Рассеяние ультракоротких лазерных импульсов многоатомными молекулярными структурами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Харламова Анастасия Александровна

• Харламова Анастасия Александровна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Харламова Анастасия Александровна

3.7 Удлинение ДНК

3.8 Метод симметрий

3.9 Выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Научное понимание материи зависит от способности современной науки определять строение вещества на атомном уровне. Особенно это важно для исследования молекулярных объектов, т.к её структура и функция тесно связаны, что является основным принципом структурной биологии и биофизики.

Один из ключевых методов исследования сложных молекулярных структур — метод рентгеноструктурного анализа (РСА) [1]. В настоящее время РСА — это не только хорошо зарекомендовавший себя способ исследования структуры вещества, но и метод, который постоянно развивается в связи с появлением новых источников рентгеновского излучения. Научно-технический прогресс дал ученым новые инструменты для исследования структуры вещества и это требует расширения РСА. Результатом этого процесса за последние десятилетия стали новые способы использования рентгеновской дифракции и появление новых направлений исследования, например, фемтосекундная кристаллография и т.д.[2-4].

Впервые эффекты рассеяния были рассмотрены Ч.Г.Дарвином в 1914 году на основе модели Брэгга [5-7]. Идея волнового поля как результата сложения всех волн, рассеянных на атомах в веществе, была выдвинута в 1917 г. П.Эвальдом [8], а в 1931 г. М.Лауэ предложил принципиально новый подход, создав основы в теории рассеяния рентгеновских лучей.

Практическое применение РСА — анализ дифракционной картины при рассеянии излучения на веществе и определение структуры этого вещества. В результате получается функция распределения электронной плотности, выполнив преобразование Фурье которой, можно найти координаты атомов исследуемого материала.

Основная характеристика, связанная с электронной плотностью — дифференциальная вероятность рассеяния

где (Ре/(О — дифференциальная вероятность рассеяния на свободном электроне (рассеяние Томсона), р — импульс, переданный электрону при рассеянии света (иначе р = 2п/А(п — п0) — вектор рассеяния, где п — направление рассеянного излучения, п0 — направление первичного излучения), О — телесный угол, в который происходит рассеяние. Выражение (1) применяется как для непрерывных источников рентгеновского излучения, так и для уль-

2

(1)

тракоротких.

Ультракороткие лазерные импульсы (УКИ) — это перспективный источник рентгеновского излучения. В последние годы появляется все больше технических возможностей, позволяющих генерировать ультракороткие импульсы контролируемых характеристик [9-19], например Европейский рентгеновский лазер на свободных электронах (XFEL)(Германия), Линейный ускоритель когерентного источника света ^^Б)(США), Free Electron laser Radiation for Multidisciplinary Investigations (FERMI)(Италия). Использование УКИ перспективно в следующих направлениях развития науки:

-изучение электронной динамики в отделительных атомах и молекулах; -измерение быстропротекающих процессов; -исследование физико-химических реакций; -исследование внутримолекулярных процессов; -анализ строения сложных макромолекул.

Классические источники рентгеновского излучения позволяют исследовать кристаллические структуры, атомы в которых периодичны и симметричны. Но не все вещества поддаются кристаллизации [20]. Порядка 40 % белков не кристаллизуются. Молекулярные соединения сложно кристаллизовать так, чтобы получить качественный образец для исследования. Хорошо известно, что при использовании УКИ и метода зонд-накачка (pump-probe) проблема кристаллизации не возникает. Кроме того, молекулярные соединения отличаются «подвижностью» в отличие от многих других материалов. Это значит, что в молекулах и белках во время выполнения анализа продолжают протекать различные физико-химические процессы, такие как образование и перестройка химических связей, внутриатомные и молекулярные процессы и др [21, 22]. УКИ позволяет исследовать такие объекты исключая влияние происходящих в них атомных перестроек, так как время импульса сравнимо или меньше времени подобных химических реакций. Ведутся разработки в направлении анализа динамических процессов в биомолекулах, когда наблюдение происходит в реальном времени, а результатом является «атомно-молекулярный фильм»[23-26]. Подобные исследования могут дать новое знание об образовании и разрыве связей в молекулах, миграции зарядов в биологических системах и т.д.

Для описания рассеяния ультракороткого импульса на нестационарной системе выражения (1) недостаточно. Классически дифракция рентгеновских лучей описывается как падение плоской непрерывной волны, но, когда рассматривается излучение, длительность которого меньше характерного вре-

менного масштаба системы, на которую он падает, используется выражение (2).

(Р (Ре

/

р (г, г) е""£т ,

(2)

(г (г

Это выражение учитывает электронную плотность в заданный момент времени Ь. Но стоит отметить, что использование мгновенной плотности не способно учесть всю специфику рассеяния УКИ. Сверхбыстрое рассеяние может изменять отображаемый волновой пакет, что внесет неточности в результат дифракции.

Данная работа направлена на развитие теории рассеяния УКИ на сложных многоатомных молекулярных структурах. Исследуются молекулы ДНК различных конформаций и состояний как одно из наиболее интересных молекулярных соединений, методы анализа которой, на сегодняшний день, не всегда позволяют исследовать ее структуру на атомном уровне. Полученные результаты расширяют возможности современных методов исследования макромолекул с помощью УКИ, а также развивают метод РСА. Проведенные расчеты показали, что использование выражений (1) и (2) дают неточности и ошибки в получаемых дифракционных картинах. Таким образом, актуальность данной работы высока, и полученные в данной диссертации результаты могут быть использованы в РСА с использованием источников УКИ.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Развить теорию рассеяния ультракортких рентгеновских импульсов на многоатомных молекулярных системах, преимущественно молекулах ДНК и РНК, где основную роль играют параметры межатомного расстояния и длительности импульса. Полученные результаты должны иметь аналитическую форму и быть простыми для использования РСА.

1. Развить аналитическую теорию рассеяния ультракоротких рентгеновских импульсов на многоатомных молекулярных системах. Показать, при каких условиях развитая теория переходит в ранее известную и определить, при каких условиях необходимо применять развитую теорию.

2. Найти спектры рассеяния УКИ от нуклеотидов ДНК и РНК (аденин, тимин, цитозин, гуанин) и показать, каким образом спектры рассеяния зависят от длительности импульса и от межатомного расстояния рассматриваемой молекулы.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

3. Найти спектры рассеяния УКИ от тринуклеотидов ДНК и РНК (ООО, ООО, ОАО, ОиО) и показать, каким образом спектры рассеяния зависят от длительности импульса и от межатомного расстояния рассматриваемой молекулы.

4. Показать, что при рассеянии аттосекундных импульсов от точечных мутаций молекулы ДНК, в структуре которой есть изгибы, и срезы необходимо использовать развитую теорию рассеяния УКИ.

5. Показать, что при рассеянии аттосекундных импульсов на биомолекулах параметры длительность импульса и межатомное расстояние рассматриваемой молекулы являются важной характеристикой, и их необходимо учитывать при анализе дифракционной картины для определении структуры вещества.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Развита аналитическая теория рассеяния ультракоротких рентгеновских импульсов на многоатомных молекулярных системах с учетом длительности падающего импульса и межатомного расстояния, рассматриваемой молекулы.

2. Показано, что развитая теория рассеяния ультракоротких рентгеновских импульсов на многоатомных молекулярных системах является более общей и при больших длительностях УКИ переходит в ранее известную теорию рассеяния монохроматического рентгеновского излучения.

3. Найдены спектры рассеяния УКИ от нуклеотидов ДНК и РНК (аденин, тимин, цитозин, гуанин), а также от тринуклеотидов (ООО, ООО, ОАО, ОИО) и показано, что для аттосекундных импульсов эти спектры могут существенно отличаться от спектров ранее известной теории рассеяния.

4. Показано, что при рассеянии аттосекундных импульсов от точечных мутаций молекулы ДНК, в структуре которой есть изгибы и срезы, спектры рассеяния существенно отличаются от спектров в ранее известной теории рассеяния.

5. Установлено, что при рассеянии аттосекундных импульсов на биомолекулах параметры длительность импульса и межатомное расстояние рассматриваемой молекулы являются важной характеристикой, и их необходимо учитывать в рентгеноструктурном анализе вещества.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Развита аналитическая теория рассеяния рентгеновских УКИ на многоатомных молекулярных системах с учетом длительности падающего импульса. Данная теория учитывает параметр длительности импульса и при рассеянии на определенных структурах может давать большой вклад. Показано, что при рассеянии аттосекундных импульсов на структурах ДНК и РНК параметр длительности импульса дает большой вклад и спектры рассеяния сильно отличаются от ранее известной теории. Данная диссертация имеет не только теоретическую значимость, но и практическую. Развитая теория может быть использована в ренгеноструктурном анализе сверхвысокого разрешения для исследования молекул ДНК и РНК. Использование развитой теории позволит более точно определять структуру и мутации исследуемых молекул. Для исследования таких структур в настоящее время существуют рентгеновские лазеры на свободных электронах (ХРЕЬ), которые могут генерировать УКИ, используемые в работе.

Достоверность и научная обоснованность полученных результатов и выводов обеспечивается надёжностью применяемых методов расчёта, тщательным тестированием применяемых алгоритмов и программ, а также сравнением с результатами расчётов других авторов и совпадением представленной в диссертации теории с ранее известными теориями в случае импульса большой длительности.

Методология и методы исследований диссертационной работы — известные приближения квантовой физики и квантовой электродинамики: приближение внезапных возмущений, теория возмущний, метод вторичного квантования в применении к теории излучения. Кроме того, в диссертационной работе использовались модельные методы, основанные на точном решении уравнения Шредингера. Также, некоторые численные расчёты проводились, используя язык программирования С++, пакет МЛТЫЕМЛТ1СЛ и программу Луо§а^о.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Аналитическая теория рассеяния рентгеновских УКИ на многоатомных молекулярных системах, с учетом конечной длительности падающего импульса, которая является более общей по сравнению с ранее известной теорией рассеяния.

2. Спектры рассеяния УКИ от нуклеотидов ДНК и РНК (аденин, тимин, цитозин, гуанин), а также от тринуклеотидов (CCG, CGG, CAG, CUG) для аттосекундных импульсов, которые могут существенно отличаться от спектров ранее известной теории рассеяния.

3. Спектры рассеяния аттосекундных импульсов от точечных мутаций молекулы ДНК, в структуре которой есть изгибы и срезы, которые могут существенно отличаются от спектров в ранее известной теории рассеяния.

4. Условия отличия развитой теории от ранее известной теории рассеяния в случае монохроматического рентгеновского излучения.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты исследований были представлены на 11 конференциях и опубликованы в сборниках конференций: VII Международная молодежная научная конференция, посвященная 100-летию Уральского федерального университета, Екатеринбург ФТИ, 18-22 мая 2020 г.; Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2020» XXVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва, МГУ, 10-27 ноября 2020 г.; XV International Scientific and Technical Conference «Actual Problems Of Electronic Instrument Engineering», НГТУ, Новосибирск, 19-21 ноября 2021 г.; VIII Международная молодежная научная конференция. ФИЗИКА. ТЕХНОЛОГИИ. ИННОВАЦИИ. ФТИ-2021, 17-21 мая 2021, Екатеринбург; 9-я Школа-конференция «SPb0PEN2022», Санкт-Петербург, ВШЭ, 2427 мая 2022 г.; 2nd International Conference «Problems of Informatics, Electronics and Radio Engineering (PIERE)», Новосибирск, НГТУ, 11-13 ноября 2022 г.; IX International Conference on Information Technology and Nanotechnology (ITNT-2023), 17-21 апреля 2023 г.; IEEE APEIE 2023. IEEE XVI International Scientific and Technical Conference «Actual Problems of Electronic Instrument Engineering» (APEIE), Новосибирск, НГТУ, 10-12 ноября 2023 г.; XXVII International Scientific Conference of Young Scientists and Specialists (AYSS-2023), ОИЯИ, Дубна, 30 октября - 3 ноября 2023 г.; IEEE CSGB IEEE Ural-Siberian Conference on Computational Technologies in Cognitive Science, Genomics and Biomedicine (CSGB), 29-30 сентября 2023 г.; 10-я Школа-конференция «SPb0PEN2023», Санкт-Петербург, ВШЭ, 23-26 мая 2023 г.;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рассеяние ультракоротких лазерных импульсов многоатомными молекулярными структурами»

ПРОЕКТНАЯ РАБОТА

Работа выполнялась в рамках плановых научно-исследовательских работ кафедры фундаментальной и прикладной физики ФГАОУ ВО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова». Работа выполнена в рамках проектов, где автор диссертации был исполнителем или основным исполнителем — Российский Научный Фонд (РНФ), № 20-72-10151, 2020-2023 г.; Грант Президента РФ № МД-4260.2021.1.2, 2021-2022 г.; Госзадание проект № FSRU-2020-0005, FSRU-2021-0008 ; Российский Научный Фонд (РНФ), № 23-12-20014, 2023 г.

ПУБЛИКАЦИИ

В результате проведенных исследований было опубликовано 12 печатных работ, 12 из которых индексируемые в базах Web of Science/Scopus и входящие в перечень ВАК, 4 из которых входят в первый квартиль (Q1): International Journal of Molecular Sciences — 3 публикация, Scientific Reports — 1 публикации и 1 в третий квартиль (Q3): Journal of Biomedical Photonics and Engineering.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Научным руководителем и основными авторами совместных статей ставились задачи по расчетам исследуемых физических величин (спектров рассеяния). Харламовой А.А. эти задачи выполнялись. Также проводились необходимые выкладки и проверки исследуемых величин, с последующим их расчетом в программе Wolfram Mathematica. Автором были самостоятельно проведены расчеты спектров рассеяния УКИ на различных моделях ДНК, азотистых основаниях, тринуклеотидах, нике ДНК.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка использованных источников. Диссертация изложена на 105 страницах, содержит 59 рисунков. Список литературы диссертации включает 136 источников.

1 СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР

В этом обзоре рассмотрены различные методы математической обработки результатов рентгеноструктурного анализа (РСА), отмечены их достоинства и недостатки, описаны проблемы расшифровки данных при исследовании сложных молекулярных структур ультракороткими лазерными импульсами (УКИ), представлены современные эксперименты с различнымих биологиче-скимих объектами.

1.1 РСА: Проблемы и существующие способы анализа

Использование РСА для исследования структуры сложных биологических объектов началось с работы 1935 г. физика А.Паттерсона [27]. Одна из основных проблем РСА — обратное преобразование функции электронной плотности, где фаза неизменно теряется. Паттерсон предложил способ определения координат без использования информации о фазе. Он ввел функцию, зависящую от квадратов модулей амплитуд. Максимумы функции показывают величину межатомных расстояний.

Методы прямого определения фаз продолжили Д.Харкер и Д.Каспер в 1947 г. [28], связав элементы симметрии образца и структурные амплитуды. Полученные неравенства позволяли определять фазу. В 1950 г. этот подход в решении проблемы был развит методом детерминантов. Тогда же А.Вильсон предложил статистический способ обработки, основанный на вероятностных соотношениях между амплитудами. В 1952 г. Д.Сейер, В.Кокрен и В.Захариа-сен описали подход связи амплитуд, введя условие положительной электронной плоскости и модели кристалла как тела, состоящего из сферических симметричных не перекрывающих друг друга атомов. В 1953 Д.Карл и Г.Хауптман разработали прямой метод, использующий вероятностный подход [29-30].

Однако, для исследования сложных биологических объектов данных методов недостаточно. Многие молекулы не укладываются в модель симметричного тела с идеальным расположением атомов. Хаотичность и несимметричное положение атомов затрудняют анализ. Кроме того, метод не работает на системах, состоящих из атомов с близкими атомными номерами. Широкое применение РСА в структурной биологии началось с работ М.Перуца 1953 г., который усовершенствовал метод прямого определения фаз и впервые расшифровал молекулу гемоглобина [31-33]. М.Перуц предложил способ

фазировки дифрагированных рентгеновских лучей путем сравнения кристалла белка с тяжелым атомом с белком без него.

Сейчас этот метод широко применяется и называется методом тяжелого атома, или изоморфного замещения. Однако, недостатком данного подхода является невозможность включения тяжелого атома в некоторые молекулярные структуры такие как РНК и ДНК. В кристаллизованной молекуле должны быть «пустоты», т.е свободное пространство, где возможно разместить тяжелый атом-метку. Метод широко применяется в кристаллах белка, т.к до 70 % в них занимает растворитель, но для макромолекул внедрение метки затруднительно. Тем не менее, метод М.Перуца получил дальнейшее развитие.

Следующим способом РСА стало использование эффекта аномального рассеяния. Длина волны падающего излучения подбирается таким образом, чтобы наблюдался эффект резонанса и, как следствие, «аномальное рассеяние» на некоторых атомах. В случае, когда в образце таких атомов нет, задача возвращается к той же проблеме, что и в изоморфном замещении.

Попыткой решить данную проблему стал метод молекулярного замещения. В этом случае для определения фазы взаимодействия излучения с неизвестным объектом берется информация о фазе из рассеяния на образце с известной структурой. Объекты подбирают так, чтобы их структуры были схожи.

Такой способ основывается на компьютерном моделировании объекта, т.к. на практике расположить два образца в одних координатах невозможно. Такое молекулярное замещение нашло широкое применение при расшифровке рассеяния ультракороткого лазерного импульса (УКИ). Экспериментально полученные дифракционные картины, сравниваются с компьютерной моделью, которая должна отображать все известные данные об исследуемом объекте или схожем с ним. На сегодняшний день требуются новые подходы создания таких моделей на сложных многоатомных структурах для дальнейшего применения РСА с использованием УКИ. Это позволило бы уточнять структуру известных молекулярных объектов, расшифровывать их различные состояния на атомном уровне. В данной работе теоретически будут рассмотрены такие модели для использования их в анализе дифракционных картин, полученных от УКИ.

1.2 Использование УКИ при исследовании биологических объектов

Существует несколько способов использования УКИ в опытах с молекулами (рисунок 1). Первый не имеет особенностей и применяется как для анализа кристаллизованных молекул, так и для других веществ — это метод «накачки-зонда» или «возбуждения-измерения». Пучок лазера делят на два. Первый пучок-накачки, или возбуждения, начинает генерацию импульса. В этот момент происходит воздействие излучения на объект. Второй пучок детектирует импульс, поэтому называется зондирующим. Измерение происходит за счет изменения зондирующего импульса. Важна когерентность обоих пучков, которые связаны по фазе. Эта связь позволяет взаимодействовать двум импульсам между собой на одних и тех же участках. Взаимодействие происходит в детекторе, и здесь зондирующий импульс всегда попадает на один и тот же участок импульса накачки. Для регистрации разных участков импульса вносят задержки. В результате, меняя интервалы временных задержек, получают осциллограмму, которую преобразуют методом Фурье. Такой способ получил название — кристаллография с временным разрешенияем.

Рисунок 1. Концепция работы лазера при исследовании молекулярных объектов. Источник [65].

Так как большая часть молекулярных структур не поддается качествен-

ной кристаллизации, для работы с ними разработаны другие способы исследования. В некоторых случаях образец устанавливается на поддерживающую мембрану из нитрида кремния. Недостаток такого измерения заключается в большой доле фонового рассеяния от подложки. Если число атомов подложки намного больше количества атомов самого образца, то фон доминирует над измеряющим сигналом. Для случаев ДНК и РНК, состоящих из большого набора атомов, такой способ подходит, но для одиночных изолированных молекул нет, поэтому была разработана и введена в эксплуатацию система обработки образцов без поддерживающих мембран. В этом случае пучок частиц вводится в рентгеновский пучок газодинамическим распылителем (рисунок 2).

Рисунок 2. Концепция работы лазера, сканирующего впрыскиваемый аэрозоль. Источник [63].

Схема экспериментальной установки, работающей с некристаллизованны-ми одиночными и многоатомными молекулами, выглядит иначе. Импульсы, подающиеся лазером, проходят через апертуру и фокусируются в пятно (порядка 20 мкм). Величина фокусировки определяет область взаимодействия. Генерируемый аэрозоль подается аэродинамическим устройством. Лазерные лучи, дифрагированные при взаимодействии с молекулой, отражаются от градиентного многослойного планарного зеркала на чувствительную рентгеновскую матрицу, при этом прямой луч проходит через отверстие в центре зеркала. Для случая макромолекулы в пучке размещается подложку с

образцом. В результате измерения получается дифракционную картину взаимодействия излучения с молекулой.

Для исследования динамических процессов, например, перестройки атомов или других жизненных процессов молекулы используется метод многомерной спектроскопии. В этом случае применяется многомерная оптическая спектроскопия, которая использует сверхбыстрые импульсы. Различные динамические процессы исследуются при помощи различных частот. Если есть внутримолекулярные колебания, вызванные каким-либо процессом, то облучение даст ангармонические отклики, которые фиксируются в получаемых спектрах. Последовательность работы при многомерной спектроскопии выглядит следующим образом:

- первый импульс переводит систему в когерентное состояние;

- второй импульск переводит систему в возбужденное состояние;

- третий импульс переводит систему снова в когерентное состояние, при этом испускается импульс.

Далее строится спектр, который преобразуют методом Фурье. Фиксируются задержки по времени между первым и вторым импульсами и между вторым и третьим. Многомерная спектроскопия использует видимый и инфракрасный диапозоны. Кроме того, фемтосекундные лазеры применяются в следующих видах исследований:

- дифракционная визуализация электронов;

- микроскопия по Керру;

- визуализация сверхбыстрыми электронными импульсами;

- терагерцовая визуализация.

Актуальность данных методов состоит в их неинвазивности. Дифракционная визуализация электронов, или метод лазерно-индуцированной электронной дифракции, представляяет собой визуализацию сверхбыстрой динамики малых молекул с помощью фемтосекундных лазеров среднего инфракрасного диапазона. Когда молекулы впрыскиваются в интенсивное лазерное поле, генерируются фотоэлектроны как низкой, так и высокой энергии. Согласно количественной теории перерассеяния, электроны высокой энергии образуются в процессе повторного рассеяния, при котором электроны, рожденные на ранней фазе лазерного импульса, возвращаются обратно для перерассеяния на исходном ионе. По импульсу электрона высокой энергии в спектре можно извлечь дифференциальные сечения упругого электрон-ионного рассеяния без поля или дифракционные изображения. Эксперименты показывают, что метод может использоваться для выделения положений атомов в

молекуле с пространственным разрешением ниже ангстрема по аналогии со стандартным методом дифракции электронов с использованием лазеров средней инфракрасной области в качестве управляющих импульсов. Поскольку инфракрасные лазеры с длительностью импульса порядка от единиц до десятков фемтосекунд уже доступны, то дифракционную визуализацию можно использовать для визуализации динамики молекул с пространственным разрешением в доли ангстрема и временным разрешением в несколько фем-тосекунд. Первый эксперимент показал, что длина связи молекул кислорода сокращается на 0,1 А за пять фемтосекунд после однократной ионизации. Микроскопия по Керру — это микроскоп с Керр-стробированием (рисунок 3), способный собирать ограниченные дифракцией 2Э-флуоресцентные изображения с разрешением 100 фемтосекунд по времени. Концепция основана на установке твердотельного оптического затвора Керра в широкопольный микроскоп. В дополнение к значительно улучшенному временному разрешению широкополосная конструкция позволяет одновременно отслеживать несколько объектов и получать сверхбыструю флуоресцентную визуализацию легированных и гетерогенных поверхностей в течение всего срока службы.

бэипд ри!$о (800 пт.1 ре. 45')

а. Лиоге&свпсв

Рисунок 3. Схема Керр-стробирования. Источник: Л. Кабо-Фернанде. СЬеш. РЬуэ., 2019, 21, 23833-23842.

Другой метод — визуализация изолированных молекул в трех измерениях с атомным разрешением — важен для выяснения сложных молекулярных структур и промежуточных состояний в молекулярной динамике. Эта цель до сих пор оставалась недостижимой из-за случайной ориентации молекул в газовой фазе. На сегодняшний день некоторые работы показывают, что трехмерная структурная информация может быть получена из нескольких электронных дифрактограмм выровненных молекул. Молекулы импульсно выравниваются фемтосекундным лазерным импульсом и исследуются фем-тосекундным электронным импульсом через две пикосекунды, когда степень выравнивания достигает максимума (рисунок 4).

Рисунок 4. Таргецовая микроскопия. Источник: К.Хенсли, LETT., 2012, 109.

Таргецовая микроскопия интересна для исследования функциональных состояний белков.

Структурные колебания белков влияют на биологию, переводя структуру в функциональные промежуточные состояния, усиливая процессы туннели-рования и оптимизируя передачу энергии. Сильное поглощение воды и широкая непрерывная плотность колебательных состояний помешали оптической идентификации этих колебаний. Однако этот метод требует сложного позиционирования образца и длительного времени измерения. Сегодня ученые решают эту проблему, предлагая различные упрощения для сокращения времени сбора данных. Таргецовая микроскопию с изменяющейся поляризацией и анизотропией, показывает чувствительность к связыванию ингибиторов и уникальные колебательные спектры для нескольких белков и G-квадруплекса

РНК. Чувствительность метода к анизотропному поглощению и двулучепре-ломлению обеспечивает быструю оценку динамики макромолекул, влияющих на биологию.

УКИ для анализа биологических объектов решает сразу несколько проблем. Кристаллизация образца не нужна, как уже было сказано выше, способы расположения молекулы в лазерном пучке позволяют исследовать живые формы белков и биомолекул. Время анализа меньше или сравнимо с временным масштабом химических реакций в образцах, что дает возможность снять снимок структуры в момент времени, без погрешности, возникшей за счет внутренних перестроек. В идеальном случае время воздействия так мало, что объект исследования не успевает разрушиться или видоизмениться под воздействием импульса. В результате получается изображение «дифракции перед разрушением». Во время исследования очень много копий молекулы подвергаются взаимодействию с фемтосекундными импульсами. Каждый импульс дает сверхъяркий сигнал, по которому далее восстанавливается структура молекулы. Получение качественной дифракционной картины зависит от того, насколько последовательно генерируется импульс, насколько точна его фокусировка на область с образцом, от способа и качества введения молекулы в поле фокуса импульса, позиционирования биомолекулы, как точности регистрации дифрагированных сигналов соотношения сигнал-шум. На сегодняшний день уже решены многие проблемы биохимии блгодаря фемто-секунной спектроскопии. Большой проблемой были и остаются сверхбыстрые процессы. Их изучение важно для понимания свойств вещества, но их изучение затруднено. Тем не менее, такие процессы часто встречаются в науке, например:

- фотоизомеризация хромофора ретиналя родопсина;

- динамика возбужденного состояния ДНК;

- популяционная динамика ДНК;

- перенос заряда;

- фотосинез.

В данной работе все расчеты будут сводиться к нахождению дифракционных картин от процесса взаимодействия ультракороткого лазерного импульса с различными конфигурациями ДНК, путем построения контурного графика в полярной системе координат для простой и наглядной иллюстрации, а также сравнения некоторых представленных теоретических результатов с уже известными экспериментальными данными [34-37].

1.3 Объект исследования — ДНК. Классические способы исследования ДНК, существующие проблемы

В качестве объекта исследования в данной работе выбрана молекула ДНК. ДНК - это одна из основных макромолекул, которая содержит в себе генетический план развития и функционирования живого организма. Информация в ней представлена в виде генетического кода, записанного в определенной последовательности нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, дезоксирибозы и фосфатной группы. Существует четыре типа азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин и тимин. ДНК представляет собой две цепи последовательности нуклеотидов, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Молекула закручена двойным винтом, в котором азотистые основания скреплены между собой водородными связями. Ширина спирали составляет от 22 до 24 А . Расстояние между соседними нуклеотидами 3,4 А . На одном обороте винта находится десять пар нуклеотидов. Состав молекулы определяется пятью сортами атомов: азот, кислород, водород, углерод, фосфор.

Структура ДНК в масштабе нуклеотида уже изучена методом рентгено-структурного анализа. Само понятие гена или «наследственного задатка» принадлежит Г.Менделю и относится к 1800 г., но так как экспериментально подтвердить свои предположения Мендель не смог, понятие было переоткрыто в 1900-е годы, а сама молекула была идентифицирована швейцарским химиком И.Фишером в 1860-х годах. К 1910 г. науке уже было известно о том, что в состав ДНК входят азотистые основания и дезоксирибоза. За эту работу немецкий биохимик А.Коссель был удостоен Нобелевской премии. Его же авторству принадлежит и название ДНК «Дезоксирибонуклеи-новая кислота». Открытие того, что именно ДНК ответственна за хранение и перенос генетической информации, принадлежит американским генетикам О.Эвери, К.Маклеоду и М.Маккартни. Другая группа, подтвердившая, что за наследственность отвечает именно ДНК — американские генетики А.Херши и М.Чейз.

Структура ДНК стала известна только после экспериментов с применением рентгеновских лучей. Первый снимок молекулы, который был расшифрован, принадлежит английскому кристаллографу Р.Франклин, полученный ею в 1951 г. Труды группы ученых, а именно М.Перутца, Р.Франклин, Ф.Крика и Д.Уотсона открыли миру современную форму ДНК [38].

По получаемым рентгеновским снимкам можно сделать выводы о коли-

честве пар нуклеотидов, расстоянии между ними, но невозможно понять, из каких именно азотистых оснований состоит молекула, а значит, невозможно исследовать ген, невозможно отличить друг от друга нуклеотиды. Кроме того, получаемые рентгеновские снимки трудночитаемы, размыты и неточны из-за сложности кристаллизации образца. Поэтому ученые продолжили поиски новых методов, которые позволили бы точнее определять структуру ДНК, находить в ней последовательности нуклеотидов, как следствие, и генов.

Секвенирование молекулы стало возможным после изобретения метода по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) или метода Сэнгера [39, 40]. Этот способ анализа ДНК позволяет добиться концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты. Дальше анализ множества фрагментов ДНК проводится методом гель-электрофореза. Макромолекулы помещаются в гель, через который пропускают электрический ток. Под действием градиента напряжения молекулы начинают двигаться. В зависимости от размера молекулы приобретают разную скорость и постепенно исходный препарат из разных участков ДНК разделяется на зоны. Для визуализации результатов полученный гель окрашивается. По полученным окрашенным дорожкам миграции биомолекул исследуется триплетный состав ДНК. Метод сложен в подготовке, а также не даст результатов относительно точных мутаций. На сегодняшний существует несколько способов исследования ДНК.

Первый из них — массово-параллельное опознавательное секвенирование. Метод позволяет исследовать за раз большое количество пар оснований ДНК. Меченые продукты ПЦР, полученные из ДНК, амплифицируются таким образом, что каждая соответствующая молекула мРНК дает ~ 100 000 продуктов ПЦР с уникальной меткой. Основное отличие массового параллельного секвенирование от метода по Сэнгеру —- возможность прочитать несколько нитей ДНК за один раз. Секвениование по этому методу состоит из нескольких этапов (рисунок 5):

- фрагментирование ДНК;

- присоединение к фрагментам ДНК известных адаптеров;

- ПЦР тест каждого фрагмента ДНК;

- прикрепление фрагментов на твердой поверхности (чипе);

- считывание чипа.

Рисунок 5. Первая схема считывания участков днк по методу массово-параллельное опознавательное секвенирование. Источник: Рейнарц Дж. Genomic Proteomic 1(1):95-104.

Следующий метод, применяемый в исследованиях ДНК и РНК — пиро-секвенирование (рисунок 6). Это наиболее быстрый способ расшифровки последовательности ДНК. Метод основан на ПЦР тестировании, но при этом используются нанотехнологии, которые позволяют ускорить процесс обработки.

Рисунок 6. Схема пиросеквинирования.

https://fr.slideserve.com/danno/14

Источник:

Наиболее интересно одномолекулярное секвенирование (рисунок 7). С его помощью исследуются короткие участки ДНК. Основан на классическом методе ПЦР, но с использованием флуоресцирующих меток.

Ер|Аио«5«пм (1ет«|1оп Итт»

Рисунок 7. Схема одномолекулярного секвинирования. Источник: Ид.Д. Баепсе. 2009.

Для увеличения точности секвинирования также применяются методы на-нопоры и наношариков. В ходе ПЦР молекула ДНК синтезируется в ДНК-шарики (рисунок 8). Полученные шарики помещаются на специальный субстрат, который представляет собой свообразную решетку, с которой особым методом считывается информация.

Рисунок 8. Схема ПЦР с наношариками. Источник: Дрманак. Р. Наука. 327 (5961): 78-81.

Второй вариант нанопора — сложный с технической точки зрения метод секвинирования, но эффективен в прочтении генома, его точность выше, а также он позволяет читать короткие участки ДНК. Основан на фиксации нуклеотидного состава ДНК в процессе протаскивания через нанопору (рисунок 9).

Рисунок 9. Схема секвинирования ДНК с помощью нанопоры. Источник: Хилтеманн. С.

Несмотря на разнообразие методов, их недостаточно для полного описания структуры сложных билогических объектов. Проблемы при анализе ДНК связаны с динамикой молекулы, с ее подготовкой и т.д.

ДНК — известная форма макромолекулы, но еще остается много открытых вопросов относительно ее структуры. Методы ни из области классического рентгеноструктурного анализа, ни из области химии не дают четких картин ДНК с различными ее конфигурациями и состояниями, такими как точечная мутация, удлинение расстояния между азотистыми основаниями, разрез и т.д. А кроме того, они не способны изучить молекулу на атомном уровне, а следовательно не имеют перспективы для изучения динамических процессов ДНК таких как, деление, репликация, транскрипция и т.д. Именно поэтому ДНК и другие подобные объекты, белки, одиночные молекулы изучаются посредством УКИ.

1.4 Актуальные эксперименты на биологических объектах

Несмотря на сложность воспроизведения экспериментов с использованием УКИ, перспективность применения получаемых результатов побуждает ученых ставить новые опыты с различными биологическими обьектами. Результаты этих опытов говорят о применимости метода для исследования сложных апериодичных молекулярных структур.

О потенциале УКИ как способе визуализации биомолекул писали с конца 1990-х по 2000-е гг. [41]. Тогда перед научным сообществом стоял вопрос о том, сможет ли лазерный импульс зафиксировать структуру образца до его разрушения. В работах [41, 42] было проведено математическое моделирование облучение лизоцима, белок которого со связанными молекулами растворителя подавался в область импульсного воздействия в газовой фазе. Было рассчитано, что при облучении импульсами длительностью около 2 -10 фс молекула взрывается, но импульс успевает считать информацию о ее структуре.

Проверить математическую модель смогли только после 2009 г., когда был создан первый в мире лазер, способный получать ультракороткие рентгеновские импульсы (США, Национальная лаборатория в Менло-Парке, Калифорния). В 2011 году были получены первые данные с нового лазера. Группа Г.Чепмена получила данные о структуре большого комплекса нанокристал-лов белка и доказала возможность проведения дифракции перед разрушением [43]. В том же году были проведены исследования на мимивирусе. Размер

мимивируса не позволяет провести его реконструкцию с помощью микроскопа, а волокна, покрывающие его, препятствуют кристаллизации. Исследование на мимивирусе — это пример того, как применимость нового метода проверяется на уже изученном обьекте. В сравнении с уже известными данными о мимивирусе авторы работы пришли к выводу, что новый метод способен показать действительную структуру образца [44]. Дифракционные картины подтвердили способность УКИ фиксировать структуру образца до его разрушения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Харламова Анастасия Александровна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Суворов, Э.В. Дифракционный структурный анализ : учеб. пособие для академического бакалавриата / Э.В. Суворов. — Издательство Юрайт, 2019.

[2] Suryanarayana, C. X-Ray Diffraction: A Practical Approach / C. Surya-narayana, N. M. Grant. — Science and Business Media: Springer, 2013.

[3] Jones, N. Crystallography: Atomic secrets / N. Jones // Nature. — 2014.— Vol. 505.

[4] Deisenhofer, J. X-ray structure analysis of a membrane protein complex. electron density map at 3 a resolution and a model of the chromophores of the photosynthetic reaction center from rhodopseudomonas viridis / J. Deisenhofer, O. Epp, K. Miki et al. // Journal of Molecular Biology.— 1984. — Vol. 180. — Pp. 385-398.

[5] Darwin, C.G.The theory of X-ray reflexion / C.G. Darwin. // Philosophical Magazine Series 6. — 1914. — Vol. 27. — Pp. 315-333.

[6] Darwin, C.G.The theory of X-ray reflexion. Part II / C.G. Darwin. // Philosophical Magazine Series 6. — 1914. — Vol. 27. — Pp. 675-690.

[7] Darwin, C.G.The reflexion of X-rays from imperfect crystals. / C.G. Darwin. // Philosophical Magazine Series 6. — 1922. — Vol. 43. — Pp. 800-829.

[8] Ewald, P.P.Fifty Yers of X-Ray Diffraction / P.P. Ewald. // Physics Today. — 1963. — Vol. 16. — Pp. 70-72.

[9] Hentschel, M.Attosecond metrology / M. Hentschel. // Nature. — 2001.— Vol. 414. — Pp. 509-513.

10] Paul, P.M.Observation of the sequence of attosecond pulses from the generation of high harmonics / P.M. Paul, E.S.Toma et al. // Science. — 2001. — Vol. 292. — Pp. 1689-1692.

11] Popmintchev, T.Bright coherent ultrahigh harmonics in the X-Ray mode keV from femtosecond lasers of the mid-infrared range / T. Popmintchev. // Science. — 2012. — Vol. 336. — Pp. 1287-1291.

12] Teichmann, S.M.0.5 keV soft X-Ray attosecond continua / S.M. Teichmann, F.Silva et al. // Nat. Commun. — 2012. — Vol. 7. —

13] Johnson, A. S. High-flux soft x-ray harmonic generation from ionization-shaped few-cycle laser pulses / A. S. Johnson et al. // Science Advances. — 2018. —Vol. 4. —P. eaar3761.

14] Emma, P. Femtosecond and subfemtosecond X-ray pulses from a self-amplified spontaneous-emission-based free-electron laser / P. Emma et al. // Phys. Rev. Lett. — 2004. — Vol. 92. — P. 074801.

15] Tet, I. Compact X-ray free-electron laser emitting in the sub-angstrom region / I. Tet et al. // Nat. Photon. — 2012. — Vol. 6. — Pp. 540-544.

16| Neil, M.C. Free electron X-ray lasers / M.C. Neil, N.R. Thompson. // Science. — 2010. — Vol. 4. — Pp. 814-821.

17| Schoenlein, R. Recent advances in ultrafast x-ray sources / R. Schoenlein et al. // Philos. Trans. R. Soc. A. — 2019. — Vol. 377. — P. 20180384.

18| Johnson, A. S. Attosecond soft X-ray high harmonic generation / A. S. Johnson et al. // Philos. Trans. R. Soc. A. — 2018.— Vol. 377.— P. 20170468.

19] Yang, J.Imaging CF3 I conical intersection and photodissociation dynamics with ultrafast electron dynamics / J. Yang. // Science. — 2018. — Vol. 361. — Pp. 64-67.

20] Bragg, W.L.Refraction of X-rays by crystals / W.L. Bragg. // Proc. R. Soc. Lond. — 1913. — Vol. 88. — Pp. 428-438.

21| Chapman, H. N. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography / H. N. Chapman et al. // Nature. — 2011. — Vol. 470. — Pp. 73-77.

22| Siebert, M.M.Single mimivirus particles intercepted and imaged using an X-ray laser / M.M. Siebert. // Nature. — 2011. — Vol. 88. — Pp. 428-438.

23| Neutze, R.Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-Ray pulses / R. Neutze, E.Weckert et al // Nature. — 2000. — Vol. 406. — Pp. 752757.

241 Chapman, H. N. Femtosecond diffractive imaging with a soft-X-ray free-electron laser / H. N. Chapman et al. // Nature Physics. — 2006. — Vol. 2. — Pp. 839-843.

25! Chapman, H. N. Femtosecond time-delay X-ray holography / H. N. Chapman et al. // Nature Physics. — 2007. — Vol. 448. — Pp. 676-679.

26| Kahra, S.A molecular conveyor belt by controlled delivery of single molecules into ultrashort laser pulses / S. Kahra, G.Leschhorn, M.Kowalewski et al // Nature. — 2012. — Vol. 8. — Pp. 238-242.

2^ Patterson, A. L. A direct method for the determination of the components of interatomic distances in crystals / A. L. Patterson // Zeitschrift fur Kristallographie. — 1935. — Vol. 90. — P. 517.

28] Harker, D.Direct determination of the phases of Fourier coefficients from X-ray data / D. Harker, I.Kasper // Nature. — 1948. — Vol. 35. — Pp. 271275.

29] Cochran, W.A.Relation between the Signs of Structure Factors / W.A. Cochran // Acta Cryst. — 1952. — Vol. 5. — Pp. 65-67.

30| Zachariasen, W.H.A new Analytical Metod for Solving Complex Crystal Structures / W.H. Zachariasen // Acta Cryst. — 1952. — Vol. 5.— Pp. 6873.

[31] Perutz, M.Proteins and Nucleic Acids: Structure and Function / M. Pe-rutz // Elsevier. — 1962.

[32] Perutz, M.Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins / M. Perutz // Cambridge University Press. — 1990.

[33] Perutz, M.Protein Structure : New Approaches to Disease and Therapy / M. Perutz // Cambridge University Press. — 1992.

[34] Weisshaupt, J. High-brightness table-top hard x-ray source driven by sub-100-femtosecond mid-infrared pulses / J. Weisshaupt et al. // Nat. Photon. — 2014. — Vol. 8. — Pp. 927-930.

[35] Korff Schmising, C. V. Coupled ultrafast lattice and polarization dynamics in ferroelectric nanolayers / C. V. Korff Schmising et al. // Phys. Rev. Lett. — 2007. — Vol. 98. — P. 257601.

[36] Woerner, M. Concerted electron and proton transfer in ionic crystals mapped by femtosecond x-ray powder diffraction / M. Woerner et al. // J. Chem. Phys.—2010. —Vol. 133. — P. 064509.

[37] Weisshaupt, J. Theoretical analysis of hard X-ray generation by nonpertur-bative interaction of ultrashort light pulses with a metal / J. Weisshaupt et al. // Struct. Dyn. — 2015. — Vol. 2. — P. 024102.

[38] Watson, J.Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid / J. Watson, F. Crick // Nature. — 1953. —Vol. 171.—

[39] Sanger, F.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Niclein, A. Coulson // Proc Natl Acad Sci USA. — 1977.— Vol. 74.— Pp. 5463-5467.

[40] Sanger, F.A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase / F. Sanger, S. Niclein, A. Coulson // Proc Natl Acad Sci USA. — 1975. — Vol. 94. — Pp. 444-448.

[41] Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules / R. Henderson // Quarterly Reviews of Biophysics. — 1995. — Vol. 28. — Pp. 171-193.

[42] Grunbein, M.L. Megahertz data collection from protein microcrystals at an X-ray free-electron laser / M.L. Grunbein, J. Bielecki, A. Gorel et al // Nat Commun. — 2018. — Vol. 9.

[43] Owen, R.L. Experimental determination of the radiation dose limit for cry-ocooled protein crystals / R.L. Owen, E. Rudino-Pinera, E.F. Garman // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 2006. — Vol. 103. — Pp. 4912-4917.

[44] Xiao, C. Structural studies of the giant mimivirus. / C. Xiao et al // PLoS Biol. — 2009. — Vol. 7.

[45] Doerr, A. Diffraction before destruction. / A. Doerr // Nat Methods. — 2011. —Vol. 8.

[46] Henry, N. Natively Inhibited Trypanosoma brucei Cathepsin B Structure Determined by Using an X-Ray / N. Henry et al // Science. — 2012. — Vol. 339. — Pp. 227-230.

[47] Dean, N. Seeing in a flash / N. Dean // Nature. — 2014. — Vol. 511.

[48] Reiser, M. Resolving molecular diffusion and aggregation of antibody proteins with megahertz X-Ray free-electron laser pulses / M. Reiser et al // Nat Commun. — 2022. — Vol. 13.

[49] Nass, K. Structural dynamics in proteins induced by and probed with X-Ray free-electron laser pulses / K. Nass, A. Gorel, M. Abdullah et al // Nat Commun. — 2020. — Vol. 11.

[50] Pandey, S. Time-resolved serial femtosecond crystallography at the european XFEL / S. Pandey et al // Nature Methods. — 2020.— Vol. 17.— Pp. 73—78.

[51] Astapenko, V. A. Scattering of an ultrashort electromagnetic radiation pulse by an atom in a broad spectral range / V. A. Astapenko // Journal of Experimental and Theoretical Physics. — 2011. — Vol. 112.— Pp. 193-198.

[52] Makarov, D.N. Analytical wave function of an atomic electron under the action of a powerful ultrashort electromagnetic field pulse. / D.N. Makarov, M.K. Eseev, K.A. Makarova // Optics Letters. — 2019. — Vol. 44, Iss. 12. — pp. 3042-3045.

[53] Matveev, V. I. Dynamics of electronic transitions and reemission spectra of attosecond electromagnetic pulses / V. I. Matveev, D. N. Makarov // JETP Letters. — 2014. — Vol. 99. — Pp. 258-65.

[54] Corkum, P. Attosecond science / P. Corkum // Nature Phys. — 2007. — Vol. 3. — Pp. 381—387.

[55] Haessler, S. Self-probing of molecules with high harmonic generation / S. Haessler // J. Phys. B: At. Mol. Opt. Phys. — 2011. — Vol. 44.

[56] Shigaev, A.S. Theoretical and experimental studies of open states of DNA, Mathematical Biology and Bioinformatics. / A.S. Shigaev, O.A. Pono-marev, V.D. Lakhno // Physics and Mathematics. — 2013. — Vol. 8. Iss.2 — Pp. 553-664.

[57] Tsakiris, G.D. Route to intense single attosecond pulses. / G.D. Tsakiris, K. Eidmann, J. Meyer-ter-Vehn, F. Krausz // New J. Phys. — 2006. — Vol. 8.

[58] Nitzan, A. Electron transport in molecular wire junctions. / A. Nitzan, M.A. Ratner // Science. — 2003. — Vol. 300. — Pp. 1384--1389.

[59] Hauri, C.P. Intense self-compressed, self-phase-stabilized few-cycle pulses at 2 ?m from an optical filament. / C.P. Hauri et al // Opt. Lett. — 2007. — Vol. 32. — Pp. 868-870.

[60] Dromey, B. High harmonic generation in the relativistic limit. / B. Dromey et al // Nature Phys. — 2006. — Vol. 2. — Pp. 456-459.

[61] Benediktovich, A. Theoretical Concepts of X-Ray Nanoscale Analysis. / A. Benediktovich, I. Feranchuk, A. Ulyanenkov // Springer-Verlag Berlin Heidelberg. — 2014.

[62] Krausz, F. Attosecond physics. / F. Krausz, M. Ivanov // Rev. Mod. Phys. — 2009. — Vol. 81.

[63] Calegari, F. Advances in attosecond science. / F. Calegari et al // J. Phys. B: At. Mol. Opt. Phys. — 2016. — Vol. 49.

[64] Dixit, G. Imaging electronic quantum motion with light. / G. Dixit, O. Ven-drell, R. Santra // PNAS. — 2012. — Vol. 109. — Pp. 11636-11640.

[65] Peng, P. Attosecond imaging of molecules using high harmonic spectroscopy. / P. Peng, D. Marceau // Nature Reviews Physics. — 2019.— Vol. 1.— Pp. 144-145.

[66] Kraus, M. The ultrafast X-ray spectroscopic revolution in chemical dynamics. / M. Kraus et al // Nature Reviews Chemistry. — 2018.— Vol. 2.— Pp. 82-94.

[67] Schoenlein, R. Recent advances in ultrafast X-ray sources. / R. Schoenlein et al // Philos. Trans. R. Soc. A. — 2019. — Vol. 377.

[68] Duris, J. Tunable isolated attosecond X-ray pulses with gigawatt peak power from a free-electron laser. / J. Duris, L. Siqi et al // Nature Photonics.— 2020. — Vol. 14. — Pp. 30-36.

[69] Maroju, P. Attosecond pulse shaping using a seeded free-electron laser. / P. Maroju et al // Nature. — 2020. — Vol. 578. — Pp. 386-391.

[70] Mukamel, S. Multidimensional attosecond resonant X-ray spectroscopy of molecules: lessons from the optical regime. / S. Mukamel et al // Annu. Rev. Phys. Chem. — 2013. — Vol. 64. — Pp. 101-127.

[71] Leone, S.R. What will it take to observe processes in "real time"? / S.R. Leone et al // Nature Photonics. — 2014. — Vol. 8. — Pp. 162-166.

[72] James, R.W. The Optical Principles of the Diffraction of X-rays (Ox Bow), Woodbridge, Connecticut. / R.W. James // Optical Principles of the Diffraction of X-Rays. — 1982.

[73] Henriksen, N.E. On the Theory of Time-Resolved X-ray Diffraction. / N.E. Henriksen, K.B. Moller // J. Phys. Chem. B. — 2008.— Vol. 112.— Pp. 558-567.

[74] Astapenko, V.A. Excitation of a quantum oscillator by short laser pulses. / V.A. Astapenko, E.V. Sakhno // Applied Physics B. — 2020. — Vol. 126.

[75] Rosmej, F.B. Scattering of ultrashort laser pulses on "ion?sphere" in dense plasmas. / F.B. Rosmej // Contrib. Plasma Phys. — 2019.— Vol. 59.— Pp. 189-196.

^ Makarov, D.N. Quantum theory of scattering of ultrashort electromagnetic field pulses by polyatomic structures. / D.N. Makarov // Optics Express. — 2019. — Vol. 27. — Pp. 31989-32008.

[7^ Eseev, M.K. Scattering of Ultrashort X-ray Pulses by Various Nanosystems. / M.K. Eseev, A.A. Goshev, D.N.Makarov // Nanomaterials. — 2022.— Vol. 10.

^ Eseev, M.K. X-ray diffraction analysis of matter taking into account the second harmonic in the scattering of powerful ultrashort pulses of an electromagnetic field. / M.K. Eseev, A.A. Goshev, K.A.Makarova et al // Scientific Reports. — 2021. — Vol. 11.

[79] Moller, K.B. Time-resolved x-ray diffraction: The dynamics of the chemical bond. / K.B. Moller, N.E. Henriksen // Struc. Bond. — 2012. — Vol. 142.

^ Tanaka, S. Time-resolved x-ray spectroscopies: Nonlinear response functions and liouville-space pathways. / S. Tanaka, V. Chernyak, S. Mukamel // Phys. Rev. Lett. — 2001. — Vol. 63. — Pp. 63405-63419.

[81 Dixit, G. Proposed Imaging of the Ultrafast Electronic Motion in Samples using X-Ray Phase Contrast. / G. Dixit, J.M. Slowik, R. Santra // Phys. Rev. Lett. — 2013. —Vol. 110.

[82] Makarov, D.N. Analytical wave function of an atomic electron under the action of a powerful ultrashort electromagnetic field pulse. / D.N. Makarov, M.K. Eseev, K.A. Makarova // Optics Letters. — 2019. — Vol. 44, Iss. 12. — Pp. 3042-3045.

^ Salvat, F. Analytical Dirac-Hartree-Fock-Slater screening function for atoms (Z = 1-92). / F. Salvat et al // Phys. Rev. A. — 1987. — Vol. 36, Iss. 2. — Pp. 467-474.

[8^ Lin, Q. Subcycle pulsed focused vector beams / Q. Lin, J. Zheng, W. Becker // Phys. Rev. Lett. — 2006. — Vol. 97. — P. 253902.

^ Feng, Y.L. DNA nicks induce mutational signatures associated with BRCA1 deficiency. / Y.L. Feng, Q. Liu, R.D. Chen et al // Nat. Commun. — 2022.

^ Aymami, J. Molecular structure of nicked DNA: a substrate for DNA repair enzymes. / J. Aymami, M. Coll, G.A. van der Marel et al // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1990.

[87| Suck, D. Structure refined to 2A of a nicked DNA octanucleotide complex with DNase I. / D. Suck, A. Lahm, C. Oefner // Nature. — 1988.

^ McClarin, J.A. Structure of the DNA-Eco RI endonuclease recognition complex at 3 A resolution. / J.A. McClarin, C.A. Frederick, B.C. Wang et al // Science. — 1986.

^ Shuman, S. Crystal Structure of Eukaryotic DNA Ligase-Adenylate Illuminates the Mechanism of Nick Sensing and Strand Joining. / S. Shuman et al // Molecular Cell. — 2000. — Vol. 6—Pp. 1183-1193

[90] Nair, P. Structural basis for nick recognition by a minimal pluripotent DNA ligase. / P. Nair, J. Nandakumar, P. Smith et al // Nat. Struct. Mol. Biol. — 2007. — Vol. 14— Pp. 770-778

[91] Athreya, N. Interaction dynamics and site-specific electronic recognition of DNA-nicks with 2D solid-state nanopores. / N. Athreya, O. Milenkovic, J.P. Leburton // Mater Appl. — 2020. — Vol. 4

[92] Frank-Kamenetskii, M. DNA structure: A simple solution to the stability of the double helix? / M. Frank-Kamenetskii // Nature. — 1986. — Vol. 324

[93] Frank-Kamenetskii, M. H-form DNA and the hairpin-triplex model. / M. Frank-Kamenetskii // Nature. — 1988. — Vol. 333

[94] Klug, A. Rosalind Franklin and the double helix. / A. Klug // Nature. — 1974. — Vol. 248 — Pp. 787-788

[95] Clancy, S. Genetic Mutation. / S. Clancy // Nature Education. — 2008.— Vol. 187

[96] Nakamori, M. A slipped-CAG DNA-binding small molecule induces trinucleotide-repeat contractions in vivo. / M. Nakamori, et al // Nature Genetics. — 2020. — Vol. 5252 — Pp. 146-159

[97] Mosbach, V. Trinucleotide repeat instability during double-strand break repair: from mechanisms to gene therapy. / V. Mosbach, et al // Current Genetics. — 2019. — Vol. 6565 — Pp. 17-28

[98] Shendure, J. Next-generation DNA sequencing. / J. Shendure, J. Hanlee // Nature Biotechnology. — 2008. — Vol. 26— Pp. 1135-1145

[99] Friedberg, C. DNA damage and repair. / C. Friedberg // Nature. — 2003. — Vol. 421 — Pp. 436-440

[100] Piper, P. Nonsense suppressors of Saccharomyces cerevisiae can be generated by mutation of the tyrosine tRNA anticodon. / P. Piper, M. Wasserstein, F. Engbaek et al. // Nature. — 1976. — Vol. 262— Pp. 757-761

[101] Wajnrajch, M. Nonsense mutation in the human growth hormone-releasing hormone receptor causes growth failure analogous to the little (lit) mouse. / M. Wajnrajch, J. Gertner, M. Harbison et al. // Nat. Genet. — 1996.— Vol. 12—Pp. 88-90

[102] Li, C.M. A nonsense mutation is responsible for the RNA-negative pheno-type in human citrullinaemia. / C.M. Li, H.K. Chao, Y.F. Liu et al. // Eur. J. Hum. Genet.— 2001. —Vol. 9—Pp. 685-689

[103] Styrkarsdottir, U. Nonsense mutation in the LGR4 gene is associated with several human diseases and other traits. / U. Styrkarsdottir, G. Thorleifs-son, P. Sulem et al. // Nature. — 2013. — Vol. 497— Pp. 517-520

[104] Fan, L.L. Exome sequencing identifies a novel nonsense mutation of Ring Finger Protein 207 in a Chinese family with Long QT syndrome and syncope. / L.L. Fan, Y.Q. Chen, H. Huang et al. // J. Hum. Genet. — 2019. — Vol. 64—Pp. 233-238

[105] Yi, H. A novel nonsense mutation in ADAMTS17 caused autosomal recessive inheritance Weill-Marchesani syndrome from a Chinese family. / H. Yi, X. Zha, Y. Zhu et al. // J. Hum. Genet. — 2019. — Vol. 64— Pp. 681-687

[106] Urreizti, R. A De Novo Nonsense Mutation in MAGEL2 in a Patient Initially Diagnosed as Opitz-C: Similarities Between Schaaf-Yang and Opitz-C Syndromes. / R. Urreizti, A. Cueto-Gonzalez, H. Franco-Valls et al. // Sci. Rep. — 2017. — Vol. 7—44138

[10^ Takano, K. A novel nonsense mutation in the NOG gene causes familial NOG-related symphalangism spectrum disorder. / K. Takano, N. Oga-sawara, T. Matsunaga et al. // Hum. Genome Var.— 2016.— Vol. 3 — 16023

[108] North, K. A common nonsense mutation results in ?-actinin-3 deficiency in the general population. / K. North, N. Yang, D. Wattanasirichaigoon et al. // Nat. Genet. — 1999. — Vol. 21 — Pp. 353-354

[109] Alhamoudi, K.M. A homozygous nonsense mutation in DCBLD2 is a candidate cause of developmental delay, dysmorphic features and restrictive cardiomyopathy. / K.M. Alhamoudi, T. Barhoumi, H. Al-Eidi, et al. // Set. Rep. — 2021. — Vol. 11 — 12861

[1^ Xiang, Y. Exome sequencing reveals a novel nonsense mutation of GLI3 in a Chinese family with 'non-syndromic' pre-axial polydactyly. / Y. Xiang, Z. Wang, J. Bian, et al. // J. Hum. Genet. — 2016. — Vol. 61 — Pp. 907-910.

[H^ Benhabiles, H. Optimized approach for the identification of highly efficient correctors of nonsense mutations in human diseases. / H. Benhabiles, S. Gonzalez-Hilarion, S. Amand, et al. // Biomedicines. — 2017. — Vol. 12, Iss.11 —e0187930.

[1^ Carrard, J. Identifying Potent Nonsense-Mediated mRNA Decay Inhibitors with a Novel Screening System. / J. Carrard, F. Ratajczak, J. Elsens, et al. // Biomedicines. — 2023. — Vol. 11, Iss.10:2801

[1^ Bidou, L. 2-Guanidino-quinazoline promotes the readthrough of nonsense mutations underlying human genetic diseases. / L. Bidou, O. Bugaud, G. Merer, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 2022.— Vol. 119, Iss.35— e2122004119.

[11^ Culbertson, M. Sense versus nonsense in DNA diagnostics. / M. Culbertson // Nat. Biotechnol.— 2001. — Vol. 19— Pp. 413-414.

[1^ Zhang, S. Mutation screening using fluorescence multiplex denaturing gradient gel electrophoresis (FMD): detecting mutations in the BRCA1 gene. / S. Zhang, G. Kuperstein, S. Narod // Nat. Protoc.— 2006.— Vol. 1 — Pp. 3101-3110.

[1^ Ashton, E. Simultaneous mutation scanning for gross deletions, duplications and point mutations in the DMD gene. / E. Ashton, S. Yau, Z. Deans, et al. // Eur. J. Hum. Gene. — 2008. — Vol. 16 — Pp. 53-61.

118

119

120

121 122

123

124

125

126

127

128

Alvarez, M. Functional characterization of somatic mutations in cancer using network-based inference of protein activity. / M. Alvarez, Y. Shen, F. Giorgi, et al. // Nat. Genet. — 2016. — Vol. 48 — Pp. 838-847.

Zech, M. Next-generation sequencing and bioinformatics in rare movement disorders. / M. Zech, J. Winkelmann // Nat. Rev. Neurol. — 2024. — Vol. 20 — Pp. 114-119.

Gigante, S. Using long-read sequencing to detect imprinted DNA methyla-tion. / S. Gigante, et al. // Nucleic Acids Res. — 2019. — Vol. 47, Iss.8 — P. e46.

Avvakumov, G. Structural basis for recognition of hemi-methylated DNA by the SRA domain of human UHRF1. / G. Avvakumov, J. Walker, S. Xue, et al. // Nature. — 2008. — Vol. 455 — Pp. 822-825.

Bull, J. Heavily methylated amplified DNA in transformants of Neurospora crassa. / J. Bull, J. Wootton // Nature. — 1984. — Vol. 310 — Pp. 701-704.

Arita, K. Recognition of hemi-methylated DNA by the SRA protein UHRF1 by a base-flipping mechanism. / K. Arita, M. Ariyoshi, H. Tochio, et al. // Nature. — 2008. — Vol. 455 — Pp. 818-821.

Hubert, J. Detection of DNA methylation signatures through the lens of genomic imprinting. / J. Hubert, N. Iannuccelli, C. Cabau, et al. // Sci. Rep. — 2015. — Vol. 14, Iss. 1694

AkbariJean, V. Genome-wide detection of imprinted differentially methylated regions using nanopore sequencing. / V. AkbariJean, M. Garant, K. O'Neill, et al. // eLife. — 2015. — 11:e77898

Wang, S. MethylRAD: A simple and scalable method for genome-wide DNA methylation profiling using methylation-dependent restriction enzymes. / S. Wang, et al. // Open Biol. — 2015. — Vol. 5, Iss. 11 — 150130.

Olova, N. Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting DNA methylation data. / N. Olova, et al. // Genome Biol. — 2018. — Vol. 19, no. 1 — P. 33.

Noordermeer, D. Differential 3D chromatin organization and gene activity in genomic imprinting. / D. Noordermeer, R. Feil // Curr. Opin. Genet.— 2020. — Dev. 61 — Pp. 17-24.

Guo, W. CGmapTools improves the precision of heterozygous SNV calls and supports allele-specific methylation detection and visualization in bisulfite-sequencing data. / W. Guo, et.al. // Bioinforma. Oxf. Engl. — 2018.— Vol. 34, no. 3—Pp. 381-387.

Okonechnikov, K. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. / K. Okonechnikov, A. Conesa, F. Garcia-Alcalde // Bioinformatics. — 2016. — Vol. 32, no. 2— Pp. 292294.

130] Ewels, P. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. / P. Ewels, M. Magnusson, S. Lundin, M.Kaller // Bioinformatics. — 2016. — Vol. 32, no. 19— Pp. 3047-3048.

131] Daley, T. Predicting the molecular complexity of sequencing libraries. / T. Daley, A.D. Smith, // Nat. Methods. — 2013. — Vol. 10, no. 4 — Pp. 325327.

132] Koziol, M. Identification of methylated deoxyadenosines in vertebrates reveals diversity in DNA modifications / M. Koziol, C. Bradshaw, G. Allen, // Nat. Struct. Mol. Biol. — 2016. —Vol. 23. — Pp. 24-30.

133] Gunthert, U. DNA methylation in adenovirus, adenovirus-transformed cells, and host cells / U. Gunthert, M. Schweiger, M. Stupp, W. Doerfler // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1976. — Vol. 73. — Pp. 3923-3927.

134] Sobel, H. Stereochemistry of Actinomycin-DNA Binding. / H. Sobel // Nature New Biology. — 1971. — Vol. 231. Iss.24

135| Sobel, H. How Actinomycin Binds to DNA. / H. Sobel // Scientific American. — 1974. — Vol. 231. Iss.2 — Pp. 82-91.

136! Sobel, H. Organization of DNA in chromatin. / H. Sobel // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1976. — Vol. 72. Iss.2 — Pp. 3068-3070.