Концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, доктор наук Денисова Елизавета Аркадьевна

• Денисова Елизавета Аркадьевна
• доктор наук
• 2015

Оглавление диссертации доктор наук Денисова Елизавета Аркадьевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Степень разработанности проблемы

Цель работы

Задачи исследования

Научная новизна

Практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Достоверность результатов исследований

Апробация работы

Публикации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Система качества ХАССП и ее роль в обеспечении безопасности мясной и рыбной продукции

1.2 Опасные факторы в технологических процессах по получению мясного и рыбного сырья и продуктов их переработки

1.3 Критерии и нормативы безопасности производств по получению, мяса, рыбы и продуктов их переработки

1.4 Опасные факторы и методы их контроля

1.5 Гетероморфизм бактерий и его роль при контроле опасных факторов

1.6 Обеспечение безопасности производственных и сточных вод

1.7 Средства и методы дезинфекция сырья, продукции,

производственных помещений и сточных вод

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и объекты исследований

2.2 Методы исследований

2.2.1 Методики определения микроорганизмов с помощью тест-

систем «ШёаСоип1;» (Германия)

2.2.2. Методики определения возбудителей инфекций с помощью иммунохроматографических индикаиторных элементов с наночастицами коллоидного золота

2.2.3 Методики определения сульфаниламидов и антибиотиков в мясе, рыбе и продуктах их переработки на основе иммуномикрочиповой технологии с помощью тест-систем фирмы КАКООХ, Великобритания

2.2.4 Методики определения антигельминтных веществ в мясе, рыбе 143 и продуктах их переработки на основе иммуномикрочиповой технологии с помощью тест-систем фирмы КАКБОХ, Великобритания

2.2.5 Методики определения токсикантов (фосфорорганических

соединений и карбаматов) в сырье и продукции животного и

растительного происхождения на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы с помощью тест-системы АЬгах1Б ОР/С, США

2.2.6 Методики идентификации возбудителей инфекций на основе ПЦР в режиме «Реального времени»

2.2.7 Методики идентификации возбудителей инфекций на основе ДНК-чипов

2.2.8 Методика дифференцированного определения вегетативных и Ь-форм бактерий на основе ДНК-зондов

2.2.9 Методика дифференциального определения вегетативных и Ь-форм бактерий на основе ПЦР

2.2.10 Статистическая обработка результатов

2.3 Результаты исследований

2.3.1 Анализ отдельных технологий и элементов обеспечения безопасности при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки

2.3.2 Усовершенствование анализа микробных контаминаций в ККТ

с помощью тест - систем RIDA® COUNT

2.3.3 Усовершенствование определения микроорганизмов, токсинов и трансгенных белков в ККТ с помощью иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота

2.3.4 Усовершенствование индикации и идентификации патогенных бактерий в ККТ с помощью мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени»

2.3.5 Разработка ускоренных методик дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики

2.3.6 Адаптация тест- системы на основе ДНК-чипов для контроля микроорганизмов в ККТ

2.3.7 Усовершенствование токсикологического контроля опасных факторов в ККТ на основе тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro

2.3.8 Адаптация тест- системы на основе иммуномикрочиповой технологии для оценки ККТ (сырье и продукция) на остаточные количества лекарственных средств

2.3.9 Сравнительные исследования методик определения опасных факторов при мониторинге ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки

2.3.10 Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствование систем корректирующих мероприятий по очистке воды используемой на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки

2.3.11 Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования систем корректирующих мероприятий проведения дезинфекции объектов при получении мяса,

рыбы и продуктов их переработки

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Получаемое на предприятиях АПК сырье и продукты животного происхождения должно быть высокого качества, так как направлено на обеспечение пищевой безопасности и на получение компонентов биотехнологических процессов производства полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии, улучшающих воздействие на окружающую среду и формирование экологичной среды обитания человека и животных.

Комплекс средств и методов обеспечения безопасности на указанных предприятиях включает различные элементы: системы управления, систем контроля производственных помещений, оборудования, сырья и продукции, воздухо- и водоснабжения, отходов производства, а также систем деконтаминации и очистки. В современных условиях требования безопасности обеспечиваются соответствующими техническими

регламентами, а так же стандартами систем качества (ИСО 22000, ХАССП, ОМР) и стандартами экологического мененджмента. При этом, необходимо осуществлять быстрое и эффективное обнаружение опасных факторов, способных оказать негативное влияние в критических контрольных точках, своевременно анализировать эти факторы и проводить соответствующие корректирующие мероприятия. Такой подход с успехом используется за рубежом и у нас в стране (31, 66, 88, 123, 219, 227, 271, 351).

Одним из основных опасных факторов, влияющих на безопасность получения сырья и продукции животного происхождения является микробная контаминация. При этом важно определять не только общие показатели микробного обсеменения, а и проводить идентификацию возбудителей инфекции. К таким возбудителям, относятся прежде всего эшерихии, сальмонеллы, золотистый стафилококк, кампилобактерии и листерии (100, 128, 150, 342). Существующие методы бактериологического анализа достаточно длительны и трудоемки (42, 80, 169, 350) и не совсем пригодны для скрининговых исследований микробных загрязнений в

критических контрольных точках. Весьма перспективным в этом направлении являются методы на основе ПЦР в режиме «реального времени», ДНК-чипов, ускоренных тест-систем подращивания на селективных хромагенных средах (RIDA COUNT),

иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами колойдного золота. Несмотря на имеющиеся данные об успешном использовании этих методов и тест-систем для индикации и идентификации различных микроорганизмов (10, 52, 240, 245, 258), актуальным является валидация их к конкретным объектам и разработка более эффективных модификаций.

В некоторых случаях под действием различных факторов (температура, химические воздействия и т. д.) популяции бактерий могут переходить в гетероморфное состояние, которое затрудняет их индикацию (48, 49, 87, 122, 194, 195, 214). Кроме того, в научных целях иногда важно знать в каком соотношении находятся популяции в различных гетероморфных состояниях. Это актуально, например, при изучении эффективности корректирующих мероприятий с использованием различных средств дезинфекции в критических контрольных точках. В решении проблемы дифференциального определения популяции бактерий в различных гетероморфных состояниях перспективными представляются подходы на основе ДНК-диагностики (146, 302, 471).

Опасными факторами при получении продукции животного происхождения могут являться различные токсиканты, которые могут накапливаться в организме животных, попадать в соответствующее сырье и концентрироваться в продукции при различных технологических процессах. К таким токсикантам следует отнести нитрозамины, фосфорорганические соединения, антибактериальные и антигельминтные препараты, бактериальные токсины, загрязняющие сырье. Ботулинический и стафилококковый токсины могут накапливаться как в сырье, так и готовой продукции при ее хранении (145, 336, 391). При несоблюдении технологии

дезобработки могут накапливаться на различных поверхностях производства и самой продукции остаточные количества дезсредств, или их составляющих, например ПАВ, что в конечном итоге скажется на безопасности и качестве готовой продукции (206, 207, 287, 441). Для ускоренного контроля перечисленных опасных факторов токсичной природы перспективным представляется использование методов и тест систем, основанных на реакциях антиген-антитело и ингибирования ферментативных систем или тест-организмов (232, 277, 342). Эти методы хорошо зарекомендовали себя при специфичном и неспецифичном контроле безопасности (102, 277, 305, 390). Однако для применения их в конкретных случаях систем обеспечения безопасности при получении продукции также требуется соответствующая адаптация.

Наконец, для каждого технологического процесса получения продукции животного происхождения необходимо создать свою систему на основе принципов ХАССП, определить критические контрольные точки и опасные факторы технологического процесса, разработать и совершенствовать системы контроля и проведения корректирующих мероприятий (26, 64, 141, 143, 172, 204, 221, 338).

Степень разработанности проблемы. Несмотря на достигнутые успехи по внедрению систем качества на различных предприятиях агропромышленного комплекса, практическая реализация такого подхода требует совершенствования всех элементов с учетом современных достижений науки и техники. Для конкретных производств необходимо разрабатывать и актуализировать все элементы систем обеспечения безопасности, определять критические контрольные точки, опасные факторы, проводить валидацию методов и верификацию приборов и оборудования.

Существующие методы контроля опасных факторов микробного происхождения на основе классического бактериологического анализа достаточно длительны и трудоемки и не совсем пригодны для скрининговых исследований микробных загрязнений в критических контрольных точках.

Из проаналированных нами литературных источников известные ускоренные методы контроля микробных загрязнений - на основе ПЦР в режиме «реального времени», ДНК-чипов, тест-систем на хромагенных средах (RIDA COUNT), иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами колойдного золота не всегда валидированы к конкретным ККТ и не все из них в применяемых модификациях обладают достаточной чувствительностью, быстродействием и не охватывают необходимый спектр контролируемых микроорганизмов.

Важная характеристика микробных загрязнений - соотношение вегетативных и L-форм, определяемая с помощью классического бактериологического анализа достаточна длительна и трудоемка, что негативно сказывается на своевременности и эффективности проведения корректирующих мероприятий для нивелирования недопустимых рисков.

Ускоренны методы контроля токсичных веществ в ККТ на основе тест-систем ферментативного ингибирования in vitro, иммуномикрочиповой технологии, иммунохроматографических тест-систем также не всегда адаптированы к конкретным ККТ, не во всех случаях обладают достаточной чувствительностью и для определенных токсикантов не установлены пределы обнаружения.

Для эффективного проведения соответствующих предупреждающих и корректирующих мероприятий требуется дальнейшее совершенствование важных элементов обеспечения безопасности производств по получения мяса, рыбы и продуктов их переработки - дезинфекции, очистки производственной и сточной вод.

На основании изложенного, были сформулированы цель и задачи нашей работы.

Целью работы являлось: Разработка концепции комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК.

В задачи исследований входило:

1. Провести анализ отдельных технологий и элементов безопасности при получении мясной и рыбной продукции для последующего усовершенствования методов и средств обеспечения безопасности в соответствии с принципами ХАССП.

2. Усовершенствовать анализ микробных контаминаций в ККТ с помощью тест - систем RIDA® COUNT.

3. Усовершенствовать определение микроорганизмов, токсинов и трансгенных белков в ККТ с помощью иммнохроматографических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота.

4. Усовершенствовать индикацию и идентификацию патогенных бактерий в ККТ с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

5. Разработать ускоренные методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики.

6. Адаптировать тест-системы на основе ДНК-чипов для индикации патогенных бактерий в ККТ.

7. Адаптировать тест-системы на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы для токсикологического контроля воды, мясного и рыбного сырья

8. Адаптировать тест-системы на основе иммуномикрочиповой технологии для оценки мясного и рыбного сырья, полуфабрикатов, сухих мясных и рыбных питательных сред на содержание остаточных количеств лекарственных средств и пестицидов.

9. Провести сравнительную оценку методик определения опасных факторов при мониторинге ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки.

10. Провести теоретическое и экспериментальное обоснования усовершенствования систем корректирующих мероприятий по очистке воды

используемых на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки.

11. Провести теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования систем корректирующих мероприятий проведения дезинфекции объектов при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки.

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена на моделях концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов (мясо- и рыбоперерабатывающей промышленности) получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, включая компоненты питательных сред для биотехнологии с применением современных ускоренных методов мониторинга опасных факторов в ККТ на основе хромогенных тест-подложек, ДНК-диагностики, индикаторных иммунохроматографических элементов с наночастицами коллоидного золота, иммуномикрочиповой технологии, тест-систем ингибирования ферментативной активности in vitro, а также новых технологий дезинфекции и очистки производственных и сточных вод.

Разработаны адаптированные методики для контроля опасных факторов микробного происхождения в ККТ технологий получения мясной и рыбной продукции на основе ускоренных хромогенных тест - систем RIDA® COUNT, давших возможность сократить в 1,5 - 2 раза время анализа по сравнению с классическими микробиологическими методами.

Разработаны адаптированные методики для контроля опасных факторов сальмонелл, скафилококкового и бутулинического токсинов, трансгенных белков в ККТ технологий получения мясной и рыбной продукции на основе иммунохроматоргафических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота, позволяющих проводить ускоренный анализ в течении 1-4 часов. При этом, впервые разработаны модификации на этапе пробоподготовки с применением сефадекса для концентрирования токсинов, повышающие чувствительность их определения в 2-3 раза.

Усовершенствован контроль опасных факторов на основе иммуномикрочиповой технологии с хемилюминисцентной детекцией, позволяющей проводить автоматизированный качественный и количественный анализ остаточных количеств пестицидов и лекарственных средств в течении 3-4 часов. При этом, впервые показана возможность применения данного метода для контроля опасных факторов в сухих мясных и рыбных питательных средах, используемых в том числе для биотехнологии.

Впервые усовершенствован контроль опасных факторов на основе ДНК-чипов и разработаны адаптированные модифицированные методики для ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, а также тест-система для одновременного анализа патогенных возбудителей: Sal. typhimurium, E. coli, S. aureus, Yer. enterocolitica, Ps. aeruginosa.

Адаптированы тест-система и методики выявления токсичных опасных факторов на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro и впервые установлены пределы обнаружения в рыбе, мясокастительных полуфабрикатах и воде для диазинона, дихлофоса и

диэтилдитиокарбамата натрия и монурона.

Впервые разработаны методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики, позволяющие сократить время анализа в 3-4 раза по сравнением с бактериологическими методами.

Усовершенствована система корректирующих мероприятий по нивелированию опасных факторов загрязнения сточной воды на основе рациональной технологической схемы очистки, включающей несколько последовательно расположенных блоков обработки: блок механической обработки - для удаления твердых частиц, блок биологической обработки -для подавления патогенных микроорганизмов и блок дезинфекционной обработки - для обеззараживания очищенной сточной воды.

Теоретически и экспериментально обоснованы эффективная стратегия и технологическая схема комплексной очистки сточных вод мясо -рыбоперерабатывающих предприятий, представляющей собой последовательную комбинацию нескольких различных по своей природе процессов, в ходе реализации которых вначале обеспечивается удаление всех взвешенных дисперсно-коллоидных частиц на участке механической очистки, затем биохимическое окисление загрязнений с помощью микроорганизмов активного ила в аэротенках и доочистка выводимых из очистных сооружений сточных вод от оставшихся органических и минеральных примесей в биофильтрах или биологических прудах.

Впервые разработан эффективный метод уменьшения количества патогенных организмов в питьевой воде, реализующий одновременно их физическое уничтожение и обеззараживание с помощью классических процессов фильтрации, коагуляции, флокуляции и осветления.

Научно обоснованны требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки ККТ технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, обеспечивающие высокую эффективность и положительные показатели: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды, низкую токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия.

Впервые, на основании изучения широкого спектра различных дезинфицирующих средств показана возможность образования Ь-форм при недостаточной концентрации рабочих растворов некоторых препаратов на основе четвертичных аммониевые соединений с помощью разработанных методик ДНК-диагностики.

Теоретически и экспериментально обоснована целесообразность использования в качестве биоцидных средств для предприятий по

получению мяса, рыбы и продуктов их переработки моюще-дезинфицирующие средства, применение которых позволяет совместить в одной операции стадии мойки и дезинфекции, сократить продолжительность санитарной обработки и расход используемой воды.

Практическая значимость работы. Результаты выполненной работы внедрены на мясо - и рыбоперерабатывающих предприятиях, что подтверждено соответствующими актами:

- Акт «Апробация методов ускоренного микробиологического и токсикологического контроля безопасности мясного сырья и мясной продукции на основе ДНК- и иммунодиагностики (ПЦР в режвме реалного времени, ДНК чипов и иммуномикрочиповой технологии, иммунохроматографических индикаторных элементов) в критических контрольных точках технологических процессов в соответствии с принципами ХАССП» - ОАО «Черкизовский мясоперерабатывающий завод» от 07.07.2015 года.

- АКТ производственного опробования на действующих очистных сооружениях метода аэробной биологической очистки от биогенных элементов и патогенной микрофлоры - ООО «Кузнецовский комбинат» 28.08.2015 года.

- Справка об использовании проектной организацией результатов научно-исследовательской работы - ОАО «МосводоканалНИИпроект» от 23.12.2014 года.

- Справка ООО «Тихий океан» № 46-11-14 от 19.11.2014 г.

- Справка ООО «Комбинат по производству пищевых продуктов

«РУСКОН» 64/исх/2 от 25.04.2015 г.

- Справка ООО «ЕВРОФИШ» № 15 от 11.02.2014 г.

По результатам исследований разработаны и утверждены:

- Патент РФ № 2535989. Способ аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов А. А., Денисова Е.А., Плотников

М.В., Крупский А.С., Чичилеишвили Г.Д., Гринь А.В., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. - Бюл. № 35.

- Патент РФ № 2535842. Установка для аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов А.А., Денисова Е.А., Плотников М.В., Крупский А.С., Чичилеишвили Г.Д., Дадасян А.Я., Гринь А.В., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. - Бюл. № 35.

- Методическое пособие по применению ускоренных методов и тест-систем иммунохроматографии для мониторинга критических контрольных точек при производстве мясной и рыбной продукции на основе принципов ХАССП (утверждены отделением ветеринарии РАСХН 12.11.2013 г.).

- Рекомендации по проведению ветеринарной дезинфекции на животноводческих комплексах и биопредприятиях - Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ, 2014 г.2014 г.

- Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясе -07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

- Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясных полуфабрикатах - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

- Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в мясе на основе иммуномикрочиповой технологии- 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

- Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в мясных полуфабрикатах на основе иммуномикрочиповой технологии - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

- Методические рекомендации по дифференциальному определению вегетативных и Ь-форм бактерий в объектах ветеринарно-санитарного контроля с использованием ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах (Утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 28.02.2001 г.).

- Методические указания по индикации Staphylococcus aureus в мясопродуктах с использованием генных зондов (Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 14.09.2000 г. № 13-5-2/194).

Основные положения, выносимые на защиту:

- усовершенствованная комплексная система обеспечения безопасности технологических процессов переработки мяса, рыбы и продуктов их переработки, включая компоненты питательных сред для биотехнологии с применением современных ускоренных методов мониторинга опасных факторов в ККТ на основе хромогенных тест-подложек, ДНК-диагностики, индикаторных иммунохроматографических элементов с наночастицами коллоидного золота, иммуномикрочиповой технологии, тест-систем ингибирования ферментативной активности in vitro, а также новых технологий дезинфекции и очистки производственных и сточных вод;

- адаптированные методики для контроля опасных факторов сальмонелл, скафилококкового и бутулинического токсинов, трансгенных белков в ККТ технологий получения мясной и рыбной продукции на основе иммунохроматоргафических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота;

- адаптированные методики контроля опасных факторов на основе ДНК-чипов для ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, а также тест-система для одновременного анализа патогенных возбудителей: Sal. typhimurium, E. coli, S. aureus, Yer. enterocolitica, Ps. Aeruginosa;

- адаптированные методики для конроля опасных факторов (остаточных количеств антибактериальных и противопаразитарных веществ) на основе тест-систем иммуномикрочиповой технологии и пределы обнаружения тетрациклина, фуразолидона, тиабендазола, левамизола в мясе и рыбе;

- адаптированые методики выявления токсичных опасных факторов на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro и пределы обнаружения в рыбе, мясокастительных полуфабрикатах и воде для диазинона, дихлофоса и диэтилдитиокарбамата натрия и монурона;

- ускоренные методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики;

- усовершенствованная система корректирующих мероприятий по нивелированию опасных факторов загрязнения сточной воды на основе рациональной технологической схемы очистки, включающей несколько последовательно расположенных блоков обработки;

- технологическая схема комплексной очистки сточных вод мясо -рыбоперерабатывающих предприятий, представляющей собой последовательную комбинацию нескольких различных по своей природе процессов, в ходе реализации которых вначале обеспечивается удаление всех взвешенных дисперсно-коллоидных частиц на участке механической очистки, затем биохимическое окисление загрязнений с помощью микроорганизмов активного ила в аэротенках и доочистка выводимых из очистных сооружений сточных вод от оставшихся органических и минеральных примесей в биофильтрах или биологических прудах;

- метод уменьшения количества патогенных организмов в питьевой воде, реализующий одновременно их физическое уничтожение и обеззараживание с помощью фильтрации, коагуляции, флокуляции и осветления;

- требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки ККТ технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, обеспечивающие высокую эффективность и положительные показатели: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды,

низкую токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия.

Личный вклад автора. Диссертационная работы выполнена автором самостоятельно и является совокупностью многолетних научных исследований. Автором лично сформулирована проблема, определены цель и задачи исследований и пути их реализации. Проведены теоретическое и экспериментальное обоснование эффективности применения методов и тест-систем оценки показателей микробиологической и токсикологической безопасности исследуемых объектов, а также проведение корректирующих мероприятий на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки. Материалы диссертации проанализированы и обобщены лично автором. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Достоверность результатов исследований. Достоверность результатов исследований подтверждаются соответствием теоретических данных с полученными результатами экспериментов, а также их математической обработкой.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены

на:

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора В.А. Першина «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИиТИБП РАСХН (г. Щелково, 1998);

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения Н.Ф. Чуклова «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИиТИБП РАСХН (г. Щелково, 1998);

- Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (дезинфекция, дезинсекция, дератизация)» ВНИИВСГЭ РАСХН (г. Москва, 1999);

- Международной научно-практической конференции «Достижения молекулярной биологии и биотехнологии в ветеринарии и зоотехнии» 2013, Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (г. Москва, 2013).

-Международной научно-практической очно-заочной конференции «Современные проблемы ветеринарно-санитарной экспертизы и пути и решения творческого наследия А.П. Ермолаева (к 100-летию со дня рождения) 2013,Омск,

-Международной научно-практической конференции посвященной ветеранам ветеринарной науки ВНИИБТЖ (г. Москва, 2013).

- Международной научно-практической конференции.- г. Щелково, 5-7 декабря - 2012.

- Международной конференции посвященной 85-летию ГНУ Самарской НИВС, г. Самара, 16 октября 2014 г.

- Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИиТИБП, Щелково, 27-28 ноября 2014 г.

- Научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии» посвященные 5-летию Ассоциации «Ветеринария, зоотехния и биотехнология» Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных работ, из них 13 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ и 15 в сборниках и трудах Всероссийских и Международных конференций.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Система качества ХАССП и ее роль в обеспечении безопасности

мясной и рыбной продукции

В последние годы за рубежом и у нас в стране получила развитие система ХАССП (анализ рисков и критические контрольные точки). В Российской Федерации утвержден ГОСТ Р 51705.20-2001 Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП. Сертификация в системе ХАССП является добровольной, однако, является, с одной стороны, важным и эффективным элементом обеспечения безопасности продукции, с весьма надежным внутренним контролем производства, с другой,- это один из главных факторов, учитываемых при обязательном подтверждении соответствия продукции требованиям безопасности. Внедрение системы ХАССП на предприятиях является необходимым условием экспорта товаров [26, 31, 65, 77, 97, 137, 141, 143, 148, 172, 204, 220, 221, 227, 231, 338, 397, 400, 443].

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Денисова Елизавета Аркадьевна, 2015 год

Источники

О1аг&а находится, в основном, в фекалиях людей и животных, особенно крупного рогатого скота. Лямблиоз является эндемическим заболеванием, у людей, и более чем у 40 видов животных, частота заболеваний (медицинских случаев), распространенность составляет от 1 до 100 % [439, 474]. В таблице 3 приводятся сводные данные о распространенности (частота заболеваний, медицинских случаи) 01агШа у человека и некоторых животных и выявляет высокий уровень лямблиоза у крупного рогатого скота. Кисты 01агШа выделяются в больших количествах в фекалиях людей и зараженных животных (симптоматическое и бессимптомное). Например, у зараженного крупного рогатого скота, выделяют до миллиона (106) кист на грамм навоза [427, 428, 442]. Кисты легко рассеиваются в окружающей среде и могут передаваться фекально-оральным способом. Фекалии бобра, собаки, ондатры и лошади также являются источником 01атШа, в том числе вида О. 1ашЬНа человеческого происхождения [328, 357, 358, 359, 378, 383, 480].

Таблица 3 - Распространенность 01атШа ¡ашЬИа [439] у человека и некоторых животных

Виды Распространенность (%)

Люди 1-5

Крупный рогатый скот 10-100

Свиньи 1-20

Часто кисты 01атШа встречающиеся в сточных и поверхностных вод, а иногда и в питьевой воде. В ходе исследования, проведенного в период между 1991 - 1995 годов [487] обнаружено, что пробы сточных вод, сырья, сырой воды и очищенной воды, содержали, соответственно, 73,0 %, 22,0 % и 19,0 % цист О1аг&а. Концентрации О1аг&а в поверхностных водах находились в диапазоне 2 - 200 кисты/100 л. Концентрация выше, чем 8 700

кисты/100 л, были связаны исключительно с весенним стоком, что с очевидностью показало важность реализации отбора проб, когда происходит определенное [347]. В целом, Giardia часто обнаруживается в относительно низких концентрациях, которые варьировались от 1 до 40 кисты/л. Предыдущий поиск [395, 414, 431], показал, что в целом концентрации кист в неочищенных сточных водах и очищенных сточных водах бытового происхождения варьировались от 5 000 до 50 000 кисты/л и от 50 до 500 кисты/л соответственно [369, 4301, 435, 487, 488].

Выживание

Кисты Giardia могут выживать в окружающей среде в течение длительного времени. В воде они могут выживать в течение недель или даже месяцев (и, возможно, дольше), в зависимости от ряда факторов, в том числе собственных характеристик штамма и воды, например температура. При увеличении температуры, имеет место значительное сокращение периода выживания кист Giardia. Кисты Giardia могут выжить до 77 суток в водопроводной воде при 8 °С, по сравнению с 4 сутками при температуры 37 °С [317]. Подобный эффект сохраняется в речных и озерных водах [346]. Это действие температуры приводит к пиковым концентрациям Giardia [395 430]. Воздействие УФ лучей также сокращает выживание 01аг&а.

Воздействие

Заражение происходит фекально-оральным путем, либо напрямую, либо косвенно, т.е. при потреблении питьевой воды, или контаминированными продуктами питания. Животные могут также играть важную роль в передачи зоонозных Giardia. Установлено, что крупный рогатый скот является носителям рода 01аг&а заразного для человека, как собаки и кошки. Генотипы Giardia были обнаружены также у диких животных, включая бобра и оленя [439, 476].

Имеется ряд доказательств, основанных на передаче зоонозных Giardia, большинство из них является косвенными или ограниченными

средствами контроля. Таким образом, неясно, с какой частотой и в каких обстоятельствах происходит передача зоонозов. В целом, эти данные указывают на то, что, в большинстве случаев, животные не являются первоначальным источником инфекции 01агШа для человека. Однако, они обеспечивают размножение генотипов 01агШа, присутствующих в других источниках, например, в загрязненной воде. Генотип 01агШа встречается у домашних животных и является преобладающим для крупного рогатого скота, которые могут быть заражены зоонозным генотипом 01агШа заразным для человека. Вполне вероятно, что зоонозные генотипы О1аг&а передаются крупным рогатым скотом или тамим источником, каким являются загрязненные воды. Учитывая, что навоз телят, зараженных 01агШа, обычно содержат от 105 до 106 кист на грамм, эти животные могут играть важную роль в передаче аагйа [320, 358, 359, 383, 413, 416, 454, 469, 474, 475, 479, 480].

Данные свидетельствуют о том, что генотипы О. ¡ашЬИа заразные для человека передаются диким животным посредством загрязненных сточных вод. По мере роста населения и интенсивности деятельности человека усиливается объем сбрасываемых сточных вод, увеличивается потенциал инфекционных загрязнений источников пресной воды, следовательно, требуется учитывать возможность загрязнения сточными водами. Установлено, что некоторые вспышки водного происхождения являются результатом загрязнения сточных вод [360, 432, 488]. Существует значимые связи между использованием воды человеком в различных целях и распространенностью О. ¡ашЬИа у животных и в поверхностных водах. С использованием методов генотипирования были получены новые доказательства существования этой связи. Так что вполне вероятно, что дикие, сельскохозяйственные и домашние животные могут играть роль резервуаров инфекционных простейших О. ¡ашЬИа для человека. Если инфицированные животные содержатся выше по течению или вблизи водозаборов станций водоподготовки питьевой воды, они могут играть

важную роль в передаче Giardia водным путем. Таким образом, управление водосборами для мониторинга сбросов сточных вод и популяций водных млекопитающих вблизи водозаборов важно для предотвращения заболеваний [357, 463, 476].

Болезни, передающихся через воду

Giardia - это простейшие кишечные наиболее часто встречающиеся во всем мире [310, 364]. Всемирная Организация здравоохранения оценивает частоту заболеваний от лямблиоза в 200 млн. случаев в год [363]. Giardia является частой причиной вспышки инфекционных заболеваний, передающихся через воду в странах мира [369], Giardia был возбудителем болезни чаще всего связанной с вспышкой инфекционных заболеваний, связанных с питьевой водой [459].

Cryptosporidium.

Источники

Люди и животные, особенно крупный рогатый скот, являются значительным наиболее предпочтительным резервуаром Cryptosporidium. Случаи криптоспоридиоза у человека были зарегистрированы в более чем 90 странах на шести континентах [349, 365]. Распространенность криптоспоридиоза у людей колеблется в диапазоне от 1 до 20 %, а самые высокие показатели были зарегистрированы в развивающихся странах [329, 349, 419, 425, 488, 502]. Животные, особенно крупный рогатый скот, являются значимым источником Cryptosporidium. В анализах, отобранных у сельскохозяйственных животных, обнаружены, Cryptosporidium в пробах навоза от крупного рогатого скота (20 %), овец (24 %), свиней (на 11 %) и лошадей (17 %) [314, 429]. Наличие ооцист чаще находят у телят, чем у взрослых животных. У зараженных телят, могут выделять до 10 ооцист на грамм навоза [466]; таким образом, они представляют важный источник Cryptosporidium в поверхностных водах.

Таблица 4 - Распространенность Cryptosporidium spp. у человека и некоторых животных

Распространенность (%)

Люди 1-5

Крупный рогатый скот 10-100

Свиньи 1-20

Ооцисты Cryptosporidium легко распространяются в окружающей среде и могут передаваться фекально-оральным путем. Питьевая вода и загрязненные пищевые продукты, являются важным механизмом для передачи Cryptosporidium. Контакт с животными, особенно животными на откорме, также, представляет распространенный путь передачи инфекции.

Обычно ооцисты Cryptosporidium находят в сточных и поверхностных водах, а иногда и в очищенной воде. Анализ имеющихся исследований показал, что пробы сточных вод, сырья и очищенной воды содержали, соответственно, 6,2 %, 4,6 % и 3,6 % ооцист Cryptosporidium [488]. Концентрации Cryptosporidium в поверхностных водах, как правило, изменялась в пределах от 1 до 100 ооцист/100 л. Сообщалось о том, что концентрация выше, чем 10200 ооцист/100 л, были связаны со значительными весенними паводками [369, 450].

Обзор данных о качестве воды в поверхностных источниках показал, что концентрации Cryptosporidium в воде в Северной Америке и в Европе различаются [347, 411, 438]. Концентрации Cryptosporidium варьировались от 0,006 до 250 ооцист/л. В рамках этой инициативы были собраны данные мониторинга качества девяти источники воды в Европе (Франция, Германия, Швеция и Соединенное Королевство) и источника воды в Австралии. В целом, Cryptosporidium часто обнаруживается в относительно низких концентрациях, которые изменялись в диапазоне 0,05 - 4,5 ооцист/л. Предыдущие обследования показали, что концентрация ооцист в неочищенных сточных водах и очищенных сточных вод бытового

происхождения изменялись в диапазонах 1000 - 10000 ооцист/л и 10-1000 ооцист/л соответственно [418].

Мало что известно о присутствии Cryptosporidium в грунтовых водах. Исследования, проведенные в США и других странах, в мире показали, что появления ооцист в артезианских и грунтовых водах достаточно случайно и концентрации ооцист были низкими [370, 377, 422].

Определено незначительное содержание Cryptosporidium в очищенной воде в низких концентрациях [352, 389, 430, 435], за исключением некоторых случаев, когда ооцисты были обнаружены в очищенной нефильтрованной воде поверхностных источников водоснабжения [369, 488].

Выживание

Установлено, что ооцисты Cryptosporidium выживают в холодной воде при 4 °C в течение периода продолжительностью до 16-18 месяцев [314]. Отмечено, что ооцист C. parvum может противостоять различным экологическим стрессам, включая замораживание и воздействие морской воды [450]. Как правило, срок выживаемости ооцист уменьшается с увеличением температуры [411, 438].

Отмечена также низкая жизнеспособность ооцист в фильтрованной воде. Исследование, показали, что в фильтрованной воде 22 ооциста на 24 имели неустойчивую морфологию (т.е. отсутствие спорозоитов и деформацию или сужение цитоплазмы) [408].

Воздействие

Прямой контакт с домашним скотом и косвенный контакт с водой, загрязненной навозом, важные пути передачи Cryptosporidium [358, 365, 392, 453, 468]. Крупный рогатый скот является важным источником C. parvum в поверхностных водах. Проведенный обзор еженедельных проб воды ручья, взятых в течение 10 месяцев вверх и вниз по течению от комплекса по откорму крупного рогатого скота, показал, что концентрация ооцист, были

значительно более высокими, вниз по течению ручья (среднее значение 13 ооцист/100 л, диапазон от 2 до 300 ооцист/100л) по сравнению с пробами, отобранными вверх по течению (среднее значение 6/100л, диапазон от 1 до 35 ооцист/100л) [431]. Наблюдается значительный всплеск концентрации ооцист в пробах, отобранных ниже по течению ручья. Во время вспышки заболевания подтвержден криптоспоридиоз, передающихся через воду, был обнаружен ооцист в 70 % пробах навоза крупного рогатого скота, отобранных в бассейне, на выходе после очистки [430].

Водоплавающие птицы также могут являться источниками Cryptosporidium. Гистологические исследования органов дыхания и желудочно-кишечного тракта птиц, показали, после семи суток инокуляции, простейшие были не в состоянии заразить птиц [374]. В рамках исследования [374], Обнаружено, что помет диких гусей содержал ооцист Cryptosporidium в семи из девяти изученных мест. Этими исследованиями, подтверждается, что водоплавающие птицы могут быть заражены ооцистами Cryptosporidium, которые они могут транспортировать и распространить в окружающей среде, в том числе в источниках питьевого водоснабжения [375, 441].

Обзор рисков для здоровья, связанных с наличием кишечных простейших в питьевой воде, рассматривает и оценивает риски для здоровья, которые были выявлены, и которые связаны с наличием кишечных простейших в питьевой воде. Обзор включает в себя оценку новых исследований и подходов, с учетом ограниченных методов обнаружения простейших в питьевой воде. Цель обработки, необходимой для поддержания здоровья, требует уменьшения не менее чем на 3 log простейших, ответственных за кишечные заболевания, в питьевой воде.

Киста Giardia и ооциста Cryptosporidium могут выживать в окружающей среде в течение длительного времени, в зависимости от характеристик воды. Обнаружено, что они могут противостоять различным экологическим стрессам, в частности, замораживанию и воздействию морской воды. Кисты и ооцисты обычно часто встречаются в водных

источниках. Внезапное и быстрое поступление этих микроорганизмов в водные источники приводит к повышению риска инфицирования, связанного с передачей питьевой воды.

Микробиологическая оценка источников воды должна быть частью регулярных медико-санитарных обследований с целью определения безопасности и должна содержать регулярный целенаправленной мониторинг на наличие кишечных простейших Giardia и Cryptosporidium, а также других патогенов, передающихся через питьевую воду. Наблюдение за простейшими в водном источнике должно быть направлено на получение информации о потенциальных источниках загрязнения фекалиями: санитарного обследования в сочетании с данными об атмосферных осадках, таянии снега, течения рек и мутности воды. Это позволит определить условия, которые могут привести к недопустимо высокому загрязнению водного источника. В случаях, когда невозможно проводить регулярный контроль присутствия Giardia и Cryptosporidium (например, в небольших системах водоснабжения), возможно проведение периодической оценки концентрации цист и ооцист. Эти данные должны быть основаны на информации, полученной в ходе исследования источника воды, а также других параметров качества воды, которые могут надежно информировать о риске и степени загрязнения водоемов фекалиями в водном источнике.

После определения качества источника воды необходимо установить степень удаления патогенов и принять эффективные методы обработки для получения безопасной обработанной питьевой воды. В общем, необходимо обрабатывать все источники водоснабжения и поддерживать в любое время достаточные остаточные концентрации дезинфицирующих средств в разводящей водопроводной сети. Наиболее эффективным методом для снижения количества простейших в питьевой воде является сочетание физической элиминации (например, фильтрации) и дезинфицирующего барьера (например, УФ-лучей). Учитывая устойчивость простейших к дезинфицирующим средствам, широко используется, например хлор.

Системы очистки воды, которые в настоящее время используют только хлор, как способ обработки, нуждаются в повышенных значениях «концентрация х время» (CT) для эффективной инактивации кисты Giardia. В случае с Cryptosporidium, значения СТ должны быть особенно высокими, так как иначе было бы затруднено использование хлора для инактивации ооцист этого паразита [32, 102, 104, 148, 175, 209, 411].

Отсутствие в сточной воде Escherichia coli и бактерий группы кишечной палочки не обязательно означает отсутствие кишечных простейших, которые остаются самыми надежными показателями при проверке качества микробиологических исследований питьевой воды. Мониторинг подхода к многочисленным барьерам «от источника - к крану», в ассоциации с мониторингом ряда показателей (например, мутность, остаточный хлор, E. coli), могут быть использованы для проверки качества обработки воды и, таким образом, обеспечить приемлемое микробиологическое качество.

При наличии кишечных простейших в обязательном порядке требуется обработка воды, при этом рекомендации по Giardia и Cryptosporidium предусматривают соответствующую ликвидацию или инактивацию, как минимум, на 3 log кист и ооцист. В зависимости от качества источника воды для достижения более значительной логарифмической инактивации, возможна более интенсивная обработка. Методы обработки и меры защиты водосборов или скважин, необходимые для достижения их эффективности в снижении риска заболеваний, передающихся через воду, должны быть в обязательном порядке реализованы и поддерживаться, особенно если источник воды может быть загрязнен фекалиями или в прошлом уже был причиной, приведшей к вспышкам заболеваний, передающихся через воду, с помощью Giardia или Cryptosporidium.

Возможна также количественная оценка микробного риска (EQRM), чтобы определить риск, присущий конкретной системе водоснабжения. В EQRM используются имеющиеся данные о качестве воды источника и

методы обработки, а также особенности, характерные для патогенных микроорганизмов. Эти материалы позволяют произвести оценку нагрузки по болезням, связанную с воздействием патогенных микроорганизмов, находящихся в источнике питьевой воды. В рамках этой оценки, можно определить вклад в изменение качества воды источника и эффективность обработки в общем риске. Такой анализ может использоваться для оценки, если осуществляются адекватные меры контроля, и если приходится прибегать к дополнительной обработке или оптимизировать существующую обработку, даже если она может помочь установить ограничения критических контрольных точек (ККТ) [97, 148, 172, 221, 332, 338, 341, 350].

В количественной оценке микробного риска EQRM рассматриваются различные кишечные простейшие, которые, благодаря своим характеристикам, являются наиболее предпочтительными представителями простейших. Предполагается, что если обработка эффективна против этих простейших, то она будет также эффективна и против всех простейших, вызывающих аналогичное воздействие. Для оценки риска были выбраны простейшие Cryptosporidium parvum и Giardia lamblia, учитывая их распространенность, высокий потенциал и способность привести к вспышкам заболеваний, а также их устойчивость к дезинфекции хлором.

Следует ограничить концентрации Giardia и Cryptosporidium, используя подход «от источника до крана» для защиты качества питьевой воды. Этот подход предусматривает оценку системы питьевого водоснабжения в целом, от источника воды до потребителя.

Оценка источников воды должна быть частью медико-санитарных обследований. Она должна включать в себя регулярный контроль на наличие Giardia и Cryptosporidium. Оценка должна также включать определение потенциальных источников загрязнения колиформного происхождения водосборного бассейна или водоносного горизонта, равно как и потенциальные пути, которые могут обеспечить поступление простейших в источник воды и существенно повлиять на качество воды. Источники

колиформного происхождения, поступающие со станций очистки стоков, могут содержать значительное количество Giardia и Cryptosporidium. Отходы от сельскохозяйственных животных, диких животных и других животных, также рассматриваются как важный источник видов Giardia и Cryptosporidium, которые способны вызвать заболевания у человека.

Важно реализовать полную оценку источников грунтовых вод для того, чтобы классифицировать их как подпадающих под прямое влияние поверхностных вод или считающихся менее уязвимыми к загрязнению колиформными микроорганизмами (т.е. те, которые не находятся под прямым влиянием поверхностных вод). Эти оценки должны включать, как минимум, гидрогеологические изыскания, оценку целостности скважин и исследования в области здравоохранения, физические характеристики региона и мероприятия, которые там проводятся. Грунтовые воды считаются менее уязвимыми к фекалиями и не должны содержать простейших. Однако, даже эти источники грунтовых вод, имеют некоторую степень уязвимости и должны периодически переоцениваться.

Оценки качества воды должны рассматривать динамику «наихудшего случая» для каждого источника воды. Например, это может быть короткий период, когда качество источника воды особенно низкое после грозы. В краткосрочной перспективе это снижение качества может представлять большую часть риска в системе снабжения питьевой водой. Отбор проб и анализ образцов источника воды для проверки наличия Giardia и Cryptosporidium могут содержать важную информацию для определения степени необходимой обработки, а также необходимых мер по снижению последствий, которые должны быть реализованы для снижения концентрации цист и ооцист до приемлемого уровня. Если отбор проб и анализ воды из источника невозможны то необходимо определить наличие Giardia и Cryptosporidium (например, в небольших системах водоснабжения), и концентрации цист и ооцист. Произведенные оценки должны включать анализ информации, полученной при оценке источника воды, а также другие

параметры качества воды, которые могут показать риски и степень загрязнения водоемов фекалиями. Вследствие того, что эти оценки имеют большую степень неопределенности, то следует применять другие критерии безопасности во время проектирования или модернизации очистных сооружений. Либо необходимо предусмотреть более значительное чем расчетное логарифмическое снижение микробного риска, используя подход количественной оценки EQRM, для того, чтобы обеспечить микробиологически приемлемое получение воды питьевого качества [23, 45, 167, 456, 477, 490, 492, 497, 502].

Информация, полученная в ходе оценки источника воды, является важной частью оценки риска местности в целом. Эта информация должна быть использована в сочетании с информацией по обработке воды в водораспределительной сети, чтобы более точно оценить риски от источника до водоразборного крана. При этом предполагает использовать количественную оценку микробного риска EQRM в качестве инструмента, который может помочь лучше оценить системы водоснабжения и степень их воздействия на изменение качества воды источника и эффективность процесса обработки, в том числе потенциального воздействия опасных событий, таких, как грозы, непредвиденные загрязнения или неисправности систем обработки. Анализ, полученный таким образом, позволяет определить, являются ли осуществленные меры контроля эффективными или необходимо прибегать к дополнительной обработке либо оптимизировать существующую. Кроме того, анализ позволит установить обоснованные пределы для критических контрольных точек.

В случае, когда обработка воды необходима, требуется ликвидация и инактивация не менее чем на 3 log кист Giardia или ооцист Cryptosporidium. Для многих поверхностных источников питьевой воды, требуется еще более значительное логарифмическое сокращение.

Снижение микробиологических загрязнений может быть получено физическими способами очистки, такими как фильтрация, а также и

инактивацией, химической дезинфекцией и ультрафиолетовым облучением. В целом, обработка обеспечивает снабжение потребителей поверхностными или подземными водами, подверженными микробиологическому воздействию. Обработка должна включать, как минимум, фильтрацию и соответствующую дезинфекцию. Для того, чтобы определить характер и уровень обработки, необходимо учитывать потенциальные колебания качества воды, в том числе ухудшение качества воды в краткосрочной перспективе и изменение эффективности обработки. Для определения изменчивости обработки (очистки) могут быть использованы пилотные испытания или другие экспериментальные способы. В системах с водораспределительной сетью, следует поддерживать в любое время остаточную концентрацию дезинфицирующих средств [206, 207, 208, 209, 223, 224].

В рамках подхода, состоящего из нескольких барьеров, необходимо регулярно контролировать различные показатели (например, мутность, концентрацию остаточного хлора и наличие E. coli), чтобы убедиться, что вода должным образом очищена и обработана и что, таким образом, достигнута цель очистки и обработки, направленная на сохранение здоровья людей и животных. Эти показатели могут также использоваться для оценки эффективности распределительной сети и микробиологического контроля качества воды во всей сети до водоразборного крана потребителя.

Простейшие представляют собой разные группы микроорганизмов эукариотов, как правило, одноклеточные. Их можно разделить на две функциональные группы: кишечные паразиты и простейшие свободные. Причинами заболевания людей, вызванных простейшими свободными, является, как правило, потребление зараженной воды [441].

Простейшие кишечные паразиты, часто присутствует в кишечнике человека и других млекопитающих. Как энтеральные бактерии и вирусы, они могут попадать в воду в результате прямого или косвенного загрязнения с фекалиями человека или животных [402, 459]. Микроорганизмы этой группы

способны производить кисты и ооцисты, чрезвычайно устойчивые к экологическим стрессам и обычным методам обеззараживания питьевой воды.

Простейшими кишечными, присутствующими в источниках воды и наиболее часто связанными с заболеваниями, передающимися через воду, являются Cryptosporidium и Giardia. Некоторые штаммы (Toxoplasma gondii, Cyclospora cayetanensis и Entamoeba histolytica) также являются патогенными, они могут выживать в течение длительного времени в окружающей среде и являются устойчивыми к химической дезинфекции.

Микроорганизмы-индикаторы регулярно контролируются в рамках барьерного подхода «от источника до крана», причем для оценки качества питьевой воды могут служить E. coli и колиформы. Присутствие кишечной палочки в воде является показателем фекального загрязнения, и, следовательно, сигнализирует возможность повышенного риска для здоровья, что наблюдается при наличии болезнетворных организмов, таких как простейшие кишечные. Однако, отсутствие E. coli не обязательно означает, что простейшие кишечные также отсутствуют. Все группы кишечной палочки не относятся собственно к фекальным, и, следовательно, не могут быть использованы для выявления фекального загрязнения или потенциального наличие энтеральных возбудителей. Они используются, скорее, чтобы выявить общие проблемы, связанные с качеством воды. Технические документы, рекомендации по E. coli и общие колиформы, включают более подробно роль кишечной палочки и бактерий кишечной палочки в управлении качеством воды [353, 441].

По сравнению с простейшими, E. coli и семейство группы бактерий кишечной палочки не выживают так долго в окружающей среде и являются более чувствительными ко многим дезинфицирующим средствам, используемых при очистке питьевой воды [353]. Таким образом, хотя присутствие E. coli и указывает на фекальное загрязнение и, следовательно, на возможное более широкое присутствие простейших кишечных, ее

отсутствие не обязательно означает, что простейшие кишечные также отсутствуют. В качестве доказательства, цисты Giardia и ооцисты Cryptosporidium были обнаружены в обработанной питьевой и фильтрованной воде, которые удовлетворяли требованиям нормативных существующих стандартов, но были связаны с вспышками заболеваний, передающихся через воду [309, 343, 408, 417, 426, 452].

Таким образом, контроль многократных барьеров «от источника до крана», необходим для мониторинга рисков, связанных с простейшими кишечных заболеваний. Когда каждый барьер системной обработки питьевой воды контролируется, можно убедиться, что система работает надлежащим образом, что качество источника воды, E. coli и общие колиформы удовлетворяют предъявляемым требованиям. Бактериологические показатели, используемые в сочетании с информацией по эффективности процесса обработки (например, эффективности фильтров, соответствующих сочетаний концентрация^время [CT] для инактивации Giardia, дозы УФ, и т.д.), позволяют подтвердить, что вода была надлежащим образом очищена и обработана и что она, таким образом, имеет микробиологически приемлемое качество.

Принятие подхода, основанного на оценке рисков, является важным условием эффективного управления системами снабжения водой [432]. Такой подход должен заключаться в оценке всей системы, начиная с водозабора или водоносного горизонта и до подачи воды к потребителю, проходя через системы обработки и водораспределения.

Современные рекомендации, касающиеся качества воды, стимулируют реализацию несколько барьеров для обеспечения безопасности питьевой воды. При таком подходе, используются различные индикаторы-микроорганизмы, показатели мутности и концентрации остаточных дезинфицирующих средств для определения качества обработанной питьевой воды. В частности, E. coli и общие колиформы являются примерами бактериологических показателей, часто используемых для оценки

микробиологического качества питьевой воды. Индикаторы не дают количественной информации о патогенных организмах, они свидетельствуют только о потенциальной склонности к заболеванию населения, связанному с качеством питьевой водой. Количественная оценка микробного риска становится все более используемой как элемент подхода к многократным барьерам. Количественная оценка заключается в использовании данных о качестве водоисточников, информации, связанной с процессами обработки и характеристиками возбудителя для оценки тяжести заболеваемости, связанной с воздействием патогенных микроорганизмов в источнике воды. Количественная оценка микробного риска полезна, поскольку она позволяет оценить каждую систему водоснабжения и получить информацию о чистоте ландшафта местности, чтобы:

- понять, как изменения в качестве источника воды могут повлиять на качество микробиологического исследования полученной питьевой воды;

- определить действующие меры контроля, являющиеся адекватными, учитывая особенности изменения на каждой местности;

- изучить возможность улучшения микробиологического качества питьевой воды по созданию дополнительных технологических процессов обработки или оптимизации существующих процессов;

- оценить возможность оказания помощи в установлении пределов для критических контрольных точек в системе водоподготовки.

Особенности изменений местного ландшафта, должны учитывать потенциальные воздействия опасных событий, как грозы, непредвиденные загрязнения и неисправности системы обработки при водоподготовке. Надо учитывать следующие моменты при интерпретации результатов количественной оценки микробного риска (EQRM):

- качество данных количественной оценке микробного риска зависит от качества входных данных;

- некоторые данные могут предполагать высокую степень неопределенности (например, данные о качестве водоисточников и степени удаления патогенных);

- количественная оценка микробного риска, опирается на предположения, которые не обязательно четко отражают состояние систем водоснабжения или воздействия на патогены в системе обработки.

В связи с этими ограничениями, необходимо по возможности использовать количественную оценку микробного риска, для того, чтобы попытаться оценить уровень заболеваемости среди населения, Зато оценки нагрузки по заболеваемости, полученные в результате количественной оценки микробного риска, являются полезными для оценки данной определенной местности в рамках подхода в несколько барьеров, направленных на обеспечение безопасности питьевой воды [31, 98, 99, 171, 199, 351, 354, 355].

Основные патогенные микроорганизмы, содержащиеся в сточных

водах

Станции очистки сточных вод принимают различные потоки такие, как коммунальные стоки и сточные воды промышленных предприятий, отвечающие требованиям сброса в канализацию. Именно в этих водах содержится большинство микроорганизмов, поступающих, в основном, с фекалиями.

Болезнетворные микроорганизмы, включают, в основном, в порядке возрастания размеров: вирусы, бактерии, простейшие и гельминты. Они имеют различные последствия для здоровья и являются причиной нетяжелых как гастроэнтерит, так и смертельных болезней, таких как холера [361, 367, 377, 386].

Большинство бактерий и простейших, которые можно найти в сточных водах, а также симптомы заболевания, с которыми они ассоциируются, представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Основные бактерии, обнаруженные в сточных водах

Бактерии Заболевание

Enterococcus faecalis Сопротивляемость почти всем антибиотикам

Гастроэнтерит, других инфекций

Salmonella Гастроэнтерит и сепсис

Shigella Диарея

Enterobacter Циститы, плевриты, менингиты

Yersinia enterocolitica Диарея

Legionella Пневмония, другие респираторные заболевания

Escherichia Coli (certaines souches) Диарея

Cam pylobacter _ jejun i Гастроинтениты, диареи

Staphylococcus Кожные и подкожные заболевания

Pseudomonas aeruginosa ЛОР инфекции, сепсис

Простейшие

Giardia lamblia Брюшные боли, диарея (лямблиоз поддерживание инфекцию людей тонкокишечный не бактерийный имеющий высокую частоту заболеваемости)

Cryptosporidium parvum Диарея сопровождаемая брюшными болями, рвотой и высокой температурой

Toxoplasma Токсоплазмоз

Microsporidium Диарея

Гельминты

Taenia Диарея, мышечная боль

Ascaris Расстройства пищеварения

Показатели микробиологического загрязнения воды На практике, технически и экономически невозможно контролировать все болезнетворные микроорганизмы, которые могут вызвать инфекции, передающиеся через воду. С учетом преобладающих фекальных микроорганизмов в основном используются показатели загрязнения фекалиями, для того чтобы выявить возможное присутствие патогенных микроорганизмов и произвести оценку микробиологического загрязнения

воды. Этими индикаторами являются: микробы-индикаторы и тест-микробы. Отметим, что присутствие микробов индикаторов в воде показывает, с какой вероятностью, но не определенностью, наблюдается загрязнение патогенными микроорганизмами одного и того же фекального происхождения загрязнения. Напротив, их отсутствие не означает отсутствия риска для здоровья [47, 129, 133, 141, 164].

Выбор этих показателей имеет решающее значение и должен отвечать ряду критериев, перечисленных в таблице 6.

Таблица 6 - Требования к критериям индикации микроорганизмов

По экологии Индикаторы должны:

Присутствовать в то же время, что и возбудители болезней

Появляться в большем количестве, чем патогенные

Вести себя по отношению лечения, предусмотренные способ, как можно ближе патогенов,

Широко развиваться, независимо от других организмов и ингибироваться другими бактериями

Не размножаться после обработки (очистки)

По аналитической возможности Индикаторы должны:

Быстро развиваться на простых и специфичных средах

Производить простые реакции и признаки, позволяющий однозначно идентифицировать род

Быть случайно распределенными в исследуемой пробе

Быть легко идентифицированными и регистрированными

Показатели бактериального фекального загрязнения воды Традиционно, используются микробы тестирования по общему количеству термоустойчивой группы кишечной палочки, а также, иногда, фекальных стрептококков.

Все группы кишечной палочки содержат несколько видов бактерий, обладающих особенностями свойств структуры и культуры при 35-37 оС. Эти показатели не являются специфическими характеристиками фекального загрязнения.

Все термоустойчивые группы кишечной палочки (так называемые фекальные колиподобные бактерии) имеют те же свойства, структуры и культуры бактерий кишечной палочки, но после инкубации при температуре 44 оС. Это наиболее представительные кишечные бактерии, так как они являются хозяева желудочно-кишечного тракта человека или животного. Они являются относительно надежным показателем присутствия, выживания или резистентности к терапии или обработки. В подавляющем большинстве они представлены Escherichia Coli (между 95 и 98%). Эта бактерия имеет значительное преимущество для конкретной среды обитания нормального кишечного тракта и не размножается в окружающей среде.

Фекальные стрептококки также используются из-за их лучшего сопротивления в среде.

Используемым методом анализа является инкубация показательных микробов на культуральной среде, применяемая для выделения разыскиваемой колонии. На этой стадии инкубации производят подсчет бактерий (единица измерения: КОЕ/100 мл).

Однако, были зарегистрированы многие вспышки заболеваний, передающихся через воду, хотя, не было зарегистрировано никакого превышения показателя бактериальной загрязненности. Эти эпизоды были вызваны патогенными микроорганизмами другой природы, не имеющие традиционных удовлетворительных показателей, в данном случае, в частности Cryptosporidium и Giardia [41, 398, 404, 422, 431, 436, 452].

Наиболее существенное значение представляют эти два вида простейших, т.к. они являются главными действующими инициаторами заболеваний, широко распространенными на земле.

Определение ооцист и кист осуществляется путем центрифугирования сточной воды, образцы затем сушат и закрепляют метанолом. Затем выполняется иммунофлуоресценция: антитела против ооцист и добавляются кисты, все содержимое инкубируют и после появления окраски проводят анализ под микроскопом (единица измерения: число цист/литр) [432].

Потенциал для передачи эпидемии микроорганизмов зависит от их биологических свойств, в том числе их инфекционности, устойчивости к процессам очистки сточных вод, а также способности выживать и развиваться.

Для возбудителей инфекции взаимоотношения доза-эффект описаны точными значениями, такими как минимально инфекционная (отравляющая) доза (БМ1). Она соответствует наименьшему количеству микроорганизмов, которые должны быть поглощены, чтобы проявились симптомы болезни по крайне мере у некоторого количества людей. Доза БМ1 устанавливает связь между уровнем воздействия микроорганизмов и вероятностью развития смертельных случаев (таблица 7) [192, 346].

Таблица 7 - Средние БМ1 патогенных микроорганизмов в сточных

водах

Микроорганизмы БМ1

Бактерии 102-106

Простейшие 10-102

Надо отметить, что значения минимально инфекционной дозы БМ1 для патогенных микроорганизмов получить трудно, т.к. отношения дозы/ответы зависят от возбудителя, хозяина и условий экспозиции. Действие патогенного возбудителя будет зависеть от серотипа и изучаемого штамма. Более того, вирулентность лабораторных штаммов, как правило, отличается от природных штаммов. Физиологическое состояние хозяина будет также определять ответ: его иммунный статус, возраст и пол.

Поэтому трудно экстраполировать результаты, полученные в одной географической области, с другой областью, имеющих разные природные условия.

Очистка сточных вод включает несколько этапов.

Предварительная обработка

Устройства предварительной обработки присутствуют во всех очистных сооружений с целью ликвидации твердых грубых загрязнений, которые могут помешать дальнейшей обработке или привести к повреждению оборудования.

Предварительная обработка в зависимости от необходимости состоит из 3 этапов:

- решетки для удаления отходов больших размеров;

- песколовки для удаление песка, размер частиц которого превышает 200 мкм;

- жироловки для удаления жира и масла.

Последним этапом предварительной подготовки является обезмасливание и обезжиривание с помощью напорной флотации, что позволяет удалить 80-90% жиров и плавучих материалов (от 30 до 40 % всего жира).

Сточные воды после предварительной обработки содержат только растворенные вещества и вещества, находящиеся во взвешенном состоянии [45, 102, 104, 148, 175, 209, 411].

Первичная обработка (очистка): осаждение.

Первичная обработка состоит в осаждении взвешенных твердых частиц (ВВ) в отстойнике. Удаление части взвешенных твердых частиц позволяет облегчить последующую биологическую очистку. Эффективность очистки зависит от гидравлического времени пребывания воды в сооружении и скорости оседания взвешенных веществ. Оседающие взвешенные вещества увлекают за собой как микро загрязнения, так и микроорганизмы. Сточные

воды после первичной очистки переходят на следующий этап очистки, тогда как осевшие твердые вещества удаляются из системы.

В некоторых случаях, в целях повышения эффективности осаждения, используется физико-химическая обработка, которая включает фазу коагуляции/флокуляции. Такая обработка позволяют удалить до 90 % взвешенных веществ.

В сточной воде, очищенной на этапе осаждения, содержатся мелкодисперсные, коллоидные и растворенные минеральные и органические вещества.

Вторичная обработка: биологическая очистка

Возможны два направления очистки сточных вод от органических биоразлагаемых соединений:

- анаэробный: он осуществляется в восстанавливающей среде, где органический углерод трансформируется в СН4 и биомассу. Этот процесс производится анаэробными бактериями. Анаэробная очистка используется на очистных сооружениях при обработке промышленных стоков сильно загруженных органическими загрязнениями;

- аэробный: устанавливается в водах с достаточной аэрацией, где органический углерод и биогенные элементы разлагаются при бактериальном дыхании.

Аэробный путь может осуществляться интенсивной (обычной) или экстенсивной обработками.

Интенсивные методы очистки

Интенсивная аэробная биологическая очистка состоит из двух последовательных этапов:

- Аэротенк: бассейн содержит микроорганизмы, которые, благодаря аэрации 02, потребляют растворенные загрязнения и развиваются. Эта смесь образует активный ил;

- Вторичный отстойник: после аэротенка, смесь сточной воды и активного ила проходит через вторичный отстойник, где происходит разделение очищенной сточной воды от сложного биоценоза активного ила, осевшего на дно отстойника.

Существуют различные типы процессов в аэротенке:

- биологические процессы со свободными культурами в аэротенке,

- с активным илом в системе мембранного биологического реактора (МБР),

- с иммобилизованными биологическими культурами в биофильтрах.

Очистка активным илом.

Этот процесс биологической обработки используется практически на всех станциях биологической очистки. В этом процессе бактерии находятся во взвешенном состоянии в воде аэротенка при постоянном перемешивании. Благодаря этому активный ил находится в постоянном контакте с органическими веществами, которыми питаются бактерии, и с кислородом, необходимым для их ассимиляции. Для того, чтобы сохранять постоянное и достаточное количество бактериальной массы, производят рециркуляцию части активного ила, выделенного во вторичном отстойнике, в аэротенк. Оставшаяся доля (избыточный активный ил) отводится на блоки обработки осадка [489, 492, 502].

Таким образом, станция биологической очистки сточных вод активным илом включает:

- аэротенк, в котором вода очищается от органических загрязнений (биогенных элементов) в контакте с массой активного ила и растворенного кислорода,

- вторичный отстойник, в котором происходит разделение очищенной воды и бактериальной культуры,

- устройство для рециркуляции активного ила, обеспечивающее возврат к аэротенку активного ила, выделенного из вторичного отстойника, а также устройство удаления и утилизации избыточного активного ила.

Очистка в мембранном биологическом реакторе ( МБР).

Система мембранного биологического реактора (МБР) является вариантом процесса очистки с активным илом, в котором фильтрация на мембранах заменяет вторичный отстойник. Разделения фаз осуществляется через мембрану, которая удерживает твердую фазу и позволяет воде пройти до следующей очистки. В этой системе чаще используются органические или минеральные мембраны пористостью 0,2 мкм. На мембранах дополнительно развивается биомасса в виде биопленки. Система МБР является очисткой, которая сочетает в себе процесс фильтрации совместно с микробиологической активностью.

Существует два типа систем МБР.

- система с рециркуляцией, где мембранный модуль находится за пределами биологического модуля,

- система, где мембранный модуль находится в биологическом модуле в погружном состоянии.

Третичная экстенсивная очистка: пруд доочистки и слой гравия

Пруды и слой гравия используют природные механизмы для очистки (обработки) сточных вод. Такая система очистки чаще используется для небольших расходов сточных вод из-за их простоты, неприхотливости и хороших показателей очистки стоков. В меньшей степени такая система очистки подходит для больших расходов, вследствие больших площадей сооружений.

Очистка в прудах обычно включает три типа бассейнов: бассейн анаэробный, бассейн факультативный и бассейн для созревания.

Анаэробный бассейн позволяет снизить нагрузку по органическим веществам. В анаэробных прудах достигаются хорошие результаты для сточных вод с высокой нагрузкой по органическим веществам. В этих прудах, значительная глубина является важным принципиальным элементом, способствующим процессу (от 5 до 6 м, например). Такой пруд применяется только при сбросе сточных вод с высокой концентрацией биогенных

элементов, и, чаще всего, в качестве предварительной обработки перед второй стадией очистки в аэрируемом пруду.

Бассейн дополнительный (факультативный) обеспечивает развитие водорослей фотосинтезом, которые будут производить кислород, необходимый для развития аэробных бактерий. Это поступление может быть дополнено, в виде исключения, аэраторами для повышения биологической активности и уменьшения площади поверхности прудов [342, 459].

Существует два типа факультативных прудов в зависимости от растений, которые они содержат:

- пруды с микрофитами: они содержат микроскопические водоросли в основном зеленые или синие,

- пруды с макрофитами: они содержат наблюдаемые невооруженным глазом растения в свободном виде (например, lentilles d'eau) или закрепленные (например, roseaux тростник).

Наконец, пруд созревания позволяет удалять патогенные микроорганизмы, в частности, под действием УФ-лучей.

Существует вторая экстенсивная очистка: очистка с использованием слоя гравия. В этом случае, пруд оборудуют подложкой из гравия, по которому вода движется по горизонтали и, следовательно, фильтруются через подложку. При этом виде очистки при необходимости могут быть посажены или нет макрофиты.

По экономическим причинам, в большинстве случаев, сточные воды предварительно не обрабатываются, прежде чем поступить в пруды. Таким образом, накопление отложений значительны, систематическое опорожнение и очистку лагун необходимо проводить каждые 10 до 20 лет. Отвода осадка часто добавляется в укосы водных растений.

Также можно отметить, что этот метод позволяет выполнить удаление азота и фосфора, поэтому не требуется дополнительная третичная очистка [342, 402, 423, 459, 462].

На процесс удаления микроорганизмов при экстенсивной очистке сточных вод влияют различные параметры: тип растения, тип субстрата, условия среды, тип исходных сточных вод, также как размеры сооружений и время пребывания сточных вод в этой системе [369, 348].

Тип растений

Типы растений, выращенных в экстенсивных системах влияют на удаление микроорганизмов. Проведены наблюдения за уменьшением группы кишечной палочки в прудах с поликультурами (содержащий смесь рогоз) и в контрольном пруде без растительности [383]. Сравнивается также система с макрофитпми и микрофитами и определяется сокращение фекальных колиформных бактерий с более коротким временем пребыванием в сооружении [423]. Отмечена значительная разница в уничтожении бактерий между очисткой макрофитами и очисткой микрофитами: в первом пруде уничтожение было более эффективным [380, 462]. Доказана значительная роль водных растений в снижении вирусов. Установлено, что эффект сокращения значительно выше с макрофитами, по сравнению с очисткой без растений: концентрация бактериофагов в очищенном стоке без растений была в 5 раз больше, чем в системе с растениями [417, 373].

Система с поликультурой менее всего чувствительна на сезонные колебания. Предполагается, что присутствие разнообразных видов растений приносит более эффективное распределения на корни и на разнообразие микроорганизмов, чем системы с монокультурами [342, 402, 469].

Кроме потребления кислорода растениями, ведущая роль макрофитов состоит в получении дополнительных поверхностей для развития биопленки в ризосфере и осуществлении наиболее оптимальной фильтрацию для бактерий [459]. Эти поверхности являются опорой, позволяющей также агломерировать бактерии в экологическую нишу, благоприятную для нематод. Более того, некоторые макрофиты способны выделять из корневой системы вещества, токсичные для бактерий, такие как дубильные и галловая кислоты [347, 395, 431, 459].

Другим действием растений является их естественная склонность изменять рН. Уровень рН воды устанавливается из баланса между мощностью буферной емкости системы, фотосинтеза водорослей и усвоения азота. Быстрое увеличение числа растений и, следовательно, их фотосинтез, позволяет повысить рН и скорость отмирания бактерий. Некоторые системы показывают большие перепады суточной кислотности, которая может достичь рН 11 для высоких скоростей фотосинтеза. Однако эти растения оказывают негативное влияние на удаление микроорганизмов путем ослабление передачи света. Растения понижают бактерицидное действием света [315, 402]. Поэтому очень важно выбрать баланс между рН и проникновением лучей света для того, чтобы максимизировать бактерицидное действие [364].

Основа (подложка) Существует два типа основы (подложки): основа, состоящая из гравия и основа, состоящая из суспензии. Доказано, что первая имеет более высокую производительность по удалению микроорганизмов, чем вторая. Этот результат объясняется несколькими факторами, в том числе значительной фильтрующей способностью, особенно после развития биопленки [341, 347, 369]. Добавим также, что гравий создает достаточную защиту бактерий против хищничества, по сравнению с основой, состоящей из суспензии [347]. Более того, тип основы (подложки) влияет на сообщество и количество инфузорий. Отмечено, что эффект от концентрации свободных амеб в три раза больше в системе с гравийным основанием, чем в системе субстрата ила [347, 348].

Условия

Температура: Высокая температура увеличивает ликвидацию микроорганизмов. Это действие можно объяснить, косвенным образом, увеличением роста популяций хищников [347, 431]. Наоборот, при низкой температуре (ниже 3о С), отмечается снижение уровня колиформных

фекальных бактерий. Это связано с низкой метаболической активностью микробных хищников и сокращением биомассы корней, что ограничивает возможности фильтрации. Однако следует отметить, что низкие температуры также непосредственно влияют на популяцию колиформных фекальных бактерий уменьшая их выживание [402].

Кислород:

Удаление микроорганизмов увеличивается при увеличении аэрации [364, 415]. Различные процессы являются основой для этой цели. Во-первых, определенное количество кислорода необходимо для того, чтобы развивать сообщество хищников в виде активных инфузорий. Более того, необходимо иметь определенный уровень кислорода для инициирования процесса фотоокисления [322, 365, 415]. Похоже также, что на адсорбцию вируса на твердом основании влияет или растворенный кислород, или десорбция, реализуемая в анаэробных условиях [415].

Концентрация микроорганизмов в исходных сточных водах.

Степень уничтожения бактерий зависит от концентрации бактерий в исходных сточных водах: повышенная эффективность удаления имеет место, когда концентрация популяций более низкая [417, 404].

Концентрации органического вещества в системе.

Концентрация органического вещества в сточных водах влияет на ликвидацию микроорганизмов, как в прямую, так и косвенно. В условиях низкой концентрации БПК возникает конкуренция между микроорганизмами и, следовательно, имеет место улучшение удаления этих микроорганизмов. Более того, в водах, нагруженных органическим веществом, увеличение мутности ослабляет пропускание и передачу света и, следовательно, снижает его бактерицидное действие. Добавим также, что в водах, сильно нагруженных органическим веществом происходит снижение растворенного кислорода, что приводит к развитию менее активных по питанию видов инфузорий [55, 347, 348, 382].

Время пребывания, размеры системы и исходного стока.

Многие исследователи демонстрируют эффект от гидравлического времени пребывания воды на ликвидацию микроорганизмов для технологических схем с прудами доочистки, оборудованными слоем гравия: более продолжительное время гидравлического пребывания стоков в сооружении положительно влияет на удаление бактерий и паразитов [375, 404, 425].

Размеры системы и исходного стока непосредственно связанны с временем гидравлического пребывания [437], вследствие чего важно иметь систему, размеры которой благоприятно влияют на очистку стоков. Глубина сооружения, в свою очередь, помимо влияния на время пребывания стока, также будет влиять и на другие процессы: проникновение света будет снижаться с глубиной водоема [402, 419, 434]. Только в поверхностном слое, будет происходить очистка за счет воздействия освещенность [57, 416].

Понятно, что все эти факторы взаимодействуют друг с другом. Например, расход потока может влиять на время контакта с подложкой и растительностью, и, следовательно, на возможность благоприятных процессов хищничества, фильтрации и осаждения. А при повышенных расходах в сточных водах на выходе из очистных сооружений будет находиться большое количество бактерий [313, 425].

Четвертичная обработка (очистка): методы дезинфекции.

Для жилых зон очень важно, чтобы сбрасываемые очищенные сточных воды не содержали высокую концентрацию патогенных микроорганизмов. Поэтому применяется дополнительная обработка: дезинфекция, которая может осуществляться с помощью различных методов, в том числе путем хлорирования, УФ излучения и озонирования.

Хлорирование

Хлор является сильным окислителем, который очень активен в ликвидации микроорганизмов. Однако, в результате реакции с органическими веществами или ионами аммония, будет происходить формирование вторичных соединений органического хлора или хлорамина, являющихся высоко канцерогенными веществами. Учитывая канцерогенный характер побочных продуктов хлорирования, хлор становится все менее и менее используемым и даже запрещенным в некоторых странах.

Ультрафиолетовые лучи

Обработка ультрафиолетовыми лучами очень эффективна и широко распространена в мире. Системы УФ излучения состоят из двух частей: камера обработки, называемая также реактором и электрический модуль. Вода для дезинфекции поступает в камеру облучения, где размещены содержащие ртуть лампы, изолированные от воды кожухом из кремния или кварца, испускающие ультрафиолетовое излучение [4, 17, 22, 36, 50, 70, 116].

Озонирование

Озон очень эффективен в ликвидации микроорганизмов.

Установка озонирования включает в 4 блока:

- очистка воздуха, используемого для производства кислорода, воздух для производства озона должен быть чистым и сухим;

- электрический генератор озона, называемый озонатором: озон образуется из сухого воздуха при разряде электрического тока или при УФ-облучении,

- перенос озона в воду центрифугированием, гидроижектированием и диффузорами,

- системы восстановления и обработки отработанного озона: вентиляционные отходы озона восстанавливаются и могут быть

использованы для предварительного озонирования воды при дезинфекции. Избыток озона ликвидируется термическим или каталитическим методом.

Динамика изменения патогенных микроорганизмов в зависимости от состава технологических схем водоподготовки, вида обеззараживания питьевой воды, поступающей в производственную систему водоснабжения мясокомбината, а также очистки производственных сточных вод от патогенных микроорганизмов, должна рассматриваться в синтеза трех аспектов: эффективность, стоимость и техническая осуществимость [33, 49, 51, 126, 148, 177, 202, 291, 319, 339, 340].

Такой подход позволит получить предварительный отбор технологических схем очистки в зависимости от удовлетворительной степени очистки по предельным, заранее установленным, значениям. Далее, проанализировав соотношение между качеством очистки сточных вод по микробиологическим показателям, полученным на каждом этапе каждой из этих технологических схем, прошедших предварительный отбор, должна определится их санитарная, экологическая, техническая и финансовая осуществимость и надежность.

1.7 Средства и методы дезинфекция сырья, продукции, производственных помещений и сточных вод

Дезинфекция на предприятиях мясной и рыбной промышленности - одно из важнейших ветеринарных и санитарно- гигиенических мероприятий. Для выпуска высококачественной продукции большое значение имеет правильная и своевременная ветеринарно-санитарная обработка всех объектов мясоперерабатывающих предприятий, что является неотъемлемой частью технологических процессов производства. Это связано с тем, что мясо и другие пищевые ингредиенты, представляют собой питательные субстраты, содержащие компоненты, которые необходимы для жизнедеятельности микроорганизмов.

Решением проблем санитарной обработки производственных цехов,

технологического оборудования, тары в мясоперерабатывающей промышленности занимались и продолжают заниматься многие ученые и работники специализированных фирм и организаций во всех развитых странах мира, в том числе и в России [35, 206, 207, 208, 209, 223, 224]. Для современного технологического оборудования, используемого в новейших технологиях при высокотемпературных режимах переработки мясного сырья, с применением различных видов жировых и растительных добавок, стабилизаторов и ароматизаторов, важен правильный выбор моющих и дезинфицирующих средств. Применение примитивных средств для мойки и дезинфекции оборудования, основанных только на использовании каустической соды, хлорной извести, кислот и горячей воды, сегодня мало эффективно, а зачастую уже невозможно. Необходимо использовать новые технологии мойки и дезинфекции, используя опыт ведущих российских и европейских предприятий.

В последние годы на животноводческих фермах, предприятиях мясной и молочной промышленности наряду с традиционными стали использовать новые химические средства, к которым предъявляются следующие основные требования: отсутствие стойкого запаха и цвета рабочих растворов, которые могут оказать влияние на органолептические и другие показатели готовой продукции; способность хорошо омылять и эмульгировать жиры, гидролизовать белки мяса и крови, растворять слизь и прочие органические вещества, не теряя при этом своей эффективности; низкая токсичность при используемых концентрациях; отсутствие коррозионного действия на ограждающие конструкции и оборудование; хорошая растворимость в воде и высокая проникающая способность, полное удаление при ополаскивании; быстрота и эффективность действия в отношении широкого спектра патогенной, условно-патогенной и санитарно-показательной микрофлоры;

Дезинфекция является важнейшим звеном в системе профилактических, противоэпизоотических мероприятий, обеспечивающих благополучие животных, включая птиц по инфекционным болезням,

безопасности человека в отношении зоонозов, санитарного качества продуктов, сырья и кормов животного происхождения [23, 24, 31, 36, 39, 58, 59, 109, 191, 228, 230].

Основное назначение этих мероприятий - разорвать эпизоотическую цепь путем воздействия на её важнейшее звено - факторы передачи возбудителя болезни от источника инфекции к восприимчивому организму [367].

По назначению дезинфекцию подразделяют на профилактическую и вынужденную.

Профилактическую дезинфекцию проводят на предприятиях по производству продуктов животного происхождения с целью предотвращения распространения патогенных микроорганизмов [78, 191, 228, 230, 260].

Дезинфекция состоит из последовательно проводимых операций: предварительной дезинфекции (при необходимости), тщательной механической очистки и собственно дезинфекции.

Для дезинфекции объектов ветеринарного надзора используют средства разрешенные к применению Россельхознадзором Российской Федерации.

Современные средства и методы дезинфекции, в зависимости от инактивирующих факторов разделяют на несколько групп [86, 211, 281]: физические, химические, биологические и комбинированные. Среди этих групп наибольшее распространение получили средства и методы, основанные на использовании химических инактивирующих веществ -дезинфектантов. Широкому использованию обеззараживающих средств в дезинфекции способствуют их высокая эффективность в сочетании с простотой и экономичностью эксплуатации [160, 161].

Ассортимент антимикробных веществ, пригодных для использования в дезинфекции, ограничен рядом требований, предъявляемых к средствам обеззараживания [205, 294, 301, 319, 324, 339]. Они должны обладать [93, 95, 207, 209, 294, 301, 319, 339]: хорошей растворимостью в воде или

способностью образовывать в ней стойкие эмульсии; высокой антимикробной активностью (средство должно обеспечивать инактивацию микроорганизмов в короткие сроки при действии малых концентраций действующих веществ); обеззараживающим действием при наличии посторонних веществ (органических и неорганических); низкой коррозионной активностью в отношении различных конструкционных материалов; высокой стабильностью при хранении; низкой токсичностью для человека, сельскохозяйственных животных и птицы; доступными и дешевыми; удобными при транспортировке и хранении, экологически безопасными.

Разнообразие химических веществ, пригодных для использования в качестве дезинфектантов, позволяет варьировать их использование в соответствии с условиями обеззараживания и, таким образом, решать различные задачи в области дезинфекции объектов ветеринарного надзора.

Указанные дезинфицирующие средства используются в основном при дезинфекции, осуществляемой методом орошения [162].

Средства обеззараживания по химическому строению действующего вещества (ДВ) подразделяются на несколько классов [28, 135, 206, 292, 301, 319, 339],

- хлор и хлорорганические соединения;

- галоиды (йод, бром и их соединения);

- окислители;

- фенолы, крезолы и их производные;

- соли тяжелых металлов;

- спирты;

- кислоты и их соли;

- щелочи;

- детергенты;

- эфиры, эфирные масла и фитонциды;

- красители;

- антибиотики и другие антимикробные лекарственные соединения;

- отходы и полупродукты промышленности, пригодные для дезинфекции.

Разнообразие химических веществ, пригодных для использования в качестве дезинфектантов, позволяет варьировать их использование в соответствии с условиями обеззараживания и, таким образом, решать различные задачи в области дезинфекции объектов ветеринарного надзора.

Указанные дезинфицирующие средства используются в основном при дезинфекции, осуществляемой методом орошения.

Метод влажной дезинфекции основан на орошении (увлажнении) обрабатываемых (зараженных) поверхностей растворами химических дезинфицирующих средств путем равномерного орошения до полного их смачивания, что создает надежный контакт химического средства с микроорганизмами, находящимися на очищаемой от загрязнений поверхности, подлежащей дезинфекции [134]. Метод аэрозольной дезинфекции.

Аэрозоль представляет собой дисперсную систему с газообразной дисперсной средой и твердой или жидкой дисперсной фазой [36, 94, 163, 275, 278]. В практике дезинфекции дисперсной средой является воздух, а дисперсной фазой, как правило, жидкость, а точнее дезинфицирующий раствор [30].

Предложено значительное количество классификаций аэрозолей, в основу которых положены различные принципы их образования и свойства [34, 206, 211].

По происхождению аэрозоли подразделяют на дисперсионные и конденсационные. Дисперсный аэрозоль образуется за счет распыления дезинфицирующих растворов с помощью различных диспергирующих устройств, в которых с помощью струи сжатого воздуха или различного типа физического воздействия, дезинфектант дробится на частицы очень маленьких размеров. Конденсационные аэрозоли образуются при испарении

или возгонке дезинфектантов с последующей конденсацией их паров в относительно холодном воздухе. Важнейшими характеристиками аэрозолей вообще, и аэрозолей дезинфектантов в частности, являются процессы их устойчивости и осаждения.

Размеры частиц аэрозоля могут варьировать в широких пределах: от тысячных долей до сотен микрометров [16, 25, 208, 294, 301, 319, 339, 405].

В целом в ветеринарной практике используются аэрозоли, размер частиц дисперсной фазы которых не превышает 100 мкм.

Средства для дезинфекции.

Снизить уровень микрофлоры в помещениях и тем самым уменьшить заболеваемость животных можно при организации производства по принципу «пусто-занято» и использовании современных методов очистки дезинфекции помещений [133, 141, 142, 143, 334, 471]. Для дезинфекции освобожденных от животных помещений методом орошения применяют: 34% горячий раствор едкого натра, 3% раствор парасода или фоспара, 3% раствор хлорамина или гипохлора, 2% растворы формальдегида и перекиси водорода с добавлением 0,1% молочной кислоты [9, 26, 43, 103], ДП-2, ДП-2Т, сульфохлорантин и другие.

Пены, их основные свойства и применение

Пена - это дисперсная система, состоящая из ячеек-пузырьков газа, разделенных пленками жидкости (или твердого вещества). В пене газ (воздух) рассматривается как дисперсная фаза, а жидкость (или твердое вещество) - как непрерывная дисперсная среда. Жидкие или твердые пленки, разделяющие пузырьки газа, образуют в совокупности пленочный каркас, являющиеся основою пены [117, 120, 138, 208, 297, 409].

Таким образом, обзор существующего состояния проблемы показывает следующее.

По мере роста населения и интенсивности деятельности человека требуется учитывать возможность загрязнения сточных вод, т.к. возрастает

объем сбрасываемых вод и увеличивается потенциал инфекционных загрязнений источников пресной воды.

Обзор проведенных в настоящее время исследований показал, что выбор оптимальных технологических схем очистки сточных вод зависит от коэффициента разбавления сбрасываемых вод водами природных объектов, в которые они сбрасываются. При низком коэффициенте разбавления (около 2) более предпочтительной является схема очистки в мембранном биореакторе с последующей УФ дезинфекцией. При высоком коэффициенте разбавления (около 100) более выгодной оказывается очистка в прудах с макро- и микрофитами.

При разбавлении очищенных сточных вод необходимо учитывать как процессы удаление патогенных организмов, так и процессы их хищничества, осаждения и выживания.

Причиной вспышек заболеваний, связанных с питьевой водой, являются патогенные простейшие и патогенные микроорганизмы (бактерии, вирусы).

Наибольшую опасность представляют патогенные

простейшие Giardia и Cryptosporidium, которые могут попадать в воду в результате прямого или косвенного загрязнения ее фекалиями человека или животных.

Поэтому микробиологическая оценка источников воды должна быть частью регулярных медико-санитарных обследований с целью определения безопасности и должна содержать регулярный целенаправленной мониторинг на наличие кишечных простейших Giardia и Cryptosporidium, а также других патогенов, передающихся через питьевую воду.

Снижение микробиологических загрязнений может быть получено физическими способами очистки, такими как фильтрация, а также и инактивацией, химической дезинфекцией и ультрафиолетовым облучением.

Современные рекомендации, касающиеся качества воды, стимулируют реализацию несколько барьеров для обеспечения безопасности питьевой

воды. Для того чтобы определить степень необходимой обработки, следует учитывать потенциальные колебания загрязнений воды, в том числе ухудшение качества воды в краткосрочной перспективе и изменение эффективности ее обработки.

Анализ литературных источников показал, что потенциал для передачи эпидемии микроорганизмов зависит от их биологических свойств, в том числе их инфекционности, устойчивости к процессам очистки сточных вод, а также способности выживать и развиваться.

Для возбудителей инфекции взаимоотношения доза-эффект в настоящее время описаны величиной минимальной

инфекционной (отравляющей) дозы, соответствующей наименьшему количеству микроорганизмов, которые должны быть поглощены, чтобы проявились симптомы болезни по крайне мере у некоторого количества людей [139, 157, 303]. Минимальная инфекционная доза устанавливает связь между уровнем воздействия микроорганизмов и вероятностью развития смертельных случаев

По современным взглядам очистка сточных вод может производиться несколькими этапами и способами: предварительная механическая обработка (решетки, песколовки, жироловки), первичная очистка (осаждение в первичных отстойниках), биологическая очистка (аэротенки, метантенки), вторичная очистка (осаждение во вторичных отстойниках), очистка в мембранном биореакторе, третичная экстенсивная очистка в прудах доочистки и гравийных фильтрах, четвертичная обработка (дезинфекция хлорированием, ультрафилетовыми лучами и озонированием).

Эффективность биологической очистки зависит от ряда факторов: температуры обрабатываемой среды, концентрации растворенного кислорода, концентрации микроорганизмов в исходной сточной воде, концентрации органического вещества в системе и времени пребывания.

Динамика изменения содержания патогенных микроорганизмов в зависимости от состава технологической схемы водоподготовки, степени

обеззараживания питьевой воды, поступающей в систему водоснабжения, а также эффективности очистки сточных вод от патогенных микроорганизмов должна оцениваться путем синтеза трех определяющих аспектов: эффективность, стоимость и техническая осуществимость [140, 152, 298].

Такой подход позволяет выполнить предварительный отбор технологической схемы в зависимости от установленной степени очистки, проанализировать качество очистки сточных вод по микробиологическим показателям на каждом этапе технологической схемы и в конечном счете определить ее санитарную, экологическую, техническую и финансовую осуществимость и надежность.

Анализ существующих исследований в направлении разработки средств и методов дезинфекции сырья, продукции, производственных помещений и сточных вод предприятий мясной и рыбной промышленности показал, что для выпуска высококачественной продукции большое значение имеет правильная и своевременная ветеринарно-санитарная обработка всех объектов мясоперерабатывающих предприятий.

Дезинфекция является важнейшим звеном в системе профилактических, противоэпизоотических мероприятий, обеспечивающих благополучие животных по инфекционным болезням и безопасность человека в отношении зоонозов, санитарного качества продуктов, сырья и кормов животного происхождения.

Основное назначение дезинфекционных мероприятий - разорвать эпизоотическую цепь путем воздействия на её важнейшее звено - факторы передачи возбудителя болезни от источника инфекции к восприимчивому организму.

Средства и методы дезинфекции, в зависимости от инактивирующих факторов разделяют на несколько групп: физические, химические, биологические и комбинированные. Среди этих групп наибольшее распространение получили средства и методы, основанные на использовании химических инактивирующих веществ - дезинфектантов. Широкому

использованию обеззараживающих средств для дезинфекции способствуют их высокая эффективность в сочетании с простотой и экономичностью эксплуатации.

Современные методы дезинфекции предусматривают применение разнообразных химических веществ, пригодных для использования в качестве дезинфектантов, что позволяет варьировать их использование в соответствии с условиями обеззараживания и, таким образом, решать различные задачи в области дезинфекции объектов ветеринарного надзора.

Основным методом дезинфкции является метод орошения.

Метод влажной дезинфекции основан на увлажнении обрабатываемых зараженных поверхностей растворами химических дезинфицирующих средств путем равномерного орошения до полного их смачивания, что создает надежный контакт химического средства с микроорганизмами, находящимися на очищаемой от загрязнений поверхности, подлежащей дезинфекции.

Метод аэрозольной дезинфекции, когда аэрозоль представляет собой дисперсную систему с газообразной дисперсной средой (воздухом) и жидкой дисперсной фазой (дезинфицирующим раствором).

В настоящее время в ветеринарной практике используются аэрозоли, рзмер частиц дисперсной фазы которых не превышает 100 мкм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что система ХАССП является достаточно надежным фактором, обеспечивающим безопасность на всех этапах технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки. Система активно внедряется на различные предприятия как у нас в стране, так и за рубежом.

Можно отметить, что ККТ и опасные факторы для конкретных технологических процессов различаются, однако и имеют много общего. В

большинстве случаях, в качестве опасных факторов в основном выступают сходные группы антропогенных и природных токсикантов, что дает основание к применению аналогичных методик для контроля соответствующих опасных факторов. С целью оперативного контроля всех рисков необходимо применять ускоренные, но весьма чувствительные и специфичные методики. В этом плане перспективными являются как классические физико-химические методы, так и методы на основе ДНК- и -иммуноанализа.

Для обеспечения безопасности производства система ХАССП предусматривает управляющее воздействие для предотвращения или исключения недопустимых рисков. К предупреждающим действиям относят: соблюдение ветеринарно-санитарных норм и контроль параметров технологического процесса производства, концентрации вредных веществ, мойку и дезинфекцию. В случаях обнаружения недопустимых рисков необходимо проводить соответствующие корректирующие мероприятия для их устранения или снижения до допустимого уровня.

Обзор и обобщение рассмотренных литературных источников свидетельствует о том, что в современных условиях настоятельно необходимо выполнение комплекса расчетно-экспериментальных работ по созданию достаточно эффективных и надежных методов обеспечения работы предприятий по производству мясной и молочной продукции.

В связи с этим необходимо усовершенствовать системы очистки и контроля воды, используемых на предприятиях по получению и переработке мяса и рыбы, системы биоцидной обработки производственных помещений, оборудования.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и объекты исследований

Работа проводилась в период с 2002 по 2015 гг. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научный исследовательский и технологический институт биологической промышленности» и отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии».

В работе использовались тест-системы RIDA® COUNT Corporation, Япония.), тест-системы для определения антибиотиков, сульфаниламидов и ангельминтиков фирмы RANDOX, Великобритания, иммунохроматографические индикаторные элементы (ИИХЭ) производства ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» ФМБА России, тест-система Abraxis OP/C, США, для определения фосфорорганических соединений, праймеры, дезоксинуклеозидтрифосфаты, ДНК-полимераза, тест - наборы для определения микроорганизмов с помощью ПЦР в режиме «реального вемени» фирмы «Интрелабсервис» (Россия) термоциклир «Mastercycler epgradient S eppendorf realpleax ». Электронно-микроскопические исследования проводили на электронном микроскопе "Hitachi-800" со сканирующей приставкой "Hitachi-8010".

В исследованиях использовалось не менее 5 повторностей проб.

2.2 Методы исследований

2.2.1 Методики определения микорганизмов с помощью тест-систем «RIDA® COUNT» (Германия)

Метод с применением указанных тест-систем основан на использовании готовых стерильных сухих подложек, представляющих собой готовую систему с набором питательных веществ, герметично закрытыми непроницаемой мембраной, которая снимается перед посевом, закрывается

после него и термостатируется при соответствующих температурах. Слой сухой питательной среды на подложке покрыт специальным нетканым волокном, обеспечивающим превосходное впитывание и распределение исследуемых проб по поверхности подложки. Прозрачная пленка предохраняет подложки от загрязнения при инкубации.

Тест-система RIDA®COUNT Total предназначена для выявления и подсчета количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов при культивировании в аэробных условиях. Подложки представляют собой готовую систему для нанесения исследуемого образца на питательную среду, содержащую стандартный набор питательных веществ и хромогенный субстрат. Восстановление хромогена (ТТС-красный) в точках роста бактерий приводит к окрашиванию образующихся колоний в красный цвет, что значительно облегчает подсчет колоний. При использовании в качестве разбавителя MRS-бульон и при инкубировании посевов в анаэробных условиях, возможно использование подложек для выявления и подсчета лактобактерий.

Тест-система RIDA® COUNT Yeast & Mould Rapid предназначена для ускоренного выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов. Подложки представляют собой готовую систему для нанесения исследуемого образца, содержащую питательную среду (дрожжевой экстракт и глюкозу) с антибиотиком - хлорамфениколом, который ингибирует рост сопутствующей бактериальной флоры на подложке. Ферментация глюкозы, в присутствии эстеразного субстрата, приводит к изменению рН - среды, индикатор окрашивает колонии дрожжей и плесневых грибов в зелено-голубой цвет, что облегчает подсчет колоний.

Тест-система RIDA® COUNT iform предназначена для выявления в исследуемом образце колиформных бактерий, а также их количественного определения. Подложки представляют собой готовые системы, содержащие модифицированный питательный состав с желчью ингибирующий рост грамположительных бактерий. Характерный для колиформных бактерий

фермент b-галактозидаза расщепляет хромогенный субстрат, что приводит к формированию голубых колоний, колиформные бактерии с высоким метаболизмом или низкой энзимной активностью (поврежденные клетки) формируют колонии зеленого цвета.

Тест-система RIDA® COUNT coli предназначена для ускоренного определения бактерий вида E. coli. Подложки представляют собой готовые системы, содержащие модифицированный питательный состав ингибирующий рост грамположительных бактерий. Принцип действия основан на выявлении у E. coli. высокоспецифического фермента b-глюкуронидазы. Хромогенный субстрат Х-глюкуронид, используемый в данной среде, позволяет выявить глюкуронидазную активность. Клетки E. coli сорбируют Х-глюкуронид, внутриклеточная глюкуронидаза расщепляет связь между глюкуронидом и хромофором, который, высвобождаясь, окрашивает колонии E. coli в пурпурный цвет.

Тест-система RIDA® COUNT Е. coll/Collform предназначена для ускоренного одновременного определения колиформных бактерий и бактерий вида E. coll. Подложки представляют собой готовые системы, содержащие модифицированный питательный состав с желчью и кристаллическим фиолетовым, ингибирующими рост грамположительных бактерий. Принцип действия основан на выявлении характерного для колиформных бактерий фермента b-галактозидаза, у E. coll высокоспецифического фермента b-глюкуронидазы. Для обнаружения этих ферментов в питательный состав подложек входят хромогенные субстраты, при расщеплении которых этими ферментами образуются окрашенные продукты. В результате колонии Е. coli окрашиваются в пурпурный цвет, а колиформные бактерии в светло-синий, светло-зеленый цвета.

Тест-система RIDA® COUNT Salmonella предназначена для ускоренного определения бактерий рода Salmonella. Подложки представляют собой готовые системы, содержащие модифицированный XLD - агар (ксилозо-лизин-дезоксихалатный агар). Присутствие в среде дезоксихалата

натрия ингибирует рост сопутствующей грамположительной флоры. Сальмонеллы ферментируют ксилозу и декарбоксилируют лизин до кадаверина, что сопровождается повышением величины рН и выделением сероводорода, который, соединяясь с железом, образует сульфид железа, что выражается в формировании черных колоний.

Подложки RIDA®COUNT S. aureus предназначены для ускоренного определения S. aureus. Подложки представляют собой готовые системы, содержащие модифицированный маннитол-фенол-солевой агар. Высокая концентрация хлорида натрия и антибиотиков ингибирует рост большинства бактерий, за исключением стафилококка. Ферментация маннитола, связанная с кислотно-фосфатазной активностью стафилококка, приводит к понижению рН среды, колонии окрашиваются в зелено-голубой цвет.

Метод основан на высеве определенного количества образца или его разведения на подложки RIDA®COUNT, инкубировании посевов, подсчете всех выросших видимых колоний.

Подготовку проб проводили в соответствии с ГОСТ 26669 на пищевые продукты и другими действующими ГОСТ и НД на конкретные виды анализируемых образцов.

Масса (объем) навески продукта, предназначенной для приготовления исходного разведения или гомогената, должна составлять не менее 10,0 ± 0,1 г/см3.

Исходные разведения продуктов с массовой долей NaCl более 5 % готовят с использованием пептонной воды, исходные разведения мясных, рыбных и молочных продуктов - с использованием физиологического раствора.

Для обеспечения оптимального роста микроорганизмов величина рН исследуемого образца продукта или его разведения должна быть в интервале значений 6,6 - 7,2. Для кислых продуктов величину рН регулируют 1н раствором NaOH. Для щелочных продуктов величину рН регулируют 1н раствором НС1.

Невскрытые пакеты с подложками серии RIDA®COUNT хранили в холодильнике при температуре 8 °С. Перед использованием подложки выдерживали при комнатной температуре. После вскрытия пакета неиспользованные подложки вкладывали в пакет из фольги и закрывали его с помощью скрепки. Вновь запечатанные пакеты хранили при температуре 2 -8 °С.

При проведение испытаний для подсчета количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, количества дрожжей и плесневых грибов, лактобактерий, колиформных бактерий, бактерий вида E. coli, S. aureus подложки серии RIDA®COUNT помещали на ровную поверхность.

Из подготовленного образца продукта или его соответствующего разведения, смывной жидкости отбирали образец объемом 1,0 см , снимали прозрачную пленку подложки.

Вносили 1,0 см исследуемого образца или его разведения в центр подложки.

Опускали верхнюю пленку на образец, не допуская образования пузырьков воздуха. Прижимают пленку по периметру подложки, избегая контакта с её центральной частью.

Возможно использование подложек при прямом исследовании загрязнения поверхностей, оборудования, упаковки, рук персонала и др. предметов. Для этого с помощью пипетки на открытую подложку вносят 1,0 см3 стерильного физиологического раствора, затем подложку закрывают пленкой. После 10 - 15 минут равномерного распределения раствора по подложке пленку снимают и влажную подложку прижимают к исследуемой поверхности. Затем подложку закрывают пленкой в соответствии с рекомендациями п. 10.4. При исследовании поверхностей можно также использовать сухие подложки, на которые потом наносят 1,0 см стерильного физиологического раствора. Промежуток времени между отбором пробы на

сухую подложку и внесением на неё стерильного физиологического раствора может составлять до 24 ч.

При исследовании поверхностей с помощью тампонов предварительно на открытую подложку вносят 1,0 см стерильного физиологического раствора и закрывают подложку пленкой. Равномерное распределение раствора по подложке проводится в течение 10 - 15 минут. В это время, исследуемую поверхность протирают стерильным латексным или хлопковым тампоном, затем снимают пленку и с помощью тампона проводят посев по всей поверхности подложки.

При использовании метода мембранной фильтрации образец пропускается через мембранный фильтр, затем, извлеченный из фильтродержателя мембранный фильтр, помещают на подложку тыльной стороной вверх. Предварительно на подложку вносят 1,0 см стерильного физиологического раствора и оставляют на 10 - 15 минут для впитывания.

В термостате подложки располагают в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх. Допускается размещать подложки друг на друга.

Подложки серии RIDA®COUNT инкубируют:

При определении и подсчете количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в течение 24 - 48 ч при температуре 37° С.

При определении и подсчете лактобактерий в течение 48 ч при температуре 37° С в анаэробных условиях.

При определении и подсчете количества дрожжей и плесневых грибов в течение 48 - 120 ч при температуре 25° С.

При определении и подсчете количества колиформных бактерий и бактерий рода E. coli. в течение 24 часов при температуре 37 °С.

При определении и подсчете количества S. aureus в течение 24 - 48 часов при температуре 37° С.

После инкубирования подложек

RIDA®COUNT Total

подсчитывали все красные колонии, независимо от их размера и интенсивности окраски.

Если инкубированные подложки с разведением образца 1:10 не содержат колоний, то результат выражали следующим образом: меньше, чем

1 3

1 : 10 или 10 бактерий на 1,0 см (г) продукта.

Если на подложках с разведением образца 1:10 содержится меньше, чем 30 колоний, то результат выражают так: количество микроорганизмов менее М : 10, где М - число выросших колоний.

Если количество колоний более 30, подсчитывают количество колоний и умножают на соответствующее разведение и получают число микроорганизмов в 1,0 см (г) продукта.

На пластинах, где выросло более 300 колоний, подсчитывают количество колоний в одном или более показательных квадратах и определяют среднее количество колоний на квадрат. Умножали среднее число колоний на 20, так как зона роста подложек имеет площадь 20 см2 и на соответствующее разведение, получают число микроорганизмов в 1,0 см (г) продукта.

Полученный результат округляли по ГОСТ 26670.

Ответ выражали в виде числа КОЕ/г (см ).

После инкубирования подложек RIDA®COUNT Yeast & Mould Rapid в течении 48 часов подсчитывают количество дрожжей и плесневых грибов суммарно.

Через 48 часов инкубации на подложке учитывали колонии дрожжей и плесневых грибов сине-зеленого цвета.

При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов увеличивают время инкубации, проводят микроскопические исследования. После 120 часов инкубации колонии дрожжей на подложках сине-зеленые или белые с сине-зеленым ореолом, растекающиеся круглые, более светлые. Колонии плесневых грибов опушенные, более диффузные, чем колонии дрожжей, большего размера, более темные по цвету. Для выполнения микроскопического исследования поднимали верхнюю пленку подложки, затем пористую салфетку и вынимали колонию из геля. Из

колонии готовят препарат методом раздавленной капли. На предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды. Затем в эту каплю вносят часть колонии. Полученная суспензия покрывалось покровным стеклом.

Результаты микроскопирования оценивали, пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов.

Для количественного подсчета отбирают пластины, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и от 5 до 50 колоний плесневых грибов, умножают на соответствующее разведение и получали число дрожжей или плесневых грибов в 1,0 см (г) продукта.

На пластинах, где выросло более 150 колоний дрожжей и более 50 колоний плесневых грибов, подсчитывали количество колоний в одном или более показательных квадратах и определяют среднее количество колоний на квадрат. Умножают среднее число колоний на 20, так как зона роста подложек имеет площадь 20 см и на соответствующее разведение, получают число микроорганизмов в 1,0 см (г) продукта.

Результаты обрабатывали и пересчитывали отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

После инкубирования подложек

RIDA®COUNT Coliform, RIDA®COUNT E. coli, RIDA®COUNT E. coli/Coliform учитывали колиформные бактерии и Е. coli, окрашенные в определенный цвет в соответствии с применяемым хромогенным субстратом.

При необходимости колонии можно было изолировать для дальнейшей идентификации.

После инкубирования подложек

RIDA®COUNT S.

aureus, учитывали

зелено-голубые колонии диаметром 1 мм как S. aureus, колонии более бледного цвета или другого цвета, диаметром менее 1 мм не учитывают.

После инкубирования подложек

RIDA®COUNT Salmonella,

круглые,

резко очерченные колонии черного цвета учитывали как сальмонеллы. Колонии тусклые, черного или коричневого цвета, расплывчатые,

мигрирующие, относят к протею, колонии почти не окрашенные, большого размера относят к цитробактеру.

Примеры интерпретации результатов подсчета окрашенных колоний взятых из информации производителя представлены на рисунке 9.

- Определение Е. еоШ колифирмы

УЕЯ8Т/|*ШР) ВДм 050812«? 0703Е

- Определение дрожжей и плесневых гриоов

- Определение энтеробактерий

- Определение общено микробное числа

- Определение S. aureus

- Определение бактерий рода Salmonella

Рисунок 9 - Примеры интерпретации результатов подсчета окрашенных колоний.

При необходимости колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации.

2.2.2 Методики определения возбудителей инфекций с помощью иммунохроматографических индикаиторных элементов с наночастицами коллоидного золота

Определение микроорганизмов проводили с использованием индикаторных иммунохроматографических элементов (ИИХЭ), пропитанных коллоидным золотом и с антителами различных эпитопов, иммобилизованными на определенные зоны.

ИИХЭ представляет собой сборку из нескольких мембран, плотно прилегающих друг к другу и обеспечивающих свободное перемещение жидкой пробы под действием капиллярных сил от подложки для нанесения исследуемого образца к подложке для впитывания образца. Раствор конъюгата коллоидного золота с антителами наносится на подложку из стекловолокна или ацетата целлюлозы. На нитроцеллюлозной мембране узкими зонами нанесены антитела против антигенов микроорганизмов -аналитическая зона и антивидовые по отношению к антителам конъюгата антитела - контрольная зона.

Принцип достижения аналитического эффекта заключается в следующем. Жидкая проба, содержащая микроорганизмы, наносится на подложку, затем проба перемещается вдоль сборки мембран, реагируя с антителами, конъюгированными с коллоидным золотом. Образованный комплекс имеет вишневую окраску. Полученный иммунный комплекс под действием капиллярных сил перемещается по нитроцеллюлозной мембране, достигает аналитической зоны, где происходит его иммобилизация на мембране за счет связывания с антителами аналитической зоны. В этой зоне образуется ярко окрашенный «сэндвич» конъюгата коллоидного золота, связанного с микробными клетками, и антител, иммобилизованных на мембране. Как правило, в аналитической зоне наносят антитела к другим антигенным эпитопам инфекционного агента. Часть жидкой пробы продолжает перемещение по нитроцеллюлозной мембране, связываясь с

антителами контрольной зоны и впитываясь в подложку. Образование окраски в контрольной зоне подтверждает наличие связанных с золем золота антител, косвенно указывая на иммунохимическую активность конъюгата. Это важно для валидации всего иммунохроматографического анализа, особенно после периода хранения ИИХЭ. Итак, при наличии на нитроцеллюлозной мембране двух окрашенных полос можно сделать вывод о наличии в искомой пробе инфекционного агента. Присутствие же окраски лишь в контрольной зоне говорит об отсутствии искомого возбудителя и сохранности индикаторного реагента (конъюгата коллоидного золота с антителами). Отсутствие окраски в обеих зонах указывает на непригодность ИИХЭ.

Отбор проб мясного и растительного сырья, специй, консервов проводили по установленным государственным стандартам и нормативным документам.

С объектов внешней среды консервного цеха брали смывы с поверхности 10х10 см с использованием стерильных тампонов, которые помещали в стерильные пробирки с транспортной средой (забуференная пептонная вода). Воздух анализировали, используя пробоотборник, концентрируя исследуемый воздух в импинджер.

Отобранные пробы и смывы подвергали дифференциальному центрифугированию, полученный осадок ресуспендировали в 1 см3 специального буфера для проведения иммунохроматографического анализа. Затем 120-150 мкл полученного раствора по каплям переносили на подложку иммунохроматографического индикаторного элемента. Дальнейшая реакция проходила, как описано выше. Результат оценивали через 15-20 минут.

Оптимальные результаты теста получали при температуре окружающей среды от 10 до 40°С. Понижение температуры приводило к увеличению микровязкости при латеральной диффузии реагентов в мембране и снижению эффективности иммунохимических взаимодействий.

Для повышения чувствительности метода можно проводить предварительное обогащение микроорганизмов в жидкой питательной среде с последующим концентрированием бактерий путем центрифугирования.

2.2.3 Методики определения сульфаниламидов и антибиотиков в мясе, рыбе и продуктах их переработки на основе иммуномикрочиповой технологии с помощью тест-систем фирмы RАNDOX, Великобритания