Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Амосова, Ирина Викторовна

• Амосова, Ирина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Амосова, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АДЕНОВИРУСЫ, ИХ ОБЩАЯ И АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ. ПРОТИВОАДЕНОВИРУСНЫЕ ПРЕПАРАТЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Строение вирионов АВ.

1.2. Структурные белки аденовирусов.

1.3. Неструктурные (ранние) белки.

1.4. Репликация аденовирусов.

1.5. Классификация АВ.

1.6. Клинико-эпидемиологическая характеристика и патогенез АВ-инфекции.

1.7. Современные методы диагностики аденовирусной инфекции.

1.7.1. Выделение вируса в культуре клеток.

1.7.2. Иммунофлуоресцентный метод.

1.7.3. Иммуноферментный анализ (ИФА).

1.7.4. Моноклональные антитела.

1.7.5. Иммунохроматографический анализ.

1.7.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

1.8. Противоаденовирусные препараты.

1.8.1. Основные направления получения противоаденовирусных препаратов.

1.8.2. Эффективность и недостатки препаратов, используемых для лечения и профилактики аденовирусных инфекций.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Клеточные культуры.

2.1.2. Вирусы.

2.1.3. Моноклональные антитела.

2.2. Методы.

2.2.1. Вирусологические методы.

2.2.2. Методы гибридомной технологии.

2.2.3. Электронно-микроскопический анализ.

2.2.4. Взятие и подготовка клинических образцов.

2.2.5. Биохимические методы.

2.2.6. Иммунохимические методы.

2.2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.8.Статистическая обработка.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АДЕНОВИРУСУ.

3.1. Оценка специфической активности гипериммунных аденовирусных сывороток кролика в непрямом методе флуоресцирующих антител.

3.2. Первичное тестирование полученных МКА.

3.2.1. Изучение специфической активности в ИФА.

3.2.2. Изучение специфической активности МКА с помощью Н-МФА.

3.3. Определение эпитопной направленности МКА#6.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФИТЦ-КОНЬЮГАТОВ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

4.1. Получение и изучение активности ФИТЦ-коньюгатов ПКА.

4.2. Лабораторная апробация МКА#6 при дифференциальной диагностике аденовирусной инфекции непрямым иммунофлуоресцентным методом.

4.3. Получение и изучение активности ФИТЦ-коньюгатов МКА#6.

4.4. Клинико-лабораторная апробация ФИТЦ-коньюгатов МКА#6 при дифференциальной диагностике аденовирусной инфекции прямым иммунофлуоресцентным методом.

ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ.

5.1. Изучение специфической активности МКА#6 и 7F1.

5.2. Получение и изучение специфической активности пероксидазных коньюгатов МКА#6 и МКА 7F1.

5.3. Конструирование иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции аденовирусных антигенов в клеточных культурах и клинических материалах.

ГЛАВА 6. ДИЗАЙН И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «АДЕНОВИР» ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АДЕНОВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ В КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ.

6.1. Клинико-лабораторная апробация ИФТС «АДЕНОВИР».

6.1.1. Возможности выявление аденовирусного антигена в носоглоточных смывах при использовании ИФТС «АДЕНОВИР».

6.1.2. Изучение возможности индикации аденовирусных антигенов в копрофильтратах.

6.2. Дизайн ИФТС «АДЕНОВИР».

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции»

Актуальность исследования. Аденовирусы (АВ) представляют собой обширное семейство вирусов (Adenoviridae), патогенных для человека, млекопитающих и птиц. АВ человека циркулируют повсеместно и во всех частях мира. По своей распространенности они занимают третье место после гриппа и респираторно-синцитиальной инфекции. Их удельный вес в структуре ОРЗ составляет около 9% [8, 9, 34, 44].

ОРЗ негриппозной (в том числе аденовирусной) этиологии вносят важный вклад в структуру общей инфекционной патологии. В отличие от эпидемий гриппа, имеющих выраженную сезонность, они регистрируются на протяжении всего года, вызывая подъемы заболеваемости, в основном, среди детских групп населения [52, 53, 54, 56, 59, 67, 108].

АВ, как и вирусы гриппа, способны вызывать тяжелые поражения не только верхних, но и нижних отделов дыхательного тракта в виде пневмоний, бронхитов и бронхиолитов [1, 4, 18, 57, 79, 88], а также других систем и органов [43, 71, 106].

Известно, что АВ являются причиной вспышек фарингоконъюнктивальной лихорадки среди детей и новобранцев и нозокомиальных заболеваний, в том числе в офтальмологических отделениях. АВ вызывают также лимфоаденопатии, острые и хронические тонзиллиты, отиты, фарингиты, протекающие с явлениями интоксикации и гипертермии, поражения печени и миокарда [6, 44, 71, 79]. Отдельные серотипы АВ (12, 18, 31, 40, 41) вызывают обширные вспышки гастроэнтеритов, а серотипы 12, 18 и 31 обладают повышенными онкогенными потенциями [1, 4, 73, 84].

Появляется все больше данных о тяжелом генерализованном течении АВ инфекций у пациентов с иммуносупрессией, которым осуществляется трансплантация органов или костного мозга [32, 47, 61, 63, 82, 101], а также у онкологических больных при проведении химиотерапии [37, 41, 106]. Подчеркивается важность распознавания АВ инфекции у доноров органов в предоперационном периоде во избежание тяжелых осложнений, способных приводить к летальным исходам у иммуносупрессированных реципиентов [67, 113].

Рост заболеваемости аденовирусой этиологии регистрировался в детских группах населения, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС в 1986 г. [11, 14].

Эффективность надзора за аденовирусной инфекцией и ее терапии зависит от раннего диагностирования инфекции с ее дифференциацией от других вирусных заболеваний со сходными симптомами [18, 47], что определяет важность применения строго специфичных и высоко чувствительных методов дифференциальной лабораторной диагностики [24, 38, 40]. Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материалах от больных [49, 52, 60].

Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материале от больных [25, 42, 52, 60].

Для ранней дифференциальной диагностики ОРВИ необходимо создание простых, быстрых и недорогих тестов, к числу которых относятся усовершенствованные варианты иммуноферментного (ИФА) [5, 78, 79, 88] и иммунофлуоресцентного анализа [24, 52, 55, 68, 110]. Целесообразность их использования обоснована не только медицинскими показаниями, но и существенной экономической выгодой, достигаемой, главным образом, за счет отмены антибиотиков при острых респираторных инфекциях вирусной природы (ОРВИ) и сокращения сроков госпитализации [75, 92].

Одним из ведущих направлений в области совершенствования диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител (МКА) к возбудителям ОРВИ, обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов [3, 10, 46, 83].

Целью настоящей работы явилось создание усовершенствованных тест-систем для диагностики аденовирусной инфекции.

Задачи исследования: • - разработка методики получения высокоочищенного гексонного антигена аденовируса;

- разработка технологии производства коньюгатов поликлонального типа с флуоресцеинизотиоцианатом для быстрой диагностики аденовирусной инфекции;

- получение и скрининг моноклональных антител к различным сайтам в составе гексона аденовируса, общим для разных семейств аденовирусов;

- разработка технологии получения коньюгатов моноклональных антител с флуоресцеинизотиоцианатом;

- дизайн новых моноклональных иммуноферментных тест-систем для" ранней диагностики аденовирусной инфекции;

- клинико-лабораторная апробация разработанных препаратов с оценкой их диагностических параметров в сравнении с другими методами (электронная микроскопия, ПЦР, выделение аденовирусов в культуре клеток, серологический анализ).

Научная новизна работы. Научно обоснована целесообразность получения для диагностических целей моноклональных антител направленных к консервативным детерминантам в составе гексонного белка аденовируса.

Впервые в России детально отработана методика получения высокоочищенного (до кристаллического состояния) гексонного белка аденовирусов.

Впервые в России получена панель моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа. Дана характеристика биологических и диагностических свойств полученных моноклональных антител в различных иммунологических реакциях.

Экспериментально обосновано, что разработанные моноклональные антитела позволяют диагностировать заболевания, вызываемые аденовирусами, принадлежащими к различным группам (В, С, Е и F) семейства Adenoviridae.

Практическая значимость работы. Разработаны новые тест-системы для ранней диагностики аденовирусной инфекции на основе иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа. В клинико-лабораторных исследованиях обоснована перспективность их применения в условиях практического здравоохранения как для индивидуальной диагностики в госпитальных условиях, так и для расшифровки природы эпидемических вспышек неясной этиологии, в т.ч. в отдаленных точках страны.

Впервые в России получены коньюгаты моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа с флуоресцеинизотиацианатом и пероксидазой хрена без снижения специфической активности препаратов.

Высокие показатели чувствительности и специфичности разработанной ИФТС «АДЕНОВИР» в сравнении с данными, полученными в ПЦР и при электронной микроскопии, позволяют рекомендовать ее для использования в лабораторной практике при диагностике аденовирусных инфекций.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полученные моноклональные антитела # 6 (МКА#6)к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа являются перспективными иммунореагентами и могут быть использованы в различных иммунологических тестах детекции аденовирусных антигенов.

2. Применение МКА #6 к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа повышает чувствительность и специфичность ранее разработанных диагностических тестов.

3. Использование ФИТЦ-коньюгатов моноклональных антител позволяет выявлять аденовирусы, принадлежащие к различным группам (В, С, Е) семейства аденовирусов и облегчает интерпретацию результатов за счет большей яркости специфической флуоресценции.

4. Разработанная иммуноферментная тест-система «Аденовир» характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью и может быть рекомендована для диагностики аденовирусной инфекции, как при респираторных, так и при кишечных формах заболевания.

Методы исследования. Использованы различные методы работы с клеточными культурами, вирусологические, серологические, биохимические, молекулярно-биологические и электронно-микроскопические методы исследования, методы гибридомной технологии, очистки и концентрирования вирусных белков, очистки моноклональных антител с помощью аффинной хроматографии, а также статистические приемы обработки и анализа полученных результатов. В работе использовали пакет прикладных программ

Statistika-5,0 для непараметрических выборок. Для расчета показателей диагностической эффективности препарата рассчитывали суммарный показатель совпадения результатов с референтной системой и средний квадрат

12 сопряженности phi .

Оценка диагностических свойств новых тест-систем для определения аденовирусной инфекции проведена на материалах от 574 больных ОРВИ. Методами сравнения служили: иммунофлуоресцентный анализ детекции аденовирусных антигенов в эпителиальных клетках носоглоточного эпителия,-иммуноферментный анализ для выявления аденовирусных антител класса IgG (ИФТС-AB-IgG), выделение аденовирусов в культуре клеток, а также выявление ДНК аденовирусов при помощи полимеразной цепной реакции.

Внедрение результатов в практику. Разработана научно-технологическая документация (НТД) на препарат «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий антигексоновый аденовирусный» («ИДФАГ»). Регламент производства № 4429427-001-09 и технические условия № 93 8837-001-4429427-2008 на препарат «ИДФАГ» согласованы с ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Инструкция по применению № 01-11/131-08 от 15.08.2008г. утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ. Препарат «ИДФАГ» зарегистрирован на территории России (Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03940), внедрен в производство на базе ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» и используется в различных организациях практического здравоохранения (ФГУЗ ЦГЭ, глазные клиники, инфекционные стационары), включая сеть базовых лабораторий по мониторингу за гриппом и ОРВИ в составе Референс-центра при НИИ гриппа СЗО РАМН.

Материалы исследования используются в учебном процессе в курсе тематического усовершенствования, профессиональной переподготовки и сертификационном курсе по специальности «Вирусология» на базе ПДО СПб ГОУВ Государственной Медицинской академии им. И.И. Мечникова совместно с НИИ гриппа СЗО РАМН.

Апробация работы. Материалы исследования были доложены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Республика Беларусь, Минск, 2007), на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов (Россия, Санкт-Петербург, 2008) и на XXXI Итоговой научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционных заболеваний у детей» (Россия, Санкт-Петербург, 2009), а также представлены на международной конференции «Options for the control of Influenza VI» (Канада, Торонто, 2007).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 20 работ, из-них - 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК и Методические рекомендации «Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом».

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 120 печатных листах, иллюстрирована 15 таблицами и 19 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 113 источников, из них 14 отечественных и 99 иностранных авторов, 5 приложений.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Амосова, Ирина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Разработан и внедрен в производство препарат поликлонального типа «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий аденовирусный антигексоновый сухой» («ИДФАГ») для ранней диагностики аденовирусной инфекции по детекции вирусных антигенов в клинических материалах. Препарат зарегистрирован на территории РФ.

2. В Государственных испытаниях установлено, что препарат «ИДФАГ» по показателям качества не уступает одному из лучших зарубежных аналогов («IMAGEN» фирмы «DAKO», Дания).

3. Получена и криоконсервирована в Государственной коллекции клеточных культур при НИИ гриппа СЗО РАМН панель гибридом, продуцирующих МКА к различным сайтам в составе гексонного антигена аденовируса, в т. ч. моноклональные антитела 6, обладающие наиболее широким спектром активности в отношении различных серотипов аденовирусов.

4. Установлено по результатам клинико-лабораторных исследований, что коньюгаты моноклональных антител#6 с флуоресцеинизотиоцианатом в сравнении с «ИДФАГ» дают равноценные показатели чувствительности и специфичности при более яркой специфической флуоресценции, что значительно облегчает интерпретацию результатов анализа.

5. Впервые в России осуществлен дизайн иммуноферментной тест-системы «АДЕНОВИР» на основе моноклональных антител#6 и 7F1. Определена оптимальная композиция всех составляющих тест-системы с итоговым лимитом чувствительности 20 нг/мл по белку (2 нг в пробе).

6. Показана высокая чувствительность и специфичность разработанной ИФТС «АДЕНОВИР» (96% и 93%, соответственно), при диагностике аденовирусных инфекций в сравнительных клинико-лабораторных исследованиях с наиболее чувствительным тестом - полимеразной цепной реакцией.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Амосова, Ирина Викторовна, 2009 год

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2001.-736 с.

2. Вирусология: в 3-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа и др. -М.: Мир,1989.- 456с.

3. Вопросы общей вирусологии: учебное пособие / Под ред. Киселева О.И., Жилинской И.Н. СПб: СПбГМА им. И.И.Мечникова, 2007 г.-374 с.

4. Дяченко Н.С. Аденовирус, клетка, организм.-Киев: Наукова Думка, 1988.-232с.

5. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высш. шк.,1991 г.-288с.

6. Казанцев А.П. Справочник по инфекционным болезням: 3 изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1986.-320с.

7. Карпович Л.Г. Изучение диагностической эффективности препарата «Иммуноглобулина диагностического флуоресцирующего аденовирусного антигексонового сухого» // Сб. «Проблемы инфекционных болезней», ч. 2- М.,2000.-С. 146-149.

8. Колобухина Л.В. Клиника и лечение гриппа // Русский медицинский журнал.-2001.-Т.9.-710с.

9. Малеев В.В. Птичий грипп: эпидемиология, клиника и лечение / В «Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф»: Сб. статей / Под ред. В.И.Покровского.- СПб.: Росток, 2006.-С.103-130.

10. Монаенков А.О. Получение и характеристика моноклональных антител к аденовирусу в иммуноферментных и иммунофлюоресцентных реакциях // Вопросы вирусологии.-2000.-№5.-С.30-33.

11. Попова Т.Л. Изменение структуры циркулирующих вирусных популяций в условиях воздействия неблагоприятных экологических факторов // Материалы VII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- М.,1997.-т. 1.-С.499-500.

12. Соминина А.А. Анализ этиологической структуры гриппоподобнойзаболеваемости и мониторинг эпидемии гриппа 1998 — 1999 г.г. с использованием методов лабораторной диагностики // Вестник РАМН-2001.-№3.-С.8-12.

13. Соминина А. А. Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом: методические рекомендации. СПб: ГУ НИИ гриппа РАМН, 2006.-1 Ос.

14. Цыбалова JI.M. Острые и хронические заболевания у лиц, подвергшихся воздействию радиации // Тезисы юбилейной международной научной конференции «Грипп 21 век».- СПб.,1997.-С.41.

15. Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy / Ed: by Prem Seth, 1999.- 30p.

16. Adrian T. DNA restriction analysis of adenovirus prototrype 1 to 41 // Arch. Virol.-1986.-Vol.91 .-P.277-290.

17. Andreasi M.S.A. Adenovirus, calicivirus and astrovirus detection in fecal samples of hospitalized children with acute gastroenteritis from» Campo, Grande, MS, Brazil //Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro.-2008.-Vol. 103.-P.741-744.

18. Avellon A. Rapid and sensitive diagnosis of human adenovirus infections by a generic polymerase chain reaction / A. Avellon, P. Perez, J.C. Aquilar // J. Virol, Methods—2001 .-Vol.92.-P. 113-120.

19. Baum S.G. Adenoviruses // In: Mandell G.L., Bennet J.I., Dolin R., eds. Principles and practice of infectious diseases.- N.Y.,2000.-P. 1624-1630.

20. Bellau-Pujol S. Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory viruses // J. Virol. Methods.-2005.-Vol.126.-P.53-63.

21. Blyn L.B. Rapid Detection and Molecular Serotyping of Adenovirus by Use of PCR Followed by Electrospray Ionization Mass Spectrometry // J. Clin.

22. Microbiol.-2008.-№2.-P.644-651.

23. Chakrabarti S. Adenovirus infections in stem cell transplant recipients: Recent developments in understanding of pathogenesis, diagnosis and // Leukemia and Lymphoma-2004.-Vol.45.-P.873-885.

24. Qi<?ek C. Comparison of the assay with the combination of shell vial cell culture and immunofluorescence antibody test for the detection of respiratory viruses // J. of Virological Methods.-2007.-Vol.l43.-P.161-168.

25. Cockerill, F. R. Application of rapid-cycle real-time polymerase chain reaction for diagnostic testing in the clinical microbiology laboratory // Arch. Pathol. Lab. Med.-2003.-Vol. 127.-P. 1112-1120.

26. Coiras M.T. Simultaneous detection of influenza А, В, С viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested-PCR assay // J. Med. Virol.-2003.- Vol. 69.-P. 132-144.

27. Dagher H. Rhinovirus detection: comparison of real-time and conventional-PCR // J. Virol. Methods-2004.-Vol.l 17.-P.113-121.

28. Damen M. Real-Time PCR with an Internal Control for Detection of All Known Human Adenovirus Serotypes //J. of clinical microbiology.-2008.-№12.-P.3997-4003.

29. Doane F.W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses // In A.Z. Kapikian (ed), Viral infections of the gastrointestinal tract, 2nd ed. Marcel Dekker, Inc.- N.Y.,1994.-P.101-130.

30. Erdman D.D. GeneScan reverse transcription-PCR assay for detection of six common respiratory viruses in young children hospitalized with acute respiratory illness //J. Clin. Microbiol.-2003.-Vol.41.-P.4298-43 03.

31. Echavarria M. PCR method for detection of adenovirus in urine of healthy and human immunodeficiency virus infected individuals // J. Clin. Microbiol.-1998.-Vol.36.-P.3323-3326.

32. Echavarria M.S. PCR detection of adenovirus in a bone morrow transplant recipient: hemorrhagic cystitis as a presenting manifestation of disseminated disease//J. Clin. Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.686-689.

33. Echavarria M. Rapid detection of Adenovirus in throat swab specimens by PCR during respiratory disease outbreaks among military recruits // J. of Clinical Microbiology.-2003.-Vol.41.-P.810-812.

34. Echavarria M. Adenoviruses in immunocompromised hosts // Clin. Microbiol. Rev.-2008.-Vol.21.- P.704-715.

35. Epstein S.P. Topical cobalt chelate CTC-96 for the treatment of adenovirus conjunctivitis in a rabbit model // Investigative Ophthalmology and Visual Science.-2003.-Vol.44.-E-abstract 4650.

36. Everitt E. Structural proteins of adenoviruses. XII. Location and neighbor relationship among proteins of adenovirion type 2 as revealed by enzymatic iodination, immunoprecipitation and chemical cross-linking // Virology.-1975.-V.67.-P. 197-208.

37. Gavin P.J. Intravenous ribavirin treatment for severe adenovirus disease in immunocompromised children // Paediatrics.-2002.-Vol.110.-P.9.

38. Gavin P.J. Review of rapid diagnostic tests for influenza // Clinical and applied immunology reviews-2003 -Vol.4.-P. 151 -172.

39. Gruteke P. Practical implementation of a multiplex PCR for acute respiratory tract infections in children // J. Clin. Microbiol.-2004.-Vol.42.-P.5596-5603.

40. Henrickson K.J. Diagnostic assays for respiratory syncytial virus disease // J. The pediatric infectious diseas.-2007.-Vol.26.-P.36-40.

41. Hierholzer J.C. Adenoviruses in the immunocompromized host // Clinical Microbiology Reviews.-1992.-Vol.5.-P.262-274.

42. Hijazi Z. Laboratory diagnosis of acute lower respiratory tract viral infections in children // J. Trop. Pediatr.-1996.-Vol.42.-P.276-280.

43. Hillenkamp J. The effects of cidofovir 1% with and without cyclosporin A 1% as a topical treatment of acute adenoviral keratoconjunctivitis—a controlled clinical pilot study // Ophthalmology.-2002.-Vol.l09.-P.845-850.

44. Irmen K.E. Use of monoclonal antibodies for rapid diagnosis of respiratory viruses in a community hospital // Clin. Diagn. Lab. Immunol.-2000.-Vol.7-P.396-403.

45. Kang G. Etiology of diarrhea in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation in South India// Transplantation.-2002.-Vol.73.-P.1247-1251.

46. Kim S.R. Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay // J. of Virological methods.-2009.-Vol. 156.- P.l 11-116.

47. Kinchington P.R. Sequence changes in the human adenovirus type 5 DNA polymerase associated with resistance to the broad spectrum antiviral cidofovir // Antiviral Research.-2002.-Vol.56.- P.73-84.

48. Kinchington P. R. Prospects for adenovirus antivirals // Journal of Antimicrobial Chemotherapy: Review.-2005.-Vol.55.-P.424-429.

49. Kuroiwa Y. Comparison of an Immunochromatography Test with Multiplex Reverse Transcription-PCR for Rapid Diagnosis of Respiratory Syncytial Virus Infections // J. Clin. Microbiol.-2004.-Vol.42.-P.4812-4814.

50. Kuypers J. Evaluation of quantitative and type-specific real-time PCR assays for detection of RSV in respiratory specimens from children // J. Clin. Virol.-2004.-Vol.31.-P. 123-129.

51. Kuypers J. Comparison of Real-Time PCR Assays with Fluorescent-Antibody Assays for Diagnosis of Respiratory Virus Infections in Children // J. Clin. Microbiol.-2006.-Vol.44.- P.2382-2388.

52. Lagos R. Systematic surveillance of influenza, syncytial respiratory, parainfluenza and adenovirus in children with acute respiratory infections // Rev. Med. Chil.-1999.-Vol.127.-P.1063 1072.

53. Landry M.L. SimulFluor respiratory screen for rapid detection of multiple respiratory viruses in clinical specimens by immunofluorescence staining // J.

54. Clin. Microbiol.-2000.-Vol.38.-P.708-711.

55. Levent F. Performance of a new immunochromatographic assay for detection of adenoviruses in children // J. of Clinical Virology.-2009.-Vol.44.-P.173-175.

56. Leung A.Y. Quantification of adenovirus in the lower respiratory tract of patients without clinical adenovirus-related respiratory disease // Clin. Infect. Dis.-2005 .-Vol.40.-P. 1541 -1544.

57. Mahony J. Development of a Respiratory Virus Panel Test for Detection of Twenty Human Respiratory Viruses by Use of Multiplex PCR and a Fluid Microbead-Based Assay // J. Clin. Microbiol.-2007.-Vol.45.-P.2965-2970.

58. Maitreyi R.S. Rapid detection of respiratory viruses by centrifugation enhanced cultures from children with acute lower respiratory tract infections // J. Clin. Virol.-2000.-Vol.l6.-P.41-47.

59. Marinheiro J.C. Duplex-PCR assay for the detection of adenovirus and respiratory syncytial virus in nasopharyngeal samples // Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro.-2009.-Vol.l04.-P.l 18-120.

60. Matar L.D. Respiratory viral infections in lung transplant recipients: radiologic findings with clinical correlation // Radiology.-1999.-Vol.213.-P.735-742.

61. Mentel R. Inhibition of adenovirus DNA polymerase by modified nucleoside triphosphate analogs correlate with their antiviral effects on cellular level // Medical Microbiology & Immunology.- 2000.-Vol.l89.-P.91-95.

62. Miura-Ochiai R. Quantitative detection and rapid identification of human adenoviruses // J. Clin. Microbiol.-2007.-Vol.45.-P.958-967.

63. Moore P.L. Relevance of commercial diagnostic tests to detection of enteric adenovirus infections in South Africa // J. Clin. Microbiol.-2000.-V.38.-P.1661-1663.

64. Monto A. S. Epidemiology of viral respiratory infections //Am. J. Med.- 2002.-Vol.112.-P.4-12.

65. Morfin F. Differential susceptibility of adenovirus clinical isolates to cidofovir and ribavirin is not related to species alone // Antivir. Ther.- 2009.-Vol.14.-P.55-61.

66. Newton D.W. Clinical and laboratory diagnosis of influenza virus infections // The American journal of managed care.-2000:-Vol.6.-P.265-275.

67. Ozbay Ho§nut F. Adenovirus infection as possible: cause of acute liver failure in a healthy child: A case report//Turk. J. Gastroenterol.-2008.-Vol.19.-P.281-283. v

68. Perkins S.M. Comparison of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay and a Culture Technique for Quantitative Assessment of Viral Load in Children Naturally Infected with Respiratory Syncytial Virus // J. Clin. Microbiol.-2005.-Vol.43.-P.2356-2362.

69. Poon L.L. Detection of SARS coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome by conventional and real-time quantitative reversetranscription-PCR assays // Clin. Chem.-2004.-Vol.50.-P.67-72.

70. Puppe W. Evaluation of a multiplex reverse transcriptase PCR ELISA for the detection of nine respiratory tract pathogens // J. Clin. Virol. -2004.-Vol.30.-P.165-174.

71. Raboni S.M. Comparison of PCR, enzyme immunoassay and conventional culture for adenovirus detection in bone marrow transplant patients with hemorragic cystitis //J. of Clin. Virology -2003 .-Vol.27.-P.270-275.

72. Romanowski E.G. Antiviral prophylaxis with twice daily topical cidofovir protects against challenge in the adenovirus type 5/New Zealand rabbit ocular model // Antiviral Research.- 2001.-Vol.52.-P.275-280.

73. Romanowski E.G. Beyond cidofovir: the in vitro evaluation of newer potential antiviral agents against ocular isolates of adenovirus // Investigative Ophthalmology and Visual Science.-2001.-Vol.42.-P.579.

74. La Rosa A. M. Adenovirus infections in adult recipients of blood and marrow transplants // Clinical Infectious Diseases.-2001.-Vol.32.-P.871-876.

75. Rovida F. Monoclonal antibodies versus reverse transcription-PCR. for detection of respiratory viruses in a patient population with respiratory tract infections admitted to hospital // J. Med. Virol.-2005.-Vol.75.-P.336-347.

76. Saderi H. Incidence of enteric adenovirus gastroenteritis in Iranian children // J. Clin. Virol.-2002.-Vol.24.-P.l-5.

77. Samransamruajkit R. Prevalence, clinical presentations and complications among hospitalized children with influenza pneumonia // Jpn. J. Infect. Dis.-2008.-Vol.61.-P.446-449.

78. Selvaraj G. Molecular Epidemiology of Adenovirus Isolates from Patients Diagnosed with Intussusception in Melbourne, Australia // J. Clin. Microbiol.-2006.-Vol.44.-P.3371-3373.

79. Smith R.M. Monoclonal antibodies: Harnessing the potential / R.M. Smith, P.J. Fairchild // Sci. Progress Oxford.-1992.-P.323-343.

80. Suga T. Analysis of adenoviruses isolated in Cobe City, Japan, from 2000 to 2007 // Jpn. J. Infect. Dis.-2008.-Vol.61.-P.503-504.

81. Syrmis M. W. A sensitive, specific, and cost-effective multiplex reverse transcriptase-PCR assay for the detection of seven common respiratory viruses in respiratory samples // J. Mol. Diagn.-2004.~Vol.6.-P.125-131.

82. Takimoto S. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay, indirect immunofluorescence assay and virus isolation for detection of respiratory viruses in nasopharyngeal secretions // J. Clin. Microbiol.-1991.-Vol.29.-P.470-474.

83. Templeton К. E. Improved diagnosis of the etiology of community-acquired pneumonia with real-time polymerase chain reaction // Clin. Infect. Dis.-2005.-Vol.41.-P.345-351.

84. Tijssen P. Practice and Theory- of Enzyme Immunoassay // In: Laboratory. Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. (Ed. By R.H.Burdon, P.H.Knippenberg): Amsterdam; New York; Oxford; Elsevier.-1985. -Vol.15 -549p.

85. Tsutsumi H. Imunochromatography test for rapid diagnosis of adenovirus respiratory tract infections: comparison with virus isolation in tissue culture // J. Clin. Microbiol.-1999.-Vol. 37.-P.2007-2009.

86. Tuteja U. Generation and characterization of monoclonal antibodies to adenovirus // Indian. J. Exp. Biol.-2000.-Vol.38.-P.1259-1262.

87. Family Adenoviridae / In: Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ed. by M.H.V. van Regenmortel et al.).- San Diego:Academic Press., 1999.-P.227-23 7.

88. Wadell G. Molecular epidemiology of human adenoviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-1984.-Vol. 110.-P. 191 -220.

89. Wadell G. Enteric adenoviruses / In: Viral Infections of the Gastrointestinal Tract, (ed. by Kapikian A.Z. N.Y.),1994.- P.519-548.

90. Wadell G. Adenoviruses // In: Principles and Practice of Clinical Virology. 4th Edition, (ed. by Zuckeman A.E. et al.), 2000.-P.307-327.

91. Walls T. Adenovirus: an increasingly important pathogen in pediatric bone marrow transplant patients // Lancet Infectious Diseases.-2003.-Vol.3.-P.79-86.

92. Waters V. Etiology of community-acquired pediatric viral diarrhea: a prospective longitudinal study // Pediatr. Infect. Dis. J.-2000.-V.19.-P.843-848.

93. Weinberg G.A. Superiority of reverse-transcription polymerase chain reaction to conventional viral culture in the diagnosis of acute respiratory tract infections in children // J. Infect. Dis.-2004-Vol.l89.-P.706-710.

94. Weitzel T. Field Evaluation of a Rota- and Adenovirus Immunochromatographic Assay Using Stool Samples from Children with

95. Acute Diarrhea in Ghana // J. Clin. Microbiol.-2007.-Vol.45.-P.2695-2697.

96. Wood S.R. Rapid detection and serotyping of adenovirus by direct immunofluorescence//J. Med .Virol.-1997.-Vol. 51.-P. 198-201.

97. Yeung R. Characterization of culture-positive adenovirus serotypes from respiratory specimens in Toronto, Ontario, Canada: September 2007-June 2008 // Virology Journal.-2009.-VoL6.-P.6-l 1.

98. Zarubaev V.V. Effect of 6-azacytidine to experimental adenoviral infection // Antiviral Research.-2000.-Vol.46.-P.66.

99. Zheng X. Identification of Adenoviruses in Specimens from High-Risk Pediatric Stem Cell Transplant Recipients and Controls // J. Clin. Microbiol.-2008.-Vol.46.-P.317-320.шетаШййве