Разработка функционализированных липосомальных систем для доставки лекарственных препаратов с использованием разветвленных сополимеров на основе хитозана тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Ле-Дейген, Ирина Михайловна

• Ле-Дейген, Ирина Михайловна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Ле-Дейген, Ирина Михайловна

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Липосомы как система доставки лекарственных препаратов

1.1.1 Свойства липосом и влияние на их свойства липидного состава

1.1.3 Методы стабилизации свободных липосом и липосомальных форм лекарств

1.1.4 Методы векторизации липосом

1.2. Методы изучения липосом и их комплексов с различными лигандами

1.3. ИК-спектроскопия Фурье

1.3.1. Основной принцип метода ИК-спектроскопии

1.3.2. Особенности математической обработки ИК-спектров

1.3.3. ИК-спектроскопия биомолекул

1.3.4. ИК-спектроскопия клеток

1.4. Выводы из обзора литературы

1.5. Постановка задачи

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2 Методы

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Синтез и характеристика производных хитозана

3.1.1 Синтез сополимеров ПЭГ-хитозана

3.1.2 Разработка методики определения содержания ПЭГ в растворе по данным ИК-спектроскопии Фурье

3.1.3 Определение степени ПЭГилирования хитозана

3.1.4 Исследование стабильности ПЭГ-хитозана при хранении

3.1.5 Синтез и характеризация конъюгатов хитозана с фолиевой кислотой с целью разработки систем активного нацеливания

3.2 Разработка метода анализа свойств липосом и их комплексов на основе ИК-спектроскопии Фурье

3.2.1 Изучение процесса фазового перехода липосом

3.2.2 Изучение взаимодействия липосом с модельным поликатионом ПЭВП

3.3 Изучение взаимодействия липосом с производными хитозана

3.3.1 Изучение взаимодействия липосом с конъюгатами ПЭГ-хитозан

3.3.2 Определение константы устойчивости комплекса липосом с ПЭГ-хитозаном

3.3.3 Механизм взаимодействия ПЭГ-хитозана с липосомами

3.3.4 Влияние комплексообразования с ПЭГ-хитозаном на фазовый переход липосом

3.3.5 Влияние комплексообразования с ПЭГ-хитозаном на стабильность липосом при хранении

3.3.6. Взаимодействие липосом с конъюгатом хитозан-фолиевая кислота

3

3.4 Получение липосом, загруженных лекарственными веществами

3.4.1 Получение липосом, загруженных доксорубицином

3.4.2 Получение липосом, загруженных моксифлоксацином

3.4.3 Получение липосом, загруженных рапамицином

3.5 Влияние комплескообразования с производными хитозана на процесс высвобождения лекарств из липосом

3.5.1. Влияние комплексообразования с ПЭГ-хитозаном на процесс высвобождения доксорубицина из липосом

3.5.2 Влияние комплексообразования с ПЭГ-хитозаном на процесс высвобождения моксифлоксацина из липосом

3.5.3. Влияние комплексообразования с конъюгатом хитозана с фолиевой кислотой на процесс высвобождения доксорубицина из липосом

3.6. Влияние комплексообразования с производными хитозана на цитотоксичность липосомальных форм лекарств

3.6.1. Изучение цитотоксичности полимеров и комплексов полимеров с липосомами, не загруженными лекарством

3.6.2. Влияние комплексообразования с производными хитозана на цитотоксичность липосомальных форм доксорубицина

3.6.3. Влияние комплексообразования с производными хитозана на захват клетками липосомальных форм доксорубицина

3.6.4. Влияние комплексообразования с производными хитозаном на цитотоксичность липосомальных форм рапамицина

Заключение

Выводы

Благодарности

Список использованной литературы

Список сокращений

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ДМСО диметилсульфоксид

ДПФХ дипальмитоилфосфатидилхолин

ДСР метод динамического светорассеяния

ЖК жидокристаллическое состояние липосом

ИК-спектроскопия Фурье - инфракрасная спектроскопия Фурье

КЛ кардиолипин

ЛДокс липосомальная форма доксорубицина ЛМокс липосомальная форма моксифлоксацина ЛРапа липосомальная форма рапамицина м(АБ) моноклональное антитело

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразол бромид НПВО нарушенное полное внутренне отражение

ПЭВП статистический сополимер N-этил^-винилпиридиний бромида и 4-

винилпиридина («поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромид»)

ПЭГ полиэтиленгликоль

ТНБС тринитробензолсульфокислота

ФК фолиевая кислота

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ЭКД ^-(3-диметиламинопропил)- А^-этилкарбодиимид EGFR рецептор эпидермального фактора роста EpCAM белок клеточной адгезии

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

HER тирозиновая протеинкиназа семейства рецептора эпидермального

фактора роста EGFR/ErbB

MBP манноза-связывающий белок

MDR множественная устойчивость к лекарствам MEA 2-меркаптоэтиламин

mPEG-suc-NHS монометокси-РЕО-К-гидрокси сукцинимидилсукцинат NTA метод анализа траектории наночастиц PCA метод главных компонент

RESS метод быстрое расширения сверхкритических растворов SAP сывороточный амилоид Р SD стандартное отклонение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка функционализированных липосомальных систем для доставки лекарственных препаратов с использованием разветвленных сополимеров на основе хитозана»

Введение

Как в России, так и в мире существует потребность в разработке новых, более эффективных и безопасных лекарств. Использование систем доставки лекарственных препаратов с управляемыми свойствами позволяет решить ряд характерных для многих активных молекул проблем, среди которых малая биодоступность и растворимость, выраженные побочные эффекты и низкая эффективность длительной терапии. Наиболее остро данная проблема проявляется в случае тяжелых хронических болезней, таких как злокачественные опухоли, туберкулёз и другие, когда требуется длительная медикаментозная терапия с применением высоких дозировок. Низкая эффективность систем доставки вынуждает принимать высокие дозы препаратов в течение многих месяцев и даже лет, что наносит значительный вред всему организму. При этом возрастает риск развития резистентности и множественной лекарственной устойчивости. Повышение экспозиции препаратов при тех же или меньших дозировках, а также обеспечение направленной доставки лекарств к очагам воспаления способны кардинально повысить эффективность и безопасность терапии широкого круга заболеваний.

Перспективной системой доставки представляются липосомы -липидные везикулы, сходные по химическому составу с мембраной живой клетки. Вариабельность свойств липосомального контейнера, биосовместимость и биодеградируемость обуславливают широкое применение липосом в современной медицине. Структура липосом позволяет включать в них гидрофобные, гидрофильные и амфифильные соединения. Несмотря на значительный прогресс в области создания липосомальных контейнеров, лишь немногие лекарственные препараты были реализованы на практике. Основные ограничения в применении липосомальных систем -

невысокая ёмкость липосомального контейнера, низкая эффективность захвата липосом целевыми клетками и медленное высвобождение лекарства в зоне терапевтического действия. Поэтому актуальным является создание функционализированных липосомальных систем с целью придать системе требуемые свойства: в первую очередь адресную доставку и увеличенное время циркуляции в кровотоке.

Биосовместимые полимеры, способные образовывать нековалентные комплексы с липосомами, - перспективные регуляторы свойств липосомальных систем. В связи с активным развитием подхода к модификации липосомальной поверхности за счет полимерной оболочки, актуальным является детальное изучение механизма комплексообразования, и выявление факторов, влияющих на структурно-функциональные свойства получаемых комплексов.

В настоящей работе предложен подход к получению липосомальных систем фунционализированных ПЭГ-хитозаном и конъюгатами хитозана с фолиевой кислотой для доставки трех клинически важных препаратов: противоопухолевого препарата доксорубицина, антибиотика широкого спектра действия моксифлоксацина и иммуномодулятора рапамицина. Для доксорубицина показана эффективность систем доставки на основе липосомальных систем (первое нанолекарство, допущенное к применению в терапии, - липосомальная форма доксорубицина БохП®), однако требуются дальнейшие исследования, направленные на создание систем активной доставки с управляемыми свойствами. Остро стоит вопрос разработки систем доставки моксифлоксацина - одного из наиболее эффективных препаратов для лечения туберкулёза. Трудности в терапии моксифлоксацином заключаются в его малой растворимости в воде и невысокой биодоступности в очагах воспаления. Использование липосом может решить данные

проблемы: высокое сродство липосом на основе фосфатидилхолина к легочному сурфактанту и возможность придания им мукоадгезивных свойств за счет покрытия производными хитозана может повысить биодоступность и обеспечить эффект пролонгированного действия преперата. Таким образом, функционализированные липосомальные системы особенно привлекательны для доставки моксифлоксацина.

Рапамицин - крупная гидрофобная молекула, абсолютно нерастворимая в воде, поэтому включение его в липосомы может помочь значительно повысить эффективность терапии за счёт увеличения биодоступности.

Для детального изучения физико-химических свойств липосомальных форм лекарственных препаратов и их комплексов с полимерами предложен комплексный подход на основе ИК-спектроскопии Фурье. Метод позволяет получать детальную информацию о тонкой структуре надмолекулярных систем и микроокружении функциональных групп. Анализ изменений положения и структуры полос поглощения в ИК-спектре позволяет определять характер взаимодействий функциональных групп с лигандами. Важным преимуществом метода является его применимость для анализа микрогетерогенных и гетерогенных коллоидных систем, таких как липосомальные комплексы, поскольку светорассеяние не оказывает влияние на оптические свойства системы в данной области электромагнитного излучения.

В настоящей работе исследованы возможности ИК-спектроскопии для тонкой диагностики состояния липидной мембраны и ее комплексов с низко-и высокомолекулярными лигандами (лекарствами и производными хитозана) и определения их физико-химических параметров (К^, стабильность, структурные характеристики). Показано, что разработанная нами методология позволяет получать детальную информацию о структуре

комплекса липосом с полимерными полиэлектролитами различной природы, исследовать влияние свойств полимера на молекулярное состояние бислоя и роль каждой из функциональных групп липидных молекул в комплексообразовании; определять сайты связывания лиганда с бислоем, определять характер взаимодействия и сайты связывания лекарственных молекул с липидами.

Таким образом, работа направлена на создание липосомальных систем доставки доксорубицина, рапамицна и моксифлоксацина, в том числе с эффектом активного нацеливания. Важными задачами работы является, во-первых, изучение механизмов формирования комплексов липосом с полимерами и механизмов включения лекарственных препаратов в липосомы. Во-вторых, изучение влияния молекулярной архитектуры полимерного покрытия на физико-химические и цитотоксические свойства полученных липосомальных форм.

Полученные в работе результаты служат основной для развития применения сложных липосомальных систем, включающих низко- и высокомолекулярные лиганды, в биомедицине и более глубокого понимания механизмов, определяющих свойства комплексов липосомальных систем с полимерами.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Липосомы как система доставки лекарственных препаратов

1.1.1 Свойства липосом и влияние на их свойства липидного состава

Ввиду амифифильности липиды в водных растворах обычно образуют агрегаты. Структура и размер агрегатов существенным образом зависит от липидного состава системы, температуры, способа получения и концентрации.

За счет подвижности ацильных остатков молекулы могут принимать различные геометрические формы и образовывать большое количество разнообразных липидных фаз. Для данной классификации обычно используют параметр упаковки

_ V

1а0 ^ )

где V - объем, занимаемый молекулой липида, 1 - длина молекулы липида, ао - площадь, занимаемая полярной группой в мембране [1].

На рис. 1 представлена фазовая диаграмма для дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ). В зависимости от температуры и содержания воды в системе может образовываться ряд фаз: ламеллярная гелевая фаза Ьр, ламеллярная жидкокристаллическая Ьа и промежуточная рифленая фаза Рр, кубическая фаза Оа и гексагональная фаза На. Последние две могут образовываться при высокой температуре и в условиях низкой степени гидратации липидов. Для фазы На характерны гексагональное расположение трубчатых структур с гидрофобными хвостами молекул, повернутыми против просвета трубки. Эта фаза также в литературе называется Н11 в противовес фазе Н12, которая образуется в избытке воды и для которой характерной расположение гидрофобных хвостов внутрь

просвета трубки. Некоторые фосфолипиды, например, дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, способны образовывать данные фазы при комнатной температуре [2]. Ламеллярные фазы ДПФХ представлены более вязкой гель-фазой Ьр и менее вязкой жидкокристаллической Ьа. В гелеобразной фазе фосфолипиды упакованы плотно, подвижность гидрофобных хвостов существенно ограничена. Следует отметить наличие фаз Ьр' т.н. рифленой фазы, которая характерна, например, для дипальмитоилфосфатидилхолина, наблюдаются не для всех фосфолипидов. В фазе Ьр' гидрофобные остатки липидных молекул располагаются под углом 300 к поверхности бислоя.

Рис. 1. Фазовая диаграмма для дипальмитоилфосфатидилхолина (структура на вставке) в воде. Указаны следующие фазы: ламеллярная гелевая фаза Lp, ламеллярная жидкокристаллическая La и промежуточная рифленая фаза Pp, кубическая фаза Qa и гексагональная фаза Пунктиром показана граница максимальной адсорбции воды с образованием гомогенной водно-липидной смеси [3].

Липосомы представляют собой частицы, которые образованы одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислоями, внутренний объем которых изолирован от внешней среды. Часто липосомы состоят из нескольких липидов. Например, наличие холестерина в липосомах

приводит к увеличению жесткости, уменьшает текучесть и ограничивает проницаемость для малых водорастворимых молекул, а также увеличивает упругость и механическую прочность бислоя [4].

Для обеспечения заряда на поверхности липосом, т.е. получения катионных или анионных липосом, добавляют соответственно, например, бис(гуанидиний)-тренхолестерин и кардиолипин. Заряд на поверхности липосом может требоваться, например, для образования электростатических комплексов с полиэлектролитами [5] или для доставки заряженных целевых молекул, в частности, нуклеиновых кислот [6].

Как уже упоминалось ранее, температура оказывает существенное влияние на состояние липидов. Для липосом характеристическим свойством является температура фазового перехода Ьр - Ьа Тф п; для основных липидов величины Тфп приведены в таблице 1. Так, более длинные и более насыщенные углеводородные цепи обладают более высокой температурой перехода (рис. 2), а наличие ненасыщенных связей в г/иоконфигурации приводит к повышению текучести бислоя из-за снижения компактности упаковки цепей без изменения гидрофобности [3].

Рис. 2. Зависимость температуры фазового перехода от содержания атомов в углеводородной цепи остатков жирных кислот для насыщенных фосфолипидов.

90

12.0 14 0 16:0 18 0 20.0 22.0 24.0

число атомов углерода в цепи

Таблица 1. Структуры и температура фазовых переходов некоторых фосфолипидов.

Структура Тфп., °С

Димиристоилфосфатидилхолин 24

Дипальмитоилфосфатидилхолин 41

Дистеароилфосфатидилхолин 55

Диолеоилфосфатидилхолин -17

Кардиолипин 14:0 (аммонийная соль) 47

Кардиолипин 16:0 (натриевая соль) 62,2

Одним из важнейших фосфолипидов является дифосфатидилглицерид кардиолипин. Он отличается особой структурой (таблица 1) и впервые был выделен из мышечных тканей бычьего сердца. Содержится в значительном количестве во внутренней мембране митохондрий (до 20 % всех липидов этой мембраны). Кардиолипин обладает двумя фосфатными группами и относится к анионным липидам. Особенности строения обуславливают необычные свойства кадиолипина. Известно, что изменение рН [7] и присутствие бивалентных катионов [8] могут способствовать изменениям в его структуре. Так, присутствие Са2+ обуславливает переход кардиолипина из ламеллярной фазы в гексагональную [9].

Для липосом, как и для липидов, характерно наличие одного или нескольких фазовых переходов (рис. 3). При температуре ниже фазового перехода бислой находится в гель-фазе Ьр и Ьр'. Увеличение температуры и в некоторых случаях давления приводит к фазовому переходу в состояние жидкого кристалла Ьа. Для липосом, содержащих некоторые лецитины, в частности ДПФХ, был обнаружен предпереход из гелеобразной фазы в т.н. «рифленую» Рр [10]. Для данной фазы характерно искривление бислоя с образованием характерных «волн» на поверхности [11] с длиной ондуляции (волн на поверхности) порядка 140 ангстрем. Для данной фазы характерно наличие доменов гелеобразной и жидкокристаллической фаз [12]; дальнейший рост температуры приводит к основному фазовому переходу в Ьа. Для данной фазы характерна высокая подвижность гидрофобных хвостов и отсутствие дальнего порядка в структуре. Для некоторых липосом также характерна псевдокристаллическая фаза Ьс' (рис.3).

Рис. 3. Организация ламеллярного бислоя ДПФХ: жидкокристаллическая, рифлёная, гель и псевдокристаллическая фаза. Ориентация гидрофобных цепей показана в правом столбце. Рисунок из работы [13].

Таким образом, состав липосом оказывает существенное влияние на их свойства. Следует также учесть, что даже липосомы одного состава могут проявлять различные физико-химические свойства в зависимости от условий получения.

1.1.2. Методы получения и загрузки липосом

На сегодняшний день получение липосом обычно состоит из нескольких этапов, включающих в себя растворение липидов в органическом растворителе (обычно хлороформе или метаноле, возможно также использование этанола), последующее удаление органического растворителя и получение тонкой липидной пленки, диспергирование липидов в водной среде и получение мультиламеллярных везикул, обработка суспензии для получения моноламеллярных липосом. Тщательное удаление органического растворителя (с помощью роторного испарителя или тока очищенного азота)

является принципиальным, поскольку по данным ряда исследователей [14] в липосомах может оставаться от 3% до 4% исходного растворителя. Присутствие органических растворителей крайне нежелательно в случае использование липосом как систем доставки лекарств; обычно от остатков растворителя избавляются методом диализа. При диспергировании в водных средах самопроизвольно образуются мультиламелляные везикулы размером до 5 микрон [15]. Дальнейший переход от мультламеллярных липосом к моноламеллярным липосомам заданного размера обычно проходит под действием ультразвука [16] или путем экструзии сквозь пористые мембраны [17]. В случае использования ультразвукового воздействия важным является контроль температуры образца и времени экспозиции, в противном случае может произойти перегрев суспензии и окисление липидов [18].

Разработаны также методы, исключающие использование летучих органических растворителей, например, пузырьковый метод [19], суть которого заключается в пропускании пузырьков инертного газа, например, очищенного N2, сквозь грубую дисперсию фосфолипидов. Хитинг-метод [20] заключается в гидратации липидной суспензии водным буферным раствором и нагреванием до 120°С в присутствии 3% глицерина. Авторы данного метода сообщают о неизменности химического состава системы после воздействия. Данные методы, однако, не позволяют в полной мере контролировать размер получаемых везикул.

Важным аспектом является оптимизация условий загрузки липосом содержимым. Большую часть лекарственных молекул можно разделить на 4 группы: гидрофильные, гидрофобные, амфифильные и нерастворимые ни в воде, ни в гидрофобных растворителях (рис. 4).

Молекулы

Гидрофобные высвобождение высвобождение

Гидрофильные

• Низкая загрузка

• Контролируемое высвобождение

Амфифильные

• Высокая загрузка . Быстрое высвобождение

Нерастворимые

<изкая загрузка

среда ^N*

Фосфолипидный бислой

Рис. 4. Основные типы лекарственных молекул и характер их встраивания в липосомы [21].

Для данной классификации веществ удобно пользоваться подходом, разработанным Корвином Ганшем [22]. Ганш предложил определить минимальную эффективную дозу лекарственного вещества С:

где P - коэффициент распределения вода - октанол, 6 - константа Гамметта, ki - константы, полученные методом регрессионного анализа.

log P (константа Ганша) является измеряемой величиной гидрофобности, которая была выбрана как характеристика способности лекарственного вещества проникать сквозь клеточную мембрану. Величина log P отражает относительную растворимость вещества в октаноле и воде и может быть определена экспериментально, но в настоящее время рассчитывается в специальном программном обеспечении [23]. Значения log P чаще всего лежат в промежутке от 7 до -7.

(2)

Так, гидрофильные вещества с величиной logP < — 1, например, синтетический антиметаболит цитозин-арабинозид [24], цитидин-дифосфат-холин [25], тенофовир [26,27] расположены исключительно во внутренней водной области липосомы.

Таблица 2. Лекарственные препараты, загружаемые в липосомы. Величины log P приводятся по данным баз PubChem и ChemSpider

Название

Формула

logP

Ссылки

Цитозин-арабинозид

-2,8

[24]

Цитидин-дифосфат-холин

-7,07

[25]

Тенофовир

1,6

[26,27]

Доксорубицин

2,82

[28,29]

Моксифлоксацин

1,6

[30,31]

Рапамицин 3,54 [32-36]

Ибупрофен 3,72 [37]

Ванкомицин ж -1,44 [38]

6-Меркаптопурин -0,18 [39]

5-фторурацил -0,78 [40]

Загрузка и высвобождение гидрофильных лекарств зависит от состава бислоя и способа получения липосом [25], а также от физических свойств

везикул. Так, в работе [27] предложена математическая модель расчета эффективности загрузки гидрофильных низкомолекуляных веществ в липосомы. В модели рассматриваются сферические моноламеллярные липосомы с ^-нормальным распределением по размерам и гидрофильное лекарство, которое не вступает во взаимодействие с липидами и распределяется равномерно во внутренней (в липосоме) и во внешней водной среде. Тогда, согласно модели, на эффективность загрузки в /-тую липосому влияют такие параметры, как толщина бислоя d, средняя площадь гидрофильной головки липида а, радиус липосомы г и параметры 1о§-нормального распределения по размерам о), концентрация липидов и объем образца. Эффективность загрузки в таком случае может быть рассчитана по формуле

где Р/ - вероятность получения липосомы заданного радиуса г/, которая может быть рассчитана по формуле

Полученная модель была подтверждена экспериментально как разработчиками модели на примере противовирусного препарата тенофовира, так и другими исследователями, например в работе [41] для фикоцианина из водорослей Klamath и имикуимода, стимулятора синтеза цитокинов [42]. Ценность данной модели - в возможности сравнить экспериментальные результаты с результатами расчётов и дальнейшей

(4)

оптимизации методов включения лекарства при существенном расхождении величин.

Классическим методом загрузки гидрофильных низкомолекулярных веществ является диспергирование тонкой липидной плёнки буферным раствором, содержащим данное вещество. Далее полученную грубую суспензию подвергают либо экструзии, либо ультразвуковому воздействию. Более эффективным является инжекционный метод, при котором спиртовой раствор липидов тонкой иглой вводят в водный раствор, содержащий целевую молекулу, при интенсивном перемешивании. Для ряда лекарственных средств эффективность загрузки может составлять до 50% [43]. Для повышения эффективности загрузки гидрофильных веществ в липосомы могут быть использованы три подхода [44], схематично представленные на рис. 5.

Рис. 5. Способы загрузки гидрофильных низкомолекулярных веществ в липосомы: метод замораживания - оттаивания (А), дегидратации - регидратации (Б) и обращенно-фазового выпаривания (В) [44].

Метод замораживания-оттаивания (рис. 5 А) позволяет эффективно загружать лекарственные препараты в липосомы. Так, в работе [38] предложена липосомальная форма ванкомицина, полученная данным методом с эффективностью загрузки порядка 40%. Данный метод также позволяет загружать в липосомы некоторые белки, например, каталазу [45]. Значительными достоинствами данного метода, помимо высокой эффективности загрузки, являются методическая простота и минимальный риск нарушения стерильности суспензии. Однако, есть данные, указывающие на слияние липосом и увеличение их в размере в результате многократных циклов замораживания-оттаивания [46].

Метод дегидратации-регидратации был предложен в 1984 году Кристофером Кирби [47] и заключается в лиофилизации гидратированной липидной пленки в присутствии криопротекторов (рис. 5 Б) и последующей контролируемой гидратации. Значительным достоинством метода является простота масштабирования данного метода для применения в промышленности. Эффективность загрузки составляет порядка 40%. В процессе регидратации увеличивается индекс полидисперсности суспензии, поэтому обычно после регидратации дополнительно применяют экструзию

[48].

Метод обращенно-фазового выпаривания [49] позволяет достичь значений эффективности загрузки до 78% для некоторых антибиотиков. Суть метода заключается в следующем. Раствор липидов в органическом растворителе смешивают с водным раствором включаемого вещества в буферном растворе и подвергают ультразвуковому воздействию, что приводит к образованию эмульсии «вода в масле». Далее на роторном испарителе медленно удаляют органический растворитель при температуре выше температуры фазового перехода липидов так, чтобы образовался гель.

К гелю прибавляют буферный раствор и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом или подвергают экструзии.

Вышеописанную группу методов часто называют методами «пассивной загрузки». Следует отметить, что липосомы, полученные таким образом, могут быстро и бесконтрольно высвобождать содержимое [50]. Для хорошо растворимых молекул с величиной константы Ганша, большей -0,3, разработана группа методов т.н. активной загрузки. Суть данных методов сводится к включению лекарственного препарата в уже сформированные моноламеллярные липосомы при помощи градиента рН или концентраций солей (сульфата аммония или марганца). Данные методы активно применяются, например, при загрузке слабых оснований, в частности доксорубицина.

В структуре доксорубицина присутствует 12 сайтов - акцепторов протона и 6 сайтов - доноров протона (по данным СИешАхоп). При нейтральных и слабощелочных рН молекула несет на себе единичный положительный заряд. Наличие в структуре доксорубицина ионогенных групп обуславливает многоступенчатую схему диссоциации молекулы.

Ввиду наличия большого количества ионногенных центров в молекуле очевидным градиентом концентрации, который может быть использован для активной загрузки доксорубицина в липосомы, является градиент рН, обычно создаваемым цитратным буферным раствором [50,51]. Данный метод отличает методическая простота, удобство и высокая эффективность загрузки - до 98% (рис. 6А). Предложены также методы загрузки в градиенте ионов Мп2+ в присутствии [52] (рис. 6Б) и отсутствии ионофоров [28] (рис. 6В), а также в градиенте (N^^04 [53,54] (рис. 6Г).

Рис. 6. Методы загрузки доксорубицина в липосомы. А. Градиент цитрат-иона. Липосомы получают в 300 мМ цитратном буферном растворе, pH 3,5; внешний буферный раствор заменяется на HEPES-буферный раствор pH 7,5. Б. Загрузка в градиенте сульфата марганца в присутствии ионофора А23187. Липосомы получают в 300 мM растворе сульфата марганца pH 3,5, внешний буферный раствор заменяется на раствор 300 мM сахарозы/ 20 мM HEPES/ 15 мM ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) pH 7,5 в присутствии ионофора A23187. В. Загрузка в градиенте сульфата аммония. Липосомы получают в 120 мM растворе сульфата аммония pH 5,5, внешний буферный раствор заменяют на 145 мM pH 5,5. Г. Загрузка в градиенте сульфата марганца. Липосомы получают в 300 мM растворе сульфата марганца pH 3,5. Внешний буферный раствор заменяется на раствор, содержащий 300 мM сахарозы и 20 мM HEPES, 15 мM ЭДТА pH 7.5 [55].!

Аналогично могут быть загружены в липосомы и другие молекулы, растворимые в воде, в частности, антибактериальные препараты группы фторхинолонов: офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин [30,56,57]. Так, моксифлоксацин содержит в своей структуре 2 сайта - донора и 8

сайтов-акцепторов протона, т.е. свойства молекулы значительно зависят от рН раствора; т.о. активная загрузка фторхинолонов в липосомы представляется возможной.

Липофильные препараты, например, ибупрофен, диклофенак, напроксен [37] самопроизвольно эффективно встраиваются в липосомы [58]. Высокая эффективность загрузки была продемонстрирована для таких липофильных соединений, как витамин Е, ацетат ретинола и тестостерон [59]. Эффективность загрузки может зависеть от ряда факторов; так, для нового противопухолевого препарата камптотецина ББ-67 показана роль рН буферного раствора, который используется для диспергирования: наибольшая эффективность достигается при в слабокислых и нейтральных значениях рН (до 75%), в то время как в щелочных растворах эффективность загрузки уменьшается до 15% [60]. Обычно липофильный лекарственный препарат вводят в раствор липидов в органическом растворителе, далее упаривают до получения тонкой пленки и диспергируют.

Наибольшую сложность представляет собой загрузка веществ, которые плохо растворимы как в воде, так и в неполярных растворителях, например, 6-меркаптоурин, азатиоприн, аллопуринол, сиролимус. Для каждого из веществ данной группы необходимо индивидуально подбирать оптимальные параметры загрузки. Так, для 6-меркаптопурина было обнаружено, что при диспергировании липидной плёнки буферным раствором, содержащим 6-меркаптопурин, эффективность загрузки составляла от 0,35% (для липосом, содержащих фосфатидилхолин и холестерин) до 1,78% (для липосом, содержащих фосфатидилхолин, холестерин и кардиолипин) [39]. Напротив, если вводить 6-меркаптоурин в раствор липидов в органическом растворителе перед выпариванием, эффективность инкапсуляции может составлять до 97% [61]. Аналогичные результаты получены для азатиоприна

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ле-Дейген, Ирина Михайловна, 2018 год

Список использованной литературы

1. Israelachvili J.N., Mitchell D.J., Ninham B.W. Theory of self-assembly of hydrocarbon amphiphiles into micelles and bilayers // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 2. 1976. Vol. 72. P. 1525.

2. Boggs J.M. et al. Influence of ether linkage on the lamellar to hexagonal phase transition of ethanolamine phospholipids. // Biochemistry. 1981. Vol. 20, № 20. P. 5728-5735.

3. Геннис Р.Б. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Москва: "МИР," 1997. 624 p.

4. Briuglia M.-L. et al. Influence of cholesterol on liposome stability and on in vitro drug release // Drug Deliv. Transl. Res. 2015. Vol. 5, № 3. P. 231-242.

5. Deygen I.M., Kudryashova E.V. Structure and stability of anionic liposomes complexes with PEG-chitosan branched copolymer // Russ. J. Bioorganic Chem. 2014. Vol. 40, № 5. P. 547-557.

6. Safinya C.R. et al. Cationic liposome-nucleic acid complexes for gene delivery and gene silencing // New J. Chem. 2014. Vol. 38, № 11. P. 51645172.

7. Kates M. et al. pH-dissociation characteristics of cardiolipin and its 2'-deoxy analogue. // Lipids. 1993. Vol. 28, № 10. P. 877-882.

8. Rand R., Sengupta S. Cardiolipin Forms Hexagonal Structures with Divalent Cations // Biochim. Biophys. Acta. 1972. Vol. 255. P. 484-492.

9. Ortiz a et al. Membrane fusion and the lamellar-to-inverted-hexagonal phase transition in cardiolipin vesicle systems induced by divalent cations. // Biophys. J. Elsevier, 1999. Vol. 77, № 4. P. 2003-2014.

10. Korlach J. et al. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. Vol. 96. P. 8461-8466.

11. de Vries A.H. et al. Molecular structure of the lecithin ripple phase // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. Vol. 102, № 15. P. 5392-5396.

12. De Vries A.H. et al. Molecular Dynamics Simulations of Phospholipid Bilayers : Influence of Artificial Periodicity , System Size , and Simulation Time // J. Phys. Chem. B. 2005. Vol. 109. P. 11643-11652.

13. Lewis R., McElhaney R. The Mesomorphic Phase Behavior of Lipid Bilayers // The Structure of Biological Membranes, Second Edition / ed. Yeagle P.L. CRC Press, 2011. P. 19-89.

14. Mozafari M.R. Liposomes: an overview of manufacturing techniques // Cell. Mol. Biol. Lett. 2005. Vol. 10, № 4. P. 711-719.

15. Szoka F. et al. Preparation of unilamellar liposomes of intermidiate size (0,1 - 0,2 micron) by a combination of reverse phase evaporation and excturison through polycarbonate membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1980. Vol. 601. P. 559-571.

16. Sybachin A. V. et al. Complexation of polycations to anionic liposomes: composition and structure of the interfacial complexes. // Langmuir. 2007. Vol. 23, № 20. P. 10034-10039.

17. Deygen I.M. et al. Novel Prodrug of Doxorubicin Modified by Stearoylspermine encapsulated into PEG-Chitosan-Stabilized Liposomes // Langmuir. 2016.

18. Jana A.K., Agarwal S., Chatterjee S.N. The Induction of Lipid Peroxidation in Liposomal Membrane by Ultrasound and the Role of Hydroxyl Radicals // Radiat. Res. 2014. Vol. 124, № 1. P. 7-14.

19. Talsma H. et al. A novel technique for the one-step preparation of liposomes and nonionic surfactant vesicles without the use of organic solvents. Liposome formation in a continuous gas stream: the "bubble" method. // J. Pharm. Sci. 1994. Vol. 83, № 3. P. 276-280.

20. Mozafari M.R. et al. Construction of stable anionic liposome-plasmid particles using the heating method: a preliminary investigation. // Cell. Mol. Biol. Lett. 2002. Vol. 7, № 3. P. 923-927.

21. Gulati M. et al. Lipophilic drug derivatives in liposomes // Int. J. Pharm. 1998. Vol. 165, № 2. P. 129-168.

22. Hansch C. A Quantitative Approach to Biochemical Structure-Activity Relationships // Chem. Res. 1969. Vol. 2, № 4. P. 232-239.

23. Андреева Е.П., Раевский О.А. Расчет липофильности органических соединений на основе структурного сходства и молекулярных физико-химических дескрипторов // Химико-фармацевтический жунал. 2009. Vol. 43, № 5. P. 28-32.

24. Mayhew E. et al. Use of liposomes for the enhancement of the cytotoxic effects of cytosine arabinoside // Ann N Y Acad Sci. 1978. Vol. 308. P. 371386.

25. Fresta M. et al. Cdp-Choline Entrapment and Release from Multilamellar and Reverse-Phase Evaporation Liposomes // Drug Dev. Ind. Pharm. 1993. Vol. 19, № 5. P. 559-585.

26. Zidan A.S. et al. Near-infrared investigations of novel anti-HIV tenofovir liposomes. // AAPS J. 2010. Vol. 12, № 2. P. 202-214.

27. Xu X., Khan M. a., Burgess D.J. Predicting hydrophilic drug encapsulation inside unilamellar liposomes // Int. J. Pharm. Elsevier B.V., 2012. Vol. 423, № 2. P. 410-418.

28. Cheung B.C.. L. et al. Loading od doxorubicin into small liposomes by forming Mn - drug complexes // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1414. P. 205-216.

29. Papahadjopoulos D. et al. Sterically stabilized liposomes: improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy. // Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 1991. Vol. 88, № 24. P. 11460-11464.

30. Ventura C.A. et al. Chitosan microspheres for intrapulmonary administration of moxifloxacin: Interaction with biomembrane models and in vitro permeation studies // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008. Vol. 68, № 2. P. 235244.

31. Bensikaddour H. et al. Characterization of the interactions between fluoroquinolone antibiotics and lipids: A multitechnique approach // Biophys. J. 2008. Vol. 94, № 8. P. 3035-3046.

32. Onyesom I., Lamprou D. Sirolimus encapsulated liposomes for cancer therapy: physicochemical and mechanical characterization of sirolimus

distribution within liposome bilayers // Mol.....2013. Vol. 10, № 11. P.

4281-4293.

33. Zhang W. et al. Preparation and Influencing Factors of Sirolimus Liposome by Supercritical Fluid. 2012. № 38. P. 62-65.

34. Haeri A. et al. Use of remote film loading methodology to entrap sirolimus into liposomes: Preparation, characterization and in vivo efficacy for treatment of restenosis // Int. J. Pharm. Elsevier B.V., 2011. Vol. 414, № 1-2. P. 16-27.

35. Rouf M.A. et al. Development and characterization of liposomal formulations for rapamycin delivery and investigation of their antiproliferative effect on MCF7 cells. // J. Liposome Res. 2009. Vol. 19, № 4. P. 322-331.

36. Alemdar A.Y. et al. Liposomal Formulations of Tacrolimus and Rapamycin Increase Graft Survival and Fiber Outgrowth of Dopaminergic Grafts // Cell Transplant. 2004. Vol. 13, № 902. P. 263-271.

37. Fini a et al. Dissolution and partition thermodynamic functions of some nonsteroidal anti-inflammatory drugs. // J. Pharm. Sci. 1986. Vol. 75, № 1. P.

23-25.

38. Liu J. et al. Liposomes for systematic delivery of vancomycin hydrochloride to decrease nephrotoxicity: Characterization and evaluation // Asian J. Pharm. Sci. Elsevier Ltd, 2014. Vol. 10, № 3. P. 212-222.

39. Agrawal V., Paul M.K., Mukhopadhyay A.K. 6-Mercaptopurine and Daunorubicin Double Drug Liposomes-Preparation, Drug-Drug Interaction and Characterization // J. Liposome Res. 2005. Vol. 15, № 3-4. P. 141-155.

40. Sasaki H. et al. Characterization of alkylcarbamoyl derivatives of 5-fluorouracil and their application to liposome // Int. J. Pharm. 1987. Vol. 36. P. 147-156.

41. Caddeo C. et al. Extraction, purification and nanoformulation of natural phycocyanin (from Klamath algae) for dermal and deeper soft tissue delivery // J. Biomed. Nanotechnol. 2013. Vol. 9, № 11. P. 1929-1938.

42. Fox C.B. et al. A nanoliposome delivery system to synergistically trigger TLR4 AND TLR7. // J. Nanobiotechnology. 2014. Vol. 12. P. 17.

43. Pons M., Foradada M., Estelrich J. Liposomes obtained by the ethanol injection method // Int. J. Pharm. 1993. Vol. 95, № 1-3. P. 51-56.

44. Eloy J.O. et al. Liposomes as carriers of hydrophilic small molecule drugs: Strategies to enhance encapsulation and delivery // Colloids Surfaces B Biointerfaces. Elsevier B.V., 2014. Vol. 123. P. 345-363.

45. Yoshimoto M. et al. Stabilization of quaternary structure and activity of bovine liver catalase through encapsulation in liposomes // Enzyme Microb. Technol. 2007. Vol. 41, № 6-7. P. 849-858.

46. Pick U. Liposomes with a large trapping capacity prepared by freezing and thawing of sonicated phospholipid mixtures // Arch. Biochem. Biophys. 1981. Vol. 212, № 1. P. 186-194.

47. Kirby C., Gregoriadis G. Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple

Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes // Bio/Technology. 1984. Vol. 2, № 11. P. 979-984.

48. Varypataki E.M. et al. Cationic Liposomes Loaded with a Synthetic Long Peptide and Poly(I:C): a Defined Adjuvanted Vaccine for Induction of Antigen-Specific T Cell Cytotoxicity. // AAPS J. 2014. Vol. 17, № 1. P. 216-226.

49. Cortesi R. et al. Preparation of liposomes by reverse-phase evaporation using alternative organic solvents. // J. Microencapsul. 1999. Vol. 16, № 2. P. 251256.

50. Mayer L.D., Bally M.B., Cullis P.R. Uptake of adriamycin into large unilamellar vesicles in response to a pH gradient // BBA - Biomembr. 1986. Vol. 857, № 1. P. 123-126.

51. Li X. et al. Doxorubicin physical state in solution and inside liposomes loaded via a pH gradient. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1415, № 1. P. 23-40.

52. Fenske D.B. et al. Ionophore-mediated uptake of ciprofloxacin and vincristine into large unilamellar vesicles exhibiting transmembrane ion gradients // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1998. Vol. 1414, № 1-2. P. 188-204.

53. Haran G. et al. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases // Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1151. P. 201-215.

54. Lasic D.D. et al. Gelation of liposome interior A novel method for drug encapsulation // FEBS Lett. 1992. Vol. 312, № 2-3. P. 255-258.

55. Abraham S. a et al. The liposomal formulation of doxorubicin. // Methods Enzymol. 2005. Vol. 391. P. 71-97.

56. Сорокоумова Г.М. et al. Создание и изучение свойств липосомальной

формы левофлоксацина // Вестник МИТХТ. 2013. Vol. 5, № 8. P. 72-76.

57. Furneri P.M. et al. Ofloxacin-loaded liposomes: In vitro activity and drug accumulation in bacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. Vol. 44, № 9. P. 2458-2464.

58. Manrique-Moreno M. et al. The membrane-activity of Ibuprofen, Diclofenac, and Naproxen: a physico-chemical study with lecithin phospholipids. // Biochim. Biophys. Acta. Elsevier B.V., 2009. Vol. 1788, № 6. P. 1296-1303.

59. Montenegro L. Quantitative determination of hydrophobic compound entrapment in dipalmitoylphosphatidylcholine liposomes by differential scanning calorimetry // Int. J. Pharm. 1996. Vol. 138, № 2. P. 191-197.

60. Joguparthi V., Xiang T.X., Anderson B.D. Liposome transport of hydrophobic drugs: Gel phase lipid bilayer permeability and partitioning of the lactone form of a hydrophobic camptothecin, DB-67 // J. Pharm. Sci. Elsevier Masson SAS, 2008. Vol. 97, № 1. P. 400-420.

61. Umrethia M. et al. 6-mercaptopurine (6-MP) entrapped stealth liposomes for improvement of leukemic treatment without hepatotoxicity and nephrotoxicity // Cancer Invest. 2007. Vol. 25, № 2. P. 117-123.

62. MacKeigan J.P., Krueger D. Differentiating the mTOR inhibitors everolimus and sirolimus in the treatment of tuberous sclerosis complex // Neuro. Oncol. 2015. Vol. 17, № 12. P. 1550-1559.

63. Jozwiak J., Jozwiak S., Oldak M. Molecular activity of sirolimus and its possible application in tuberous sclerosis treatment // Med. Res. Rev. 2006. Vol. 26, № 2. P. 160-180.

64. Weiss B. et al. Sirolimus for progressive neurofibromatosis type 1-associated plexiform neurofibromas: A neurofibromatosis clinical trials consortium phase II study // Neuro. Oncol. 2014. Vol. 17, № 4. P. 596-603.

65. Chheda M.G. et al. Vandetanib plus sirolimus in adults with recurrent glioblastoma: results of a phase I and dose expansion cohort study // J. Neurooncol. 2015. Vol. 121, № 3. P. 627-634.

66. Iwase Y., Maitani Y. Preparation and in Vivo Evaluation of Liposomal Everolimus for Lung Carcinoma and Thyroid Carcinoma // Biol. Pharm. Bull. 2012. Vol. 35, № 6. P. 975-979.

67. Fishman Y., Citri N. L-Asparaginase entrapped in liposomes: preparation and properties // FEBS Lett. 1975. Vol. 60, № 1. P. 17-20.

68. Jorge J.C. et al. Liposomal palmitoyl-L-asparaginase: characterization and biological activity. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1994. Vol. 34, № 3. P. 230-234.

69. Ulrich A.S. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. // Biosci. Rep. 2002. Vol. 22, № 2. P. 129-150.

70. Chung H. et al. Oil components modulate physical characteristics and function of the natural oil emulsions as drug or gene delivery system. // J. Control. Release. 2001. Vol. 71, № 3. P. 339-350.

71. Lasik D.D. On the Thermodynamic Stability of Liposomes // J. Colloid Interface Sci. 1990. Vol. 140, № 1. P. 3-5.

72. Jones M.N. The surface propeties of phospolipid liposome system and their characterisation // Adv. Colloid Interface Sci. 1995. Vol. 54. P. 93-128.

73. Riaz M. Review article: stability and uses of liposomes. // Pak. J. Pharm. Sci. 1995. Vol. 8, № 2. P. 69-79.

74. Yan X., Scherphof G.L., Kamps J. a a M. Liposome opsonization. // J. Liposome Res. 2005. Vol. 15, № March. P. 109-139.

75. Du H., Chandaroy P., Hui S.W. Grafted poly-(ethylene glycol) on lipid surfaces inhibits protein adsorption and cell adhesion // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1997. Vol. 1326, № 2. P. 236-248.

76. Semple S., Chonn A. Liposome-blood protein interactions in relation to liposome clearance // J. Liposome Res. 1996. Vol. 6, № March. P. 33-60.

77. Yan X. et al. The role of apolipoprotein E in the elimination of liposomes from blood by hepatocytes in the mouse // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. Vol. 328, № 1. P. 57-62.

78. Ishida T., Harashima H., Kiwada H. Liposome clearance. // Biosci. Rep. 2002. Vol. 22, № 2. P. 197-224.

79. Klibanov A.L. et al. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes // FEBS Lett. 1990. Vol. 268, № 1. P. 235237.

80. Bradley A.J. et al. Inhibition of Liposome-Induced Complement Activation by Incorporated Poly ( Ethylene Glycol ) -Lipids // Arch. Biochem. Biophys. 1998. Vol. 357, № 2. P. 185-194.

81. Szebeni J. et al. Role of Complement Activation in Hypersensitivity Reactions To Doxil and Hynic Peg Liposomes: Experimental and Clinical Studies // J. Liposome Res. 2002. Vol. 12, № 1-2. P. 165-172.

82. Vert M., Domurado D. Polyethylene glycol): Protein-repulsive or albumin-compatible? // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2000. Vol. 11, № 12. P. 13071317.

83. Furumoto K. et al. Effect of coupling of albumin onto surface of PEG liposome on its in vivo disposition // Int. J. Pharm. 2007. Vol. 329, № 1-2. P. 110-116.

84. Caracciolo G. Liposome-protein corona in a physiological environment: Challenges and opportunities for targeted delivery of nanomedicines // Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med. Elsevier Inc., 2015. Vol. 11, № 3. P. 543-557.

85. Richter A.W., Äkerblom E. Antibodies against Polyethylene Glycol

Produced in Animals by Immunization with Monomethoxy Polyethylene Glycol Modified Proteins // Int Arch Allergy Immunol. 1983. Vol. 70. P. 124—131.

86. Ishida T., Kiwada H. Accelerated blood clearance (ABC) phenomenon upon repeated injection of PEGylated liposomes // Int. J. Pharm. 2008. Vol. 354, № 1-2. P. 56-62.

87. Bedu-Addo F.K., Huang L. Interaction of PEG-phospholipid conjugates with phospholipid: implications in liposomal drug delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. 1995. Vol. 16, № 2-3. P. 235-247.

88. Lehtonen J.Y. a, Kinnunen P.K.J. Changes in the lipid dynamics of liposomal membranes induced by poly(ethylene glycol): free-volume alterations revealed by intermolecular and intramolecular excimer-forming phospholipid analogs // Biophys. J. 1994. Vol. 66, № June. P. 1981-1990.

89. Nag O.K., Awasthi V. Surface engineering of liposomes for stealth behavior // Pharmaceutics. 2013. Vol. 5, № 4. P. 542-569.

90. Merino M., Zalba S., Garrido M.J. Immunoliposomes in clinical oncology: State of the art and future perspectives // J. Control. Release. Elsevier B.V, 2018. № 2017.

91. Torchilin V.P., Papisov M.I. Why Do Polyethylene Glycol-Coated Liposomes Circulate So Long? // J. Liposome Res. 1994. Vol. 4, № 1. P. 725-739.

92. Torchilin V.P. et al. Poly(ethylene glycol) on the liposome surface: on the mechanism of polymer-coated liposome longevity // BBA - Biomembr. 1994. Vol. 1195, № 1. P. 11-20.

93. Torchilin V.P. Polymer-coated long-circulating microparticulate pharmaceuticals // J. Microencapsul. 1998. Vol. 15, № 1. P. 1-19.

94. Woodle M.C., Engbers C.M., Zalipsky S. New amphipatic polymer-lipid

conjugates forming long-circulating reticuloendothelial system-evading liposomes. // Bioconjug. Chem. 1994. Vol. 5, № 6. P. 493-496.

95. Romberg B. et al. Poly(amino acid)s: Promising enzymatically degradable stealth coatings for liposomes // Int. J. Pharm. 2007. Vol. 331, № 2. P. 186189.

96. Watanabe K., Kaneko M., Maitani Y. Functional coating of liposomes using a folate- polymer conjugate to target folate receptors. // Int. J. Nanomedicine. 2012. Vol. 7. P. 3679-3688.

97. Yaroslavov A. a et al. Polyelectrolyte-coated liposomes: stabilization of the interfacial complexes. // Adv. Colloid Interface Sci. 2008. Vol. 142, № 1-2. P. 43-52.

98. Khameneh B., Momen-nejad M., Tafaghodi M. In vivo evaluation of mucoadhesive properties of nanoliposomal formulations upon coating with trimethylchitosan polymer // Nanomedicine J. 2014. Vol. 1, № 3. P. 147154.

99. Jain S. et al. Oral delivery of doxorubicin using novel polyelectrolyte-stabilized liposomes (Layersomes) // Mol. Pharm. 2012. Vol. 9, № 9. P. 2626-2635.

100. Jain S. et al. Polyelectrolyte stabilized multilayered liposomes for oral delivery of paclitaxel. // Biomaterials. Elsevier Ltd, 2012. Vol. 33, № 28. P. 6758-6768.

101. Henriksen I., Srnistad G., Karlsen J. Interactions between liposomes and chitosan // Int. J. Pharm. 1994. Vol. 101. P. 227-236.

102. Henriksen I. et al. Interactions between liposomes and chitosan II: Effect of selected parameters on aggregation and leakage // Int. J. Pharm. 1997. Vol. 146, № 2. P. 193-203.

103. Yaroslavov A.A. et al. Lipid segregation in membranes of anionic liposomes

adsorbed onto polycationic brushes // Chem. - A Eur. J. 2013. Vol. 19, № 41. P. 13674-13678.

104. Prabaharan M. Review paper: chitosan derivatives as promising materials for controlled drug delivery. // J. Biomater. Appl. 2008. Vol. 231. Praba, № 1. P. 5-36.

105. Cuomo F. et al. In-vitro digestion of curcumin loaded chitosan-coated liposomes // Colloids Surfaces B Biointerfaces. Elsevier B.V., 2017.

106. Li N. et al. Liposome coated with low molecular weight chitosan and its potential use in ocular drug delivery // Int. J. Pharm. 2009. Vol. 379, № 1-2. P. 131-138.

107. Seong J.S., Yun M.E., Park S.N. Surfactant-stable and pH-sensitive liposomes coated with N-succinyl-chitosan and chitooligosaccharide for delivery of quercetin // Carbohydr. Polym. Elsevier, 2018. Vol. 181, № November 2017. P. 659-667.

108. Caddeo C. et al. Physico-chemical characterization of succinyl chitosan-stabilized liposomes for the oral co-delivery of quercetin and resveratrol // Carbohydr. Polym. 2017. Vol. 157. P. 1853-1861.

109. Casettari L. et al. PEGylated chitosan derivatives: Synthesis, characterizations and pharmaceutical applications // Prog. Polym. Sci. Elsevier Ltd, 2012. Vol. 37, № 5. P. 659-685.

110. Jeong Y.-I. et al. Preparation and spectroscopic characterization of methoxy poly(ethylene glycol)-grafted water-soluble chitosan. // Carbohydr. Res. 2008. Vol. 343, № 2. P. 282-289.

111. Gorochovceva N., Makuska R. Synthesis and study of water-soluble chitosan-O-poly(ethylene glycol) graft copolymers // Eur. Polym. J. 2004. Vol. 40, № 4. P. 685-691.

V

112. Gruskiene R., Ciuta G., Makuska R. Grafting of poly (ethylene glycol ) to

chitosan at c (6) position of glucosamine units via " click chemistry " reactions // Chemija. 2009. Vol. 20, № 4. P. 241-249.

113. Bodnar M., Hartmann J.F., Borbely J. Synthesis and study of cross-linked chitosan-N-poly(ethylene glycol) nanoparticles. // Biomacromolecules. 2006. Vol. 7, № 11. P. 3030-3036.

114. Pattni B.S., Chupin V. V., Torchilin V.P. New Developments in Liposomal Drug Delivery // Chem. Rev. 2015. P. 150526165100008.

115. Deshpande P.P., Biswas S., Torchilin V.P. Current trends in the use of liposomes for tumor targeting. // Nanomedicine (Lond). 2013. Vol. 8, № 9. P. 1509-1528.

116. Bazak R. et al. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2014. P. 769-784.

117. Weitman S.D. et al. Distribution of the Folate Receptor GP38 in Normal and Malignant Cell Lines and Tissues Distribution of the Folate Receptor GP38 in Normal and Malignant Cell Lines and // Cancer Res. 1992. Vol. 52, № 12. P. 3396-3401.

118. Luyckx M. et al. Profile of vintafolide (EC145) and its use in the treatment of platinum-resistant ovarian cancer // Int. J. Womens. Health. 2014. Vol. 6, № 1. P. 351-358.

119. Liu Y. et al. Synthesis and evaluation of a novel lipophilic folate receptor targeting ligand. // Anticancer Res. 2011. Vol. 31, № 5. P. 1521-1525.

120. Maruyama K. Intracellular targeting delivery of liposomal drugs to solid tumors based on EPR effects. // Adv. Drug Deliv. Rev. Elsevier B.V., 2011. Vol. 63, № 3. P. 161-169.

121. Sapra P., Allenz T.M. Internalizing antibodies are necessary for improved therapeutic efficacy of antibody-targeted liposomal drugs // Cancer Res. 2002. Vol. 62, № 24. P. 7190-7194.

122. Sapra P. et al. Improved Therapeutic Responses in a Xenograft Model of Human B Lymphoma ( Namalwa ) for Liposomal Vincristine versus Liposomal Doxorubicin Targeted via Anti-CD19 IgG2a or Fab ' Fragments Improved Therapeutic Responses in a Xenograft Model of Human B Lymph // Clin. cancer Res. 2004. Vol. 10, № 780. P. 1100-1111.

123. Sapra P., Allen T.M. Improved Outcome When B-Cell Lymphoma Is Treated with Combinations of Immunoliposomal Anticancer Drugs Targeted to Both the CD19 and CD20 Epitopes // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10, № 7. P. 2530-2537.

124. Lundberg B.B., Griffiths G., Hansen H.J. Cellular association and cytotoxicity of doxorubicin-loaded immunoliposomes targeted via Fab' fragments of an anti-CD74 antibody // Drug Deliv. 2007. Vol. 14, № 3. P. 171-175.

125. Mamot C. et al. Epidermal growth factor receptor-targeted immunoliposomes significantly enhance the efficacy of multiple anticancer drugs in vivo // Cancer Res. 2005. Vol. 65, № 24. P. 11631-11638.

126. Hosokawa S. et al. Efficacy of immunoliposomes on cancer models in a cell-surface-antigen-density-dependent manner. // Br. J. Cancer. 2003. Vol. 89, № 8. P. 1545-1551.

127. Pastorino F. et al. Doxorubicin-loaded Fab' fragments of anti-disialoganglioside immunoliposomes selectively inhibit the growth and dissemination of human neuroblastoma in nude mice // Cancer Res. 2003. Vol. 63, № 1. P. 86-92.

128. Pagnan G. et al. Delivery of c-myb antisense oligodeoxynucleotides to human neuroblastoma cells via disialoganglioside GD(2)-targeted immunoliposomes: antitumor effects. // J. Natl. Cancer Inst. 2000. Vol. 92, № 3. P. 253-261.

129. Park J.W. et al. Anti-HER2 Immunoliposomes: Enhanced Efficacy Attributable to Targeted Delivery Anti-HER2 Immunoliposomes : Enhanced Efficacy Attributable to Targeted Delivery 1. 2002. Vol. 8, № April. P. 1172-1181.

130. Wicki A. et al. Targeting tumor-associated endothelial cells: Anti-VEGFR2 immunoliposomes mediate tumor vessel disruption and inhibit tumor growth // Clin. Cancer Res. 2012. Vol. 18, № 2. P. 454-464.

131. Gupta B., Torchilin V.P. Monoclonal antibody 2C5-modified doxorubicin-loaded liposomes with significantly enhanced therapeutic activity against intracranial human brain U-87 MG tumor xenografts in nude mice // Cancer Immunol. Immunother. 2007. Vol. 56, № 8. P. 1215-1223.

132. Sawant R.M. et al. Prostate cancer-specific monoclonal antibody 5D4 significantly enhances the cytotoxicity of doxorubicin-loaded liposomes against target cells in vitro // J. Drug Target. 2008. Vol. 16, № 7-8. P. 601604.

133. Hussain S. et al. Antitumor activity of an epithelial cell adhesion molecule targeted nanovesicular drug delivery system. // Mol. Cancer Ther. 2007. Vol. 6, № 11. P. 3019-3027.

134. Biltonen R.L., Lichrenberg D. The use of differential scanning calorimetry as a tool to characterize liposome preparations // Chem. physicis Lipids. 1993. Vol. 64. P. 129-142.

135. Bilge D. et al. Interactions of tamoxifen with distearoyl phosphatidylcholine multilamellar vesicles: FTIR and DSC studies. // Spectrochim. Acta. A. Mol. Biomol. Spectrosc. Elsevier B.V., 2014. Vol. 130. P. 250-256.

136. Efimova a. a. et al. Biodegradable multi-liposomal containers // Polym. Sci. Ser. B. 2015. Vol. 57, № 2. P. 140-144.

137. Lianos P., Mukhopadhyay a. K., Georghiou S. Microenvironment of

Aromatic Hydrocarbons Employed As Fluorescent Probes of Liposomes // Photochem. Photobiol. 1980. Vol. 32, № 3. P. 415-419.

138. Macdonald A.G. et al. Temperature, pressure and cholesterol effects on bilayer fluidity; a comparison of pyrene excimer/monomer ratios with the steady-set fluorescence polarization of diphenylhexatriene in liposomes and microsomes // Biochim. Biophys. Acta. 1988. Vol. 938. P. 231-242.

139. Boldyrev I. et al. New BODIPY lipid probes for fluorescence studies of membranes. // J. Lipid Res. 2007. Vol. 48, № 7. P. 1518-1532.

140. Goormaghtigh E., Raussens V., Ruysschaert J.-M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes // Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 1999. Vol. 1422. P. 105-185.

141. Savitzky A., Golay M.J.E. Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures // Anal. Chem. 1964. Vol. 36, № 8. P. 1627-1639.

142. Kaupplnen J.K. et al. Fourier Transforms in the Computation of Self-Deconvoluted and First-Order Derivative Spectra of Overlapped Band Contours // Anal. Chem. 1981. Vol. 53, № 9. P. 1454-1457.

143. Yang H. et al. Obtaining information about protein secondary structures in aqueous solution using Fourier transform IR spectroscopy. // Nat. Protoc. 2015. Vol. 10, № 3. P. 382-396.

144. Dong A., Huang P., Caughey W.S. Protein Secondary Structures in Water from Second-Derivative Amide I Infrared Spectra // Biochemistry. 1990. Vol. 29, № 13. P. 3303-3308.

145. Venyaminov S.Y., Kalinin N.N. Quantitative IR Spectrophotometry of Peptide Compounds in Water (H2O) Solutions. 1. Spectral Parameters of Amino Acid Residue Absorption Bands // Biopolymers. 1990. Vol. 30. P. 1243-1257.

146. Shivu B. et al. Distinct beta-sheet structure in protein aggregates determined by ATR-FTIR spectroscopy // Biochemistry. 2013. Vol. 52, № 31. P. 51765183.

147. Bobroff V. et al. FTIR spectroscopy characterization of fatty-acyl-chain conjugates // Anal. Bioanal. Chem. 2016. Vol. 408, № 1. P. 319-326.

148. Baker M.J. et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials // Nat. Protoc. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved., 2014. Vol. 9, № 8. P. 1771-1791.

149. Derenne A., Vandersleyen O., Goormaghtigh E. Lipid quantification method using FTIR spectroscopy applied on cancer cell extracts. // Biochim. Biophys. Acta. Elsevier B.V., 2014. Vol. 1841, № 8. P. 1200-1209.

150. Byler D.M., Susi H. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra // Biopolymers. 1986. Vol. 25, № 3. P. 469-487.

151. Duarte M.L. et al. An optimised method to determine the degree of acetylation of chitin and chitosan by FTIR spectroscopy // Int. J. Biol. Macromol. 2002. Vol. 31, № 1-3. P. 1-8.

152. Saito S.T. et al. Study of DNA-emodin interaction by FTIR and UV-vis spectroscopy // J. Photochem. Photobiol. B Biol. Elsevier B.V., 2012. Vol. 111. P. 59-63.

153. Ojeda J.J. et al. Characterization of the cell surface and cell wall chemistry of drinking water bacteria by combining XPS, FTIR spectroscopy, modeling, and potentiometric titrations // Langmuir. 2008. Vol. 24, № 8. P. 4032-4040.

154. Derenne A., Gasper R., Goormaghtigh E. The FTIR spectrum of prostate cancer cells allows the classification of anticancer drugs according to their mode of action // Analyst. 2011. Vol. 136, № 6. P. 1134.

155. Mignolet A., Goormaghtigh E. High throughput absorbance spectra of

cancerous cells: a microscopic investigation of spectral artifacts // Analyst. Royal Society of Chemistry, 2015. Vol. 140, № 7. P. 2393-2401.

156. Derenne A., Verdonck M., Goormaghtigh E. The effect of anticancer drugs on seven cell lines monitored by FTIR spectroscopy // Analyst. 2012. Vol. 137, № 14. P. 3255.

157. Miller L.M., Bourassa M.W., Smith R.J. FTIR spectroscopic imaging of protein aggregation in living cells // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. Elsevier B.V., 2013. Vol. 1828, № 10. P. 2339-2346.

158. Jangir D.K. et al. FTIR and circular dichroism spectroscopic study of interaction of 5-fluorouracil with DNA // J. Photochem. Photobiol. B Biol. 2011. Vol. 105, № 2. P. 143-148.

159. Wood B.R. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues // Chem. Soc. Rev. Royal Society of Chemistry, 2015.

160. Rigas B. et al. Human colorectal cancers display abnormal Fourier-transform infrared spectra // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. Vol. 87, № 20. P. 8140-8144.

161. Wong P.T. et al. Infrared spectroscopy of exfoliated human cervical cells: evidence of extensive structural changes during carcinogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991. Vol. 88, № 24. P. 10988-10992.

162. Wong P.T.T. et al. Distinct Infrared Spectroscopic Patterns of Human Basal Cell Carcinoma of the Skin. 1993. P. 762-765.

163. Vazquez-Zapien G.J. et al. FTIR Spectroscopic and Molecular Analysis during Differentiation of Pluripotent Stem Cells to Pancreatic Cells // Stem Cells Int. 2016. Vol. 2016. P. 1-11.

164. Mata-Miranda M.M. et al. Morphological, molecular and FTIR spectroscopic analysis during the differentiation of kidney cells from pluripotent stem cells

// Biol. Res. BioMed Central, 2017. Vol. 50, № 1. P. 14.

165. Cohenford M. a, Rigas B. Cytologically normal cells from neoplastic cervical samples display extensive structural abnormalities on IR spectroscopy: implications for tumor biology. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. Vol. 95, № 26. P. 15327-15332.

166. Andrus P.G., Strickland R.D. Cancer grading by Fourier transform infrared spectroscopy. // Biospectroscopy. 1998. Vol. 4, № 1. P. 37-46.

167. Gaigneaux A. et al. The infrared spectrum of human glioma cells is related to their in vitro and in vivo behavior // Exp. Cell Res. 2004. Vol. 297, № 1. P. 294-301.

168. Gaigneaux A., Ruysschaert J.M., Goormaghtigh E. Infrared spectroscopy as a tool for discrimination between sensitive and multiresistant K562 cells // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269, № 7. P. 1968-1973.

169. Di Giambattista L. et al. New marker of tumor cell death revealed by ATR-FTIR spectroscopy // Anal. Bioanal. Chem. 2011. Vol. 399, № 8. P. 27712778.

170. Falahat R. et al. ATR-FTIR analysis of spectral and biochemical changes in glioma cells induced by chlorotoxin // Vib. Spectrosc. Elsevier B.V., 2016. Vol. 87. P. 164-172.

171. Dos Santos N. et al. pH gradient loading of anthracyclines into cholesterol-free liposomes: Enhancing drug loading rates through use of ethanol // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 2004. Vol. 1661, № 1. P. 47-60.

172. Zhang X. et al. Targeted delivery of levofloxacin-liposomes for the treatment of pulmonary inflammation. // J. Drug Target. 2009. Vol. 17, № 5. P. 399-407.

173. Matias R. et al. A UV spectrophotometric method for the determination of folic acid in pharmaceutical tablets and dissolution tests // Anal. Methods.

2014. Vol. 6, № 9. P. 3065.

174. Yaroslavov A.A. et al. Reversibility of structural rearrangements in the negative vesicular membrane upon electrostatic adsorption/desorption of the polycation // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 2002. Vol. 1560, № 1-2. P. 14-24.

175. Yaroslavov A.A., Melik-Nubarov N.S., Menger F.M. Polymer-induced flipflop in biomembranes // Acc. Chem. Res. 2006. Vol. 39, № 10. P. 702-710.

176. Demina T. et al. Relationship between the structure of amphiphilic copolymers and their ability to disturb lipid bilayers // Biochemistry. 2005. Vol. 44, № 10. P. 4042-4054.

177. Ghanbarzadeh S., Valizadeh H., Zakeri-Milani P. The effects of lyophilization on the physico-chemical stability of sirolimus liposomes // Adv. Pharm. Bull. 2013. Vol. 3, № 1. P. 25-29.

178. Hsu P.P., Sabatini D.M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond // Cell. 2008. Vol. 134, № 5. P. 703-707.

179. Cairns R.A., Harris I.S., Mak T.W. Regulation of cancer cell metabolism // Nat. Rev. Cancer. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 11, № 2. P. 85-95.

180. Ning S. et al. Hyperthermia induces doxorubicin release from long-circulating liposomes and enhances their anti-tumor efficacy // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1994. Vol. 29, № 4. P. 827-834.

181. Lee E.S., Na K., Bae Y.H. Doxorubicin loaded pH-sensitive polymeric micelles for reversal of resistant MCF-7 tumor // J. Control. Release. 2005. Vol. 103, № 2. P. 405-418.

182. Kongtun S. et al. Cytotoxic Properties of Root Extract and Fruit Juice of Trichosanthes cucumerina // Planta Med. 2009. Vol. 75, № 8. P. 836-839.

183. Yoo Y.J. et al. An overview of rapamycin: from discovery to future perspectives // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. Springer Berlin Heidelberg,

2017. Vol. 44, № 4-5. P. 537-553.

184. Li J., Kim S.G., Blenis J. Rapamycin: One drug, many effects // Cell Metab. Elsevier Inc., 2014. Vol. 19, № 3. P. 373-379.

185. Simamora P., Alvarez J.M., Yalkowsky S.H. Solubilization of rapamycin // Int. J. Pharm. 2001. Vol. 213, № 1-2. P. 25-29.