Разработка, исследование и контроль качества новых лекарственных средств природных терпеноидов и наночастиц оксида цинка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Балакирева Алёна Анатольевна

• Балакирева Алёна Анатольевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Балакирева Алёна Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Роль наночастиц оксида цинка в метаболизме в организме человека

1.1.1. Метаболизм и гомеостаз цинка

1.1.2. Эндогенный цинк - компонент антиоксидантной ферментной защиты

1.2. Синтез наночастиц оксида цинка для медицинского назначения

1.3. Синтез наночастиц в полимерной матрице для получения композитных наноматериалов

1.4. Свойства наночастиц оксида цинка и методы их исследования

1.4.1. Спектральные свойства

1.4.2. Электрокинетические свойства, диссоциация и агрегация наночастиц оксида цинка

1.5. Биомолекулярная «корона» на наночастицах. Безопасность и токсичность

наночастиц в биологической среде

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты, материалы и методы исследования

2.2. Получение наночастиц оксида цинка

2.3. Биологическая активность

2.4.1. Моделирование термических ожогов у животных

2.4.2. Измерение площади раны

2.4.3. Биологическая активность in vitro

2.4.5.Оценка антиагрегационной активности ZnO NPs-ДФБ

2.5. Статистический анализ

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований. РАЗРАБОТКА СИНТЕЗА НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЦИНКА, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТЕРПЕНАМИ, И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ СВОЙСТВ

3.1. Разработка методики синтеза наночастиц оксида цинка и исследование их физико-химических свойств

3.2. Иммобилизация тритерпеноидов лупанового ряда в поверхность 7пО МРб-ПЭГ для их использования в составе олео- и гидрогелей

3.2.1. Физико-химические свойства 7пО МРб, модифицированных тритерпеноидами

3.2.2. Оценка поверхностной концентрации тритерпеноидов в модифицированных наночастицах

3.3. Синтез 7пО МРб, модифицированных ДФБ в матрице бактериальной целлюлозы

3.4. Прогнозирование агрегативной устойчивости наночастиц 7пО NPs-ПЭГ в водной среде и антиагрегационной активности частиц, защищённых 3,28-

дифосфатом бетулина, в биологической среде

3.4.1. Дзета-потенциал и гидродинамический радиус наночастиц 7пО ^Рб-ПЭГ, модифицированных фосфат-содержащими соединениями

3.5. Разработка состава олео- и гидрофильного геля

ГЛАВА 4. СТАНДАРТИЗАЦИЯ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЦИНКА

4.1. Методики установления подлинности наночастиц оксида цинка

4.2. Количественное определение наночастиц оксида цинка

4.3. Методики определения примесей наночастиц оксида цинка

ГЛАВА 5. Результаты собственных исследованй. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА, ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ДИФОСФАТОМ БЕТУЛИНА

5.1. Характеристики состояния здоровья животных

5.2. Оценка энергетического обмена по активности оксидоредуктаз -лактатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при лечении ожоговых ран

5.3. Анализ уровня малонового диальдегида

5.4. Уровень антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ААС - атомно-абсорбционная спектроскопия; АФС - активная фармацевтическая субстанция; Б - бетулин;

БК - бетулоновая кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

Г-6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа;

ГР - глутатионредуктаза;

ДАБ - 3,28-диацетат бетулина;

ДРС - метод динамического светорассеяния;

ДФБ - 3,28-дифосфат бетулина;

ЛДГ - лактатдегидрогеназа;

ЛС - лекарственное средство;

ЛФ - лекарственная форма;

МДА - малоновый диальдегид;

ПРФА - порошковый рентгенофазовый анализ;

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия;

УФ - ультрафиолетовая спектроскопия;

Фурье-ИК - Фурье-инфракрасная спектроскопия;

InsP6 - фитиновая кислота;

Sуд - удельная поверхность;

ZnO NPs - наночастицы оксида цинка;

ZnO NPs-ДФБ - наночастицы оксида цинка, модифицированные 3,28-дифосфатом бетулина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка, исследование и контроль качества новых лекарственных средств природных терпеноидов и наночастиц оксида цинка»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Соединения цинка широко используются в различных областях медицины, что обусловлено, главным образом, бактерицидным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием ионов цинка.

В последнее время пристальное внимание привлекают лекарственные средства (ЛС), содержащие наночастицы оксида цинка (ZnO NPs) для лечения дерматологических заболеваний [Gupta, M. et all, 2014]. В отличие от фармакопейного оксида цинка, наночастицы ZnO NPs обладают высокой проницаемостью через кожу, способствуют генерации активных форм кислорода, приводящих к гибели бактериальных и опухолевых клеток, проявляют регенерирующее действие [Arasu M.V.et all, 2019, Metwally, A.A. et all, 2022], активируя обмен веществ и синтез коллагена [Xuewei Y, et all, 2021, Rosa de Moura F. B., et all, 2022, Lansdown, A.B.G, et all, 2007].

Широкому внедрению в медицинскую практику ЛС, содержащих ZnO NPs, препятствует отсутствие надёжных методик синтеза агрегативно устойчивых наночастиц, а также способность ZnO NPs в биологической среде обрастать токсичной «биомолекулярной короной». Литературные данные по обеспечению стабильности и безопасности наночастиц немногочисленны и противоречивы.

Одним из путей решения проблемы является защита поверхностного слоя модификацией ZnO NPs поверхностно-активными веществами (ПАВ), полимерами и природными биологически активными веществами. Дифосфат бетулина (ДФБ) хорошо зарекомендовал себя при лечении ожогов и может быть использован для модификации поверхности ZnO NPs. В процессе иммобилизации ДФБ, содержащий две фосфатные группы, способен выполнять функцию «якоря» на поверхности ZnO NPs, который способствует формированию гидрофильной оболочки, стабилизирующей наночастицы.

Степень разработанности темы. Каплун А.П. и авторы показали способность ДФБ выступать ингибитором комплемента, регулирующим

фактором многих заболеваний [Каплун А.П., 2004]. В работах [Лебедевой Р.А., 2016], показано, что ДФБ активирует антиоксидантную ферментную защиту, способную ускорять процесс заживления ран. Ранее в работах [Малыгиной Д. С., 2019 г.] продемонстрирована способность ДФБ усиливать противоопухолевую активность 5-фторурацила и гидразинсульфата, показано его влияние на энергетический метаболизм клетки (активность ЛДГ) и на антиоксидантные свойства.Ассортимент ЛС с ZnO NPs включает только нанокомпозитные раневые покрытия с синтетическими и биополимерами.

Цель исследования: разработка, исследование и контроль качества наночастиц оксида цинка, модифицированных дифосфатом бетулина, как компонентов противоожоговых средств.

Задачи исследования:

1. Разработка синтеза наночастиц оксида цинка как потенциальной фармацевтической субстанции и исследование его свойств методами порошковой рентгенофазовой дифрактометрии (ПРФА), Фурье-ИК-, УФ-, флуоресцентной спектроскопии, сканирующей электронной микроскопией (СЭМ).

2. Изучение путей повышения агрегативной устойчивости наночастиц оксида цинка и создание защитной «короны» от биологической среды за счёт иммобилизации фосфат-содержащих соединений.

3. Разработка синтеза наночастиц оксида цинка в матрице бактериальной целлюлозы и изучение физико-химических свойств нанокомпозитных материалов.

4. Разработка составов противоожоговых олео- и гидрогелей бетулина с наночастицами оксида цинка, с иммобилизованными ДФБ и изучение их реологических свойств.

5. Разработка методик для идентификации и количественного определения наночастиц оксида цинка, модифицированных ДФБ.

6. Стандартизация наночастиц оксида цинка и валидация методики количественного определения.

7. Оценка биологической активности разработанных лекарственных средств (олео-, гидрогелей и композиционных материалов бактериальной целлюлозы), содержащих наночастицы оксида цинка, модифицированных ДФБ.

Научная новизна.

• Впервые разработан метод синтеза агрегативно устойчивых наночастиц оксида цинка, модифицированных дифосфатом бетулина, позволяющим контролировать размер частиц (10-17 нм).

• Впервые разработан синтез и изучены физико-химические свойства наночастиц оксида цинка в матрице бактериальной целлюлозы, содержащей ДФБ, используя в качестве прекурсоров нитрат цинка и три-(оксиметил)-аминометан.

• Впервые предложен состав тиксотропных олео- и гидрогелей бетулина и ZnO NPs, с иммобилизованным ДФБ (патент: RU 2 752 733).

• Разработаны методики для идентификации и количественного определения наночастиц оксида цинка, модифицированных дифосфатом бетулина, проведена стандартизация ZnO NPs как потенциальной фармацевтической субстанции, а также разработан проект фармакопейной статьи.

• Впервые изучено противоожоговое действие олео-, гидрогелей и композиционных материалов бактериальной целлюлозы, содержащих наночастицы оксида цинка.

Теоретическая и практическая значимость. Разработанные методики синтеза агрегативно устойчивых наночастиц оксида цинка, модифицированных дифосфатом бетулина, (как в спиртовой среде, так и в матрице бактериальной нано-целлюлозы) могут быть использованы для внедрения в фармацевтическую промышленность или в производственную аптеку для изготовления экстемпоральных олео-, гидрогелей и раневых покрытий на основе бактериальной нано-целлюлозы для лечения заболеваний кожи.

Методики анализа агрегативно устойчивых наночастиц оксида цинка используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе на фармацевтическом отделении государственного бюджетного профессионального

образовательного учреждения Нижегородской области «Нижегородский медицинский колледж» (акт внедрения от 27.04.22г, Приложение 2). Результаты по стандартизации наночастиц оксида цинка используются в государственном автономном учреждении здравоохранения Нижегородской области «Нижегородский областной центр по контролю качества и сертификации лекарственных средств» (акт внедрения от 16.03.22 г, Приложение 3). Разработан проект фармакопейной статьи на фармацевтическую субстанцию наночастиц оксида цинка.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВО "ПИМУ" Минздрава России (номер государственной регистрации 01201063248) по научной проблеме «Разработка, исследование и контроль качества новых лекарственных средств природных терпеноидов и наночастиц оксида цинка», РИД «Лекарственные препараты на основе природных тритерпенов и их производных».

Методология и методы исследования. При проведении исследования методологическую основу составили изучение и анализ работ отечественных и зарубежных ученых в области получения наночастиц оксида цинка и наночастиц оксида цинка с иммобилизованным ДФБ. При выполнении работ использованы современные методы неорганического синтеза, выделения и очистки полученных веществ. Строение и чистота полученных соединений установлены с помощью спектральных методов анализа: ИК-, УФ-, ААС-, ЯМР-, атомно-эмиссионная с ИСП - спектроскопии, ВЭЖ хроматографии, порошковой рентгеновской дифрактометрии (ПРФА). Свойства ZnO NPs изучали с использованием флуоресцентной и УФ-спектроскопии, СЭМ, БЭТ и ДРС - методов анализа. Противоожоговую и антиоксидантную активность исследовали в in vitro и in vivo экспериментах на крысах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Методики синтеза агрегативно устойчивых наночастиц оксида цинка.

2. Результаты физико-химических исследований по структуре агрегативно устойчивых наночастиц оксида цинка и наночастиц оксида цинка модифицированных дифосфатом бетулина.

3. Методики синтеза наночастиц оксида цинка в матрице бактериальной целлюлозы.

4. Результаты физико-химических исследований по структуре и физико-химическим свойствам нано-композитных материалов на основе оксида цинка и бактериальной целлюлозы.

5. Данные по составу и свойствам противоожоговых тиксотропных олео- и гидрогелей бетулина и наночастиц оксида цинка с иммобилизованным дифосфатом бетулина.

6. Методики стандартизации наночастиц оксида цинка и валидация методики количественного определения.

7. Данные по противоожоговым свойствам, разработанных лекарственных средств (олео-, гидрогелей и композиционных материалов бактериальной целлюлозы), содержащих наночастицы оксида цинка с иммобилиззованным ДФБ.

Достоверность научных положений и выводов базируется на достаточных по своему объему данных и количеству материала, современных методах исследования и статистической обработке данных.

Соответствие паспорту специальности. Работа соответствует паспорту

специальности 3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия: 2 -«Формулирование и развитие принципов стандартизации и установление нормативов качества, обеспечивающих терапевтическую активность и безопасность лекарственных средств»; 3 - «Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления».

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международном конгрессе молодых учёных в фармации «Drug research» (г. Казань, 22-23 октября 2019 г); конкурсе VI Всероссийской научно-

практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «VolgaMedScience» (г. Нижний Новгород, 16-17 марта 2020 г); международной конференции «Materials science of the future: research, development, scientific training» (г. Нижний Новгород, 17-18 ноября 2020 г); II Межвузовской научно-практической конференции с международным участием «Синтез наук как основа развития медицинских знаний» (г. Самара, 19 ноября 2021 г); XXV Всероссийской конференции молодых учёных-химиков (с международным участием) (г. Нижний Новгород, 19-21 апреля 2022 г).

Публикации. По материалам диссертации получен 1 патент, опубликованы 5 статей в ведущих рецензируемых отечественных и международных журналах, опубликованы доклады 5 конференций в форме тезисов.

Внедрение результатов исследования. Описанные в работе методы анализа наночастиц оксида цинка, модифицированных дифосфатом бетулина и обработки их результатов используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе в ГБПОУ НО «Нижегородский медицинский колледж», в государственном автономном учреждении здравоохранения нижегородской области «Нижегородский областной центр по контролюкачества и сертификации лекарственных средств» (ГАУЗ НОЦККСЛС).

Личный вклад автора. Результаты, приведённые в диссертации, получены

при непосредственном участии автора в проведении физико-химических и биологических исследований наночастиц оксида цинка, модифицированых дифосфатом бетулина, и изучении их использования в ЛС. Автор является основным исполнителем написания публикаций по теме диссертации и разработке нормативной документации на субстанцию наночастиц оксида цинка.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной методам и объектам исследования, трех глав собственных исследований, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 34 рисунка. Список литературы включает 155 работ, из которых 146 - на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В литературном обзоре рассмотрены роль наночастиц оксида цинка (ZnO NPs) в метаболизме при лечении, способы их получения для медицинского назначения, методы их качественного и количественного анализа, а также пути защиты частиц от агрегации в биологических средах.

1.1. Роль наночастиц оксида цинка в метаболизме в организме человека

Цинк является эссенциальным элементом, и его роль в организме человека определяется участием в работе различных белковых систем, главным образом, цинкзависимых и цинксодержащих ферментов.

1.1.1. Метаболизм и гомеостаз цинка

В организме человека всасывание цинка начинается в кишечнике с помощью специфических белков, транспортирующих цинк по всему организму. Поскольку цинк в значительной степени связан с альбумином, аффинность к которому низкая, а-2-макроглобулином и трансферрином с высокой аффинностью, свободный цинк редко встречается в сыворотке крови. Внутри клетки цинк в основном накапливается в специальных органеллах - цинкосомах (~ 50%) и ядре (~ 30-40%) [1, 2].

В 1957 году в цитоплазме были обнаружены специфические белки - металлотионеины, которые хелатируют цинк [3]. Металлотионеины могут связывать около 20% внутриклеточного цинка, в его гемостазе это играет важную роль. Например, металлотионеин-1 способен связать до семи ионов цинка, что делает его пригодным для использования в качестве цинкового буфера [4]. Для поддержания низких концентраций ионов цитозольных металлов и защиты от высоких концентраций цитотоксических металлов, клетки, наряду с металлсвязывающими белками, изменяются по механизмам компартментализации

и секвестрации цинка. Потребность клетки в свободном цинке обеспечивается за счет хранения цинка в цинкосомах или других органеллах, таких как эндоплазматическая сеть (ЭПС) или аппарат Гольджи [5]. Внутриклеточный баланс цинка между цитозолем и органеллами поддерживается за счет специфических транспортных белков, таких как импортеры или экспортеры цинка, или за счет мембранных каналов [6]. Содержание свободных цитозольных ионов цинка лежит в пределах пико- или наномолярных концентраций [4]. Временное и локальное увеличение концентрации цинка в цитоплазме за счет высвобождения из белка и органелл влияет на экспрессию генов, ферментативную активность и передачу сигналов клетками [5].

Распределение, транспорт и поддержание внутриклеточного уровня цинка контролируются 24 белками-транспортерами цинка и четырьмя металлотионеинами (MT1-4), действие которых взаимосвязано [7-9].

Переносчики цинка делятся на два основных семейства в соответствии с мембранной топологией: (1) семейство SLC39: Zrt-подобный (регулируемый цинком переносчик), Irt-подобный белок (регулируемый железом переносчик), ZIP, которые увеличивают цитоплазматический цинк, и (2) семейство SLC30: 10 переносчиков цинка ZnT, которые понижают цитоплазматический цинк путем транспорта цинка либо из клетки, либо во внутриклеточные органеллы [5]. Для конкретной клеточной функции необходим определенный уровень цинка, который поддерживается переносчиками этого иона в различных типах клеток организма человека, связывающими между собой наружную плазматическую мембрану и мембраны органелл, таких как митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и ЭПС [10, 11]. Другие механизмы поддержания концентрации цинка: использование рецепторов и ионных каналов, отличных от ZIP или ZnT, зависящее от разности потенциалов в кальциевых и других каналах различных рецепторов; диффузия цинка, связанного с аминокислотами [12, 13].

Наиболее важными цинксодержащими ферментами являются: матриксные металлопротеиназы (ММП), карбоксипептидаза А, карбоангидраза. Карбоксипептидаза А является экзоферментом желудочно-кишечного тракта,

катализирует гидролиз концевой пептидной связи в белках в процессе пищеварения [14]:

но н л ¥п ¥г>

н | || н I _^ н \ , \ //

-й—с—с—й—с—< --к—с—с' + н3н—с—с(

| I | ^О I

Я РЬ-СН2 к РЬ-сн2

В этом ферменте атом цинка тетраэдрически координирован двумя гистидиновыми атомами азота, карбоксильным атомом кислорода глутаминового остатка и молекулой воды. Координация цинка на I стадии происходит через карбонильную группу, которая поляризуется и на атоме углерода появляется положительный заряд, восприимчивый к нуклеофильной атаке. На II стадии происходит перегруппировка с переносом протона с участием группы ОН- от присоединенной воды и разрыв пептидной связи. Доказано, что конформация фермента способствует образованию гидрофобного «кармана» рядом с атомом цинка, который заключает неполярную боковую цепь гидролизуемого белка, и что белок занимает правильное положение благодаря образованию водородных связей с соответствующими группами фермента.

Вторым наиболее распространенным цинксодержащим ферментом, влияющим на газообмен в организме человека и на транспортные свойства гемоглобина, является карбоангидраза - сферическая молекула с одним атомом цинка, расположенным глубоко в «кармане» белка с несколькими молекулами воды [14]. Атом цинка координирован тетраэдрически тремя имидазольными атомами азота и молекулой Н20. Цинковый фермент катализирует реакцию С02 + H2O ^ HCO3- + Координированная молекула Н20 подвергается ионизации с образованием Zn-OH-, а нуклеофил ОН- затем реагирует с атомом углерода СО2 с образованием НСО3-. Это эквивалентно замене медленной гидратации СО2 водой быстрой реакцией СО2 + OH- ^ НСО3-. Данной реакции необходимо высокое значение рН. Таким образом, фермент создает подходящее окружение внутри белкового «кармана», способствующее диссоциации связанной молекулы Н^ при рН 7, степень диссоциации которой иначе была бы слишком низкой.

Кроме того, цинк в белках распознает последовательности оснований в ДНК и, следовательно, регулирует перенос генетической информации в ходе репликации ДНК. Эти белки, с так называемыми «цинковыми пальцами», содержат 9 или 10 ионов 7п2+, каждый из которых координируется с четырьмя аминокислотами, стабилизируя выступающую складку («палец») белка, так, что каждый из «пальцев» связывается с ДНК, белок обертывается вокруг двойной спирали ДНК, при этом расположение «пальца» для точного распознавания совпадает с последовательностью оснований в ДНК [2, 14].

В настоящее время большое внимание уделяется матриксным металлопротеиназам (ММП), относящимся к семейству цинкзависимых ферментов, контролирующих разложение соединительной ткани. Они включают коллагеназы, желатиназы и стромелизины и расщепляют коллагены, фибронектин и желатины. ММП могут инициировать рост опухоли, повышая подвижность соединительных тканей, в том числе, в кровеносных сосудах [12, 13]. Неправильная экспрессия ММП приводит к различным заболеваниям включая разложение хрящей и костей при ревматизме и остеоартрите; разложение и трансформирование тканей во время инвазивного роста опухоли и развитие кровеносных сосудов (ангиогенез) опухоли; деградацию белков, основанных на миелине, в гематоэнцефалическом барьере, за которым следует повреждение головного мозга; потерю прочности стенок аорты при аневризме; разложение ткани при язве желудка; распад соединительной ткани при пародонтозе.

Взаимодействие цинка с белками является очень сложным. Протеом цинка состоит из двух основных групп, включающих ферменты и факторы транскрипции, внутриклеточные сигнальные пути к цинку труднодоступны, что влияет на созревание, дифференцировку и функцию клеток [15-17].

1.1.2. Эндогенный цинк - компонент антиоксидантной ферментной защиты

Повышенные внутриклеточные уровни цинка в иммунных клетках могут отравлять поглощенные патогены и действовать цитопротективно, нейтрализуя

активные формы кислорода (АФК) и виды оксидов азота. В целом, гомеостаз цинка и сигналы цинка имеют решающее значение для противодействия воспалительным заболеваниям, а корреляция недоедания с тяжелыми воспалительными заболеваниями сопровождается длительными и тяжелыми формами гипоцинкемии в сыворотке крови. В литературе было высказано предположение, что гипоцинкемия сопровождается повышенными уровнями медиаторов воспаления, например, АФК, и антимикробными пептидами, такими как кальпротектин или ММП, вызывая повреждение тканей, особенно в печени, легких и селезенке [18, 19]. В целом, клеточные функции, такие как внутриклеточное уничтожение вредных патогенных микроорганизмов, выработка цитокинов, а также выработка АФК, зависят от уровня цинка и нарушаются из-за дефицита цинка.

Принято считать, что антиоксидантные свойства цинка определяются, главным образом, тем, что он является неотъемлемым компонентом антиоксидантных ферментов, и дефицит уровня цинка приводит к возникновению окислительного стресса [20].

Наиболее значимым по влиянию на оксидативный стресс является фермент - медь-цинк-супероксиддисмутаза (Си7п-СОД), который выполняет функцию удаления супероксид-аниона. Этот фермент обладает крайне высокой стабильностью. Так, Си7п-СОД, выделенный из мозга 3000-летней высушенной на воздухе мумии, сохранял свою активность и по своим иммунологическим свойствам был неотличим от свежевыделенного фермента. Си7п-СОД катализирует дисмутацию супероксида, постоянно образующегося при аэробном метаболизме, в кислород и пероксид водорода [21]. В организме человека ферменты, включающие медь и цинк, действуют синергетически и составляют единую антиоксидантную защиту, включающую в себя и третий элемент - селен. Именно по этой причине наиболее целесообразно изучать систему антиоксидантной защиты ферментами, оценивая активность глутатионпероксидазы, содержащей селен, и глутатионредуктазы, а также учитывать концентрацию глутатиона.

Роль цинка, не изменяющего степень окисления, в редокс-защите от оксидативного стресса является более сложной, чем меди, взаимодействующей по типу реакции Фентона. В данном контексте, цинк можно рассматривать как «косвенный» антиоксидант - модификатор биологических редокс-реакций. Антиоксидантное влияние цинка обусловлено, главным образом, способностью индуцировать стрессовую реакцию и осуществлять стабилизацию белковых тиолов (ферменты, «цинковые пальцы», металлотионеины) [21].

К потенциальному механизму антиоксидантного действия цинка можно отнести антагонизм окислительно-восстановительных переходных металлов, таких как железо или медь, и предотвращение окисления сульфгидрильных групп в белках. Тиольные группы стабилизируются цинком, что и защищает фермент или другой протеин от инактивации, вызванной оксидативным стрессом. Действие цинка, как антиоксиданта, в случае металлотионеинов, заключается в регуляции их метаболизма. В свою очередь, дефицит цинка приводит к снижению защиты сульфгидрильных групп и увеличению продукции АФК, чрезмерные уровни могут действовать как прооксиданты, вызывая снижение уровня CuZn-СОД и других важнейших металлоферментов в эритроцитах [21]. Биохимическое исследование многих заболеваний, например, сахарного диабета, подтвердило, что оптимальный уровень цинка является необходимым условием для поддержания окислительного метаболизма в норме [22].

По мнению авторов, Z. Y. Zhang и H. M. Xiong, бактерицидное действие ZnO NPs обусловлено способностью проникать через клеточную мембрану бактерий и вызывать генерацию активных форм кислорода (рисунок 1.1) [23]. С другой стороны, антибактериальное действие может проявляться за счёт способности ZnO NPs накапливаться в мембране и цитоплазме клеток, с последующим выделением Zn2+. Это вызывает бактериальное разрушение клеточной мембраны, повреждение мембранных белков, нестабильность генома, приводящая к гибели бактерий [24-26].

На способность наночастиц оксида цинка генерировать АФК (супероксид-анион, гидроксил радикал) влияет рН среды. При более низком рН протоны из

окружающей среды переносятся на поверхность частиц, что приводит к положительно заряженной поверхности 7пОН2+ (рисунок 1.1).

Рисунок 1.1. Механизм действия наночастиц оксида цинка на апоптоз по двум маршрутам (а, Ь на рисунке) в зависимости от рН среды: (а) - нейтральная или слабощелочная среда; (Ь) - кислая среда [26]

Эти положительные частицы взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфолипидами на внешней мембране клетки, в результате чего наночастицы поглощаются клеткой. В кислых лизосомах наночастицы оксида цинка растворяются и высвобождают ионы цинка, которые ингибируют действие дыхательных ферментов, вследствие чего происходит апоптоз.

Вследствие индуцирования АФК наночастицами, происходит повреждение ДНК, вызывая выброс апоптогенных факторов из митохондриальной мембраны, что в конечном итоге также приводит к апоптозу (рисунок 2.3, а) [26].

В целом, следует отметить, что при проникании ионов цинка из 7пО МРб в составе наружных ЛС, лечебный эффект может быть обусловлен их влиянием на иммунный статус, антиоксидантную ферментную защиту, способностью активировать синтез коллагена, и, главное, способностью наночастиц генерировать АФК, оказывая бактерицидное действие.

1.2. Синтез наночастиц оксида цинка для медицинского назначения

Для неорганического синтеза ZnO NPs широко используются различные методы.

Химические приёмы сочетают химическую реакцию с получением продуктов (гидроксиды, карбонаты, оксалаты и др.) с последующим термическим разложением [27-40]. Конечный продукт часто подвергают механохимической обработке для получения порошков с нужными характеристиками: средним размером кристаллитов и нужным размером Syд. При выборе химического метода получения ZnO NPs учитывают целевое назначение частиц, главным образом, необходимую структуру наночастиц, например, гексагональную структуру вюрцита, частицы сферической формы, цинкит, а также полиморфизм, полученных частиц (цветы, проволока, стерженьки и др.).

В качестве прекурсоров чаще всего используются ацетаты, хлориды, сульфаты, нитраты цинка, гидроксиды щелочных металлов и аммония. Реакцию проводят в присутствии поверхностно активных веществ (например, цетилтриметиламмония бромид, лаурилсульфат натрия) и веществ, способных выполнять функцию лигандов (например, триэтиламин, триэтаноламин). Основные прекурсоры и условия химиеского синтеза приведены в таблице 1.1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Балакирева Алёна Анатольевна, 2022 год

БЦ - -

БЦ-ZnO NPs 16,67 17,8±0,2

БЦ-ДФБ-ZnO NPs 16,67 16,2±0,3

БЦ-ДФБ-Трис-ZnO NPs 16,67 15,3±0,2

В целом, можно отметить, что предлагаемый нами способ формирования наночастиц оксида цинка в матрице нанобиоцеллюлозы в присутствии дифосфата бетулина позволяет получить нанокомпозиционный материал с высоким содержанием ZnO NPs. В главе 5, приведены данные исследования противоожогового действия полученных нанокомпозитов.

3.4. Прогнозирование агрегативной устойчивости наночастиц ZnO NPs-ПЭГ в водной среде и антиагрегационной активности частиц, защищённых 3,28-дифосфатом бетулина, в биологической среде

Как было рассмотрено ранее, фосфатная группа иммобилизованных ДФБ, на поверхности ZnO NPs в биологических средах (рН 7,4) способствует формированию устойчивой гидрофильной оболочки и возникновению необходимого для стабильности отрицательного заряда на поверхности.

Ионизация ДФБ, содержащего две фосфатные группы, способные к переносу протона, зависит от рН раствора, создаёт предпосылки возникновения увеличения отрицательного дзета-потенциала в гидрофильной среде. Иллюстрация ионизации ДФБ, рассчитанной по программе Chemicalize приведена на рисунке 3.16. На этом же рисунке представлено и изменение заряда у потенциально возможных комплексов ДФБ с Zn2+ на поверхности ZnO NPs.

Можно предположить, что одна из фосфатных групп, выполняет роль «якорной группы».

Рисунок 3.16. Данные расчётов в программе Chemicalize [150] зависимость ионизации ДФБ (верхний) и ДФБ как «якорной группы» на поверхности ZnO NPs

(нижний) от рН

Поведение наночастиц оксида цинка, модифицированных фосфат-содержащими соединениями, крайне важно при создании лекарственных средств гидрофильной природы на их основе.

Наиболее важными прогностическими факторами, определяющими агрегативную устойчивость ZnO NPs в гидрофильной среде, являются величины дзета-потенциала и гидродинамического радиуса, а также оценка способности к агрегации (и коагуляции) в биологической среде in vitro экспериментах.

3.4.1. Дзета-потенциал и гидродинамический радиус наночастиц ZnO NPs-ПЭГ, модифицированных фосфат-содержащими соединениями

Дзета-потенциал характеризует поверхностный заряд наночастиц оксида цинка, который зависит от таких факторов как растворитель, pH, функциональные группы. В качестве контроля нами были использованы ZnO NPs, обработанные в среде 1,25 • 10-4М лимонной кислоты и цитрат-ионов при pH 7,3, хорошо описанные в работе [99]. Дзета-потенциал ZnO NPs размером 15 нм в среде 3,0-104 М лимонной кислоты при pH 7,5 составлял -9,9 мВ.

Нами показано, что дзета-потенциал немодифицированных ZnO NPs при более низкой концентрации - 1,25 • 10-4 М лимонной кислоты (контроль), равен -6,47 ± 1,10 мВ (таблица 3.10). Значение дзета-потенциала наночастиц, не модифицированных ДФБ, в среде этанол:вода (1:1) равно +13,0 ± 1,20 мВ.

Таблица 3.10.

Дзета-потенциал дисперсий ZnO NPs при рН 7,4 в различных средах

ZnO NPs, % Среда Дзета-потенциал, мВ

0,00625 1,25 • 10-4 М лимонная кислота в этаноле: воде (1: 1) -6,47 ± 1,10

0,00625 1,25 • 10-4 М ДФБ в этаноле -1,49 ± 1,81

0,025 этанол: вода (1: 1) +13,0 ± 1,20

0,025 5 • 10-4 М натриевая соль ДФБ в этаноле: воде (1: 1) -7,09 ± 0,25

0,025 5 • 10-4 М ДФБ в этаноле -6,51 ± 0,60

0,025* 1 • 10-3 М ДФБ в этаноле -41,20

0,025 3 • 10-3 Фитат натрия, фитиновая кислота, в фосфатном буфере -20,64±3,27

Примечание: * наночастицы были выдержаны в этанольном растворе 1 • 10-3 М ДФБ в течение суток перед анализом

Из данных таблицы 3.10 следует, что дзета-потенциал 7пО МРб-ДФБ в спиртовых и водных растворах ДФБ (вода или фосфатный буферный раствор с рН 7.4), имеют отрицательный заряд, зависящий от среды, концентрации ДФБ и от условий предварительной выдержки. Максимальное отрицательное значение дзета-потенциала (-41 мВ) достигалось при выдержке 7пО МРб-ДФБ в концентрированном растворе ДФБ.

Стабилизирующий эффект фосфатных групп на наночастицах оксида цинка был подтверждён в эксперименте с фитиновой кислотой, имеющей шесть фосфатных групп в фосфатном буферном растворе с рН 7,4. Установлено, что дзета-потенциал в этом случае равен -20,64±3,27 мВ.

Измерение распределения гидродинамического радиуса (вторичного размера наночастиц оксида цинка) в среде 5-10-4 М ДФБ в этанол:вода (1: 1) при рН 7,4 проводили методом динамического светорассеяния (DLS). В мультимодальном режиме были зарегистрированы две моды с максимумами при 450-800 нм и 3000-4500 нм (рисунок 3.17. а). Распределение веса (объема) содержало четыре моды с максимумами при 35-55 нм; 444 нм; 744 нм и 3500 нм (рисунок 3.17. б). В логнормальной модели диаметр, усредненный по интенсивности (для всех частиц) = 592 нм, усредненный по объему, = 364 нм рисунок 3.17. в, г).

в) г)

Рисунок 3.17. Распределение ZnO МРб по размерам в 1 • 10-3 М ДФБ в

этаноле: а) по интенсивности рассеяния (мультимодальный режим); б) по

объему рассеивания (мультимодальный режим); в) по интенсивности

рассеяния (логнормальный режим); г) по объему рассеяния (логнормальный

режим).

В изученных дисперсиях количество столкновений из-за межчастичных взаимодействий увеличивается, тогда как средняя длина пути, пройденного частицами между последовательными столкновениями, падает. Мы предполагаем, что увеличение размера ZnO NPs (592 нм по интенсивности и 364 нм по объему) связано с образованием защитной оболочки, состоящей из ДФБ и его натриевой соли при pH 7,4.

Таким образом, сильное увеличение гидродинамических радиусов ZnO NPs-ДФБ в полярной среде до 3000-4000 нм является хорошим аргументом в пользу разработки гидрофильных лекарственных форм.

Влияние ДФБ на агрегацию тромбоцитов in vitro изучали в плазме человека, богатой тромбоцитами, активированной агонистом - АДФ турбидиметрическим методом в соответствии с методом Борна [151]. Для сравнения в качестве положительного контроля была выбрана ацетилсалициловая кислота, проявляющая свойства как антиагреганта, так и антикоагулянта.

Данные рисунка 3.18 и таблицы 3.11 демонстрируют сложный процесс ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов под действием 6,65 цМ ДФБ, ZnO NPs-ДФБ 6,65 цМ и ацетилсалициловой кислотой (АСК).

Прозрачная шпата

100 Г- -------

0 1 2 3 4 6

Время, мин

Рисунок 3.18. Ингибирование агрегации тромбоцитов (кровь добровольцев), индуцированной АДФ (3,75 цМ), под действием 6,65 цМ ДФБ (а), 7пО NPs-BDP 6,65 цМ (Ь), АСК 1,40 цМ (с); черная линия - контроль, действие АДФ (3.75 цМ).

На первом этапе под действием АДФ в отсутствии ингибиторов происходит агрегация тромбоцитов, отмеченная на трех рисунках 3.18 а-с черной линией. Ингибиторы агрегации добавляли в богатую тромбоцитами плазму с АДФ после двух минут от начала эксперимента. После двух минут наблюдалась обратимая дезагрегация тромбоцитов (помутнение раствора) в течение последующей минуты. На 3.5 минуты (около 210 сек) начиналась вторая волна дезагрегации

тромбоцитов. Процент ингибирования агрегации при добавлении различных агентов в присутствии агониста АДФ указан в таблице 3.7.

Таблица 3.11.

Процент ингибирования агрегации тромбоцитов под действием 6,65 цМ ДФБ, ZnO NPs-ДФБ 6,65 цМ, АСК 1,40 цМ.

Агент I петля (дезагре1 агрегация) ^ация- II петля (дезагрегация-агрегация)

% ингибирование (тах) Время, мин % ингибтрование (тах) Время, мин

ДФБ 6,65 цМ 58 2,71 90 5,00

ZnO ОТб-ДФБ 6,65 цМ 29 2,63 90 4,62

АСК 1,40 цМ 38 2,51 90 4,71

Полученные данные показывают, что ДФБ проявляет антиагрегационные свойства, так же, как и ацетилсалициловая кислота. Ионы цинка (ZnO NPs-BDP) уменьшают ингибирование агрегации тромбоцитов почти в 2 раза - 28% по сравнению с 58% под действием ДФБ на 2-3 минуте.

На рисунке 3.19 и в таблице 3.12 показано, что ДФБ ингибировал агрегацию тромбоцитов, активированную агонистом АДФ, дозозависимо.

Рисунок 3.19. Дозозависимое ингибирование агрегации тромбоцитов (кровь добровольцев), индуцированной АДФ (3,75 цМ), под действием 4,43 цМ ДФБ (а), 2,22 цМ ДФБ, 0,44 цМ ДФБ (в); черная линия - контроль, действие АДФ (3,75 цМ).

Наиболее полное ингибирование агрегации тромбоцитов достигалось при введении 4.43 мМ раствора ДФБ, достигая 90% на 5 минуте.

Таблица 3.12.

Процент ингибирования агрегации тромбоцитов под действием различных

концентраций ДФБ.

ДФБ, цМ % ингибирование Время для тах ингибирования (мин)

4мин тах

4,43 73 90 5,00

2,22 9 85 3,17

0,44 53 55 3,87

Таким образом, обратимость дезагрегация-агрегация под действием АДФ в системе ДФБ и ZnO NPs-ДФБ, вероятно, обусловлено появлением АМФ и изменениями фосфатного пула в системе, в том числе ионизованности (степени ионизации) фосфатных групп. Эти результаты хорошо согласуются с увеличением отрицательного значения дзета-потенциала и гидродинамического радиуса наночастиц под действием ДФБ.

Можно предположить, что ингибирование агрегации и увеличение дзета-потенциала под действием ДФБ и 7пО NPs-ДФБ, в которых фосфатные группы ионизованы, будут характеризовать не только агрегативную устойчивость 7пО NPs-ДФБ, но и способствовать заживлению ожоговых ран.

3.5. Разработка состава олео- и гидрофильного геля

На основе наночастиц оксида цинка, модифицированных тритерпеноидами, были получены олеогели бетулина в подсолнечном масле. Олеогели получали суспендированием бетулина (10 г) в 70 г подсолнечного масла под действием ультразвука (44 кГц) в течение 10 мин, после чего при интенсивной обработке ультразвуком осторожно добавляли модифицированные наночастицы оксида цинка (0,5 г). После образования однородной смеси массу олеогелей доводили подсолнечным маслом до 100 г и повторно обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин (таблица 3.13).

Нами предложены составы гидрогелей бетулина и масла лаванды с ZnO NPs, модифицированными бетулином или ДФБ (таблица 3.13). В отличие от

олеогелей гидрогели имеют более сложный состав за счёт введения ПАВ, таких как дипольгидроксистеарат (ПЭГ-30), Глицерилстеарата (ГС), гидроксиэтилцеллюлозы.

Таблица 3.13.

Состав (%) гелеобразных дисперсий, содержащих 7пО МРб и терпеноидов

Дисперсия ZnO NPs Б ДФБ ПАВ Вспомогательные вещества Среда

Олео 2пО 0,6 12,0 1,0 ГС -1,0 Масло лаванды - Масло подсолнечное до

КРБ-ДФБ 2,0 100

гель Тимол - 2,0

Гидро 2пО 4,7 6.0 - ПЭГ30 - ГЭЦ - 2.1 вода дистиллированная

КРб-В гель 3,7 ГС - 2,7 Масло лаванды 2.0 до 100

Гидро ZnO 4,7 5.0 1.0 ПЭГ30 - ГЭЦ - 2.1 вода дистиллированная

КРВ-ББР 3,7 Масло лаванды 2.0 до 100

гель ГС - 2,7

Введение в состав гелей масла лаванды обусловлен присутствием в нём нескольких терпенов (рисунок 3.20), обуславливающим дополнительное противовоспалительное и ранозаживляющее действие.

Мирцен Тимол гамма-Тергашен пара-Цимен

Рисунок 3.20. Формулы тритерпеноидов и терпенов, входящих в состав

лавандового масла

Нано-размер частиц оксида цинка в предлагаемой фармацевтической композиции - геле, подтверждался нами воздействием возбуждения при длине волны 254 и 365 нм в стеклянных флаконах и кварцевых кюветах, помещённых в специальный бокс (рисунок 3.21). Возбуждение в кварцевых кюветах при указанных длин волн приводило к голубой - при модификации 7пО дифосфатом бетулина или к фиолетовой (Х=254 нм) в отсутствии ДФБ. Желтая (Х=365 нм) эмиссия практически не зависела от модификации 7пО дифосфатом бетулина в композиции. Эмиссия в стеклянных флаконах не показала существенных различий в анализируемых гелях.

Полученные результаты по тестированию предлагаемых гелей на присутствие 7пО и влияния их модификации терпенами можно объяснить, что терпены, в особенности ДФБ, способны экранировать 7пО и сдвигать полосу эмиссии в сторону голубой флуоресценции. Можно предположить, что терпены являются своеобразным экраном - защитой («биомолекулярной короной») от внешнего воздействия, но при этом способность генерировать АФК должна уменьшаться.

Рисунок 3.21. Иллюстрация воздействия излучения на гели при длине волны 254 и 365 нм в стеклянных флаконах (верхний ряд) и кварцевых кюветах

(средний и нижний ряд)

Реологические свойства оценивали по зависимости структурной вязкости от скорости вращения шпинделя (рисунок 3.22). Тиксотропные характеристики разработанных олеофильных и гидрофильных гелеобразных дисперсий при 25°С подчеркивали записанные прямые и обратные реограммы.

Скорость шпинделя, об/мин Скорость шпинделя, об/мин

а) б)

Рисунок 3.22. Структурная вязкость как функция скорости вращения

шпинделя для а) олеофильных и б) гидрофильный гелеобразные дисперсии.

Значения площадей под кривыми структурной вязкости при увеличении скорости вращения шпинделя и возвращении в исходное состояние показали, что тиксотропия олеофильных дисперсий (площадь петель равна 79470) существенно меньше гидрофильных (площадь петель равна 359480).

Можно предположить, что по реологическим свойствам исследуемые гелеобразные олеофильные дисперсии будут более удобными лекарственными формами, чем гидрогель при лечении ожогов на II стадии развития ожоговой болезни.

Биологическую активность предлагаемого геля при лечении олеогелями глубоких ожогов II степени, изучали на крысах с использованием гистологических исследований, доплеровской флуометрии и оценки активности ферментов и уровня малонового диальдегида (МДА) см. главу 5. После действия

олеогелей площадь ожоговой раны и некроза уменьшилась в два раза на 10-е сутки по сравнению с 1-м днем после ожога. Показатель микроциркуляции в околораневой зоне на 20-30% улучшился по сравнению с группой без лечения. Оценка активности ферментов и уровня МДА после обработки олеогелями в течение 10 дней показала их нормализацию. Улучшение антиоксидантных биохимических показателей, а также заживление ран в основном определялось воздействием наночастиц оксида цинка.

Таким образом, данные результатов по флуоресценции, размеру частиц и адсорбции тритерпеноидов продемонстрировали лучшие функциональные свойства дифосфата бетулина по отношению к наночастицам оксида цинка. Следовательно, фосфорильная группа ДФБ может выступать как «якорная» группа, способствующая прививки этой молекулы на 7пО МРб и может способствовать их большей агрегативной устойчивости в различных фармацевтических композициях и меньшей токсичности в биологических средах.

ГЛАВА 4. СТАНДАРТИЗАЦИЯ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЦИНКА

Стандартизацию потенциальной фармацевтической субстанции -наночастиц оксида цинка (7пО МРб) проводили, используя методики установления качества по показателям «Подлинность», «Количественное определение», содержания примесей, с Руководством по использованию оценок повторяемости, воспроизводимости и правильности при оценке неопределенности измерений.

4.1. Методики установления подлинности наночастиц оксида цинка

В ходе проведённых исследований, изложенных в разделе 3.1. показано, что ПРФА, Фурье ИК-, УФ-спектральные методы анализа, позволяют провести идентификацию 7пО МРб. Свойства спектров сравнивались со стандартным образцом 7пО МРб (СОгпО ^Х который был получен по традиционному «золь-гель» методу.

Гексагональную структуру вюрцита образцов 7пО МРб определяли порошковым рентгенофазовым анализом. Полученные дифрактограммы образцов сравнивают с СОгпО 20 диапазоне 5-50° с шагом 0,026° со скоростью сканирования 0,067335 (°/с).

Фурье ИК-спектры для 7пО МРб получали в таблетках КБг, в диапозоне 400-4000 см-1; Ду ±0,1 см-1. ИК-спектр исследуемого образца должен совпадать со спектром СОгпО №8. Совпадение спектров анализируемого и стандартного образцов должно наблюдаться в области «отпечатков пальцев» (450-470 см-1).

Специфичность Фурье ИК-спектров 7пО МРб доказана сравнением со спектрами цинка ацетата, нитрата цинка - прекурсоров и примесей, в которых отсутствует полоса в области 450-470 см-1.

УФ-спектры получали для 7пО МРб, растворённого в спирте (27,2мг%). УФ-спектр исследуемого образца должен совпадать со спектром СОгпо №8, и иметь полосу поглощения в области 360±5 нм; АХ ±0,1 нм.

Специфичность УФ-спектров 7пО МРб доказана сравнением со спектрами цинка ацетата, нитрата цинка - прекурсоров и примесей, в которых полоса в области 350-370 нм отсутствует.

Реакция подлинности на ион цинка:

- образование белого осадка при реакции с 2% раствором натрия сульфида при нагревании;

- образование белого осадка с 5% раствором калия ферроцианида.

4.2. Количественное определение наночастиц оксида цинка

Количественное определение 7пО в субстанции 7пО МРб проводили методом атомно-адсорбционной спектроскопии (ААС), после растворения его в азотной кислоте, используя лампу полого катода Х = 213,9 нм в газовой среде воздух - ацетилен, 2,2 л^мин-1.

Установлено, что методика количественного определения 7пО МРб методом ААС является избирательной и селективной. Калибровочный график (уравнение АЬб= у = 0.4829Сгп - 0,0018 , где [Сгп] = мг/л приведен на рисунке 4.1. Предел обнаружения - 0,01 мг/мл; предел количественного определения - 0,03 мг/мл (рисунок 4.1).

Рисунок 4.1. Зависимость

поглощения от концентрации цинка (ААС).

Правильность методики подтверждали метoдoм «введенo-найденo». Отношение количества введенного ZnO к найденному (Хср) в %

соответствовало 100,5%, что говорит о правильности методики.

Методика удовлетворяет требованиям по сходимости для ZnO NPs, o чём свидетельствуют критерии приемлемости RSD%=1,89% (Таблица 4.1).

Таблица 4.1.

Результаты количественного определения оксида цинка в субстанции ZnO NPs по методу «введено-найдено»

Введено, мг Найденс ZnO ОТб, мг Выход, % Метрологические характеристики

Субстанция ZnO ZnO

25 22,73 22,82 100,40 Хср=100,5 SD=1,90 RSD=1,89%

25 22,73 22,55 99,20

25 22,73 22,64 99,60

50 45,45 44,55 98,00

50 45,45 45,64 100,40

50 45,45 47,27 104,00

75 68,18 70,00 102,67

75 68,18 67,45 98,93

75 68,18 69,09 101,33

4.3. Методики определения примесей наночастиц оксида цинка

Основными примесями в субстанции 7пО МРб являются металлы: кальций, железо, литий, натрий и кремний. Их содержание определяли методом 1СР (не более 20 ррт Са, Fe; не более 1ррт Ы).

По результатам исследований разработан проект фармакопейной статьи «нанонастицы оксида цинка» (Приложение 5).

ГЛАВА 5. Результаты собственных исследованй. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА, ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ

ДИФОСФАТОМ БЕТУЛИНА

Можно предположить, что сочетание тритерпеноидов (тканерепаратов) с наночастицами оксида цинка с высокой проницаемостью через ткани кожи обеспечивает синергизм местного действия. Ионы цинка влияют на обмен веществ, гомеостаз, иммунную систему и антиоксидантную ферментативную защиту, усиливают ранозаживляющее действие. Поэтому комбинированное действие компонентов предлагаемых лекарственных форм (глава 3) на системном уровне в организме человека местно может обеспечить высокую эффективность лечения глубоких ожоговых ран.

5.1. Характеристики состояния здоровья животных

После ожога в течение первых трех суток поведение животных было спокойным, а затем, до 9 суток, животные проявляли беспокойство, свидетельствующее о боли. На 10-е сутки при смене повязок поведение животных было спокойным. Заживление ран исследовали с использованием олео-, гидрогелей и нанокомпозиций на основе БЦ на 0, 10 и 21 сутки (таблица 5.1, рисунок 5.1).

Таблица 5.1.

Изменение площади раны при лечении олео-, гидрогелями и нанокомпозитами на основе БЦ, п = 3, р <0,001.

Группа Площадь раны, см2

0 день 10 день 21 день

Ожог без лечения 21,746 ± 0,612 20,127 ±0,230 16,184 ±0,971

Олеогель 2пО КРб-ДФБ -тимол-лавандовое масло 22,620 ± 0,199 18,384 ± 1,321 10,028 ± 0,224

Гидрогель 2пО КРб-ДФБ -лавандовое масло 21,459 ± 0,231 18,058 ± 0,391 10,818 ± 0,973

БЦ-2пО КРб-ДФБ (пленка) 21,846 ± 0,679 19,897 ± 0,313 9,457 ± 0,313

а)

б)

в)

О день (Олеогель ХпО КРв-ДФБ 0 сутки (Гидрогель ХпО КРв- 0 сутки (БЦ-2пО ЫРз-ДФБ - тимол-лавандовое масло) ДФБ - лавандовое масло) (пленка))

10

день (Олеогель ZnO ОТб-ДФБ -тимол-лавандовое масло)

10 сутки (Гидрогель ZnO NPs-ДФБ - лавандовое масло)

10 сутки (БЦ-ZnO NPs-ДФБ (пленка))

21 сутки (БЦ-ZnO NPs-ДФБ (пленка))

21 день (Олеогель ХпО КРв- 21 сутки (Гидрогель ХпО

ДФБ - тимол-лавандовое NPs-ДФБ - лавандовое

масло) масло) Рисунок 5.1. Лечение ожоговой болезни а) Олеогелем ZnO №б-ДФБ -

тимол-лавандовое масло; б) Гидрогелем ZnO №б-ДФБ - лавандовое масло; в) БЦ-ZnO NPs-ДФБ (пленка)

Таким образом, заживление ран у крыс было более успешным при лечении олеогелем. Однако при лечении олеогелем кожный покров крыс выглядел воспалённым по сравнению с гидрогелем и нанокомпозитом БЦ.

5.2. Оценка энергетического обмена по активности оксидоредуктаз -лактатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при лечении

ожоговых ран

Активность ферментов под действием олео-, гидрогелей и нанокомпозитов БЦ изучали на 3, 7, 10 и 21 сутки (таблица 5.2).

Усиление энергетического обмена под действием исследуемых лекарственных форм в ожоговой ране происходит за счет активации глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) - одного из ключевых ферментов пентозофосфатного пути.

Таблица 5.2.

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при лечении олео-, гидрогелем и нанокомпозитами на основе БЦ (% от контроля), п = 3, р <0,001.

т, день

Активность Г-6-ФДГ,% от контроля 1

Ожог

Олеогель ZnO №-ДФБ -тимол-масло лаванды

Гидрогель ZnO

№-ДФБ -масло лаванды

БЦ^пО ДФБ

79,52 ± 2,17

100,93 ± 3,51

146,01 ± 1,68

92,64±5,12

90,14 ± 1,57

117,72 ± 1,96

152,80 ± 2,86

112,77±5,88

10

104,02 ± 1,92

128,02 ± 3,37

165,21 ± 3,63

118,94±4,48

21

Нет данных

138,12 ± 3,60

187,48 ± 4,22

159,52±7,80

100% - 29,024 ± 0,761 нмоль НАДФН мин - 1 мг белка

3

7

1

1

На 21-е сутки наблюдалось повышение уровня Г-6-ФДГ по сравнению с контролем на 38-87% (таблица 5.2). Важной функцией фермента является образование клеточного НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) из

НАДФ+, который необходим для поддержания уровня восстановленного глутатиона в клетке, синтеза жирных кислот и изопреноидов.

В ожоговой ране при нарушении микроциркуляции крови в эритроцитах и тканях не хватает кислорода. Альтернативный путь синтеза АТФ из глюкозы -образование лактата по механизму неэффективного анаэробного гликолиза с участием лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Исследования показали, что удельная активность ЛДГ в прямой и обратной реакциях снижается после ожога без лечения на 3-й и 7-й дни и незначительно увеличивается на 10-е дни (на 2-34%). При обработке олеогелеподобными дисперсиями и нанокомпозициями на основе БЦ увеличение активности ЛДГ в прямой и обратной реакциях составляло 20-40% в течение курса лечения. В отличие от олеогелей при обработке гидрофильными препаратами активность ЛДГ в обратной реакции значительно возрастала (на 72% на 3-й день и на 53% на 7-й день). На 10 и 21 день уровень ЛДГ в обратной реакции вернулся к норме, в то время как в прямой реакции активность ЛДГ увеличилась на 18-34% (таблица 5.3).

Таблица 5.3.

Активность лактатдегидрогеназы в прямой и обратной реакциях при

лечении изучаемыми препаратами (% от контроля), п = 3, р <0,001.

Фермент т, день Активность ЛДГ,% от контроля 1

Ожог Олеогель ZnO ДФБ -тимол-масло лаванды Гидрогель ZnO ДФБ - масло лаванды БЦ^пО №-ДФБ

ЛДГпрямая 3 73,25 ± 1,61 89,15 ± 0,98 107,49 ± 2,31 96,21±4,40

7 101,32 ± 0,82 115,06 ± 3,18 118,39 ± 0,60 110,67±1,40

10 134,14 ± 1,58 141,43 ± 1,44 125,08 ± 2,11 126,26±1,73

21 Нет данных 120,93 ± 1,62 134,28 ± 0,61 138,25±2,31

ЛДГобратная 3 87,23 ± 0,92 150,59 ± 2,03 172,10 ± 1,83 110,05±5,99

7 92,38 ± 1,96 120,19 ± 1,85 153,72 ± 0,29 105,82±2,36

10 102,01 ± 1,36 125,82 ± 0,45 107,42 ± 1,99 108,28±3,55

21 Нет данных 127,18 ± 2,27 100,93 ± 0,82 123,71±3,79

1ЛДГпрямая 100% - 20,215 ± 0,482 нмоль NAPH мин- 1мг белка - 1; ЛДГобратная 100% -124,173 ± 3,892 нмоль NAPH мин -1 мг белка - 1

Активность глутатионредуктазы (ГР) увеличивалась под действием исследуемых препаратов (таблица 5.4). Это было связано с регуляцией коферментов НАДФ+/НАДФН и восстановлением глутатиона.

Таблица 5.4.

Активность глутатионредуктазы при лечении изучаемыми препаратами (% от контроля), п = 3, р <0,001.

т, День ГР активность,% от контроля 1

Ожог Олеогель ZnO NPs- Гидрогель ZnO БЦ-ZnO

ДФБ - тимол-масло ^8-ДФБ - масло ДФБ

лаванды лаванды

3 58,23 ± 0,94 80,73 ± 1,80 101,23 ± 5,25 110,35±6,26

7 67,05 ± 0,58 87,04 ± 5,71 104,09 ± 2,65 90,53±2,89

10 73,77 ± 1,43 91,62 ± 3,03 106,38 ± 1,02 99,45±1,45

21 - 120,27 ± 2,95 121,87 ± 3,01 115,36±2,17

1 100% - 95,833 ± 2,324 нмоль НАДФН мин- 1 мг белка - 1.

5.3. Анализ уровня малонового диальдегида

Маркерами развития окислительного стресса в результате окислительно -восстановительного дисбаланса являются уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и эритроцитах (таблица 5.5).

Таблица 5.5.

Уровень МДА в плазме и эритроцитах крови (мкмоль / л) при лечении изучаемыми препаратами (% от контроля), п = 3, р <0,001.

Индекс т, день Уровень МДА,% от контроля

Ожог Олеогель ZnO NPs-ДФБ -тимол-масло лаванды Гидрогель ZnO NPs-ДФБ - масло лаванды БЦ-ZnO NPs-ДФБ

MDApl 3 240,32 ± 6,22 231,34 ± 3,72 169,82 ± 2,99 200,04±3,08

7 180,48 ± 3,83 152,21 ± 8,60 143,73 ± 3,92 148,53±4,16

10 150,62 ± 4,09 124,83 ± 5,34 121,82 ± 7,28 125,16±4,31

21 Нет данных 112,04 ± 5,22 85,48 ± 5,27 83,78±6,21

MDAer 3 152,62 ± 5,38 153,81 ± 4,94 126,13 ± 8,17 120,54±5,62

7 147,24 ± 4,24 122,25 ± 6,37 113,67 ± 7,51 112,34±4,36

10 140,72 ± 8,12 103,78 ± 4,32 96,14 ± 8,11 95,43±3,83

21 Нет данных 86,42 ± 4,92 84,66 ± 4,57 84,27±4,42

Полученные нами результаты показали, что обработка ожоговой раны исследуемыми лекарственными формами снижает уровень МДА, который характеризует окислительный стресс.

5.4. Уровень антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза)

Проявление антиоксидантных свойств исследуемых препаратов изучали по ферментам супероксиддисмутазе (СОД) и каталазе. Данные, представленные в таблицах 5.6 и 5.7, говорят о повышении активности СОД и каталазы.

Таблица 5.6.

Активность СОД при лечении изучаемыми препаратами (% от контроля), п = 3, р <0,001.

т, день Активность СС Д,% от контроля 1

Ожог Олеогель ZnO NPs-ДФБ - тимол-масло лаванды Гидрогель ZnO NPs-ДФБ - масло лаванды БЦ-ZnO NPs-ДФБ

3 61,54 ± 0,82 83,63 ± 3,61 102,26 ± 6,20 108,37±2,81

7 48,27 ± 0,62 102,24 ± 4,61 121,73 ± 7,72 128,16±3,22

10 54,21 ± 2,01 107,71 ± 1,73 123,28 ± 2,67 125,14±1,66

21 - 113,24 ± 5,26 126,91 ± 7,19 126,64±2,24

1 100% - 1048,419 ± 16,820% инг мин- 1 мг белка - 1.

Таблица 5.7.

Активность каталазы при лечении изучаемыми препаратами (% от контроля), п = 3, р <0,001.

т, Активность каталазы,% от контроля1

День Ожог Олеогель ZnO Гидрогель БЦ-ZnO

NPs-ДФБ - ZnO NPs-ДФБ NPs-ДФБ

тимол-масло - масло

лаванды лаванды

3 43,82 ± 3,10 52,92 ± 2,87 56,28 ± 2,82 53,11±1,81

7 52,37 ± 0,82 61,78 ± 3,16 75,60 ± 7,28 86,71±3,84

10 61,72 ± 1,78 83,48 ± 3,72 92,03 ± 4,82 93,41±0,98

21 год - 118,34 ± 2,02 120,82 ± 5,22 121,42±3,02

100% - 42,712 ± 0,822 цмол Н2О2 мин - 1 мг белка

1

Об улучшении антиоксидантных свойств также свидетельствует увеличение удельной активности АЛДГ по сравнению с обожженными животными без лечения в течение начального периода лечения. Снижение окислительного стресса и уровня МДА подтверждается возвращением к нормальному уровню АЛДГ на 21 день лечения (Таблица 5.8).

Таблица 5.8.

Активность альдегиддегидрогеназы при лечении изучаемыми препаратами (% от контроля), п = 3, р <0,001.

100% -

т, Активность АЛДГ,% от контроля 1

день Ожог Олеогель ZnO Гидрогель БЦ-ZnO

№-ДФБ - ZnO NPs-ДФБ

тимол-масло - масло

лаванды лаванды

3 51,21 ± 0,88 146,56 ± 2,92 149,82 ± 4,62 146,88±2,44

7 50,76 ± 2,82 142,53 ± 6,82 132,48 ± 4,51 279,21±1,80

10 56,37 ± 2,37 134,82 ± 3,37 121,32 ± 6,70 115,00±4,62

21 106,82 ± 5,40 95,06 ± 2,42 94,53±0,97

23,518 ± 0,769 нмоль :!АД+ мин 1 мг белка 1.

1

Таким образом, полученные данные подтверждают, что в условиях гипоксии при термическом повреждении изменяется соотношение концентраций в парах НАДФ+/НАДФН (Г-6-ФДГ, ГР) и НАД+/НАДН (ЛДГ, АЛДГ), которые, в свою очередь, являются важным клеточным окислительно-восстановительным буфером.

Усиление ранозаживляющего эффекта и улучшение биохимических показателей крови при лечении ожоговых ран исследуемыми препаратами, вероятно, связано с комплексным синергетическим действием тритерпеноидов и компонентов масла лаванды и тимьяна в сочетании с наночастицами оксида цинка.

Влияние ZnO NPs, временно и умеренно способствующих образованию активных форм кислорода, на антиоксидантные свойства исследуемых дисперсий неоднозначно. Так, умеренная и временная генерация активных форм кислорода (АФК) способствует уменьшению площади поврежденной кожи при ожогах, ускоряет заживление ран и даже стимулирует рост волос. Возможно, вклад активации генерации АФК положительно сказывается под действием исследуемых препаратов ZnO NPs.

Действие ионов цинка, генерируемых ZnO NPs и не изменяющих степень окисления в оксидоредуктазах (ЛДГ, СОД и др.), позволяет рассматривать их как «непрямой» антиоксидант - модификатор биологических окислительно-восстановительных реакций. Значительное влияние наночастиц оксида цинка на активность СОД можно частично объяснить активацией иона цинка в CuZn-СОД, который имеет чрезвычайно высокую стабильность и высокую активность дисмутации супероксида. С другой стороны, антиоксидантный эффект цинка в основном обусловлен его способностью вызывать стрессовую реакцию с точки зрения 1) стимуляции MTF-1-зависимой транскрипции и 2) активации стресс-чувствительных сигнальных каскадов MAPK и PI3K / Akt. Кроме того, антиоксидантный эффект цинка связан со стабилизацией тиолов белков (ферментов, цинковых пальцев, металлотионеинов) [152].

АЛДГ - это фермент, который катализирует окисление широкого ряда эндогенных и экзогенных альдегидов до соответствующих им карбоновых кислот; он также способствует борьбе с синдромом эндогенной интоксикации [153, 154]. В частности, фермент утилизирует альдегиды, образующиеся при ПОЛ, тем самым уменьшая эффекты гипоксии. Каталитические реакции АЛДГ производят огромное количество цитозольного НАДН в качестве источника производства АТФ и играют роль в образовании уксусной кислоты из ацетальдегида во время гликолиза и глюконеогенеза, а также в метаболизме аминокислот, экзогенных химических веществ через цитохром P450 и липидов. пероксидазный продукт. Можно отметить антиоксидантное действие альдегиддегидрогеназы в отношении продуктов свободнорадикального окисления.

Наши результаты о повышении активности ГР, приводящем к увеличению глутатиона и одновременному снижению уровня МДА под влиянием НЧ 7пО, хорошо согласуются с данными, полученными авторами [155].

В целом, сравнивая активность ферментов СОД, каталазы, ГР, Г-6-ФДГ и ЛДГ при лечении ожогов у крыс, можно отметить лучшую нормализацию окислительно-восстановительного баланса пар коферментов N^0+/ NADH и КЛ0Р+/ NADPH под действием нанокомпозитов на основе БЦ (БЦ-7пО ЫРб-ДФБ) по сравнению с олео- и гидрогелями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённых исследований получены потенциальные активные фармацевтические субстанции наночастиц оксида цинка 7пО и наночастицы, с иммобилизованным дифосфатом бетулина 7пО NPs-ДФБ, и изучены их физико-химические и биологические свойства.

ВЫВОДЫ

1. Разработан простой и экономичный метод синтеза 7пО ИРб, используя в качестве прекурсоров ацетат цинка и гидроксид лития в среде этанола с введением ПЭГ-400 на первой стадии, и цетилового спирта - на второй. Частицы 7пО ИРб имели гексагональную структуру вюрцита со средним размером кристаллитов 10-14 нм, удельную поверхность, равную 67,9 м2/г. Свойства 7пО ИРб подтверждены данными Фурье ИК-, УФ-, флуоресцентных спектров, а также СЭМ.

2. Изучена иммобилизация бетулина и его производных - бетулоновой кислоты, диацетата бетулина и дифосфата бетулина, на поверхности наночастиц оксида цинка путём сорбции из этанольного раствора. Включение тритерпеноидов в поверхностный слой 7пО ИРб доказано данными ИК-спектров и ВЭЖ- хроматограмм. Сорбция терпенов изменялась в ряду: Гдифосфата бетулина >

Гбетулоновой кислоты > Гбетулина ~ Гдиацетата бетулина, при Этом максимальная величина Г для

ДФБ соответствовала 100 мкг/г.

3. Методами измерения дзета-потенциала и лазерного динамического светорассеяния показано, что сорбция дифосфата бетулина в поверхностный слой 7пО ИРб приводит к необходимой отрицательной величине дзета-потенциала (до -41 мВ) и обеспечивает большой гидродинамический радиус частицы (3500-4500 нм), способствующие агрегативной устойчивости частиц.

4. Разработан синтез наночастиц оксида цинка в матрице бактериальной целлюлозы, содержащей ДФБ используя в качестве прекурсоров нитрат цинка и

три-(оксиметил)-аминометан. Физико-химические свойства нанокомпозитов изучены методами Фурье ИК-, УФ-, флуоресцентной, атомно-абсорбционной спектроскопией. Структура и размер кристаллитов (10-14 нм) доказан ПРФА.

5. Предложен состав противоожоговых олео- и гидрогелей бетулина и 7пО МРб с иммобилизованным ДФБ, изучены их реологические свойства. Показано, что петля гистерезиса на кривых «сжатия-растяжения» меньше в гидрогелях.

6. Разработаны методики для идентификации и количественного определения наночастиц оксида цинка, модифицированных дифосфатом бетулина. Для идентификации предложен метод ПРФА, Фурье ИК-, УФ, флуоресцентной спектроскопии. Количественное определение 7пО ЫРб проведено методом ААС. Разработана методика ВЭЖХ для идентификации и количественного определения ДФБ. Проведена стандартизация 7пО МРб как потенциальной фармацевтической субстанции и разработан проект фармакопейной статьи.

7. Исследована биологическая активность лекарственных средств (олео-, гидрогелях и композиционных материалах бактериальной целлюлозы), содержащих наночастицы оксида цинка. Установлено существенное влияние наночастиц цинка на активацию ферментов антиоксидантной защиты, агрегацию тромбоцитов, играющих важную роль при заживлении ожоговых ран.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Vallee, B.L. The biochemical basis of zinc physiology / B.L. Vallee, K.H. Falchuk // Physiol Rev. - 1993. - V. 73, № 1. - P. 79-118.

2. Beyersmann, D. Functions of zinc in signaling, proliferation and differentiation of mammalian cells / D. Beyersmann, H. Haase // Biometals. - 2001. - № 14. - P. 331341.

3. Vallee, B. L. Metallothionein: historical review and perspectives / B. L. Vallee // Metallothionein. 1979. - № 8. - P. 19-40.

4. Colvin, R.A. Cytosolic zinc buffering and muffling: their role in intracellular zinc homeostasis / R.A. Colvin, W.R. Holmes, C.P. Fontaine, W. Maret // Metallomics. 2010. - № 2. - P. 306-317.

5. Krezel, A. The biological inorganic chemistry of zinc ions / A. Krezel, W. Maret - D0I:10.1016/j.abb.2016.04 // Arch. Biochem. Biophys. - 2016. - P. 1-16. -URL: https://www.researchgate.net/publication/301678306 (дата обращения: 21.11.2019).

6. Thomas, R. C. Homeostatic muffling / R. C. Thomas, J. A. Coles, J. W. Deitmer // Nature. - 1991. - P. 564-564.

7. Vasak, M. Mammalian metallothionein-3: New functional and structural insights /M. Vasak, G. Meloni // Int. J. Mol. Sci. - 2017. - № 18. - Р. 1-11.

8. Sutherland, D.E. The «magic numbers» of metallothionein / D.E. Sutherland, M.J. Stillman // Metallomics Integr. Biomet. Sci. - 2011. - № 3. - P. 444-463.

9. Kimura, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective / T. Kimura, T. Kambe // Int. J. Mol. Sci. - 2016. - № 17. - Р. 1-22.

10. Fukada, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis / T. Fukada, T. Kambe // Metallomics Integr. Biomet. Sci. - 2011. -№ 3. - P. 662-674.

11. Zinc Signals in Cellular Functions and Disorders // T. T. Fukada, Fukada, T. Kambe. // Springer: Tokyo, Japan. 2014. - Р. 343.

12. Vallee, B.L. The metallobiochemistry of zinc enzymes / B.L. Vallee, A. Galdes //Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. - 1984. - № 56. - P. 283-430.

13. McCall, K.A. Function and mechanism of zinc metalloenzymes / K.A. McCall, C. Huang, C.A. Fierke // J Nutr. - 2000. - № 130(5). - P. 1437-1446.

14. Соколова Т.Н., Мацулевич Ж.В. Калинина А.А. Бионеорганическая химия. Металлы жизни: учеб. пособие / Т.Н. Соколова, Ж.В. Мацулевич, А.А. Калинина; Нижегород. гос. техн. ун-т им. Р.Е. Алексеева. - Нижний Новгород, 2019. - 168 с.

15. Andreini, C. Zinc through the three domains of life / C. Andreini, L. Banci, I. Bertini, A. Rosato // J Proteome Res. - 2006. - № 5. - P. 3173-3178.

16. Andreini, C. A bioinformatics view of zinc enzymes / C. Andreini, I. Bertini // J. Inorg. Biochem. - 2012. - № 111. - P. 150-156.

17. Haase, H. Functional significance of zinc-related signaling pathways in immune cells / H. Haase, L. Rink // Annu Rev Nutr. - 2009. - № 29. - P. 133-152.

18. Wessels, I. Zinc dyshomeostasis during polymicrobial sepsis in mice involves zinc transporter ZIP14 and can be overcome by zinc supplementation / I.Wessels, R.J. Cousins // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 2015. № 309. - P. 768-778.

19. Wessels, I. Zinc deficiency induces production of the proinflammatory cytokines IL-1 and TNFA in promyeloid cells via epigenetic and redox-dependent mechanisms / I. Wessels, H. Haase, G. Engelhardt, L. Rink, P. Uciechowski // J. Nutr. Biochem. - 2013. - № 24. - P. 289-297.

20. Powell, S. R. The antioxidant properties of zinc / S.R. Powell // The Journal of Nutrition. - 2000. - 130(5). - P. 1447-1454.

21. Klotz, L. O. Role of copper, zinc, selenium and tellurium in the cellular defense against oxidative and nitrosative stress / L. O. Klotz, K. D. Kroncke, D. Buchczyk, H. Sies // The Journal of Nutrition. - 2003. - № 45. - P. 1448-1451.

22. Agrawal, P. Association of macrovascular complications of type 2 diabetes mellitus with serum magnesium levels / P. Agrawal, S. Arora, B. Singh, A. Manamalli, P.B. Dolia // Diabetes Metab Syndr Clin Res Rev. - 2011. - № 5. - P. 41-44.

23. Zhang, Z. Y. Photoluminescent ZnO nanoparticles and their biological applications / Z. Y. Zhang, H. M. Xiong // Materials. - 2015. - V. 8, № 6, P 31013127.

24. Shi, L. E.. Synthesis, antibacterial activity, antibacterial mechanism and food applications of ZnO nanoparticles: a review / L. E. Shi, Z. H. Li, W. Zheng, Y. F. Zhao, Y. F. Jin, and Z. X. Tang // Food Additives and Contaminants: Part A. - 2014. - V. 31, № 2. - P. 173-186, 2014.

25. Jiang, Y. Role of physical and chemical interactions in the antibacterial behavior of ZnO nanoparticles against E. coli / Y. Jiang, L. Zhang, D. Wen, and Y. Ding // Materials Science and Engineering: C. - 2016. - V. 69. - P. 1361-1366.

26. Mishra, M.H. Zinc oxide nanoparticles: a promising nanomaterial for biomedical applications / M.N. Mishra, A. Ekielski, S. Talegaonkar, V. Bhuvaneshwar // Drug Discovery Today. 2017. 22. 12. - P. 1825-1834.

27. Ao, W. Mechanochemical synthesis of zinc oxide nanocrystalline / W. Ao, J. Li, H. Yang, X. Zeng // Powder Technology. - 2006. - V. 168. - P. 148-151.

28. Stankovic, A. Controlled mechanochemically assisted synthesis of ZnO nanopowders in the presence of oxalic acid / Stankovic A., Veselinovic L.J., Skapin S.D., Markovic S., Uskokovic D // Journal of Material Science. - 2011. - V. 46, № 11. - P. 3716-3724.

29. Tsuzuki, T. ZnO nanoparticles synthesis by mechanochemical processing / T. Tsuzuki, P.G McCormick // Scripta Materialia - 2001. - V. 44, № 8. - P. 1731-1734.

30. Moballegh, A. ZnO nanoparticles obtained by mechanochemical technique and optical properties / A. Moballegh, H.R. Shahverdi, R. Aghababazadeh, A.R Mirhabibi // Surface Science. - 2007. - V. 601. - P. 2850-2854.

31. Aghababazadeh, R. ZnO nanoparticles by mechanochemical processing / R. Aghababazadeh, B. Mazinani, A. Mirhabibi, M. Tamizifar // Journal of Physics and Chemistry of Solids. - 2006. - V. 26, № 1. - P. 312-314.

32. Kolodziejczak-Radzimska, A. Obtaining zinc oxide from aqueous solutions of KOH and Zn(CH3COO)2 / A. Kolodziejczak-Radzimska, T. Jesionowski, A.

Krysztafkiewicz // Physicochemical Problems of Mineral Processing. - 2010. - V. 44.

- P. 93-102.

33. Lanje, A.S. Low temperature dielectric studies of zinc oxide (ZnO) nanoparticles prepared by precipitation method / A.S. Lanje, S.J. Sharma, R.S. Ningthoujam, J.S. Ahn, R.B. Pode // Advanced Powder Technology. - 2013. - V. 24, № 1. - P. 331-335.

34. Wang, Y. Preparation of ZnO nanoparticles using the direct precipitation method in a membrane dispersion micro-structured reactor / Y. Wang, C. Zhang, S. Bi, G. Luo // Powder Technology. - 2010. - V. 202. - P. 130-136.

35. Jia, W. Evidence of the formation mechanism of ZnO in aqueous solution / W. Jia, S. Dang, H. Liu, Z. Zhang, Ch. Yu, X. Liu, B. Xu // Material Letters. - 2012. -V. 82. - P. 99-101.

36. Cao, Z. Synthesis and UV shielding properties of zinc oxide ultrafine particles modified with silica and trimethyl siloxane / Z. Cao, Z. Zhang, F. Wang, G. Wang // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. - 2009. - V. 340.

- P. 161-167.

37. Khoshhesab, Z.M. Influence of urea on precipitation of zinc oxide nanostructures through chemical precipitation in ammonium hydrogencarbonate solution / Z.M. Khoshhesab, M. Sarfaraz, Z. Houshyar // Synthesis and Reactivity in Inorganic, Metal Organic and Nano Metal Chemistry. - 2012. - V. 42, № 10. - P. 13631368.

38. Kumra, K.M. Synthesis and characterization of flower shaped zinc oxide nanostructures and its antimicrobial activity / K.M. Kumra, B.K Mandal., E.A. Naidu, M. Sinha, K.S. Kumar, P.S. Reddy // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. - 2013. - V. 104. - P. 171-174.

39. Wang, Y. Preparation of nanocrystalline metal oxide powders with the surfactant-mediated method / Y. Wang, C. Ma, X. Sun, H. Li // Inorganic Chemistry Communications. - 2002. - V. 5. - P. 751-755.

40. Li P. Growth of well-defined ZnO microparticles with additives from aqueous solution / Li P., Wei Y., Liu H., Wang X.K // Journal Solid State Chemistry. 2005. Vol. 178. P. 855-860.

41. Mahato, T.H. Nanocrystalline zinc oxide for the decontamination of sarin / T.H. Mahato, G.K. Prasad, B.S.J. Acharya, A.R. Srivastava, R. Vijayaraghavan // Journal of Hazardous Materials. - 2009. - V. 165. - P. 928-932.

42. Benhebal, H. Photocatalytic degradation of phenol and benzoic acid using zinc oxide powders prepared by sol-gel process / H. Benhebal, M. Chaib, T. Salomon, J. Geens, A. Leonard, S.D. Lambert, М. Crine, B. Heinrichs // Alexandria Engineering Journal. - 2013. - V. 52. - P. 517-523.

43. Ristic, M. Sol-gel synthesis and characterization of nanocrystalline ZnO powders / M. Ristic, S. Music, M. Ivanda, S. Popovic // Journal of Alloys and Compounds. - 2005. - V. 39. - Р. 1-4.

44. Yue, S. Synthesis of zinc oxide nanotubes within ultrathin anodic aluminum oxide membrane by sol-gel method / S. Yue, Z. Yan, Y. Shi, G. Ran // Material Letters. -2013. - V. 98. - P. 246-249.

45. Ristic, M. Sol-gel synthesis and characterization of nanocrystalline ZnO powders / M. Ristic, S. Music, M. Ivanda, S. Popovic -D0I:10.1016/j.jallcom.2005.01.045 // Journal of Alloys and Compounds. - 2005. - V. 39. - Р. 1-4. - URL:https://www.researchgate.net/publication/222276970 (дата обращения: 08.03.2020).

46. Sharma, A. Effect of surface groups on the luminescence property of ZnO nanoparticles synthesized by sol-gel route. / A. Sharma, B.P. Singh, S. Dhar, A. Gondorf, M. Spasova // Elsevier. - 2011. - Р. 13-17.

47. Kolodziejczak-Radzimska A., Jesionowski T. Zinc oxide - from synthesis to application: a review // Materials. 2014. Vol. 7. P. 2833-2881.

48. Блинов, А.В. Влияние температурной обработки на структуру и состав наноразмерного ZnO, полученного золь-гель методом / А.В. Блинов, А.А. Кравцов, М.А. Ясная, А.Ю. Русанов, Е.В. Момот // Физико-химические аспекты

изучения кластеров, наноструктур и наноматериалов. - 2015. - Вып. 7. - С.123-129.

49. Oliva, J. Effect of TEA on the blue emission of ZnO quantum dots with high quantum yield / J. Oliva, L. Diaz-Torres, A. Torres-Castro, P. Salas, L. Perez-Mayen and E. De la Rosa // Optical Materials express. - 2015. - V. 5. - №. 5. - Р. 1-14.

50. Wenzhong, Sh. Photocatalytic degradation for methylene blue using zinc oxide prepared by codeposition and sol-gel methods / Sh. Wenzhong, L. Zhijie, W. Hui, L. Yihong, G. Qingjie, Z. Yuanli // Journal of Hazardous Materials. - 2008. - V. 152 -Р. 172-175.

51. Gutul, T. Preparation of poly(#-vinylpyrrolidone)-stabilized ZnO colloid nanoparticles / T. Gutul, E. Rusu, N. Condur, V. Ursaki, E. Goncearenco and P.Vlazan // Beilstein J. Nanotechnol. - 2014. - V. 5. - Р. 402-406.

52. Wessels, I. Zinc as a Gatekeeper of Immune Function. / I. Wessels, M. Maywald, L. ink // Nutrients. - 2017. - V. 9 - Р. 1-44.

53. Gupta, M. Zinc Therapy in Dermatology: A Review. / M. Gupta, V.K. Mahajan, K.S. Mehta, P.S. Chauhan // Dermatol. Res. Pract. - 2014. - V. 9. - Р. 1-11.

54. Jiang, J. The Advancing of Zinc Oxide Nanoparticles for Biomedical Applications. Bioinorg. / J. Jiang, J. Pi, J. Cai // Chem. Appl. - 2018. - V. 3. - Р. 1-18.

55. Siddiqi, K.S. Properties of Zinc Oxide Nanoparticles and Their Activity AGAINST Microbes. / K.S. Siddiqi, Ur. Rahman, A.Tajuddin, A. Husen // Nanoscale Res. Lett. - 2018. V. 13. - Р. 1-13.

56. Kang, M. Zinc mediated hepatic stellate cell collagen synthesis reduction through TGF-P signaling pathway inhibition. / M. Kang, L. Zhao, M. Ren, M. Deng and C. Li // International journal of clinical and experimental medicine. - 2015. - V. 8. - Р. 20463-20471.

57. Caldis-Coutris, N. Zinc supplementation in burn patients. / N. Caldis-Coutris, J.P. Gawaziuk, S. Logsetty - DOI: 10.1097/BCR.0b013e31824799a3 // J. Burn Care Res. - 2012. - V. 33. - Р. 678-682. - URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22245802 (дата обращения: 08.09.2020).

58. Mishra, P.K. Zinc oxide nanoparticles: A promising nanomaterial for biomedical applications. / P.K. Mishra, H.Mishra, A. Ekielski, S. Talegaonkar, B. Vaidya // Drug Discov. - 2017. - V. 22. - P. 1825-1834.

59. Mater, S. Synthesis and characterization of ZnO nanoflakes anchored carbon nanoplates for antioxidant and anticancer activity in MCF7 cell lines. / S. Mater, Eng C Mater // Biol Appl. - 2019. - V. 102. - P. 536-540.

60. Metwally, A.A. Wound healing properties of green (using Lawsonia inermis leaf extract) and chemically synthesized ZnO nanoparticles in albino rats. / A.A. Metwally, AN.A.A. Abdel-Hady, M.A.M. Haridy, K. Ebnalwaled , A.R.A Saied, A. S. Soliman // Environ Sci Pollut Res. - 2022. - № 29. - P. 23975-23987. https://doi.org/10.1007/s11356-021-17670-5.

61. Xuewei, Y. Zinc oxide nanoparticles ameliorate collagen lattice contraction in human tenon fibroblasts. / Y. Xuewei, L. Qin, W. Huixia, Ch. Ninghong, W. Shanshan, Y. Yue, L. Bin, Ch. Chen, B. Hongsheng, G. Dadong // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2019. - V. 669. - P. 1-10. https://doi:10.1016/j.abb.2019.05.016.

62. Rosa de Moura, F. B. Antioxidant, anti-inflammatory, and wound healing effects of topical silver-doped zinc oxide and silver oxide nanocomposites. / F. B. Rosa de Moura, B. A. Ferreira, E. H. Muniz, A. B. Justino, A. G. Silva, R. I. M. de Azambuja Ribeiro, N. O. Dantas, D. L. Ribeiro, A. Fernanda de Assis, F. S. Espindola, A.Ch. A. Silva, T. C. Tomiosso // International Journal of Pharmaceutics. - 2022. - №617. - P. 121-620. https : //doi. org/ 10.1016/j.ij pharm.

63. Lansdown, A.B.G. Zinc in wound healing: Theoretical, experimental, and clinical aspects. / A.B.G. Mirastschijski, U. Stubbs, N. Scanlon, E. Âgren // Wound Repair Regen. - 2007 - V. 15. - №1. - P. 2-16. https://doi.org/10.1111/j.1524-475X.2006.00179.x.

64. Khalid, A. Bacterial cellulose-zinc oxide nanocomposites as a novel dressing system for burn wounds / A. Khalid, R. Khan, M. Ul-Islam, T. Khan, F. Wahid // Carbohydrate Polymers. - 2017. - V. 164. P. 214-221.

65. Luo, Z. In situ Fabrication of Nano ZnO/BCM Biocomposite Based on MA Modified Bacterial Cellulose Membrane for Antibacterial and Wound Healing. / Z. Luo,

J. Liu, H. Lin, X. Ren, H. Tian, Y. Liang, W. Wang, Y. Wang, M. Yin, Y. Huang, J. Zhang // Nanomedicine. - 2020. - V. 15. - P. 1-15.

66. Dincä, V. Biocompatible pure ZnO nanoparticles-3D bacterial cellulose biointerfaces with antibacterial properties / V. Dincä, A. Mocanu, G. Isopencu, C. Busuioc, S. Brajnicov, A. Vlad, M. Icriverzi, A. Roseanu, M. Dinescu, M. Stroescu, A. Stoica-Guzun, M. Suchea // Arabian Journal of Chemistry. - 2020. - V. 13, № 1. - P. 3521-3533.

67. Pirsa, S. Smart films based on bacterial cellulose nanofibers modified by conductive polypyrrole and zinc oxide nanoparticles / S. Pirsa, T. Shamusi and E. M. Kia - DOI: 10.1002/app.46617 // Journal of Applied Polymer Science. - 2018. - V. 135. - P. 1-10. - URL: https://www.researchgate.net/publication/325125995.

68. Zheng, W. High photocatalytic properties of zinc oxide nanoparticles with amidoximated bacterial cellulose nanofibers as templates / W. Zheng, W. Hu, S. Chen, Y. Zheng, B. Zhou and H. Wang // Chinese Journal of Polymer Science. - 2014. - V. 32. - P. 169-176.

69. Mocanu, A. Bacterial cellulose films with ZnO nanoparticles and propolis extracts: Synergistic antimicrobial effect. / A. Mocanu, G. Isopencu, C. Busuioc, et al // Sci Rep. - 2019. - № 9. - P. 17687.

70. Katepetch, C. Formation of nanocrystalline ZnO particles into bacterial cellulose pellicle by ultrasonic-assisted in situ synthesis. / C. Katepetch, R. Rujiravanit, H. Tamura // Cellulose. - 2013. - № 20l. - P. 1275-1292.

71. Zhao, S-W. The preparation and antibacterial activity of cellulose/ZnO composite: a review. / S.-W. Zhao, Ch.-R. Guo, Y.-Zh. Hu, Y.-R. Guo, Q.-J. Pan. // Open Chem. - 2018. - № 16. - P. 9-20.

72. Wasim, M. Surface Modification of Bacterial Cellulose by Copper and Zinc Oxide Sputter Coating for UV-Resistance / M. Wasim, M.R. Khan, M. Mushtaq, A. Naeem, M. Han, Q. Wei // / Coatings. - 2020. - № 10. - P. 364.

73. Aritonang, H. F. Biotemplated synthesis of Ag-ZnO nanoparticles/bacterial cellulose nanocomposites for photocatalysis application. / H. F. Aritonang, O. E.

Kamea, H. Koleangan, A. D. Wuntu // Polymer-Plastics Technology and Materials. -2020. - V. 59. - P. 1292-1299.

74. Ul-Islam, M. Synthesis of regenerated bacterial cellulose-zinc oxide nanocomposite films for biomedical applications. / M. Ul-Islam, W.A. Khattak, M. W. Ullah, S. Khan, J. K. Park // Cellulose. - 2013. - V. 21. - № 1. - P. 433-447.

75. Hagemark, K.I. Determination of Excess Zn in ZnO. The Phase Boundary Zn-Zn1+xO. / K.I. Hagemark, P.E. Toren // Journal of The Electrochemical Society. - 1975. - V. 122. - P. 992-994.

76. Ziegler, E. Electrical properties and nonstoichiometry in ZnO single crystals. / E. Ziegler, A. Heinrich, H. Oppermann, G. Stover // Physica Status Solidi. - 1981. - V. 66. - P. 635-648.

77. Kim, J.-S. Quantum dot light emitting diodes using size-controlled ZnO NPs. / J.-S. Kim, B.-H. Kang, H.-M. Jeong, S.-W. Kim, B. Xu // Current Applied Physics. -2018. - V. 18. - P. 681-685.

78. Talam, S. Synthesis, characterization and spectroscopic properties of ZnO nanoparticles. / S. Talam, S.R. Karumuri, N. Gunnam // International Scholarly Research Notices. - 2012. - V. 2012. - P. 1-6.

79. Lavand, A.B. Synthesis, characterization and visible light photocatalytic activity of carbon and iron modified ZnO / A.B. Lavand, Y.S. Malghe // Journal of King Saud University. - 2018. - V. 30. - P. 65-74.

80. Akhil, K. Effect of humic acid on the toxicity of bare and capped ZnO nanoparticles on bacteria, algal and crustacean systems. / K. Akhil, S.S. Khan // Journal of Photochemistry and Photobiology. - 2017. - V. 167. - P. 136-149.

81. Musavi, E. Red-orange photoluminescence emission of sol-gel dip-coated prepared ZnO and ZnO:Al nano-crystalline films. / E. Musavi, M. Khanlary, Z. Khakpour // Journal of Luminescence. - 2019. - V. 216. - P. 1-8.

82. Zang, Z. Enhanced fluorescence imaging performance of hydrophobic colloidal ZnO nanoparticles by a facile method. / Z. Zang, X. Tang // Journal of Alloys and Compounds. - 2015. - V. 619. - P. 98-101.

83. Efafi, B.M.H. Strong Blue Emission from ZnO Nanocrystals Synthesized in Acetone-Based Solvent. / B.M.H. Efafi, M.H.A. Majles, S.S. Mousavi // Journal of Luminescence. - 2016. - V. 178. - P. 384-387.

84. Ramani, M. Zinc oxide nanoparticles: A study of defect level blue-green emission. / M. Ramani, S. Ponnusamy, C. Muthamizhchelvan // Optical Materials. -2012. - V. 34. - P. 817-820.

85. Anantachaisilp, S. Nature of red luminescence in oxygen treated hydrothermally grown zinc oxide nanorods. / S. Anantachaisilp, S.M. Smith, C. Ton-That, S. Pornsuwan, A.R. Moon, C. Nenstiel, A. Hoffmann, M.R. Phillips // Journal of Luminescence. - 2015. - V. 168. - P. 20-25.

86. Brahma, S. Yellow-red luminescence in ZnO nanoparticles synthesized from zinc acetylacetonate phenanthroline / S. Brahma, S.A. Shivashankar // Materials Letters. - 2016. - V. 164. - P. 235-238.

87. Jangir, L.K. Investigation of luminescence and structural properties of ZnO nanoparticles, synthesized with different precursors. / L.K. Jangir, Y. Kumari, A. Kumar, M. Kumara, K. Awasthi // Material Chemistry Frontiers. - 2017. - V. 1. - P. 1413-1421.

88. Salavati-Niasari, M. Nanosphericals and nanobundles of ZnO: Synthesis and characterization. / M. Salavati-Niasari, F. Davar, A. Khansari // Journal of Alloys and Compounds. - 2011. - V. 509. - P. 61-65.

89. Thirugnanam, T. Effect of Polymers (PEG and PVP) on sol-gel synthesis of microsized zinc oxide. / T. Thirugnanam // Journal of Nanomaterials. - 2013. - V. 6. -P. 1-7.