Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Орлова, Елена Владимировна

• Орлова, Елена Владимировна
• доктор биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор биологических наук Орлова, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Нуклеотиды и нуклеозиды: биологическая роль, участие в метаболических процессах, регуляции иммунитета, механизмов апоптоза и антиоксидантной защиты организма.

ГЛАВА I. Материалы и методы исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА II. Разработка метода получения и стандартизации комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2.1. Выбор оптимальных условий культивирования дрожжей

Saccharomyces cerevisiae для получения нуклеотидного препарата.

2.2. Исследование влияния состава среды в условиях периодического культивирования штаммов дрожжей Sacchromyces cerevisiae на выход нуклеотидных препаратов и эффективность их действия на

Са2+-зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar.

2.3. Исследование влияния состава среды при культивировании в условиях одноступенчатого хемостата дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 на выход нуклеотидного препарата и эффективность его действия на Са2г-зависимую NOS.

2.4. Исследование влияния состава среды при культивировании в условиях турбидостата дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 на выход нуклеотидного препарата и эффективность его действия на Са2+ -зависимую NOS.

2.5. Исследование влияния культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 при последовательном выращивании на средах с этанолом и глюкозой на свойства нуклеотидных препаратов.

ГЛАВА III. Изучение иммуномодулирующих свойств комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14.

3.1. Исследование влияния нуклеотидного препарата на В-клеточное звено иммунитета.

3.2. Исследование влияния нуклеотидного препарата на Т-клеточное звено иммунитета.

ГЛАВА IV. Исследование антидиабетического действия комплексного нуклеотидного препарата на модели диабета 2 типа.

4.1 .Влияние нуклеотидного препарата на уровень содержания глюкозы и инсулина в крови крыс с диабетом 2 типа.

4.2. Влияние нуклеотидного препарата на показатели окислительного стресса у крыс с диабетом 2 типа.

ГЛАВА V. Исследование влияния нуклеотидного препарата на культуры клеток перевиваемых опухолей и функциональное состояние нейтрофилов крови человека.

5.1. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на жизнеспособность клеток в культурах перевиваемых опухолей.

5.2. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на процессы апоптоза в культурах перевиваемых опухолей.

5.3. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на клеточный цикл перевиваемых опухолевых клеток.

5.4. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на продукцию активных форм кислорода, фагоцитоз, клеточную адгезию и дегрануляцию нейтрофилов.

ГЛАВА VI. Доклиническое токсикологическое изучение комплексного нуклеотидного препарата.

6.1. Исследование токсичности комплексного нуклеотидного препарата при однократном введении лабораторным животным.

6.2. Исследование токсичности комплексного нуклеотидного препарата в условиях 3-месячного хронического эксперимента на крысах Wistar.

6.3. Исследование токсичности готовой лекарственной формы комплексного нуклеотидного препарата в условиях 2-месячного хронического эксперимента на собаках.

6.4. Изучение мутагенных свойств комплексного нуклеотидного препарата.

6.5. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств комплексного нуклеотидного препарата.

6.6. Изучение влияния комплексного нуклеотидного препарата на репродуктивную функцию.

6.7. Изучение аллергизируюших свойств препарата.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae»

Актуальность темы. Среди важнейших внутриклеточных компонентов особое положение занимают вещества нуклеотидной природы, которые в качестве кофакторов и в составе ДНК и РНК участвуют в таких жизненноважных процессах живых организмов, как биосинтез белков, регуляция биохимических процессов, энергетического обмена, иммунитета и функционирования наследственного аппарата. В настоящее время существенно возрос интерес к поиску и разработке лекарственных препаратов на основе природных нуклеотидов, которые могут стать эффективными средствами регуляции различных функций организма и метаболической терапии (van der Giet M. et al., 2001; Химкина JI.H. с соавт, 2001; Медведев М.С. с соавт., 2002).

Известна также ключевая роль некоторых нуклеотидов в синтезе оксида азота- NO, которому принадлежит важная роль в регуляции многих биохимических процессов, в частности, активировании гуанилатциклазы, фосфолипазы С, влиянии на синтез инсулина, адреналин- и дофаминергическую системы. Кроме того, NO является нейротрансмиттером и веществом, участвующим в -регуляции артериального давления, иммунореактивности и многих других важных физиологических процессов (Kerwin, J. F., et al., 1995, Bartberger M. D., et al., 2002).

В связи с тем, что влияние нуклеотидов на синтез NO в организме осуществляется путем изменения активности NO-синтаз (NOS), в частности Са - зависимой NO-синтазы, поиск препаратов, влияющих на активность NOS, является одной из актуальных задач современной биологии и медицины.

Наше внимание привлекла возможность получения нуклеотидных препаратов из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые по данным Лидак М.Ю., (1980); Заерко В.В с соавт, (2000) обладают выраженной биологической активностью, низкой токсичностью и перспективны для разработки на их основе лекарственных препаратов для повышения иммунореактивности организма, коррекции метаболических нарушений и нормализации физиологических процессов при развитии ряда патологических состояний.

Цели исследования: получение нуклеотидных препаратов при различных условиях культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae, оценка влияния полученных препаратов на активность Са - зависимой NOS, выбор наиболее активного из них, исследование его фармакологических свойств и токсичности для получения разрешения на проведение клинических испытаний препарата.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способы получения и стандартизации нуклеотидных препаратов из 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae при различных условиях их культивирования.

2. Изучить влияние условий культивирования исследуемых штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae на активность полученных нуклеотидных препаратов по действию на Са2+-зависимую NO-синтазу тимоцитов крыс Wistar и отобрать наиболее активный из них.

3. Исследовать иммуномодулирующее действие отобранного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основные звенья гуморального и клеточного иммунитета, а также на систему естественной резистентности организма.

4. Исследовать антиоксидантное действие полученного нуклеотидного препарата при окислительном стрессе на модели диабета 2 типа у крыс Wistar и изучить влияние препарата на секрецию инсулина (3-клетками поджелудочной железы при данной патологии.

5. Изучить цитотоксическое действие полученного нуклеотидного препарата на клетки человеческой аденокарциномы линии НеЬа, человеческой монобластоидной линии И937, человеческой карциномы молочной железы МСР7 и мышиной фибробластомы Ь929.

6. Провести доклиническое токсикологическое изучение нуклеотидного препарата для получения разрешения на проведение его клинических испытаний.

Научная новизна и практическая значимость работы. о Впервые разработан способ получения, изучен состав и биологическая активность комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Засскаготусез сеге\Ыае раса 14, который является

2+ активатором Са - зависимой N0- синтазы, обладает иммуномодулируюгцей активностью, защищает при окислительном стрессе и стимулирует образование инсулина [3-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа и является селективным апоптотическим фактором по действию на опухолевые клетки. По эффективности действия разработанный препарат не уступает используемым в настоящее время в клинической практике лекарственным препаратам аналогичного действия. Препарат малотоксичен, не обладает мутагенными, эмбриотоксическими, тератогенными, аллергизирующими свойствами и не влияет на репродуктивную функцию животных. о Изучен предполагаемый механизм действия препарата, связанный с его нормализующим действием на систему свободно-радикального окисления путем активации ряда таких ключевых ферментов и ферментных систем, как Са - зависимая N0- синтаза и активация

Са2+ - мобилизующей системы, глутатион-связывающей системы и, возможно, с нивелированием убиквитин-перехватывающей активности.

На модели диабета 2 типа у крыс установлено, что полученный нуклеотидный препарат оказывает выраженное антиоксидантное действие, восстанавливая нарушенные системы супероксидперехватывающей активности и восстановленного глутатиона. Назначение препарата купирует изменение активности синтазы оксида азота, вызванное стрептозотоцином.

Впервые получены данные, свидетельствующие о способности разработанного препарата в концентрациях 0,2-0,5 мг/мл оказывать цитотоксическое действие in vitro на перевиваемые клетки аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы MCF7 и мышиной фибробластомы L929.

Установлено, что в диапазоне испытанных концентраций нуклеотидный препарат активирует каспазу-3 в опухолевых клетках указанных выше линий, вызывая при этом снижение доли G2/M в популяции клеток и увеличение ДОЛИ апоптотирующих клеток (< Gi) и не влияет на клетки в культуре нормальных лейкоцитов человека, т.е. обладает селективным апоптотическим действием на опухолевые клетки.

На способ получения, являющийся экологически чистым, безотходным, и биологическую активность разработанного комплексного нуклеотидного препарата получено 3 патента Российской Федерации (№ 2128218, № 2128702, № 2138549) и 3 Европатента (ЕР 0 805 201, ЕР 0 805 202, ЕР 0 805 203). На Всемирном салоне «Брюссель-Эврика-98» изобретение награждено Золотой медалью.

Внедрение результатов исследований в клиническую практику.

В соответствии с Законом Российской Федерации, разработанный комплексный нуклеотидный препарат зарегистрирован Министерством здравоохранения РФ в качестве лекарственного средства иммуностимулирующего действия для лечения острых респираторных вирусных инфекций у взрослых и детей с 6 лет и старше, сезонной профилактики ОРВИ, а также для комплексной терапии сахарного диабета 2 типа (Регистрационное удостоверение № Р №000949/ 02-2001 от 27.12.2001, ФСП 42-0331-1690-01, код АТС-[Ь0АХ]), и в качестве БАД (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 77.99.23.3.У.9412.8.05 от 16.08.2005).

Результаты исследований использованы при подготовке методических указаний для врачей "Перекисное окисление липидов и его значение в патогенезе сахарного диабета и его осложнений" Министерства здравоохранения и социального развития РФ (Москва, 2004).

Результаты исследований используются в клинической практике по целевой Федеральной программе "Профилактика гриппа и ОРВИ в дошкольных и школьных учреждениях"

Положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Оптимальным источником для получения нуклеотидного препарата из 5 изученных штаммов хлебопекарных дрожжей 8асскаготусез сегеу1н1ае (раса 14, гибрид 67, гибрид 581, гибрид 722, гибрид 739) при различных режимах культивирования на глюкозе является раса 14. Полученный при этом комплексный нуклеотидный препарат содержит: адениновые нуклеотиды, свободные аминокислоты, микро- и макроэлементы, витамины, жирные кислоты и обладает выраженным активирующим действием на Са -зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar.

2. Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, оказывает выраженное иммуномодулирующее действие на клеточный и гуморальный иммунитет, а также на систему естественной резистентности организма.

3. На модели инсулиннезависимого диабета (диабет 2 типа) у крыс Wistar нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных доз от 100-1000 мг/кг при внутрижелудочном введении животным обладает выраженным гипогликемическим эффектом и повышает уровень секретируемого поджелудочной железой инсулина. При этом восстанавливается уровень сульфгидрильных групп глутатиона в плазме крови, нормализуется активность СОД и супероксидперехватывающей активности, а также уровень Са -зависимой NOS в печени, (3-клетках поджелудочной железы и буром жире, что свидетельствует о нормализации антиоксидантных систем организма. У интактных животных нуклеотидный препарат не влияет на указанные выше биохимические показатели.

4. Нуклеотидный препарат в концентрациях 0,2-0,5мг/мл обладает цитотоксическим эффектом на перевиваемых клетках человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы линии MCF7 и мышиной фибробластомы L929; активирует каспазу-3 в клетках указанных опухолевых линий, изменяет их клеточный цикл и не влияет на эти показатели в эксперименте на интактных лейкоцитах донорской крови человека. Нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae обладает селективным апоптотическим действием на опухолевые клетки.

5. Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является малотоксичным при однократном введении мышам и крысам, хорошо переносится при длительном назначении лабораторным животным. Препарат не проявляет мутагенности в тесте Эймса, не вызывает хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и не влияет на количество доминантных леталий в зародышевых клетках мышей. При назначении беременным крысам препарат не обладает эмбриотоксичностью и тератогенностью. Препарат не влияет на репродуктивную функцию половозрелых животных. В испытанных дозах и схемах введения препарат не проявляет аллергизирующего действия.

6. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать полученный комплексный нуклеотидный препарат в качестве лекарственного средства сопутствующей терапии для коррекции метаболических нарушений при диабете 2 типа, в качестве иммуностимулятора и БАД общеукрепляющего действия.

Апробация работы.

Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: The XI-Th International Symposium on Microsoms and Drug Oxidation, Los-Angeles, USA, 1996; International Conference of EPR Spectroscopy of NO in Biological Systems. Suzdal, Russia, 1996; TheVII Balt-LASA Conference «Animal Models», Vilnius, Lithuania, 1997; 6th European Symposium on calcium binding properties in normal and transformed cells. Paris, France, 2000; International Conference "New food technologies" , Russia, Moscow, 2003; 11-th International Congress of yeasts "Yeasts in science and technology. The quest for sustainable development", Brazil, Rio De Janeiro, 2004; 25th Congress of Russian Biochemical Society, Russia, Moscow, 13-15 October, 2004, p.44; XII международный конгресс

Человек и лекарство", 2005, Москва, Россия, с.497., International Conference NMRCM-2005, Russia, St. Petersburg, 11-15 July, 2005, p.94.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 31 печатная работа, из них 9 статей в журналах перечня ВАК Министерства образования и науки РФ, 1 монография, 15 работ в материалах международных конференций. Получено 6 патентов (3 Патента РФ и 3 Европатента), а также Золотая медаль Всемирного салона "Брюссель-Эврика-98".

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 233 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 56 таблицами, 21 рисунком. Список литературы содержит 581 источник, в том числе 112 отечественных и 463 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Орлова, Елена Владимировна

выводы

1. Из 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae (раса 14, гибрид 67, гибрид 581, гибрид 722, гибрид 739) наиболее подходящим по технологичности культивирования, количественному выходу целевого продукта - биологически активного нуклеотидного препарата, доступности его выделения из биомассы и стандартизации, а также по выраженности активирующего действия на Са -зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar является штамм Saccharomyces cerevisiae раса 14.

2. Применение разработанного метода, позволяет получать нуклеотидный препарат, состоящий из комплекса биологически активных компонентов (нуклеотиды, включая адениннуклеотиды, аминокислоты, витамины, макро- и микроэлементы) и не содержащий чужеродных, несвойственных организму человеку и животных веществ.

3. Полученный по оригинальной технологии из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 нуклеотидный препарат, содержащий комплекс биологически активных веществ обладает выраженным активирующим действием на Са2+-зависимую NOS, играющую важную роль в регуляции многих физиологических процессов в организме.

4. Комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 является иммуномодулятором широкого спектра действия: оказывает дозозависимое усиление иммунного ответа и увеличение числа антителообразующих клеток на фоне антигенного стимула, усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов селезенки мышей при действии митогенов фитогемагглютинина и конканавалина А, угнетает реакцию гиперчувствительности замедленного типа, индуцируемую эритроцитами барана.

5. Внутрижелудочное введение нуклеотидного препарата в испытанных дозах крысам с диабетом 2 типа вызывает выраженный гипогликемический эффект и стимулирует образование инсулина ß-клетками поджелудочной железы. Указанные эффекты связаны с прямым активирующим действием препарата на Са2+-зависимую NOS, индуцирующую продукцию инсулина ß-клетками поджелудочной железы.

6. Введение в желудок крысам с диабетом 2 типа нуклеотидного препарата на фоне развивающегося оксидативного стресса, восстанавливает уровень SH-глутатиона и супероксид-перехватывающую активность плазмы крови и головного мозга, а также активность Ca -зависимой NOS.

7. Нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных концентраций 0,2-0,5 мг/мл в культуре перевиваемых клеток человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы линии MCF7 и мышиной фибробластомы L929 обладает цитотоксическим действием, механизм которого обусловлен индуцированием препаратом каспазы-3, вызывая селективный апоптоз опухолевых клеток. Указанный эффект сопровождается снижением доли G2/M популяции клеток перевиваемых опухолей, приводящим к увеличению доли апоптотирующих клеток (< G]).

8. Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 по разработанному регламенту, является малотоксичным веществом при однократном введении лабораторным животным. ЛД50 при внутрижелудочном введении препарата мышам BALB/c и крысам Wistar установлены на уровне 15000-20000 мг/кг. При этом не выявлено существенных видовых и половых различий в чувствительности указанных видов животных к токсическому действию препарата.

9. При ежедневном 3-х месячном введении в желудок крысам Wistar нуклеотидного препарата в дозах 100 и 500 мг/кг и при 2-х месячном назначении внутрь препарата собакам в готовой лекарственной форме (таблетки по 0,5 г) в дозе 500 мг/кг установлена хорошая переносимость препарата и отсутствие его повреждающего действия на функциональное состояние основных органов и систем подопытных животных. Отсутствие токсического действия препарата в испытанных дозах подтверждено результатами патоморфологических исследований, проведенных после окончания хронических экспериментов.

10. Нуклеотидный препарат на вызывает генные мутации у индикаторных штаммов бактерий Salmonella thyphimurium ТА 98, ТА 100 и ТА 1537 (тест Эймса), не вызывает хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих, не влияет на количество доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей и систему репарации ДНК в SOS-хромотесте, следовательно, препарат не обладает мутагенностью и не является потенциальным канцерогеном.

11. Нуклеотидный препарат при введении в желудок беременным крысам в дозе 500 мг/кг с 1 по 19 день гестации не проявляет эмбриотоксических и тератогенных свойств. При ежедневном внутриже луд очном введении нуклеотидного препарата в дозе 500 мг/кг крысам- самцам в течение 10 недель (2- 3 цикла сперматогенеза) и 2 недель крысам- самкам (2-3 эстральных цикла) не установлено влияния препарата на репродуктивную функцию животных.

12. Разработка нуклеотидного препарата, активирующего Са2+-зависимую NOS, обладающего иммуномодулирующим действием, нормализующего уровень глюкозы и стимулирующего образование инсулина (3-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа, регулирующего эффекты антиоксидантной системы защиты организма и вызывающего селективный апоптоз клеток перевиваемых опухолей открывает новые возможности нормализации биохимических нарушений при использовании препарата в качестве средства комплексной терапии при лечении указанных патологических состояний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученный по разработанной технологии из дрожжей Басскаготусез сегеугзгае раса 14 нуклеотидный препарат, содержащий комплекс биологически активных веществ - нуклеотиды, аминокислоты, витамины, макро- и микроэлементы, обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами в экспериментах на лабораторных животных и перспективен для" клинических испытаний для лечения заболеваний, сопровождающихся развитием иммунодефицитных состояний.

2. Выраженное гипогликемическое действие, защита от оксидативного стресса и стимуляция образования инсулина (3-клетками поджелудочной железы под влиянием комплексного нуклеотидного препарата на модели диабета 2 типа у крыс свидетельствуют о целесообразности проведения клинических испытаний разработанного препарата у больных с данным заболеванием.

3. Индуцирование нуклеотидным препаратом каспазы-3 и вызываемый препаратом селективный апоптоз в культуре клеток перевиваемых опухолей, а также его выраженное иммуномодулирующее действие позволяют рассматривать разработанный препарат из дрожжей БасскаготусеБ сегеуІБІае раса 14 в качестве перспективного лекарственного средства сопутствующей терапии при лечении опухолевых заболеваний.

4. Результаты доклинического токсикологического изучения разработанного нуклеотидного препарата, показавшие его низкую токсичность при однократном введении и хорошую переносимость при длительном назначении лабораторным животным, отсутствие мутагенных, эмбриотоксических, тератогенных и аллергизирующих свойств, а также негативного влияния на репродуктивную функцию животных свидетельствуют о возможности проведения клинических испытаний препарата в качестве комплексной терапии указанных выше заболеваний.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Орлова, Елена Владимировна, 2007 год

1. Ажипа Я.И., Реутов В.П., Каюшин Л.П. Окислительные свойства NO и их связь с процессами нитрозирования ненасыщенных жирных кислот. Физиол. человека, 1990, т. 16, с.131-149.

2. Аликулов З.А., Львов Н.П., Кретович В.П. Восстановление ионов NO3" в NO2" в цикле окиси азота. Биохимия, 1983, т.45, с.1714-1717.

3. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. 1994, М., «Мир».

4. Ананиади А.И., Сергеев Н.С., Кильдибеков H.A., Львов Н.П., Кретович В.А. Цикл окиси азота. Биохимия, 1983, т.48, с.932-936.

5. Арчаков а А.И. Оксигеназы биологических мембран. 37-е Баховское чтение. М., Наука, 1982, с.56.

6. Арчаков А.И. Микросомальные окисления. М., Наука, 1975, с. 327.

7. Баскакова A.A., Безбородова С.И., Беляева М.И. Нуклеазы микроорганизмов. М., Наука, 1974, с.328.

8. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Ленинград, Государственное изд-во медицинской литературы, 1963.

9. Бендолл Дж. Мышцы, молекулы и движения. М., Мир, 1970, с.256.

10. Бердиев У.Б., Кузнецов Ю.П., Куклин П.Г., Реутов В.П., Шекшеев Э.М. Моделирование спектров ЭПР парамагнитных центров крови на персональных ЭВМ типа IBM PC/XT/AT. М, Ин-т хим.физики АН СССР, 1989, 208 с.

11. Бердиев У.Б., Реутов В.П., Вишневский Е.С., Шекшеев Э.М., Каюшин Л.П.Свободно-радикальные окислы азота могу участвавовть формировании конформеров комплексов гемоглобина с окстдом азота. Биофизика, 1990, т.35, с.382-383.

12. Болдырев A.A. Биологические мембраны и транспорт ионов. М., МГУ, 1985, с. 208.

13. Болдырев A.A. Введение в биохимию мембран. М., Высшая школа, 1986, с. 112.

14. Ванин А.Ф. Взаимопревращение двух возможных форм эндотелиального фактора релаксации сосудов S-нитрозоцистеина и динитрозильного комплекса железа с цистеином. Биофизика, 1993, т.38, с. 751-761.

15. Ванин А.Ф., Блюменфельд Л.А., Четвериков А.Г. Исследование методом ЭПР комплексов негемового железа в клетках и тканях. Биофизика, 1967, т.12, с. 829-838.

16. Ванин А.Ф., Бурбаев Д.Ш. Белки, содержащие железо-серные активные центры. Журн. Всес. хим. об-ваим. Д.И. Менделеева, 1976, т.21, с.672-684.

17. Ванин А.Ф., Кубрина Л.Н., Мордвинцев П.И. Карбахол индуктор образования окиси азота в печени животных in vivo. Докл. АН СССР, 1988, т.301, с. 490-493.18