Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.05, кандидат ветеринарных наук Панюшкин, Александр Игоревич

• Панюшкин, Александр Игоревич
• кандидат ветеринарных наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Панюшкин, Александр Игоревич

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Генномодифицированная продукция и ее значение

1.2 Вопросы безопасности ГМО, необходимость контроля и маркировки

1.3 Методы определения ГМО

1.3.1 Методы определения ГМО на основе анализа нуклеиновых кислот

1.3.2 Методы определения ГМО на основе анализа белков

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Цель и задачи исследования

2.2 Материалы и методы

2.2.1 Отбор и подготовка проб для исследования

2.2.2 Методика выделение ДНК с использованием детергента СТАВ.

2.2.3 Методика выделения ДНК с использованием сорбента Silica

2.2.4 Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов

2.2.5 Методика качественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени

2.2.6 Методика количественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени

2.2.7 Методика идентификации ГМО с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003)

2.2.8 Методика определения ГМО на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией с использованием тест-систем БигеРоос!

2.2 9 Модифицированная методика определения ГМО с применением ДНК-зондов иммобилизованных на мембранных биочипах

2.2 10 Методика иммунохроматографического определения трансгенных белков

2.2.11 Статистическая обработка результатов

2.3 Результаты исследований

2.3.1. Разработка методов определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе иммунохроматографии

2.3.2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения

2.3.3. Совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией

2.3.4. Разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов

2.3.5. Количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени»

2.3.6. Проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и иммунодиагностики

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики»

Актуальность темы

С помощью генной инженерии получены различные трансгенные растения (соя, кукуруза, картофель, хлопчатник, сахарная свекла) с устойчивостью к вирусам, колорадскому жуку и другим насекомым, а также к пестицидам. Производство и оборот трансгенной продукции увеличивается в мире год от года (9, 24, 32). В настоящее время определенная часть находящихся в обороте в России продуктов и кормов содержат компоненты из генномодифицированных источников (ТМИ). Так как замена трансгенными компонентами белков животных и растений - весьма выгодный бизнес, трансгенные белки постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания и кормах биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур.

Мнения ученых о безопасности генетически модифицированных организмов (ГМО) расходятся. Одни исследователи считают, что генномодифицированный организм безвреден, по мнению других, он является источником биологических и экологических рисков для человека, животных и окружающей среды (56). Эти риски могут быть связаны как с плейотропным эффектом трансгенного белка, так и со свойствами самой встроенной-конструкции, в том числе с регуляторным действием на соседние гены. Введение в пищевую цепочку человека или животных трансгенных структур может привести к непредсказуемому воздействию на их здоровье. В ГМО вместе с целевыми генами могут интегрироваться и другие фрагменты ДНК, несущие гены с нежелательными признаками, например, гены, кодирующие токсины или устойчивость к антибиотикам.

В различных странах, включая Россию, создание, производство, реализация продукции, содержащей трансгенные компоненты, подлежит государственному регулированию. Содержание трансгенных конструкций в продуктах и кормах в соответствии с указаниями Роспотребнадзора и Россельхознадзора должно быть продекларировано. В соответствии с приказом Минсельхоза Российской Федерации в нашей стране проводится Государственный ветеринарный лабораторный мониторинг остатков запрещенных и вредных веществ в организме животных, продуктах животного происхождения и кормах. В перечень показателей безопасности входят ГМО, которые определяются в сырых и термически обработанных пищевых продуктах животного происхождения, а также в кормах и кормовых добавках.

В системе лабораторного контроля трансгенных продуктов можно выделить два направления. Это методы ДНК-диагностики и методы обнаружения трансгенных белков на основе иммунодиагностики. На основе ДНК-диагностики (ПЦР, ГЕЦР в режиме «реального времени») определяют как конкретные встроенные гены, так и регуляторные участки ДНК векторных конструкций (35 S - промотор, NOS - терминатор). Иммунологические методы позволяют определять непосредственно трансгенные белки. Они основаны на образовании устойчивого комплекса молекулы трансгенного белка (антигена) со специфичными к нему антителами. сг

В связи с изложенным, весьма важным является разработка и создание высоко эффективных методик для определения трансгенных компонентов в продуктах и кормах. Несмотря на достигнутые в этом направлении значительные успехи, актуальным представляется совершенствование методов в плане экспрессности, оптимизации пробоподготовки, валидации к конкретным объектам и приборам, а также апробация различных модификаций и определение их места в системе скринингового или количественного анализа в соответствии с задачами, ветеринарно-санитарного мониторинга продуктов и кормов.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлись разработка и совершенствование методов определения ГМО в- сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики.

В задачи исследований входило:

- совершенствование определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе метода иммунохроматографии;

- валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения;

- совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией;

- разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов;

- количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени»;

- проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в ■ продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и иммунодиагностики.

Научная новизна

Проведены исследования по усовершенствованию методов определения ГМО в сырье, продукции и кормах, с использованием комплекса методов ДНК- и иммунодиагностики.

Проведены исследования по апробации иммунохроматографических тест-систем для определения трансгенных белков, связанных с устойчивостью к гербицидам и насекомым в растительном сырье, зеленых кормах, в зернофураже. Определены чувствительность и специфичность метода и тест-систем для указанных объектов.

Осуществлена валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в нетермообработанных продуктах и кормах, включающих компоненты животного и растительного происхождения (мясорастительные полуфабрикаты, комбикорма). Определены чувствительность и специфичность валидированной методики.

На основе мультиплексной ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией усовершенствована методика выявления ГМО в термообработанных и нетермообработанных продуктах и кормах. Определены чувствительность и специфичность модифицированной методики.

Разработана модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов. Определены чувствительность и специфичность методики.

Получены данные мониторинговых исследований по определению содержания ГМО в сырье продуктах питания и кормах и проанализировано соответствие исследуемых проб нормативной документации.

Практическая значимость

На основании результатов исследований для практического использования разработаны:

-Методические рекомендации «Использование иммунохроматографических тест-систем для выявления ГМО» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06.2008 г.)

- Национальный стандарт (проект) «Растительная продукция. Экспресс - метод обнаружения специфичных белков», который прошел публичные чтения и получил положительное решение технического комитета.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- VII. Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения». Москва, МГУIЛЬ, 2008 г.

- Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии». Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008 г.

Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания». Москва, МГУПБ, 2009 г.

Международной выставке «Научно-техническое творчество молодежи (НТТМ)», 2008 г. на ВВЦ. Работа «Совершенствование методов определения ГМО на основе иммунохроматографии», представленная на ВВЦ, была отмечена почетной грамотой

Основные положения, выносимые на защиту

1. Совершенствование определения трансгенных белков на основе' иммунохроматографии в растительном сырье, зеленых кормах, зернофураже.

2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

3. Разработка модифицированной методики определения ГМО в продуктах и кормах на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

4. Разработка модифицированной методики определения ГМО с использованием ДНК-чипов.

5. Количественный анализ содержания ГМО в продуктах и кормах на основе ПЦР в режиме «реального времени».

6. Сравнительный анализ различных методов ДНК- и иммунодиагностики для качественного и количественного определения ГМО при проведении мониторинговых исследований продуктов и кормов.

Публикации Результаты исследований отражены в 7 научных статьях, из них две - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Панюшкин, Александр Игоревич

4. ВЫВОДЫ

1. Экспериментальные данные по апробации иммунохроматографического метода показали его высокую чувствительность (0,5%) и экспрессность (1 час) при определении трансгенных белков, связанных с устойчивостью к гербицидам и насекомым, что является основанием для применения метода в качестве скринингового теста при ветеринарном мониторинге растительного сырья, зеленых кормов, зернофуража.

2. Проведена валидация иммунохроматографического метода определения ГМО для нетермообработанных продуктов и кормов, включающих компоненты животного и растительного происхождения (мясорастительные полуфабрикаты, комбикорма). Чувствительность анализа составляла 0,5 %.

3. Усовершенствованная модифицированная методика выявления ГМО на основе мультиплексной ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией обладает высокой чувствительностью (0,1 %) и специфичностью и может быть использована для анализа термообработанных и нетермообработанных продуктов и кормов.

4. Разработанная модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов по специфичности не уступает классическому методу с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) и позволяет выявлять трансгенную ДНК в термообработанных и нетермообработанных продуктах и кормах с чувствительностью до 10 пг.

5. Проведенные мониторинговые исследования показали соответствие анализируемых продуктов и кормов нормативной документации и только в отдельных случаях были выявлены недекларированные продукты и корма, содержащие ГМО. Фальсификация мясных продуктов составляла от 1 до 3 %, а кормов - от 11 до 15 %. При этом, наибольшие показатели фальсификации были связаны с ЗЦМ.

6. Методики на основе иммунохроматографии достаточно эффективны и экпрессны и могут быть использованы в качестве скрининговых тестов для выявления ГМО в растительном сырье, зеленых кормах, комбикормах, ЗЦМ, и нетермообработанных полуфабрикатах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. Методики на основе амплификации, ДНК-чипов и ПЦР в режиме «реального времени» позволяют определять ГМО в термообработанной и нетермообработанной продукции и кормах, и могут служить, как в качестве скринингового теста, так и для количественного анализа (ПЦР в режиме «реального времени»).

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны: -Методические рекомендации по использованию иммунохроматографических тест-систем для выявления ГМО (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06.2008 г.)

- Национальный стандарт (проект) «Экспресс - метод обнаружения специфичных белков», который прошел публичные чтения и получил положительное решение технического комитета.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Панюшкин, Александр Игоревич, 2010 год

1. Вельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А,Б. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия, 2003,№ 2, с 74-96.

2. Гинцбург А.Л., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 123-124.

3. ГОСТ Р' 52173-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения"

4. ГОСТ Р 52174-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа"7. Директива ЕС 1829/20038. Директива ЕС 1830/2003

5. Дубцова Г.Н., Кирюхина М.Н., Дубцов Г.Г. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком // Сб.трудов 7-говсероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с.166-168.

6. Ю.Иванов A.A., Галкина И.И., Мясникова В.В. Деятельность учреждений госсанэпидслужбы России по гигиене питания (по надзору за ГМИ в 2003 году). // Информационный сборник М. - Федеральный центр Госсанэпиднадзора. - 2004г. - 17 стр.

7. Ивановцев В.В., Светличкин В.В., Каверин A.B. / Идентификация трансгенной сои в продуктах и кормах.// Журнал "Ветеринария и кормление", Москва 2006, №6 стр. 21-22

8. Каверин A.B. / Количественное определение ГМИ методом ПЦР в реальном времени// Труды ВНИИВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии и экологии", Москва, 2006, стр. 34-37

9. Киль В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука в Bt-защищенному картофелю// Arpo XXI Современное растениеводство России: практика и научные достижения., №7 с.22-24

10. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария 2000., №3., с. 59-62.

11. Лушников, К.В. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевойпродукции / Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В., Возняк В.М. // Партнеры и конкуренты. 2001. - №2,- С. 36-39.

12. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование//М., изд. «Мир»., 1994, с. 159-172.

13. Методические указания «Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной • из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги» МУК 4.2.1917-04

14. Методические указания «Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги» МУК 2.3.2.1935-04

15. Методические указания «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного' происхождения в продуктах питания». МУК 4.2.1913-04.

16. Методические указания «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции». МУК 4.2.1902-04.

17. Методические указания «Пищевые продукты и пищевые добавки. Порядок И' организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги» МУ 2.3.2.1917-04

18. Монастырский О.А «На пути к устойчивому развитию России»// Бюллетень Центра экологической-политики России №28 2004 с14-18

19. Пермяков А.Н. /Определение видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики// Ветеринария и кормление, 2009, №3, С. 6-7.

20. Попова М.Ю., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Жаринов А.И., Рогов И.А., Скрябин К.Г. Определение содержания и выделение ПЦР-пригодной ДНК из коммерческих препаратов переработки сои // Биотехнология, Москва, 2003, № 2, с. 86-94.

21. Постановление № 149 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 16.09.2003

22. Постановление № 36 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 14.11.2001

23. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации «Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из генетически модифицированных источников» от 31 декабря 2004г. № 13.