Совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.06, кандидат биологических наук Каверин, Артем Валерьевич

• Каверин, Артем Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каверин, Артем Валерьевич

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОР

1.1 Роль ГМИ в обеспечении питания населения

1.2 Проблемы безопасности продукции содержащей ГМИ.

1.3 Методы определения ГМИ

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Отбор и подготовка проб для исследования.

2.1.2 Методика выделения ДНК с использованием детергента СТАВ

2.1.3 Методика выделения ДНК с использованием сорбента Silica

2.1.4 Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов

2.1.5 Методика качественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени

2.1.6 Методика количественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени

2.1.7 Статистическая обработка результатов

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения.

2.2.2. Сравнительная характеристика методик выделения ДНК.

2.2.3. Совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов.

2.2.4. Разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени.

2.2.5. Совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени

2.2.6. Проведение мониторинговых исследований по выявления фальсифицирующих примесей

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

4. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения»

Актуальность темы.

В последние годы значительно увеличилось производство и импорт трансгенной продукции. Крупнейшими производителями генетически модифицированных организмов (ГМО) выступают такие корпорации, как DuPont Canada Agricultural Product, Bayer CropScience, AgrEvo, Pioneer Hi-Bred, Dekalb Genetics, Northrup King, Rhone-Poulens, Plant Genetic Systems, N. V, Seminis Vegetable Seeds, AstraZeneca, Aventis, Novartis, Asgrow и абсолютный лидер - американская транснациональная корпорация Monsanto. Она же - мировой лидер в производстве и внедрении в сельское хозяйство наиболее продаваемых гербицидов: Раундап и Раундап-био. Фирмой созданы трансгенные устойчивые к этим гербицидам пищевые культуры сои, кукурузы, риса, пшеницы, ячменя, сахарной свеклы, картофеля. Фирма является также разработчиком технологий возделывания трансгенных культур с использованием этих гербицидов.

За десять лет коммерческого использования ГМ-культур объемы потребления, в частности модифицированной сои, составили: в России - 300 тысяч тонн, в странах ЕС - 50 миллионов тонн, в США - 500 миллионов тонн. Список разрешенных для использования в питании и кормах сельскохозяйственных культур на 2005 год, включает более 100 генетически модифицированных продуктов. При этом ежегодный импорт товаров, произведенных с использованием биотехнологии, оценивается в 650 млн. долл. США. Внутренний ежегодный объём российского рынка биотехнологических товаров превышает 1 млрд. долл. США. В связи с этим увеличивается вероятность поступления пищевой продукции, полученной из ГМИ, или содержащей компоненты из ГМИ, на внутренний рынок Российской Федерации.

Увеличение объемов производства связано с использованием генетически модифицированных источников в пищевой отрасли. В связи с потенциальной опасностью ГМИ, были разработаны правовые документы, регулирующие генно-инженерную деятельность и использование генно-модифицированных продуктов (ГМ-продуктов), которые в обязательном порядке должны подвергаться экспертизе и проходить госрегистрацию, а продукты, содержащие белок или ДНК, затем маркироваться.

Рынок продукции содержащей компоненты животного и растительного происхождения постоянно расширяется (8, 21, 22, 28). В связи с этим проблема контроля содержания в продуктах питания ГМ-компонентов становится актуальнее год от года. Во многом это определяется активным присутствием на рынке импортных пищевых продуктов, и особенно, сырьевых растительных компонентов, количество которых в будущем будет увеличиваться (29). Учитывая, что маркировка ГМ-продуктов не была в России обязательной до июля 2000 года, существуют опасения, что российский рынок переполнен ГМ-продуктами из Северной Америки, которые невозможно продать в Европе.

В настоящее время значительная часть импортируемых в Россию продуктов содержат компоненты из ГМИ (в основном сои). Трансгенные белки сои постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур. Современные регламенты производства любых продуктов питания не ограничивают содержание в них трансгенных растительных белков, а только требуют их маркировки. Учитывая, что замена трансгенным соевым белком белков животных - сверхвыгодный бизнес, и без того весьма скудных по биологической полноценности, рацион не менее 100 млн. россиян станет на 60-70% еще хуже. Это обострит и без того весьма неблагополучное положение со здоровьем большей части населения России, особенно молодежи. Сейчас средний россиянин съедает в год 32 кг натурального мяса и рыбы, что на 40% меньше медицинской нормы. При продолжающейся замене животных белков соевыми он в 2006-2007 годах уже Будет съедать только 20-25 кг животных белков (20).

В 2005 г. территориальными управлениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по субъектам Российской Федерации, исследовано 18872 пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов (2004 г. - 12956, 2003 г. -4300). При проведении исследований выявлено 1443 пробы (2004 г. - 1552, 2003 г. - 511), содержащие компоненты ГМО, что составило 7,6% (2004 г. -12%, 2003 г. - 11,9%). В импортируемых пищевых продуктах компоненты ГМО содержались в 6,5% (2004 г. - 14,51%, 2003 г. -14.8%) (9).

Наиболее часто ГМО встречаются в мясных продуктах - 15,8% (2004г. - 20,5%, 2003 г. - 14,8%), группа продуктов "прочие" (в основном растительные белки) - 10,8% (2004 г. - 16,7%, 2003 г. - 16,4%), птицеводческие продукты - 9,1% (2004 г. -15,4%, 2003 г. - 29,5%).

В связи с этим необходимо идентифицировать продукцию содержащую примеси ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения. На сегодняшний день это является одной из актуальнейших задач биотехнологии. Для этого необходимо разработка и создание высоко эффективных диагностических методик для выявления трансгенных растений в пищевых продуктах, продовольственном сырье, семенном материале, кормах животных, лекарственном сырье. Основой современных методик служат качественные и количественные методы. Данные методики должны позволять проводить определение ГМИ как термообработанных продуктах так и нативных.

Цель и задачи исследований.

Целью исследований являлось совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

В задачи исследований входило:

- разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения ГМИ;

- сравнительная характеристика методик выделения ДНК;

- совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов;

- разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

Научная новизна.

Разработаны модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (Si02). Разработанные методики позволяют получать свободную от ингибирующих примесей и в необходимых количествах ДНК из различных продуктов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. ДНК пригодна для качественного и количественного анализа. Методики могут использоваться для экстракции и очистки ДНК как многокомпонентных смесей, так и однокомпонентных.

Усовершенствованы методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (Si02) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов.

Проведены исследования по совершенствованию методик определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени, включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (SiC^) или использование ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), амплификации ДНК с мечеными ДНК-зондами (представляющие собой олигонуклеотид, несущий флуоресцентный краситель и флуоресцентный гаситель), используемые для качественной и количественной оценки продукта.

Разработана модифицированная методика качественного обнаружения ГМИ с использованием 35S промотора, NOS терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающую ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени.

Показана высокая чувствительность и специфичность разработанных количественных методик модифицированных методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2, кукурузы линии MON 810), позволяющих обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1 % как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных. Время анализа сокращается в 1,5-2 раза.

Проведены мониторинговые исследования в сырье и продуктах питания с использованием разработанных методик, показавших возможность использования их для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

Практическая ценность.

На основании результатов исследований разработаны:

- Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г.)

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- V Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004 г.).

- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2005 г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2006г.);

- V Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» Москва, МГУ ПБ, 2006 г.

Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.

Положения, выносимые на защиту.

- разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения искомой ДНК;

- совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов;

- совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- совершенствование методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- сравнительная оценка методов по специфичности, чувствительности и быстродействию; проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Каверин, Артем Валерьевич

выводы

1. Разработанные модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (Si02), позволяют получать свободную от ингибирующих примесей ДНК и ускоряют время выделения ДНК в 1,5-2 раза.

2. Предложенные методики используются для экстракции и очистки ДНК как однокомпонентных, так и многокомпонентных смесей животного и растительного происхождения в целях последующего качественного и количественного анализа.

3. Усовершенствованные методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (БЮг) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов, ускоряют определение ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения.

4. Разработанная модифицированная методика с использованием 35S-промотора, NOS-терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающая ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени, сокращают время качественного определения ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения до 4 часов.

5. Модифицированные методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2, кукурузы линии MON 810),высоко специфичны и позволяют обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1 % как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных.

6. Разработанные методики определения и идентификации ГМИ по основным характеристикам не уступают зарубежным аналогам, имеют более низкую стоимость и сокращают время анализа в 1,5-2 раза.

7. Проведенные мониторинговые исследования продукции животного и растительного происхождения с использованием разработанных методик показали возможность их использования для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны: - Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г.)

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Каверин, Артем Валерьевич, 2006 год

1. Бельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А,Б. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия, 2003,№ 2, с 74-96.

2. Гинцбург А.Л., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 123-124.

3. ГОСТ Р 52173-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения"

4. ГОСТ Р 52174-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа"6. Директива ЕС 1829/20037. Директива ЕС 1830/2003

5. Дубцова Г.Н., Кирюхина М.Н., Дубцов Г.Г. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с.166-168.

6. Иванов А.А., Галкина И.И., Мясникова В.В. Деятельность учреждений госсанэпидслужбы России по гигиене питания (по надзору за ГМИ в 2003 году). // Информационный сборник М. - Федеральный центр Госсанэпиднадзора. - 2004г. - 17 стр.

7. Ю.Кастро де Ж. Окружающая среда и развитие/ЯСурьер ЮНЕСКО. 1973. январь, с. 22.

8. Киль В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука в Bt-защищенному картофелю// Агро XXI Современное растениеводство России: практика и научные достижения., №7 с.22-24

9. Комаров А.А., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария 2000., №3., с. 59-62.

10. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., изд. «Мир»., 1994, с. 159-172.

11. Методические указания «Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги» МУК 4.2.1917-04

12. Методические указания «Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги» МУК 2.3.2.1935-04

13. Методические указания «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания». МУК 4.2.1913-04.

14. Методические указания «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции». МУК 4.2.1902-04.

15. Методические указания «Пищевые продукты и пищевые добавки. Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги» МУ 2.3.2.1917-04

16. Монастырский О.А «На пути к устойчивому развитию России»// Бюллетень Центра экологической политики России №28 2004 с14-18

17. Нечаев А.П. Научные основы и технологические решения получения жировых продуктов для здорового и лечебно-профилактического питания // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 377-379.

18. Попова М.Ю., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Жаринов А.И., Рогов И.А., Скрябин К.Г. Определение содержания и выделение ПЦР-пригодной ДНК из коммерческих препаратов переработки сои // Биотехнология, Москва, 2003, № 2, с. 86-94.

19. Постановление № 149 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 16.09.2003

20. Постановление № 36 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 14.11.2001

21. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации «Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из генетически модифицированных источников» от 31 декабря 2004г. № 13.