with an N(7)-acycloguanosine inhibitor. FEBS Lett. 1995 Jul 3;367(3):214-8.

29. Narayana S.V., Bugg C.E., Ealick S.E. Refined structure of purine nucleoside phosphorylase at 2.75 A resolution. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1997 Mar l;53(Pt 2): 131-42.

30. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Federov A.A., Almo S.C., Ealick S.E. Calf spleen purine nucleoside phosphorylase complexed with substrates and substrate analogues. Biochemistry. 1998 May 19;37(20):7135-46.

31. Ropp A. Traut T. W. Purine nucleoside phosphorylase. Allosteric regulation of a dissociating enzyme. J. Biol. Chem. 1991 226:7682-7.

32. Ropp A. Traut T. W. Allosteric regulation of purine nucleoside phosphorylase. Arch. Biochem. Biophys. 288:614-20.

33. Stein R.L., Cordes E.H. Kinetic alpha-deuterium isotope effects for Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase-catalysed phosphorolysis of adenosine and inosine. J. Biol. Chem. 1981 Jan 25;256(2):767-72.

34. Lehikoinen P.K., Sinnott M.L., Krenitsky T.A. Investigation of alpha-deuterium kinetic isotope effects on the purine nucleoside phosphorylase reaction by the equilibrium-perturbation technique. Biochem. J. 1989 Jan 15;257(2):355-9.

35. Kline P.C., Schramm V.L. Purine nucleoside phosphoiylase. Catalytic mechanism and transition-state analysis of the arsenolysis reaction. Biochemistry. 1993 Dec 7;32(48): 13212-9.

36. Porter D.J. Purine nucleoside phosphorylase. Kinetic mechanism of the enzyme from calf spleen. J. Biol. Chem. 1992 Apr 15;267(11):7342-51.

37. Erion M.D., Stoeckler J.D., Guida W.C., Walter R.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 2. Catalytic mechanism. Biochemistry. 1997 Sep 30;36(39):11735-48.

38. Weilgus-Kutrowska B. 1998 PHD Thesis, University of Warsaw.

39. Erion M.D., Takabayashi К., Smith H.B., Kessi J., Wagner S., Monger S., Shames S.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 1. Structure-function studies. Biochemistry. 1997 Sep 30;36(39):11725-34.

40. Vita A., Amici A., Cacciamani Т., Lanciotti M., Magni G. Uridine phosphorylase from Escherichia coli B. Enzymatic and molecular properties. Int. J. Biochem. 1986; 18(5):431-5.

41. Leer J. C., Hammer-Jespersen K., Schwartz M. Uridine phosphorylase from Escherichia coli. Physical and chemical characterization. Eur. J. Biochem. 1977 May 2;75(l):217-24.

42. Kline P.C., Schramm V.L. Pre-steady-state transition-state analysis of the hydrolytic reaction catalyzed by purine nucleoside phosphorylase. Biochemistry. 1995 Jan 31 ;34(4):1153-62.

43. Blow D.M., Birktoft J. J., Hartley B.S. Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotiypsin. Nature. 1969 Jan 25;221(178):337-40.

44. Avraham Y., Grossowicz N., Yashphe J. Purification and characterization of uridine and thymidine phosphorylase from Lactobacillus casei. Biochim. Biophys. Acta. 1990 Sep 3;1040(2):287-93.

45. Desgranges C., Razaka G., Rabaud M., Bricaud H. Catabolism of thymidine in human blood platelets: purification and properties of thymidine phosphorylase. Biochim. Biophys. Acta. 1981 Jul 27;654(2):211-8.

46. Schwartz M. Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Properties and kinetics. Eur. J. Biochem. 1971 Jul 29;21(2):191-8.

47. Krenitsky T.A., Tuttle J. V. Correlation of substrate-stabilization patterns with proposed mechanisms for three nucleoside phosphorylases. Biochim. Biophys. Acta. 1982 May 3;703(2):247-9.

48. Krenitsky T.A. Pentosyl transfer mechanisms of the mammalian nucleoside phosphorylases. J. Biol. Chem. 1968 Jun 10;243(ll):2871-5.

49. Iltzsch M.H., el Kouni M.H., Cha S. Kinetic studies of thymidine phosphorylase from mouse liver. Biochemistry. 1985 Nov 19;24(24):6799-807.

50. Hamamoto Т., Noguchi Т., Midorikawa Y. Purification and characterization of purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus TH 6-2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996 Jul;60(7):l 179-80.

51. Scocca J.J. Purification and substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylase from Haemophilus influenzae. J. Biol. Chem. 1971 Nov;246(21 ):6606-10.70. http://arginine.chem.cornell.edu/Structures/TP.html

52. Walter M.R., Cook W.J., Cole L.B., Short S.A., Koszalka G.W., Krenitsky T.A., Ealick S.E. Three-dimensional structure of thymidine phosphorylase from Escherichia coli at 2.8 A resolution. J. Biol. Chem. 1990 Aug 15;265(23): 14016-22.

53. Pugmire M.J., Cook W.J., Jasanoff A., Walter M.R., Ealick S.E. Structural and theoretical studies suggest domain movement produces an activeconformation of thymidine phosphorylase. J. Mol. Biol. 1998 Aug 14;281(2):285-99.

54. Saraste M., Sibbald P.R., Wittinghofer A. The P-loop~a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sci. 1990 Nov; 15(11):430-4.

55. Pugmire M.J., Ealick S.E. The crystal structure of pyrimidine nucleoside phosphorylase in a closed conformation. Structure. 1998 Nov 15;6(11): 1467-79.75. http://arginine.chem.cornell.edu/Structures/PyPN.html

56. Zhou M., Pugmire M.J., Vuong B.Q., Ealick S.E. Cloning, expression and crystallization of pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1999 Jan;55 ( Pt l):287-90.

57. Saenger W. Principles of nucleic acid structure 1984 pp.51-104.

58. Montgomery J.A. Procedure for the preparation of 9-.beta.-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine. United States Patent 4,210,745. Current U.S. Class: 536/27.11; July 1, 1980.

59. Bauman J.G., Wirsching R.C. Process for the preparation of fludarabine or fludarabine phosphate from guanosine. United States Patent 5,602,246. Current U.S. Class: 536/55.3; February 11, 1997.

60. Witkowski J.T., Robins R.K., Sidwell R.W., Simon L.N. Design, synthesis, and broad spectrum antiviral activity of 1- -D-ribofuranosy 1-1,2,4-triazole-3-carboxamide and related nucleosides. J. Med. Chem. 1972 Nov; 15(11): 1150-4.

61. Ito Y., Nii Y., Kobayashi S., Ohno M. Regioselective synthesis of virazole using benzyl cyanoformate as a synthon., Tetrahedron Lett. 1979; 27:252124.

62. Kazimierczuk Z, Cottam H.B., Revankar G.R., Robins R.K. Synthesis of 2'-deoxytubercidin, 2-deoxyadenosine, and related 2-deoxynucleosides via anovel direct stereospecific sodium salt glycosylation procedure. J. Am. Chem. Soc.; 1984; 106(21); 6379-6382.

63. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V. Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylases. Biochemistry. 1981 Jun 9;20(12):3615-21.

64. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V., Rideout J.L., Elion G.B. An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides. Carbohydrate Research. 1981;97:139-146.

65. Holguin J., Cardinaud R. Trans-N-deoxyribosylase: purification by affinity chromatography and characterization. Eur. J. Biochem. 1975 Jun;54(2):505-14.

66. Carson D.A., Wasson D.B. Synthesis of 2',3-dideoxynucleosides by enzymatic trans-glycosylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988 Sep 15;155(2):829-34.

67. Freeman G.A., Shaver S.R., Rideout J.L., Short S.A. 2-amino-9-(3-azido-2,3-dideoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-6-substituted-9H-purines: synthesis and anti-HIV activity. Bioorg. Med. Chem. 1995 Apr;3(4):447-58.

68. Hicks N., Hutchinson D.W. Synthesis of nucleoside analogues using immobilised N-deoxyribosyltransferases. Biocatalysis. 1994 11:1-7.

69. Haertle T, Carrera C.J., Wasson D.B., Sowers L.C., Richman D.D., Carson D.A. Metabolism and anti-human immunodeficiency virus-1 activity of 2-halo-2',3'-dideoxyadenosine derivatives. J. Biol. Chem. 1988 Apr 25;263(12):5870-5.

70. Carson D.A., Wasson D.B., Beutler E. Antileukemic and immunosuppressive activity of 2-chloro-2'-deoxyadenosine. Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 1984 Apr;81(7):2232-6.

71. Utagawa Т., Morisawa H., Miyoshi Т., Yoshinaga F., Yamazaki A., Mitsugi K. A novel and simple method for the preparation of adenine arabinoside by bacterial transglycosylation reaction. FEBS Lett. 1980 Jan 14;109(2):261-3.

72. Shirae H., Yokozeki К. Mechanism of 2'-3'-dideoxyadenosine synthesis by Escherichia coli AJ 2595. Agric. Biol. Chem. 1991; 55(2):609-l 1.

73. Зинченко A.M., Барай B.H., Ерошевская JT.A., Бельгельман JI.H., Михайлов С.Н., Карпейский М.Я., Михайлопуло И.А. 2'-,3'- и 5-С-Метилпроизводные уридина в реакции микробиологического трансгликозилирования. Докл. АН СССР. 1987; 297(3):731-4.

74. Kalinichenko E.N., Barai V.N., Bokut S.B., Romanova V.V., Zinchenko A.I., Herrmann G., Mikhailopulo I.A. Microbiological synthesis of 5-ethyl- and (E)-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine. Biotechnology Letters. 1989; 11(9):621-6.

75. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., Dubchik N.V., Belyaeva Yu.V., Mikhailopulo I.A. Synthesis of 2'-deoxythymidine by an enzymatic transdeoxyribosylation. Biotechnology Letters. 1990; 12(5):341-6.

76. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., Kvasyuk E.I., Mikhailopulo I.A. Synthesis of 9-(beta-D-arabinofiiranosyl)guanine using whole cells of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990 Mar;32(6):658-61.

77. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Bokut S.B., Dubchik N. V., Barai V.N., Kalinichenko E.N., Rosemeyer H., Seela F. 1-Deaza and 3-deazapurines in the reaction of microbiological transglycosylation. Biotechnology Letters. 1992; 14(10):885-90.

78. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Kazimierczuk Z., Barai V.N., Bokut S.B., Kalinichenko E.N. Synthesis of 2-chloro-2'-deoxyadenosine by microbiological transglycosylation. Nucleosides & Nucleotides. 1993; 12(3&4):417-22.

79. Barai V.N., Zinchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Kalinichenko E.N., Kulak T.I., Mikhailopulo I.A. A universal biocatalyst for the preparation of base-and sugar-modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation. Helv. Chim. Acta. 2002; 85:1901-08.

80. Fujishima T. Yamamoto Y. Process for producing ribavirin. United States Patent 4,614,719. Current U.S. Class: 435/85; September 30, 1986.

81. Авт. свид. СССР № 1661209 А1, МПК' кл. С12 N1/20, опублик. 07.07.91.

82. Shirae Н., Yokozeki К., Kubota К. Enzymatic production of ribavirin from pyrimidine nucleosides by Enterobacter aerogenes AJ11125. Agric. Biol.Chem. 1988; 52(5): 1233-7.

83. Shirae H., Yokozeki K, Kubota K. Enzymatic production of ribavirin from orotidine by Erwinia carotovora AJ2992. Agric. Biol.Chem. 1988; 52(6): 1499-504.

84. Shirae H., Yokozeki K, Uchiyama M. Enzymatic production of ribavirin from purine nucleosides by Brevibacterium acetylicum ATCC 954. Agric. Biol.Chem. 1988; 52(7): 1777-83.

85. Hennen W.J., Wong C-H. A new method for the enzymatic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 1989; 54:4692-95.

86. Shirae H., Yokozeki K., Kubota К Adenosine phosphorolyzing enzymes from microorganisms and ribavirin production by the application of the enzyme. Agric. Biol.Chem. 1991; 55(2):605-7.

87. Зинченко A.M., Брошевская JI.A., Барай B.H. Увеличение операционной стабильности клеток Escherichia coli катализирующих реакцию синтеза аденинарабинозида, в помощью глутарового альдегида. Биотехнология. 1990; 5:36-9.

88. Studier F. W, Moffatt В.А. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 1986 May 5;189(1):113-30.

89. Grossman Т.Н., Kawasaki E.S., Punreddy S.R., Osburne M.S. Spontaneous cAMP-dependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instability. Gene. 1998 Mar 16; 209(1-2):95-103.

90. De Bellis D., Schwartz I. Regulated expression of foreign genes fused to lac: control by glucose levels in growth medium. Nucleic Acids Res. 1990 Mar 11; 18(5): 1311.

91. Moore J.T., Uppal A., Maley F., Maley G.F. Overcoming inclusion body formation in a high-level expression system. Protein. Expr. Purif. 1993 Apr;4(2): 160-3.

92. Sastry S., Ross B.M. RNA-binding site in T7 RNA polymerase. Proc. Natl. AcadSci. USA. 1998 Aug 4;95(16):9111-6.

93. Bryson H.M., Sorkin E.M. Cladribine. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic potential in haematological malignancies. Drugs. 1993 Nov;46(5):872-94.

94. Keating M.J., Kantarjian H., Talpaz M., Redman J., Koller C., Barlogie В., Velasquez W., Plunkett W., Freireich E.J., McCredie KB. Fludarabine: a new agent with major activity against chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1989 Jul;74(l): 19-25.

95. Галегов F.A., Львов H.Д., Петрова И.Г., Флорентов В.Л. Рибавирин как антивирусный химиопрепарат: химия, молекулярный механизм действия, возможность практического применения. Вопр. мед. химии. 1986; 32( 1): 10-19.

96. Hori N., Watanabe M, Yamazaki Y. Purification and characterization of thermostable purine nucleoside phosphorylase of Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric. Biol.Chem. 1989; 53(8):2205-10.

97. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y. Purification and characterization of second thermostable purine nucleoside phosphorylase in Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric. Biol.Chem. 1989; 53(12):3219-24.

98. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y. Purification and characterization of thermostable pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric.Biol.Chem. 1990; 54(3):763-8.

99. Bzowska A., Kazimierczuk Z. 2-Chloro-2'-deoxyadenosine (cladribine) and its analogues are good substrates and potent selective inhibitors of Escherichia coli purine-nucleoside phosphorylase. Eur. J. Biochem. 1995 Nov l;233(3):886-90.

100. Schwartz M. Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Methods Enzymol. 1978;51:442-5.

101. Вейко В. П., Чеботаев Д. В., Овчарова И. В., Гулъко Л. Б. Белковая инженерия уридинфосфорилазы из Escherichia coli К-12. 1. Клонирование и экспрессия в Е. coli генов уридинфосфорилаз из

102. Klebsiella aerogenes и Salmonella typhimurium. Биоорган, химия. 1998, 24(5):381-387.

103. Гуревич A.M., Качалина T.A., Каюшин A.JI., Коростелева М.Д., Мирошников А. И. Клонирование повторяющейся последовательности гена окситоцина. Биоорган, химия. 1993; 19:629-32.

104. Остерман. JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и центрифугирование. Москва "Наука" 1981.

105. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. V.2. 1989.

106. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.

107. Ред. Дарбре А. Практическая химия белка. Москва "Мир" 1989.

108. Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951 Nov; 193(l):265-75.