Взаимодействие анионных липосом с катионными полимерами различной архитектуры тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат наук Ивашков Олег Валерьевич

• Ивашков Олег Валерьевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Ивашков Олег Валерьевич

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Липиды и фазы липидов

2.1.1. Липиды

2.1.2. Фазы фосфолипидов

2.1.3. Липосомы

2.2. Липосомы: получение, свойства, применение, характеризация

2.2.1. Получение липосом

2.2.2. Основные свойства липосом и способы измерения этих свойств

2.2.2.1. Размер

2.2.2.2. ^-потенциал

2.2.2.3. Ламеллярность

2.2.2.4. Проницаемость мембраны

2.2.2.5. Агрегация и слияние

2.2.2.6. Стабильность

2.2.3. Применение липосом

2.2.3.1. Медицинские приложения липосом

2.2.3.2. Моделирование процессов клеточной мембраны

2.3. Биомедицинские приложения поликатионов

2.4. Взаимодействие липосом с поликатионами

2.4.1. Обратимость взаимодействия

2.4.2. Целостность и проницаемость мембраны

2.4.3. Агрегация

2.4.4. Слияние

2.4.5. Латеральная сегрегация

2.4.6. Трансмембранная миграция липида (флип-флоп)

2.4.7. Роль адсорбированного слоя полиэлектролита

2.4.8. Токсичность комплексов

2.4.9. Взаимодействие липосом и клеток с сополимерами, содержащими поликатионные и незаряженные звенья

2.3. Микрогели: получение и свойства

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Используемые реагенты

3.1.1. Фосфолипиды

3.1.2. Линейные полимеры

3.1.3. Микрогели поли(НИПАМ-со-ДМАПМА)

3.1.4. Низкомолекулярные реагенты

3.1.5. Вода

3.2. Объекты исследования

3.2.1. Малые моноламеллярные смешанные липосомы КЛ/ФХ и КЛ/ДПФХ

3.2.2. Липосомы со встроенной в бислой флуоресцентной меткой

3.2.3. Липосомы с заключенным во внутренний объем хлоридом натрия

3.2.4. Липосомы, заполненные доксорубицином

3.3. Методы исследования

3.3.1. Динамическое светорассеяние

3.3.2. Электрофоретическая подвижность

3.3.3. Флуориметрия

3.3.4. УФ-спектроскопия

3.3.5. Препаративное центрифугирование

3.3.6. Кондуктометрия

3.3.7. Дифференциальная сканирующая калориметрия

3.3.8. МТТ-тест

3.3.9. Метод анализа траекторий наночастиц

3.3.10. Компьютерное моделирование заполнения поверхности микрогеля липосомами и последующего коллапса микрогеля

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Взаимодействие линейных положительно заряженных полимеров с малыми анионными липосомами

4.1.1. Адсорбция полимеров на поверхности КЛ/ФХ липосом

4.1.2. Целостность липидной мембраны КЛ/ФХ липосом при её контакте с полимером

4.1.3. Состав комплексов ПМВП - КЛ/ФХ липосомы и ПМВП-ПЭО-КЛ/ФХ липосомы

4.1.4. Образование слоя полимера при адсорбции ПМВП и ПМВП-ПЭО на КЛ/ДПФХ липосомах

4.1.5. Фазовые переходы в КЛ/ДПФХ липидной мембране

3

4.1.6. Агрегация липосом, вызванная взаимодействием с ПМВП и ПМВП-ПЭО

4.1.7. Обратимость взаимодействия ПМВП и ПМВП-ПЭО с КЛ/ФХ липосомами

4.1.8. Токсичность комплексов

4.2. Взаимодействие микрогелей поли(НИПАМ-со-ДМАПМА) с малыми анионными липосомами

4.2.1. Физико-химические свойства микрогелей поли(НИПАМ-со-ДМАПМА)

4.2.1.1. Состав микрогелей

4.2.1.2. Термочувствительность микрогелей поли(НИПАМ-со-ДМАПМА)

4.2.1.3. Электрофоретическая подвижность

4.2.1.4. Влияние рН и ионной силы раствора на свойства микрогелей

4.2.2. Свойства комплексов микрогель-липосомы

4.2.2.1. Влияние степени сшивки на свойства комплексов

4.2.2.2. Механизм индуцирования высвобождения содержимого липосом, адсорбированных на частицах микрогеля, при коллапсе микрогеля

4.2.2.3. Влияние содержания отрицательно заряженного липида в липосомах на свойства комплексов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные итоги выполненного исследования

Рекомендации по использования полученных результатов

Перспективы дальнейшей разработки темы

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие анионных липосом с катионными полимерами различной архитектуры»

1. ВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние десятилетия достигнуты значительные успехи в области направленной доставки лекарственных веществ к целевым клеткам и тканям организма. На сегодняшний день описаны десятки систем различной природы: неорганические частицы, мицеллы, полимеры, (био)коллоиды, которые используются в качестве носителей лекарств. Среди большого разнообразия предложенных носителей выделются сферические бислойные везикулы, сформированные из липидных молекул с двумя алкильными радикалами и гидрофильной головкой, которая может содержать группы способные к ионной диссоциации в водном окружении. Липидные молекулы формируют тонкую (порядка 4 нм толщиной) бислойную мембрану, которая отделяет внутреннюю водную полость липосомы от внешнего водного раствора. Специфическое строение липосом позволяет инкапсулировать в них гидрофильные и гидрофобные лекарственные вещества. Первые могут быть растворены во внутренней водной полости липосом, вторые встроены в гидрофобную часть липосомальной мембраны. Липосомальные формы лекарства заняли прочное место на рынке лекарственных препаратов.

Список липосомальных препаратов продолжает активно пополняться, а число клинических испытаний - завершённых и действующих - исчисляется сотнями. В состав таких препаратов часто входят полимеры, которые придают липосомальным конструкциям дополнительную стабильность в кровотоке и улучшают их адгезивные свойства. Однако полимеры могут приводить и к нежелательным эффектам: агрегации и слиянию частиц, структурным перестройкам в липосомальной мембране и т.д.

Во многих работах, обобщающих последние достижения в области направленной доставки лекарств, отмечается перспективность разработки систем для комбинированной терапии, когда носитель доставляет в мишень сразу несколько действующих веществ. Липосомы с различными инкапсулированными веществами могут быть электростатически адсорбированы на полимерном носителе или распределены в объеме микроразмерного полимерного гидрогеля.

Помимо этого, липосомы широко используются в качестве простой, но при этом вполне адекватной модели клеточной мембраны. Встраивание в липосомальную мембрану дополнительных функциональных составляющих, например, каналообразователей и гликопротеинов, позволяет анализировать их поведение в «привычном» липидном окружении, в том числе при взаимодействии с компонентами окружающего раствора. Такими компонентами могут быть инертные полимеры-матрицы для доставки лекарств в клетки или полимеры, обладающие собственной биологической активностью.

Представленная выше картина указывает на необходимость детального изучения механизмов взаимодействия биологических (липидных) мембран с полимерами, в частности, с полиэлектролитами (ПЭ), содержащими ионогенные (диссоциирующие в водном окружении) группы. Полученные результаты позволят количественно описать связывание ПЭ на поверхности липидной (липосомальной) мембраны, агрегативную стабильность комплексов ПЭ-липосома и условия сохранения целостности липосом в составе комплексов.

Степень разработанности темы. Используемые в экспериментальной и биомедицинской практике липосомы часто имеют отрицательный поверхностный заряд для совместимости с остальными - тоже отрицательно заряженными - компонентами

5

биологической жидкости. По этой причине большая часть опубликованных работ посвящена исследованию взаиомодействия в системе «анионная липосома - катионный полимер». Такое взаимодействие может сопровождаться структурными перестройками (иногда значительными) в липосомальной мембране, а также агрегацией, слиянием и разрушением липосом. Описано влияние различных факторов: химического строения поликатиона, плотности заряда макромолекулы, размера и суммарного заряда липосом и др., на строение комплексов и их устойчивость в водно-солевых средах и в присутствии ПЭ-конкурентов.

Существенно меньше внимания уделено влиянию молекулярной массы поликатионов на строение и свойства их комплексов с анионными липосомами. Практически отсутствует информация о том, какое влияние на строение и свойства комплексов может оказывать блочная структура полимера, в котором катионный блок связан с неоинным гидрофильным блоком. Между тем, молекулярная масса полимеров и блочная структура могут оказывать заметное влияние на организацию липидного бислоя и свойства комплексов, например, на их устойчивость к диссоциации в водно-солевых средах и агрегативную стабильность.

Что касается создания мультилипосомальных систем, их предложено получать путем (1) электростатического, гидрофобного или ковалентного связывания липосом на поверхности полимерного ядра-носителя, либо (2) встраивая липосомы в полимерный гидрогель на стадии его синтеза. Предпочтительным представляется первый вариант особенно, если липосомы электростатически адсорбируются на поверхности полимерной частицы. Очевидные преимущества такого подхода - простая процедура получения комплекса, который формируется при сливании водных растворов обоих компонентотв, и стабильность получающихся комплексов к диссоциации в солевых растворах. В этом направлении сделаны только первые шаги, что не позволяет говорить о сформировавшихся представлениях о механизме взаимодействия анионных липосом с катионными полимерными носителями, в особенности когда в качестве носителй выступают полимерные микрогели, в том числе обладающие «стимул-чувствительностью», например, реагирующие на изменение рН и/или температуры окружающего водного раствора.

Цели и задачи. заключалась в исследовании формирования электростатических комплексов малых (50-100 нм в диаметре) анионных липосом и катионных полимеров различной архитектуры: (1) линейных гомополимеров, (2) блок-сополимеров, содержавших катионный блок и блок из неионных гидрофильных звеньев, и (3) ковалентно сшитых полимеров; определении строения полученных комплексов и их устойчивости в водно-солевых растворах; изучении кинетики термо-инициированного высвобождения инкапсулированных в липосомах водорастворимых веществ.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие конкретные задачи:

1. Изучить возможность и обратимость адсорбции линейных поликатионов и блок-сополимеров на поверхности липосом, для каждого случая определить количество связываемого полимера, а также изучить гидродинамические свойства комплексов в водно-солевых средах.

2. Исследовать влияние адсорбированного полимера на проницаемость липидного бислоя и возможные структурные перестройки в бислое.

3. Получить комплексы микрогель-липосомы, оценить максимальное количество липосом, которое может быть адсорбировано на одной частице микрогеля, установить влияние адсорбции на проницаемость липидного бислоя, определить является ли полученная

система термочувствительной, изучить кинетику высвобождения содержимого липосом, адсорбированных на частицах микрогеля.

4. Исследовать формирование комплексов при различных значениях ионной силы, установить возможно ли получение насыщенных комплексов при физиологических значениях ионной силы раствора (150-200 мМ).

В качестве объектов исследования были выбраны кватернизованный поли(К-метил-2-винилпиридиний) метилсульфат (ПМВП) степеней полимеризации 20, 40, 100, 270 и 440; сополимеры на основе кватернизованного 2-винилпиридиния и этиленоксида (ПМВП-ПЭО), где степень полимеризации катионного блока составляла 40, а длина полиэтиленоксидного блока варьировалась от 45 до 450 составных повторяющихся звеньев; сшитые полимеры поли(НИПАМ-со-ДМАПМА), полученные сополимеризацией К-изопропилакриламида (НИПАМ), К,К-диметиламинопропилметакриламида (ДМАПМА) и сшивающего агента бисакриламида (БИС), мольная доля которого варьировалась от 2% до 8%. Малые анионные липосомы получали методом испарения-гидратации с последующим озвучиванием или экструзией из нейтральных яичного лецитина (яФХ) или дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и отрицательно заряженных фосфатидилсерина (ФС) или кардиолипина (КЛ).

Научная новизна.

• В работе впервые исследовано влияние молекулярной массы (степени полимеризации, СП) катионного полимера на строение и свойства его комплексов со смешанными липосомами, сформированными из анионного и элекронейтрального липидов. Показано, что короткие поликатионы вызывают латеральную сегрегацию липидов в пределах внешнего монослоя липосомальной мембраны и формирование кластеров, в которых анионные липидные молекулы электростатически связаны с катионными звеньями адсорбированного полимера. Длинные поликатионы индуцируют переход анионных липидов из внутреннего монослоя мембраны на внешний, известный как флип-флоп (при этом липосомы сохраняют свою целостность), в результате чего все анионные липиды оказываются сосредоточенными на внешней стороне мембраны и собираются в кластеры, стабилизированные адсорбированным поликатионом.

• Впервые показано, что длина гидрофильного блока в адсорбированном катионном сополимере оказывает существенное влияние на организацию липосомальной мембраны. Катионный блок (одинаковой длины для всех использованных в работе сополимеров) электростатически адсорбируется на поверхности анионных липосом, инициируя формирование микрокластеров из анионных липидов. Длинныые гидрофильные блоки стерически блокируют сближение микрокластеров и микрофазовое расслоение (сегрегацию) в липидном бислое. Короткие гидрофильные блоки не препятствую такому расслоению.

• Исследована адсорбция анионных липосом, заполненных водорасторимым лекарственным веществом (доксорубицином, Докс), на поверхности термочувствительных катионных микрогелевых частиц. Показано, что высвобождение Докс из адсорбированных липосом при повышении температуры может развиваться по двум механизмам: (1) за счет сжатия и последующего разрушения липосом при резком уменьшении площади поверхности микрогеля и (2) в результате появления дефектов в

липосомальных мембранах при их взаимодействии с цепями коллапсирующего микрогеля.

• Впервые получены комплексы анионных липосом и катионного термо-чувствительного микрогеля, устойчивые к диссоциации в растворе с физиологической концентрацией [ЫаС1] = 0.15 М.

Теоретическая значимость работы заключается в установлении взаимосвязи между молекулярными хирактеристиками полимеров - степени полимеризации поликатиона и степени полимеризации гидрофильго блока в катионном сополимере - на строение комплексов полимеров с липосомами, в частности, на структурную организацию липидного бислоя. Предложены и экспериментально обоснованы механизмы термо-инициированного высвобождениия лекарства из анионных липосом, адсорбированных на поверхности катионного термо-чувствительного микрогеля.

Практическая значимость работы. Использование коротких катионных гомополимеров и катионных блок-сополимеров с длинными гидрофильными блоками обеспечивает эффективное связывание полимеров с анионными липосомами и при этом в минимальной степени оказывает вляние на структуру биологической (липидной) мембраны. Эти результаты позволяют рекомендовать такие поликатионы в качестве матриц для иммобилизации биологически активных веществ.

Описанный в работе механизм термо-индуцированного высвобождения инкапсулированного водорастворимого веществ из липосом, адсорбированных на поверхности термо-чувствителнього микрогеля, может быть использован при конструировании мультилипосомальных стимул-чувствительных средств доставки лекарств.

Методология и методы исследования. В работе исследовано формирование комплексов анионных липосом с катионными полимерами различной архитектуры и показана взаимосвязь между строением полимера и свойствами конечных продуктов. Для получения экспериментальных результатов использовали комплекс современных взаимодополняющих физико-химических методов, который включал спектрофлуориметрию, динамическое светорассеяние, лазерный микроэлектрофорез, анализ траектории наночастиц, дифференциальную сканирующую калориметрию, атомно-силовую микроскопию, гель-проникающую хроматографию, потенциометрию, кондуктометрию.

Положения, выносимые на защиту:

• Формирование электростатических комплексов линейного катионного гомополимера с малыми моноламеллярными анионными липосомами и влияние СП поликатиона на состав и свойства полученных комплексов;

• Формирование электростатических комплексов блок-сополимера, содержащего неионной гидрофильный блок и катионный блок, с малыми моноламеллярными анионными липосомами и влияние СП неионного гидрофильного блока сополимера на состав и свойства полученных комплексов;

• Формирование электростатических комплексов термо-чувствительного катионного микрогеля с малыми моноламеллярными анионными липосомами; состав и свойства полученных комплексов;

• Механизм термо-индуцированного высвобождения водорастворимого содержимого из

липосом, связанных в комплекс с микрогелем;

• Формирование комплексов микрогель-липосом устойчивых к диссоциации на исходные

компоненты в физиологическом растворе с [NaCl] = 0.15 М.

Личное участие автора. Автору принадлежит решающая роль в постановке задачи, выборе направления исследований, планировании работы, разработке экспериментальных подходов и обобщении результатов. Описанные в работе экспериментальные результаты, если не указано иное, получены лично автором или с его непосредственным участием.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обеспечена выполнением экспериментов при помощи современных инструментальных физико-химических методов исследования и статистической оценкой погрешностей результатов. Результаты работы были представлены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2014», «Ломоносов-2015», «Ломоносов-2016», «Ломоносов-2018», «Ломоносов-2019» (Россия, Москва, 2014, 2015, 2016, 2018 и 2019), VII Всероссийской конференции с международным участием молодых учёных по химии «Менделеев-2014» (Россия, Санкт-Петербург, 2014), Международной конференции «The Liposome Research Days» (Дания, Копенгаген, 2014), Всероссийской Каргинской конференции "Полимеры-2014" и «Полимеры-2017» (Россия, Москва, 2014 и 2017), 22 Оствальдовском коллоквиуме (Германия, Аахен, 2016), Международной студенческой конференции «Science and Progress» (Россия, Петергоф, 2016 и 2018), Бакеевской Всероссийской с международным участием конференции «Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпозиты» (Россия, Химки, 2016 и Москва, 2018).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 17 печатных работ, из них 3 статьи, опубликованные в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности и индексируемых в международных базах данных (Web of Science, Scopus) и 14 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 117 наименования. Работа изложена на 112 страницах, содержит 66 рисунков и 9 таблиц.

Во введении дана общая характеристика работы, обоснована актуальность научного направления, описана практическая и теоретическая значимость и новизна полученных результатов, сформулирована цель исследования и представлены основные задачи, решение которых необходимо для достижения этой цели.

Обзор литературы посвящён рассмотрению современного состояния исследований в области взаимодействия липосом с полимерами, в том числе для создания мультилипосомальных систем. Рассмотрены основные свойства липосом и полимеров, подходы к изучению их свойств, описаны основные закономерности формирования комплексов с участием полимеров и липосом и сформулированы основные задачи диссертационной работы.

Линейные полимеры были синтезированы и охарактризованы в группе проф. Х. Шмальца из Университета Байройта, Германия, микрогели были получены и в группе проф. В.Рихтеринга из Рейнско-Вестфальской технической школы - Университета Ахена, Германия.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Липиды и фазы липидов 2.1.1. Липиды

В отличие от подавляющего большинства классов органических соединений, в которых принадлежность к классу определяется наличием одной или нескольких функциональных групп (например, соединение, содержащее карбоксильную группу, относят к классу карбоновых кислот), липиды представляют собой широкий класс соединений, не объединённых схожестью химических формул. Так, холестерин и дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) (рис. 1), имеющие мало общего в химическом строении, являются представителями класса липидов. Причиной этому является то, что к липидам ещё в начале прошлого века были отнесены

Международный Комитет Классификации и Номенклатуры липидов (International Lipid Classification and Nomenclature Committee) предложил более совершенное определение липидов и их классификацию, которые по прежнему актуальны [2,3]. Таким образом, сегодня к этому классу соединений относят восемь групп веществ: жирные кислоты, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, стеролы, пренолы, сахаролипиды, поликетиды.

Одним из широко распространнёных в живых клетках компонентом являются глицерофосфолипиды (обычно называемые просто фосфолипидами). Эти соединения выступают в качестве матрицы клеточной мембраны. Подавляющее большинство фосфолипидов (например, ДПФХ на рис. 1) можно рассматривать как глицерин, в котором две гидроксильные группы участвуют в образовании сложных эфиров с жирными кислотами, а оставшаяся связана с остатком фосфорной кислоты или фосфатидилом - остатком фосфорной кислоты, где один из атомов водорода замещён на органический радикал.

2.1.2. Фазы фосфолипидов

Фосфолипиды при комнатной температуре могут представлять собой бесцветную

жидкость или белый порошок. Агрегатное состояние определяется длиной жирнокислотных

соединения, имеющие одновременно три характеристики: 1) нерастворимость в воде и растворимость в растворителях жиров (хлороформ, бензол и т.д.); 2) генетическая связь с жирными кислотами (например, эфир жирной кислоты может быть отнесён к классу липидов); 3) использование живыми организмами [1]. В 2005 году

о

Рис. 1. Структурные формулы: а) холестерин, б) ДПФХ

остатков (чем длиннее - тем температура плавления выше), а также наличием в них ненасыщенных связей (чем их больше, тем температура плавления меньше).

В научной литературе при обсуждении фаз фосфолипидов зачастую имеют ввиду не фазы, образованные только молекулами фосфолипидов, а фазы, формируемые фосфолипидами в водных и водно-солевых средах. Это связано, в первую очередь, с большим прикладным значением систем фосфолипид-вода в биомедицинской и смежных областях.

Рис. 2. Ламеллярные фазы липидов: обозначения и их схематические представления.

70

О

а р

ту

та р

е п м е

н

30

\\ 1-\ \ а \\ I 1 1 1- + н.о а 2

: __: ц. ; ц + нго ; 1.1.1

Содержание воды, масс.%

Рис. 3. Фазовая диаграмма ДПФХ-вода.

Молекула фосфолипида имеет гидрофобную часть, образованную жирнокислотными остатками, и

гидрофильную часть - фосфатидил. Такая амфифильная структура приводит к множеству форм, в которых фосфолипиды могут существовать в водных растворах: индивидуальные растворённые молекулы, мицеллы, ламеллярные структуры и др. Наличие

гидрофобной и гидрофильной

составляющих обуславливает склонность к образованию таких агрегатов, в которых гидрофобные части скрыты от воды, а гидрофильные с ней взаимодействуют.

Для нас из всех фосфолипидных фаз наибольший интерес будет представлять липидный бислой (ламеллярные фазы), который, в свою очередь, может пребывать в различных фазовых состояниях, схематично представленных на рис. 2. Фазовая диаграмма ДПФХ-вода представлена на рис. 3. [4]

2.1.3. Липосомы

В разделе 2.1.2 обсуждались ламеллярные фазы липидов.

Рис. 4. Одна из первых электронных микрофотографий липосом. Размер метки - 1000 А.

Стоит отметить, что под липидным бислоем понимался замкнутый бислой, образующий сферическую частицу, которую называют липосомой. Таким образом, всё вышесказанное о ламеллярных фазах липидов относится также и к липидным бислоям в составе липосом. Например, согласно фазовой диаграмме на рис. 3, при содержании воды 60% и температуре 30°С, в равновесии существуют водный раствор и липосомы, липидный бислой которых находится в фазе Ьр> (смектическая фаза С, в которой молекулы липидов наклонены по отношению к нормали, проведённой к поверхности бислоя).

Считается, что термин липосомы появился в 1968 году после нескольких публикаций Алека Бэнгхэма, впервые наблюдавшего замкнутые липидные бислои в просвечивающий электронный микроскоп (рис. 4) [5,6]. Получены первые липосомы были методом гидратации тонкой плёнки, при котором смешивают растворы липидов в необходимом количестве, испаряют органический растворитель, редиспергируют полученные сухие липиды в воде и подвергают суспензию действию ультразвука. Этот способ остаётся популярным и сегодня.

Липосомы могут иметь размер от нескольких десятков нанометров до нескольких десятков микрометров. По размеру их классифицируют на малые (до 0.5 микрона), большие (от 0.5 до 5 микрон) и гигантские (от 5 до десятков микрон). Кроме того, липосомы могут быть образованы как одним бислоем липидов, так и несколькими. В первом случае говорят о моноламеллярных липосомах, во втором - о мультиламеллярных.

2.2. Липосомы: получение, свойства, применение, характеризация

2.2.1. Получение липосом

Как уже было сказано, липосомы различают по размеру и ламеллярности. Эти два

параметра определяются методом получения. В таблице 1 приведены примеры методов, при помощи которых можно получить частицы желаемого размера и ламеллярности [7].

Стоит отметить наиболее популярные методы получения липосом: метод удаления детергента [8], метод инъекции [9], метод выпаривания в обращённой фазе [10], микрофлюидный подход [11], метод нагрева [12], метод сверхкритической жидкости [13], метод гомогенизации высоким давлением [14].

Таблица 1. Методы получения различных типов липосом.

Тип липосом Метод Описание метода

Гигантские однослойные Электроформирование Липидная плёнка осаждается на электроды, которые затем помещаются в водную среду. Гидратация липидной плёнки

осуществляется в присутствии электрического поля. Липосомы, полученные таким образом, зачастую содержат примесь многослойных частиц.

Большие однослойные Экструзия При экструзии суспензии многослойных липосом через мембраны с размером пор более 0,2 мкм можно получить большие однослойные липосомы с гомогенным распределением по размерам.

Многослойные частицы Гидратация липидной плёнки в присутствии гидродинамического потока Липидная плёнка гидратируется при интенсивном перемешивании. Получаемые частицы имеют широкое распределение по размерам.

Малые однослойные Ультразвуковая обработка Обработка липосом, полученных гидратацией липидной плёнки, ультразвуком, приводит к получению малых частиц, размер которых зависит от времени обработки и мощности ультразвукового излучения.

2.2.2. Основные свойства липосом и способы измерения этих свойств

Свойства липосом и методы измерения этих свойств сильно зависят от типа частиц.

Последующие пункты относятся, главным образом, к малым моноламеллярным липосомам, которые использовались в этой работе.

2.2.2.1. Размер

Для оценки радиуса липосом могут быть использованы множество методов: динамическое светорассеяние (ДРС), анализ траекторий наночастиц (АТН), просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), эксклюзионная хроматография.

Из всех вышеперечисленных методов наиболее популярен метод динамического светорассеяния. В данном методе через образец проходит лазерное излучение, а под определённым углом к исходному пучку регистрируются флуктуации рассеянного на образце света. Из сигнала 1(1), который, как кажется, колеблется около среднего значения случайным образом, вычисляют так называемую корреляционную функцию <!(1;)1(1+т)> (рис. 5).

Полученная таким образом корреляционная функция С(т) связана с корреляционной функцией рассеянного электрического поля §(т) простым соотношением:

С(т) = 1 + |в(т)|2

При допущении, что рассеивающие частицы не взаимодействуют между собой, можно найти соотношение, которое связывает значение корреляционной функции в некоторый момент т со средним расстоянием, на которое перемещается частица суспензии за время т:

= <е'ч[г№-г(*+т)]>

где q - вектор рассеяния (разность между волновыми векторами первичного и рассеянного пучков).

Интенсивность <1(1:)Щ+т)>

Рис. 5. А) Интенсивность рассеянного света, Б) Автокорреляционная функция.

Если частицы претерпевают броуновское движение, то §(т) принимает вид

§(т) = / е - 1 ч-г Р(г,т)с1 Зг , где Р(г,т) -вероятность того, что данная частица, расположенная в точке отсчёта в момент времени 1=0, окажется на расстоянии г в момент времени т. Эта функция известна для броуновского движения. После её подстановки и вычисления интеграла, получим простое выражение для корреляционной функции рассеянного электрического поля:

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ивашков Олег Валерьевич, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bloor W.R. / Biochemistry of the fats // Chem. Rev.- 1925.- V. 2, № 2.- P. 243-299.

2. Fahy E., Subramaniam S., Brown H.A., Glass C.K., Merrill A.H., Murphy R.C., Raetz C.R.H., Russell D.W., Seyama Y., Shaw W., Shimizu T., Spener F., van Meer G., VanNieuwenhze M.S., White S.H., Witztum J.L., Dennis E.A. / A comprehensive classification system for lipids. // J. Lipid Res.- 2005.- V. 46, № 5.- P. 839-861.

3. Fahy E., Subramaniam S., Murphy R.C., Nishijima M., Raetz C.R.H., Shimizu T., Spener F., van Meer G., Wakelam M.J.O., Dennis E.A. / Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. // J. Lipid Res.- 2009.- V. 50 Suppl.- P. S9-14.

4. Koynova R., Caffrey M. / Phases and phase transitions of the phosphatidylcholines // Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr.- 1998.- V. 1376, № 1.- P. 91-145.

5. Deamer D.W. / From "banghasomes" to liposomes: a memoir of Alec Bangham, 1921-2010. // FASEB J.- 2010.- V. 24, № 5.- P. 1308-1310.

6. Bangham A.D., Horne R.W. / Negative staining of phospholipids and their structural modification by surface-active agents as observed in the electron microscope // J. Mol. Biol.-Academic Press Inc. (London) Ltd., 1964.- V. 8, № 5.- P. 660-668.

7. Patil Y.P., Jadhav S. / Novel methods for liposome preparation. // Chem. Phys. Lipids.- Elsevier Ireland Ltd, 2014.- V. 177.- P. 8-18.

8. Brunner J., Scrabal P., Hauser H. / Single bilayer vesicles prepared without sonication physico-chemical properties // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr.- 1976.- V. 455.- P. 322-331.

9. Batzri S., Korn E.D. / Single bilayer liposomes prepared without sonication // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr.- 1973.- V. 298.- P. 1015-1019.

10. Szoka F., Papahadjopoulos D. / Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-1978.- V. 75, № 9.- P. 4194-4198.

11. Jahn A., Vreeland W.N., Devoe D.L., Locascio L.E., Gaitan M. / Microfluidic Directed Formation of Liposomes of Controlled Size.- 2007.- № 26.

12. Mortazavi S.M., Mohammadabadi M.R., Khosravi-darani K., Mozafari M.R. / Preparation of liposomal gene therapy vectors by a scalable method without using volatile solvents or detergents // J. Biotechnol.- 2007.- V. 129.- P. 604-613.

13. Zhao L., Temelli F. / Preparation of liposomes using a modified supercritical process via depressurization of liquid phase // J. Supercrit. Fluids.- Elsevier B.V., 2015.- V. 100.- P. 110120.

14. Meure L.A., Foster N.R., Dehghani F. / Conventional and Dense Gas Techniques for the

103

Production of Liposomes : A Review // AAPS PharmSciTech.- 2008.- V. 9, № 3.- P. 798-809.

15. Filipe V., Hawe A., Jiskoot W. / Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. // Pharm. Res-2010.- V. 27, № 5.- P. 796-810.

16. Yang C. / Measuring Zeta Potential, Methods // Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics.- 2011.- P. 1-13.

17. Laouini A., Jaafar-Maalej C., Limayem-Blouza I., Sfar S., Charcosset C., Fessi H. / Preparation, Characterization and Applications of Liposomes: State of the Art // J. Colloid Sci. Biotechnol.-2012.- V. 1, № 2.- P. 147-168.

18. Fröhlich M., Brecht V., Peschka-su R. / Parameters influencing the determination of liposome lamellarity by 31 P-NMR // Chem. Phys.- 2001.- V. 109.- P. 103-112.

19. Kai L., Kaldenhoff R. / A refined model of water and CO2 membrane diffusion: Effects and contribution of sterols and proteins // Scinetific Reports.- 2014.- P. 1-6.

20. Issack B.B., Peslherbe G.H. / Effects of Cholesterol on the Thermodynamics and Kinetics of Passive Transport of Water through Lipid Membranes. // J. Phys. Chem. B.- 2015.

21. Zheng W., Liu Y., West A., Schuler E.E., Yehl K., Dyer R.B., Kindt J.T., Salaita K. / Quantum dots encapsulated within phospholipid membranes: phase-dependent structure, photostability, and site-selective functionalization. // J. Am. Chem. Soc.- 2014.- V. 136, № 5.- P. 1992-1999.

22. Sansom M.S.P., Biggin P.C. / Molecular Simulations and Biomembranes.- 2010.- 76-90 p.

23. Mahjub R., Dorkoosh F.A., Amini M., Khoshayand M.R., Rafiee-Tehrani M. / Preparation, statistical optimization, and in vitro characterization of insulin nanoparticles composed of quaternized aromatic derivatives of chitosan. // AAPS PharmSciTech.- 2011.- V. 12, № 4.- P. 1407-1419.

24. Ashizaki K.H., Aguchi H.T., Akai H.S., Be M.A., Aito Y.S. / Carboxyfluorescein Leakage from Polyethylene glycol)-Grafted Liposomes Induced by the Interaction with Serum // Chem. Pharm. Bull.- 2006.- V. 54, № 1.- P. 80-84.

25. Bordi F., Cametti C., Sennato S., Viscomi D. / Conductometric evidence for intact polyion-induced liposome clusters. // J. Colloid Interface Sci.- 2006.- V. 304, № 2.- P. 512-517.

26. Elizondo E., Moreno E., Cabrera I., Córdoba A., Sala S., Veciana J., Ventosa N. / Liposomes and other vesicular systems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine. // Progress in molecular biology and translational science.- 2011.- V. 104.- 152 p.

27. Mondal Roy S., Sarkar M. / Membrane fusion induced by small molecules and ions. // J. Lipids.- 2011.- V. 2011.

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

Gregoriadis G. / Liposome Technology.- 2007.- V. I.

Garti N. / Delivery and controlled release of bioactives in foods and nutraceuticals.- CRC Press, 2008.

Stark B., Pabst G., Prassl R. / Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. // Eur. J. Pharm. Sci.- Elsevier B.V., 2010.- V. 41, № 3-4.- P. 546-555.

Pérez-Herrero E., Fernández-Medarde A. / Advanced targeted therapies in cancer: Drug nanocarriers, the future of chemotherapy. // Eur. J. Pharm. Biopharm.- 2015. Allison A.C., Gregoriadis G. / Liposomes as immunological adjuvants // Nature.- 1974.- V. 252.- P. 252.

Burks S R., Barth E.D., Halpern H.J., Rosen G.M., Kao J.P.Y. / Cellular Uptake of Electron Paramagnetic Resonance Imaging Probes Through Endocytosis of Liposomes // Biochim Biophys Acta.- 2010.- V. 1788, № 10.- P. 2301-2308.

Sprong H., Sluijs P. Van Der, Meer G. Van. / How proteins move lipids and lipids move proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.- 2001.- V. 2.- P. 504-513.

Seddon A.M., Casey D., Law R. V, Gee A., Templer R.H., Ces O., Seddon A.M., Casey D., Law R. V, Gee A., Templer R.H., Ces O. / Drug interactions with lipid membranes // Chem. Soc.- 2009.- V. 38, № 9.- P. 2497-2812.

Herbette L.G., Rhodes D.G., Preston Mason R. / New approaches to drug design and delivery based on drug-membrane interactions // Drug Des. Deliv.- 1991.- V. 7, № 2.- P. 75-118. Sun J., Wu X., Lu R., Liu J., Wang Y., He Z. / Profiling Drug Membrane Permeability and Activity Via Biopartitioning Chromatography // Curr. Drug Metab.- 2008.- № 9.- P. 152-166. Valkó K. / Application of high-performance liquid chromatography based measurements of lipophilicity to model biological distribution // J. Chromatogr. A.- 2004.- V. 1037.- P. 299310.

Brüggemann D., Frohnmayer J.P., Spatz J.P. / Model systems for studying cell adhesion and biomimetic actin networks. // Beilstein J. Nanotechnol.- 2014.- V. 5.- P. 1193-1202. Oupicky D., Li J. / Bioreducible polycations in nucleic acid delivery: past, present, and future trends. // Macromol. Biosci.- 2014.- V. 14, № 7.- P. 908-922. Ballarín-González B., Howard K.A. / Polycation-based nanoparticle delivery of RNAi therapeutics: adverse effects and solutions. // Adv. Drug Deliv. Rev.- Elsevier B.V., 2012.- V. 64, № 15.- P. 1717-1729.

Vert M. / Not any new functional polymer can be for medicine: what about artificial biopolymers? // Macromol. Biosci.- 2011.- V. 11, № 12.- P. 1653-1661.

43. Yabuki S. / Polyelectrolyte Complex Membranes for Immobilizing Biomolecules , and Their Applications to Bio-analysis // Anal. Sci.- 2011.- V. 27.- P. 695-702.

44. Hucik M., Bucko M., Gemeiner P., Stefuca V., Vikartovska A., Mihovilovic M.D., Rudroff F., Iqbal N., Chorvat D., Lacik I. / Encapsulation of recombinant E. coli expressing cyclopentanone monooxygenase in polyelectrolyte complex capsules for Baeyer-Villiger biooxidation of 8-oxabicyclo[3.2.1]oct-6-en-3-one. // Biotechnol. Lett.- 2010.- V. 32, № 5.- P. 675-680.

45. Li N., Zhao H., Yuan R., Peng K., Chai Y. / An amperometric immunosensor with a DNA polyion complex membrane/gold nanoparticles-backbone for antibody immobilisation // Electrochim. Acta.- 2008.- V. 54, № 2.- P. 235-241.

46. Ariga K., Lvov Y.M., Kawakami K., Ji Q., Hill J.P. / Layer-by-layer self-assembled shells for drug delivery // Adv. Drug Deliv. Rev.- Elsevier B.V., 2011.- V. 63, № 9.- P. 762-771.

47. Shchukin D.G., Patel A.A., Sukhorukov G.B., Lvov Y.M. / Nanoassembly of Biodegradable Microcapsules for DNA Encasing // J. Am. Chem. Soc.- 2004.- № 126.- P. 3374-3375.

48. Yang Y.-F., Hu H.-Q., Li Y., Wan L.-S., Xu Z.-K. / Membrane surface with antibacterial property by grafting polycation // J. Memb. Sci.- Elsevier B.V., 2011.- V. 376, № 1-2.- P. 132-141.

49. Wong S.Y., Li Q., Veselinovic J., Kim B.-S., Klibanov A.M., Hammond P.T. / Bactericidal and virucidal ultrathin films assembled layer by layer from polycationic N-alkylated polyethylenimines and polyanions. // Biomaterials.- Elsevier Ltd, 2010.- V. 31, № 14.- P. 4079-4087.

50. Jean-Francois F., Castano S., Desbat B., Odaert B., Roux M., Metz-Boutigue M.-H., Dufourc

E.J. / Aggregation of Cateslytin -Sheets on Negatively Charged Lipids Promotes Rigid Membrane Domains . A New Mode of Action for Antimicrobial Peptides? // Biochemistry.-2008.- V. 47.- P. 6394-6402.

51. Yaroslavov A.A., Sitnikova T.A., Rakhnyanskaya A.A., Ermakov Y.A., Burova T. V, Grinberg V.Y., Menger F.M. / Contrasting Behavior of Zwitterionic and Cationic Polymers Bound to Anionic Liposomes // Langmuir.- 2007.- V. 23, № 28.- P. 7539-7544.

52. Hategan A., Sengupta K., Kahn S., Sackmann E., Discher D.E. / Topographical Pattern Dynamics in Passive Adhesion of Cell Membranes // Biophys. J.- 2004.- V. 87, № November.-P. 3547-3560.

53. Yaroslavov A. a, Sybachin A. V, Zaborova O. V, Orlov V.N., Ballauff M., Talmon Y., Menger

F.M. / Lipid Segregation in Membranes of Anionic Liposomes Adsorbed onto Polycationic Brushes. // Chemistry.- 2013.- V. 19, № 41.- P. 13674-13678.

54. Sybachin A. V, Zaborova O. V, Orlov V.N., Semenyuk P.I., Kesselman E., Schmidt J., Talmon

Y., Menger F.M., Yaroslavov A.A. / Complexes between Anionic Liposomes and Spherical Polycationic Brushes. An Assembly of Assemblies // Langmuir.- 2014.- V. 30.- P. 2441-2447.

55. Yaroslavov A.A., Kuchenkova O.Y., Okuneva I.B., Melik-Nubarov N.S., Kozlova N.O., Lobyshev V.I., Menger F.M., Kabanov V.A. / Effect of polylysine on transformations and permeability of negative vesicular membranes // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr.- 2003.-V. 1611, № 1-2.- P. 44-54.

56. Karewicz A., Bielska D., Loboda A., Gzyl-Malcher B., Bednar J., Jozkowicz A., Dulak J., Nowakowska M. / Curcumin-containing liposomes stabilized by thin layers of chitosan derivatives. // Colloids Surf. B. Biointerfaces.- 2013.- V. 109.- P. 307-316.

57. Mady M.M., Darwish M.M. / Effect of chitosan coating on the characteristics of DPPC liposomes // J. Adv. Res.- 2010.- V. 1, № 3.- P. 187-191.

58. Zhuang J., Ping Q., Song Y., Qi J., Cui Z. / Effects of chitosan coating on physical properties and pharmacokinetic behavior of mitoxantrone liposomes // Int. J. Nanomedicine.- 2010.- V. 5.- P. 407-416.

59. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Kabanov V.A. / Reversibility of structural rearrangements in the negative vesicular membrane upon electrostatic adsorption/desorption of the polycation. // Biochim. Biophys. Acta.- 2002.- V. 1560, № 1-2.- P. 14-24.

60. Nicolson G.L. / The Fluid-Mosaic Model of Membrane Structure: still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. // Biochim. Biophys. Acta.- 2014.- V. 1838, № 6.- P. 1451-1466.

61. Yaroslavov A.A., Kiseliova E.A., Udalykh O.Y., Kabanov V.A. / Integrity of Mixed Liposomes Contacting a Polycation Depends on the Negatively Charged Lipid Content.- 1998.- V. 186, № 19.- P. 5160-5163.

62. Efimova A.A., Sybachin A. V., Yaroslavov A.A. / Effect of anionic-lipid-molecule geometry on the structure and properties of liposome-polycation complexes // Polym. Sci. Ser. C.- 2011.- V. 53, № 1.- P. 89-96.

63. Hong S., Leroueil P.R., Janus E.K., Peters J.L., Kober M. / Interaction of Polycationic Polymers with Supported Lipid Bilayers and Cells : Nanoscale Hole Formation and Enhanced Membrane Permeability // Bioconjugate Chem.- 2006.- № 3.- P. 728-734.

64. Mecke A., Uppuluri S., Sassanella T.M., Lee D.-K., Ramamoorthy a, Baker J.R., Orr B.G., Banaszak Holl M.M. / Direct observation of lipid bilayer disruption by poly(amidoamine) dendrimers. // Chem. Phys. Lipids.- 2004.- V. 132, № 1.- P. 3-14.

65. Volodkin D., Mohwald H., Voegel J.-C., Ball V. / Coating of negatively charged liposomes by polylysine: drug release study. // J. Control. Release.- 2007.- V. 117, № 1.- P. 111-120.

66. Bordi F., Cametti C., Diociaiuti M., Sennato S. / Large equilibrium clusters in low-density aqueous suspensions of polyelectrolyte-liposome complexes: A phenomenological model // Phys. Rev. E.- 2005.- V. 71, № 5.

67. Wytrwal M., Bednar J., Nowakowska M., Wydro P., Kepczynski M. / Interactions of serum with polyelectrolyte-stabilized liposomes: Cryo-TEM studies. // Colloids Surf. B. Biointerfaces.- 2014.- V. 120C.- P. 152-159.

68. Volodkin D., Ball V., Schaaf P., Voegel J.-C., Mohwald H. / Complexation of phosphocholine liposomes with polylysine. Stabilization by surface coverage versus aggregation. // Biochim. Biophys. Acta.- 2007.- V. 1768, № 2.- P. 280-290.

69. Kuvichkin V. V, Danev R.S., Shigematsu H., Nagayama K. / DNA-induced aggregation and fusion of phosphatidylcholine liposomes in the presence of multivalent cations observed by the cryo-TEM technique. // J. Membr. Biol.- 2009.- V. 227, № 2.- P. 95-103.

70. Yasuhara K., Tsukamoto M., Tsuji Y., Kikuchi J. / Unique concentration dependence on the fusion of anionic liposomes induced by polyethyleneimine // Colloids Surfaces A Physicochem. Eng. Asp.- 2012.- V. 415.- P. 461-467.

71. Blumenthal R., Clague M.J., Durell S.R., Epand R.M. / Membrane Fusion // Chem. Rev-2003.- V. 103.- P. 53-69.

72. Singer S.J., Nicolson G.L. / The Fluid Mosaic Model of the Structure of Cell Memebranes // Science (80-. ).- 1972.- V. 175.- P. 720-731.

73. Edidin M. / Lipids on the frontier: a century of cell-membrane bilayers // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.- 2003.- V. 4.- P. 414-418.

74. Macdonald P.M., Crowell K.J., Franzin C.M., Mitrakos P., Semchyschyn D.J. / Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective // Biochem. Cell Biol.- 1998.- V. 76, № 2-3.- P. 452-464.

75. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A. / What happens to negatively charged lipid vesicles upon interacting with polycation species? // J. Control. Release.- 2002.- V. 78, № 1-3.- P. 267-271.

76. Sathi A., Viswanad V., Aneesh T.P., Kumar B.A. / Pros and cons of phospholipid asymmetry in erythrocytes // J. Pharm. Bioallied Sci.- 2014.- V. 6, № 2.- P. 81-86.

77. Balasubramanian K., Schroit A.J. / Aminophospholipid asymmetry: A matter of life and death. // Annu. Rev. Physiol.- 2003.- V. 65.- P. 701-734.

78. Gurtovenko A. a, Vattulainen I. / Molecular mechanism for lipid flip-flops. // J. Phys. Chem. B.- 2007.- V. 111, № 48.- P. 13554-13559.

79. Yaroslavov A.A., Melik-Nubarov N.S., Menger F.M. / Polymer-induced flip-flop in biomembranes. // Acc. Chem. Res.- 2006.- V. 39, № 10.- P. 702-710.

80. Caracciolo G. / Liposome-protein corona in a physiological environment: Challenges and opportunities for targeted delivery of nanomedicines. // Nanomedicine.- 2015.- V. 11, № 3.- P. 543-557.

81. Monopoli M.P., Bombelli F.B., Dawson K.A. / Nanobiotechnology: Nanoparticle coronas take shape // Nat. Nanotechnol.- 2011.- V. 6, № 1.- P. 11-12.

82. Lundqvist M., Stigler J., Elia G., Lynch I., Cedervall T., Dawson K.A. / Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 2008.- V. 105, № 38.- P. 14265-14270.

83. Yaroslavov A.A., Sybachin A. V, Kesselman E., Schmidt J., Talmon Y., Rizvi S.A.A., Menger F.M. / Liposome fusion rates depend upon the conformation of polycation catalysts. // J. Am. Chem. Soc.- 2011.- V. 133, № 9.- P. 2881-2883.

84. Meier M., Seelig J. / Thermodynamics of the coil <==> beta-sheet transition in a membrane environment. // J. Mol. Biol.- 2007.- V. 369, № 1.- P. 277-289.

85. Fischer D., Li Y., Ahlemeyer B., Krieglstein J., Kissel T. / In vitro cytotoxicity testing of polycations: influence of polymer structure on cell viability and hemolysis // Biomaterials.-2003.- V. 24, № 7.- P. 1121-1131.

86. Chen J.-L., Wang H., Gao J.-Q., Chen H.-L., Liang W.-Q. / Liposomes modified with polycation used for gene delivery: preparation, characterization and transfection in vitro. // Int. J. Pharm.- 2007.- V. 343, № 1-2.- P. 255-261.

87. Bauer M., Kristensen B.W., Meyer M., Gasser T., Widmer H.R., Zimmer J., Ueffing M., Al E.T. / Toxic Effects of Lipid-Mediated Gene Transfer in Ventral Mesencephalic Explant Cultures // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol.- 2006.- V. 98.- P. 395-400.

88. Ko Y.T., Bhattacharya R., Bickel U. / Liposome encapsulated polyethylenimine / ODN polyplexes for brain targeting // J. Control. Release.- 2009.- V. 133, № 3.- P. 230-237.

89. Marie E., Sagan S., Cribier S., Tribet C. / Amphiphilic macromolecules on cell membranes: from protective layers to controlled permeabilization. // J. Membr. Biol.- 2014.- V. 247, № 910.- P. 861-881.

90. Kundu S.K., Sharma A.R., Lee S.-S., Sharma G., Doss C.G.P., Yagihara S., Kim D.-Y., Nam J-S., Chakraborty C. / Recent trends of polymer mediated liposomal gene delivery system. // Biomed Res. Int.- 2014.

91. Pelton R. / Temperature-sensitive aqueous microgels // Adv. Colloid Interface Sci.- 2000.- V. 85, № 1.- P. 1-33.

92. Sigolaeva L. V, Gladyr S.Y., Gelissen A.P.H., Mergel O., Pergushov D. V, Kurochkin I.N., Plamper F. a, Richtering W. / Dual-stimuli-sensitive microgels as a tool for stimulated

spongelike adsorption of biomaterials for biosensor applications. // Biomacromolecules.-2014.- V. 15, № 10.- P. 3735-3745.

93. Gokmen M.T., Prez F.E. Du. / Progress in Polymer Science Porous polymer particles — A comprehensive guide to synthesis , characterization , functionalization and applications // Prog. Polym. Sci.- Elsevier Ltd, 2012.- V. 37, № 3.- P. 365-405.

94. MacKinnon N. G.G., Liu B. G.C., Rubinstein J.L. M.P.M. / Triggered instability of liposomes bound to hydrophobically modified core-shell PNIPAM hydrogel beads // Langmuir.- 2010.-V. 26, № 2.- P. 1081-1089.

95. Medeiros S.F., Oliveira P.F.M., Silva T.M., Lara B.R., Elaissari A., Santos A.M. / Biocompatible and multi-responsive poly(N-vinylcaprolactam)-based microgels: The role of acidic comonomers in the colloidal properties and phase transition as a function of temperature and pH // Eur. Polym. J.- Pergamon, 2015.- V. 73.- P. 191-201.

96. Schacher F., Betthausen E., Walther A., Schmalz H., Pergushov D. V, Mu A H E. / Interpolyelectrolyte Complexes of Dynamic Multicompartment Micelles // ACS Nano.- 2009.-V. 3, № 8.- P. 2095-2102.

97. Ivashkov O.V., Sybachin A.V., Efimova A.A., Pergushov D.V., Orlov V.N., Schmalz H., Yaroslavov A.A. / The Influence of the Chain Length of Polycations on their Complexation with Anionic Liposomes // ChemPhysChem.- 2015.- V. 16, № 13.

98. Krause R., Maier E.E., Deggelmann M., Hagenbüchle M., Schulz S.F., Weber R. / Static Light Scattering By Solutions Of Salt-Free Polyelectrolytes // Physica A.- 1989.- V. 160.- P. 135147.

99. Lehtonen J.Y.A., Kinnunen P.K.J. / Polyethylene Glycol)-Induced and Temperature-Dependent Phase Separation in Fluid Binary Phospholipid Membranes // Biophys. J.- 1995.- V. 68.- P. 525-535.

100. Toyoda C., Suzuki Y., Tsuneyama H., Onodera T., Masuno A., Yabe R., Ogasawara K., Okuda M., Nakajima K., Uchikawa M. / Production of human monoclonal anti-Jk3, recognising an epitope including the Jk(a) /Jk(b) polymorphic site of the Kidd glycoprotein. // Off. J. Br. Blood Transfus. Soc.- 2014.- V. 24.- P. 286-291.

101. Демина О.П. / Синтез полинитроароматических производных полиэтиленгликоля.-Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова, 1979.

102. Ivashkov O.V., Sybachin A.V., Efimova A.A., Orlov V.N., Pergushov D.V., Schmalz H., Yaroslavov A.A. / Composition and properties of complexes between anionic liposomes and diblock copolymers with cationic and poly(ethylene oxide) blocks // Polym. Int.- 2017.- V. 66, № 11.

103. Sigolaeva L. V., Mergel O., Evtushenko E.G., Gladyr S.Y., Gelissen A.P.H., Pergushov D. V., Kurochkin I.N., Plamper F.A., Richtering W. / Engineering Systems with Spatially Separated Enzymes via Dual-Stimuli-Sensitive Properties of Microgels // Langmuir.- 2015.- V. 31, № 47.- P. 13029-13039.

104. Halperin A., Kröger M., Winnik F.M. / Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research // Angew. Chemie - Int. Ed.- 2015.- V. 54, № 51.- P. 15342-15367.

105. Futscher M.H., Philipp M., Müller-Buschbaum P., Schulte A. / The Role of Backbone Hydration of Poly(N-isopropyl acrylamide) Across the Volume Phase Transition Compared to its Monomer // Sci. Rep.- 2017.- V. 7, № 1.- P. 1-10.

106. Daly E., Saunders B.R. / Temperature-dependent electrophoretic mobility and hydrodynamic radius measurements of poly(N-isopropylacrylamide) microgel particles: Structural insights // Phys. Chem. Chem. Phys.- 2000.- V. 2, № 14.- P. 3187-3193.

107. Karg M., Prévost S., Brandt A., Wallacher D., Klitzing R. Von, Hellweg T. / Intelligent Hydrogels // Intell. Hydrogels.- 2014.

108. Ma X., Huang X., Zhu L., Zhao X., Tang X. / Influence of ethyl methacrylate content on the volume-phase transition of temperature-sensitive poly[(N-isopropylacrylamide)-co-(ethyl methacrylate)] microgels // Polym. Int.- 2005.- V. 54, № 1.- P. 83-89.

109. Ivashkov O. V., Yakimova T.M., Evtushenko E.G., Gelissen A.P.H., Plamper F.A., Richtering W., Yaroslavov A.A. / On the mechanism of payload release from liposomes bound to temperature-sensitive microgel particles // Colloids Surfaces A Physicochem. Eng. Asp.-Elsevier, 2019.- V. 570, № February.- P. 396-402.

110. Sugiyama M., Matsuura M., Takeuchi Y., Kosaka J., Nango M., Oku N. / Possible mechanism of polycation liposome (PCL)-mediated gene transfer // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr.-2004.- V. 1660, № 1-2.- P. 24-30.

111. Bordi F., Cametti C., Gili T., Gaudino D., Sennato S. / Time evolution of the formation of different size cationic liposome-polyelectrolyte complexes // Bioelectrochemistry.- 2003.- V. 59, № 1-2.- P. 99-106.

112. Billard A., Pourchet L., Malaise S., Alcouffe P., Montembault A., Ladavière C. / Liposome-loaded chitosan physical hydrogel: toward a promising delayed-release biosystem. // Carbohydr. Polym.- Elsevier Ltd., 2015.- V. 115.- P. 651-657.

113. Kazakov S., Levon K. / Liposome-Nanogel Structures for Future Pharmaceutical Applications // Curr. Pharm. Des.- 2006.- V. 12, № 36.- P. 4713-4728.

114. De Geest B.G., Stubbe B.G., Jonas A.M., Van Thienen T., Hinrichs W.L.J., Demeester J., De Smedt S.C. / Self-exploding lipid-coated microgels // Biomacromolecules.- 2006.- V. 7, № 1.-

P. 373-379.

115. Saleem Q., Liu B., Gradinaru C.C., MacDonald P.M. / Lipogels: Single-lipid-bilayer-enclosed hydrogel spheres // Biomacromolecules.- 2011.- V. 12, № 6.- P. 2364-2374.

116. Saleem Q., Zhang Z., Gradinaru C.C., MacDonald P.M. / Liposome-coated hydrogel spheres: Delivery vehicles with tandem release from distinct compartments // Langmuir.- 2013.- V. 29, № 47.- P. 14603-14612.

117. Yaroslavov A.A., Panova I.G., Sybachin A.V., Spiridonov V.V., Zezin A., Mergel O., Gelissen A., Tiwari R., Plamper F., Richtering W., Menger F. / Payload release by liposome burst: Thermal collapse of microgels induces satellite destruction // Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med.- Elsevier Inc., 2017.- V. 13, № 4.- P. 1491-1494.