Провоспалительный потенциал композитных матриксов при регенерации кожи и инженерии лимфоидных органов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.03, кандидат наук Носенко Максим Андреевич

• Носенко Максим Андреевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Носенко Максим Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биоматериалы в тканевой инженерии и регенеративной медицине

1.1.1. Биоматериалы на основе фиброина

1.1.2. Биоматериалы на основе спидроина

1.2. Биоматериалы для инженерии искусственных лимфоидных органов

1.2.1. Строение лимфоидных органов

1.2.2. Стромальные клетки лимфатических узлов

1.2.3. Эмбриональное развитие лимфатических узлов

1.2.4. Достижения в биоинженерии искусственных лимфоидных органов

1.3. Биоматериалы в заживлении кожи

1.3.1. Этапы заживления ран кожи

1.3.2. Использование биоматериалов для терапии ран кожи

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Полимерные матриксы

2.2. Мыши

2.3. Работа с первичной культурой мышиных эмбриональных фибробластов

2.4. Получение и работа с первичной культурой кератиноцитов

2.5. Получение и работа с первичной культурой макрофагов

2.6. Культивирование клеток на фиброин/желатиновых матриксах

2.7. Ингибирование внутриклеточных сигнальных путей

2.8. Трансдифференцировка МЭФ агонистами LTpR

2.9. Модель имплантации матриксов под капсулу почки

2.10. Модель заживления полнослойных ран кожи

2.11. Иммунофлуоресцентное окрашивание

2.12. Иммуногистохимическое окрашивание

2.13. Выделение клеток из ткани

2.14. Проточная цитометрия

2.15. Иммуноферментный анализ

2.16. Выделение РНК, обратная транскрипция, ПЦР в реальном времени

2.17. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Влияние 2D и 3D фиброин/желатиновых матриксов на культуру первичных мышиных эмбриональных фибробластов

3.1.1. Трехмерные, но не двумерные фиброин/желатиновые матриксы вызывают увеличение экспрессии молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 мышиными эмбриональными фибробластами in vitro

3.1.2. 3D фиброин/желатиновые матриксы вызывают умеренный воспалительный ответ при культивировании МЭФ

3.1.3. Индукция экспрессии молекул адгезии в МЭФ при культивировании на 3D фиброин/желатиновых матриксах зависит от активации MAP киназ JNK и p38

3.1.4. Трансдифференцировка МЭФ в направлении стромальных клеток лимфатических узлов агонистами LTPR

3.2. Характеристика фиброин/желатиновых матриксов в модели имплантации под капсулу почки мыши

3.2.1. Имплантация фиброин/желатиновых матриксов под капсулу почки мыши приводит к росту кровеносных и лимфатических сосудов в имплантах

3.2.2. Имплантация фиброин/желатиновых матркисов приводит к инфильтрации и кластеризации Т- и В-лимфоцитов в имплантах

3.2.3. Активация LTPR на МЭФ не приводит к увеличению количества инфильтрирующих лимфоцитов при имплантации фиброин/желатиновых матриксов

3.3. Характеристика прорегенеративного потенциала фиброин/желатиновых и спидроиновых микрочастиц

3.3.1. Фиброин/желатиновые и спидроиновые микроносители способствуют заживлению полнослойных ран кожи и препятствуют фиброзу

3.3.2. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микроносители вызывают умеренный провоспалительный ответ в МЭФ и макрофагах

3.3.3. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микроносители вызывают воспалительный ответ при подкожной имплантации мыши

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛЭК - лимфатические эндотелиальные клетки (lymphatic endothelial cells, LEC) МЧ - микрочастицы

МЭФ - мышиные эмбриональные фибробласты (mouse embryonic fibroblasts, MEF)

СКК - стволовые кроветворные клетки (hematopoetic stem cells, HCS)

Сп - спидроин

СФ - сфигнозин-1-фосфат

Ф/Ж - фиброин/желатин

ФРК - фибробластные ретикулярные клетки (fibroblastic reticular cells, FRC) ФДК - фолликулярные дендритные клетки (follicular dendritic cells, FDC) FBS - fetal bovine serum, эмбриональная телячья сыворотка LTiC - lymphoid tissue inducer cells, клетки-индукторы лимфоидной ткани LToC - lymphoid tissue organizer cells, клетки-организаторы лимфоидной ткани PBS - phosphate-buffered saline, фосфатно-солевой буфер

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Провоспалительный потенциал композитных матриксов при регенерации кожи и инженерии лимфоидных органов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

В последнее время все больший интерес вызывает возможность применения биоинженерных конструкций для решения различных задач в области биологии и медицины. Создание новых искусственных биосовместимых материалов открывает большие перспективы для будущего регенеративной медицины, трансплантологии, лечения инфекционных и онкологических заболеваний, а также для фундаментальных исследований тканевой организации живых организмов, для чего требуется сохранность пространственной структуры ткани или органа. В связи с этим было разработано большое количество биотехнологических материалов, имеющих следующие свойства: биосовместимость, отсутствие токсичности, а также возможность культивирования клеток в трехмерном пространстве и другие свойства, в частности, возможность функционализации субстрата в зависимости от конкретной задачи. Эти работы послужили основой для создания искусственных органов и тканей с использованием полимерного каркаса. В литературе описан ряд успешных разработок в этой области по созданию искусственных костей [1-4], кожи [5,6], сердечной ткани [7], а также других тканей и органов. Кроме того, особое внимание привлекает перспектива получения функциональных искусственных лимфоидных органов, главным образом вторичных или третичных, таких как лимфоидные фолликулы и лимфоузлы [8-10]. Этот интерес обусловлен возможностью применения подобных структур для коррекции иммунодефицитных состояний и терапии аутоиммунных, инфекционных заболеваний и рака. Предполагается, что искусственные лимфоидные органы будут частично или полностью выполнять функции нормальной иммунной системы человека в случае нарушений этой системы или ее неоптимальной работы [10]. Несмотря на широкое использование биоматериалов, оно, как правило, ограничивается формированием структурного каркаса для клеток или лекарственных веществ, в то время как их собственная биологическая активность часто остается малоизученной. Особенно это важно в случае естественных биополимеров, таких как белки или полисахариды, которые редко являются полностью инертными для клеток организма. Изучение влияния биоматериалов на фенотип клеток может иметь значение для их клинического применения в той или иной ситуации. Например, какие-то материалы способны активировать иммунную систему и могут использоваться при

инфекционных и раковых заболеваниях, тогда как другие обладают способностью стимулировать клеточную пролиферацию, что позволяет их использовать для целей регенеративной медицины. Несмотря на большое количество полимерных матриксов и покрытий, разработанных для ускоренного заживления различных повреждений, в том числе ран кожи, проблема образования фиброза остается крайне актуальной [11]. В связи с этим, перспективным направлением является поиск и характеристика новых биоматериалов, которые в скором времени могут послужить основой для регенеративной медицины будущего. Одними из таких материалов являются белки шелка, в том числе фиброин (основной белок шелка тутового шелкопряда) и спидроин (белок паучьего шелка). Эти белки в ходе естественного отбора приобрели уникальные механические характеристики, такие как высокая прочность и пластичность, в том числе у полимеров, созданных на их основе. При этом матриксы на основе фиброина или спидроина обладают высокой биосовместимостью и являются биодеградируемыми. В сумме эти характеристики делают белки шелка перспективными биоматериалами для использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине. В то же время, биологическая активность этих белков, в том числе их влияние на иммунную систему, остается недостаточно изученной.

Настоящая работа посвящена исследованию провоспалительных и прорегенеративных свойств матриксов на основе фиброина и спидроина. Помимо влияния фиброина на свойства клеток in vitro, в работе рассматривается перспектива использования фиброиновых матриксов для биоинженерии искусственных лимфоидных органов in vivo. Кроме того, в работе произведен сравнительный анализ двух типов микрочастиц на основе фиброина или спидроина, обладающих разными свойствами, по их способности стимулировать регенерацию кожи и препятствовать образованию фиброза.

Целью работы является исследование влияния полимерных матриксов на основе белков шелка на иммунную систему организма и изучение возможности использования таких матриксов в тканевой инженерии и регенеративной медицине

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние композитных фиброин/желатиновых матриксов на фенотип первичной культуры мышиных эмбриональных фибробластов in vitro.

2. Охарактеризовать фиброин/желатиновые матриксы в in vivo модели имплантации под капсулу почки мышей.

3. Изучить возможность использования мышиных эмбриональных фибробластов, в том числе трансдифференцированных агонистами LTPR, для создания искусственной лимфоидной ткани in vivo.

4. Сравнить свойства фиброин/желатиновых и спидроиновых микрочастиц в модели заживления полнослойных ран кожи у мышей in vivo.

5. Изучить влияние таких микрочастиц на фенотип мышиных эмбриональных фибробластов, кератиноцитов и макрофагов in vitro.

6. Изучить влияние микрочастиц на воспалительный иммунный ответ в коже in vivo.

Научная новизна работы

В работе впервые было изучено влияние композитных фиброин/желатиновых матриксов на свойства фибробластов, в том числе на активацию воспалительного ответа этими клетками. Более того, эти матриксы впервые были охарактеризованы в мышиной модели имплантации под капсулу почки и использованы для создания примитивной искусственной лимфоидной ткани. В отличие от других работ в этой области, используемые матриксы характеризовались повышенной стабильностью и провоспалительным потенциалом.

Кроме того, в работе впервые был произведен сравнительный анализ двух типов микрочастиц на основе белков шелка фиброина и спидроина по их влиянию на воспалительный иммунный ответ в культурах клеток in vitro, а также в мышиной модели заживления полнослойных ран кожи in vivo. Наконец, впервые было продемонстрировано прямое антифибротическое действие биоинженерных частиц на экспрессию генов факторов роста фибробластов in vitro и in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты, характеризующие биологические свойства матриксов на основе белков шелка, имеют важное значение для фундаментальной и прикладной биоинженерии, нацеленной на использование этих биоматериалов. Провоспалительные свойства фиброиновых матриксов могут быть использованы в дальнейшем как для создания терапевтических биоматериалов, стимулирующих активацию иммунного

ответа, например, при инфекционных осложнениях повреждений кожи, так и для разработки искусственных лимфоидных органоидов, характеризующихся провоспалительным микроокружением. Последние могут быть использованы для создания противоопухолевых и противоинфекционных вакцин нового поколения, которые будут представлять собой автономные центры формирования иммунного ответа заданной специфичности и направленности.

В то же время, исследованные в работе микрочастицы на основе фиброина или спидроина представляют большой интерес в разработке новых покрытий для регенеративной медицины, которые могут использоваться для доставки клеток в очаг повреждения, их активации и пролиферации в трехмерном формате. Различия в свойствах частиц на основе разных белков позволяет создать несколько терапевтических продуктов в зависимости от типа повреждения и возможных осложнений, что представляет собой основу для персонализированной медицины будущего.

Методология исследования

В работе были исследованы свойства уникальных матриксов различных конфигураций (полноразмерные 2D или 3D матриксы, а также микрочастицы) на основе белков шелка фиброина или спидроина. Эти биоматериалы были изучены как в in vitro, так и в in vivo моделях на лабораторных мышах.

В экспериментах in vitro работу проводили на первичных культурах клеток эмбриональных фибробластов, кератиноцитов и макрофагов костного мозга мыши. Для изучения влияния белков шелка на эти клетки проводили анализ экспрессии генов с помощью обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени, анализ продукции цитокинов в культуральной среде методом иммуноферментного анализа, а также анализ экспрессии поверхностных белков с помощью иммунофлуоресценции.

Изучение свойств матриксов in vivo проводили с привлечением двух экспериментальных мышиных моделей: модель имплантации под капсулу почки и модель заживления полнослойных ран кожи. Матриксы имплантировали как мышам дикого типа, так и мышам с генетической инактивацией генов TNF, LTa и LTßR для изучения роли этих цитокинов и опосредованных ими сигнальных путей в индукции инфильтрации имплантов иммунными клетками. Имплантированные матриксы

анализировали с помощью проточной цитометрии, иммуногистохимии и иммунофлуоресценции. В модели заживления кожи влияние частиц на воспаление и регенерацию ран изучали с помощью проточной цитометрии, иммунофлуоресценции и анализа экспрессии генов в коже.

Достоверность результатов

Выводы исследования сделаны на основании общепризнанных методов статистической обработки данных и по результатам постановки как минимум двух независимых экспериментов. В большинстве случае было поставлено три и более независимых экспериментов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Трехмерные фиброин/желатиновые матриксы обладают провоспалительными свойствами.

2. Фиброин/желатиновые матриксы вызывают образование искусственной лимфоидной ткани при имплантации под капсулу почки мыши in vivo.

3. Фиброин/желатиновые и спидроиновые микрочастицы способствуют заживлению полнослойных ран кожи у мыши и препятствуют фиброзу.

4. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микрочастицы обладают провоспалительными свойствами.

5. Фиброин/желатиновые и спидроиновые микрочастицы способны вызывать снижение уровня экспрессии профибротических факторов in vitro и in vivo.

Апробация результатов и публикации

Результаты работы были представлены и обсуждены на международных и отечественных конференциях и научных школах:«XV Всероссийский форум с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» Санкт-Петербург, Россия, 1-4 июня 2015; "4th Lymphoid Tissue Meeting" Сант-Галлен, Швейцария, 1-3 июня 2017; «14th Spring School on Immunology», Этталь, Германия, 1823 марта 2018; «Наука будущего - наука молодых», Сочи, Россия, 14-17 мая 2019; «Объединенный иммунологический форум», Новосибирск, Россия, 24-29 июня 2019.

По теме диссертации опубликовано печатных работ: 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, RSCI и

рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности 03.03.03 - иммунология, а также 5 тезисов.

Личный вклад автора

Основные результаты работы были получены автором или при его участии. Личный вклад автора заключается в планировании и проведении экспериментов, обработке и анализе полученных результатов, подготовке публикаций, написании текста диссертации.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биоматериалы в тканевой инженерии и регенеративной медицине

Разработка и использование новых материалов в биологических системах in vitro и in vivo представляет большой интерес как для фундаментальных исследований, так и для медицины. Биоматериалы необходимы для выполнения ряда задач, в том числе:

1. Формирование структурного каркаса (матрикса или скаффолда) определенной конфигурации для оптимального роста клеток in vitro.

2. Создание носителей для таргетной доставки лекарственных средств и клеток in vivo.

3. Создание искусственных тканей и органов для последующей трансплантации in vivo.

Как правило, матриксы на основе биоматериалов выполняют структурную функцию, обеспечивая трехмерное окружение для клеток либо лекарственных препаратов [12]. Однако, в то же время, они способны за счет своих функциональных групп непосредственно влиять на свойства, активацию и дифференцировку клеток [13]. Более того, большой интерес представляет функционализация матриксов, при которой скаффолд, построенный на основе полимера с оптимальными механическими характеристиками, модифицируется другим материалом, обладающим определенным воздействием на клетки [14]. В последнее время ведется активная разработка и исследование свойств таких композитных матриксов [15,16].

По происхождению полимера, лежащего в основе матрикса, можно выделить три основные группы:

1. Естественный внеклеточный матрикс, полученный в результате децеллюляризации ткани или органа (например, из печени или кожи) [ 17-20].

2. Матрикс на основе биополимеров - чаще всего белков и полисахаридов (примеры: целлюлоза, агароза, полигидроксибутират (П1 Б, PHB), шелк тутовых шелкопрядов и пауков) [21].

3. Матрикс на основе искусственных полимеров, металлов или минералов (примеры: полилактид (ПЛА, PLA), полиуретан, титановые и силиконовые импланты) [22].

Наименьшей иммуногенностью и наибольшей биосовместимостью обладает естественный матрикс, полученный из ткани реципиента, что представляет интерес для персонализированной медицины [23]. Однако в большинстве случаев такой подход является трудновыполнимым, особенно в ситуации создания искусственного органа для трансплантации. Поэтому большое распространение получают матриксы на основе биополимеров или искусственных полимеров, которые гораздо проще в получении и применении. Однако для таких чужеродных для организма реципиента материалов требуется тщательный контроль их иммуногенности и биосовместимости [13,24].

Среди биополимерных матриксов большой интерес в последнее время вызывают материалы на основе белков шелка - фиброина или спидроина [25-27]. Эти материалы имеют хорошую биосовместимость, полимеры на их основе обладают высокой прочностью и эластичностью, что позволяет создавать различные конфигурации матриксов как для фундаментальных исследований, так и для тканевой инженерии. Далее эти два материала будут рассмотрены более подробно.

1.1.1. Биоматериалы на основе фиброина

Продукция шелка является характерной особенностью некоторых гусениц насекомых семейства Lepidoptrean, среди которых наибольшее хозяйственное значение имеет тутовый шелкопряд Bombyx mori [28]. Шелк гусениц этих насекомых содержит два основных компонента - фиброин и серицин. Чаще всего в качестве биоматериала используется фиброин, что связано со значительной аллергенностью серицина [29], однако в последнее время появляются работы, посвященные возможному использованию и этого белка [5,30,31]. Фиброин получают из коконов шелкопряда после удаления серицина и растворения оставшихся полимерных нитей [28]. Далее мономерный фиброин может быть подвергнут полимеризации, варьирование условий которой позволяет получить разнообразные по структуре и свойствам биоматериалы, в том числе трехмерные матриксы (Рис. 1А).

Биоматериалы на основе фиброина обладают хорошей биосовместимостью in vitro и in vivo [26,27,32-34]. Так, в лаборатории конфокальной микроскопии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством М.М. Мойсеновича исследовали рост клеточной линии 3T3, а также первичной культуры мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) в фиброиновых матриксах и композитных матриксах на основе фиброина с добавлением желатина или гидроксиапатита [35].

Рисунок 1. Морфология фиброиновых и спидроиновых матриксов. Сканирующие электронные микрофотографии фиброин/желатиновых (Ф/Ж, А) и спидроиновых (Сп, Б) микрочастиц. Масштабная линейка слева - 100мкм, справа - 3мкм.

Композитные матриксы на основе желатина обладали наибольшей биосовместимостью, способствовали адгезии и пролиферации клеток. В дальнейшем было подобрано наиболее оптимальное содержание желатина в скаффолдах, которое составило 30%, так как более высокая концентрация приводила к быстрой деградации материала [36]. Интересно, что долгое время фиброин считался относительно инертным материалом, не приводящим к активации клеток in vitro [37,38]. Однако недавно с использованием моноцитов человека были продемонстрированы провоспалительные свойства трехмерных (3D), но не двумерных (2D) фиброиновых матриксов [39]. Этот интересный феномен объяснялся различиями в полимеризации двух типов материалов, однако детальный механизм не был исследован. Известно, что фиброин и серицин в мономерной форме способны активировать в клетках киназы ERK и JNK и стимулировать миграцию клеток [31]. Также недавно было показано, что внутрикожная инъекция растворенного фиброина вызывает активацию транскрипционного фактора NFkB в кератиноцитах у мышей [40]. Таким образом, провоспалительные свойства фиброиновых матриксов зависят от конфигурации скаффолдов и не всегда в полной мере объясняются свойствами мономерного белка.

Благодаря оптимальным механическим свойствам матриксов на основе фиброина, имеется большое количество работ с использованием этого материала для целей регенеративной медицины. Так, фиброиновые матриксы (в том числе - в составе композитных матриксов) активно исследуются в моделях регенерации костей [25,41,42], глаза [43-45], нервных волокон [32,46,47], кожи [48-52], хрящевой ткани [53,54] и других тканей и органов. Также разрабатываются подходы по таргетной доставке лекарств или ростовых факторов с использованием фиброина [33,55,56]. В связи с этим детальное исследование влияния фиброиновых материалов на свойства клеток является крайне актуальной задачей в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

1.1.2. Биоматериалы на основе спидроина

Паучий шелк, по сравнению с шелком шелкопрядов, обладает еще большей прочностью, а также высокой биосовместимостью из-за отсутствия аналогичного серицину покрытия [57]. Однако трудности в получении этого материала естественным путем (например, из пауков Nephila clavipes) пока ограничивают его широкое применение. В связи с этим несколькими группами, в том числе в России, были получены рекомбинантные аналоги основных белков, составляющих нить паучьего шелка - спидроинов [58,59]. Этот способ позволяет не только упростить получение биоматериала, но также внести модификации в первичную структуру белка с целью улучшения его свойств. Например, переспективной модификацией является добавление последовательности трипептида аргинин-глицин-аспартат (RGD), представляющего сайт связывания многих интегринов и, таким образом, повысить степень адгезии клеток к полимеру на основе рекомбинантного белка [60]. Также интересное решение проблемы недостатка спидроина было предложено китайскими учеными: использовать тутовых шелкопрядов с отредактированным геномом и заменой их естественного фиброина на спидроин, что позволяет производить нити из паучьего шелка в большом количестве [61].

Спидроин, как и фиброин, используется для получения различных по структуре трехмерных матриксов (Рис. 1Б), для которых показана высокая биосовместимость in vitro и in vivo, превышающая таковую для фиброиновых каркасов [62,63]. Более того, матриксы на основе спидроина обладают более высоким прорегенеративным потенциалом, как было показано в модели заживления повреждения кости [64].

Таким образом, матриксы на основе белков шелка являются перспективными объектами для тканевой инженерии и регенеративной медицины за счет оптимальных механических характеристик и высокой биосовместимости. В частности, эти материалы представляются пригодными для создания трехмерных искусственных органов, в том числе лимфоидных. В то же время, несмотря на различную структуру и свойства полимеров на основе фиброина и спидроина, сравнительный молекулярный анализ их влияния на фенотип клеток не проводился, что является предметом дальнейшего исследования этих материалов, в том числе в этой работе.

1.2. Биоматериалы для инженерии искусственных лимфоидных органов

Поскольку использование биоматериалов позволяет создавать различные конфигурации трехмерных каркасов для клеток, возникла и активно развивается идея применения этих матриксов для биоинженерии искусственных тканей и органов [12,15,65,66]. Это, с одной стороны, необходимо для лучшего понимания механизмов функционирования полноценных органов, а с другой стороны, имеет большое значение для трансплантологии. Особый интерес представляет биоинженерия искусственных лимфоидных органов, которые могут иметь применение не только в случае иммунодефицитов, но и также для модуляции иммунного ответа в патологических условиях, например, при аутоиммунных, онкологических или инфекционных заболеваниях [8,67].

Для создания искусственного лимфоидного органа необходимо детальное понимание строения естественных лимфоидных тканей и, в первую очередь, их стромального компартмента, который обеспечивает привлечение, позиционирование и функциональность иммунных клеток [68-70]. Стромальные клетки являются источником гомеостатических цитокинов и хемокинов, а также обеспечивают клеточные контакты иммунным клеткам, необходимые для перемещения и взаимодействия с другими клетками в лимфоидном органе. За последние десятилетия накопилось большое количество данных о типах стромальных клеток, их особенностях строения и функций. Это стало возможным благодаря разработке новых методов визуализации стромы, в частности, fate-mapping, прижизненной микроскопии, секвенирования транскриптомов единичных клеток и других [71-74]. Более того, для создания искусственных лимфоидных органов большое значение имеет изучение

механизмов развития лимфоидной ткани в онтогенезе, что также является предметом современных исследований [75].

Далее детальное внимание будет посвящено строению и развитию в онтогенезе лимфоидных органов с фокусом на стромальный компартмент, после чего будут рассмотрены разработанные и опубликованные модели искусственных лимфоидных тканей и органов.

1.2.1. Строение лимфоидных органов

Лимфоидные органы составляют неотъемлемую часть иммунной системы, нарушения в их работе приводят к серьезным иммунодефицитам у человека и животных [76,77]. Выделяют три группы этих органов: первичные, вторичные и третичные. Первичные и вторичные лимфоидные органы в нормальном взрослом организме присутствуют постоянно, тогда как третичные появляются локально в месте возникновения какой-либо сильной и длительной иммунной реакции, например, в области раковой опухоли или хронического воспаления [78]. Первичные лимфоидные органы обеспечивают развитие клеток иммунной системы, а также формирование репертуара рецепторов Ти В-лимфоцитов, тогда как вторичные и третичные обеспечивают их созревание и выживание, взаимодействие друг с другом, связь врожденного и адаптивного звена, а также активацию и поддержание иммунного ответа. Соответственно, моделирование различных лимфоидных органов позволит решить разнообразные задачи как в фундаментальной науке, так и в медицине.

Для всех иммунных органов характерно наличие определенной стромы, часто состоящей из нескольких типов клеток эндотелиального, мезенхимального, а в некоторых случаях эпидермального происхождения. Основными функциями стромы является пространственная организация иммунных клеток в органе, их привлечение, выживание, пролиферация, эффективное взаимодействие с антигенами и другими клетками, хотя в каждом случае эта функция представлена в соответствии с задачами конкретного органа. В костном мозге взрослого организма происходит образование всех гемопоэтических клеток, в том числе всех лейкоцитов, из кроветворных клеток-предшественников и стволовых кроветворных клеток (СКК) (). Для поддержания этих клеточных популяций в костном мозге существуют специальные ниши, обеспечивающие их длительную репопуляцию и поддержание всех необходимых линий дифференцировки [79]. Помимо этого, костный мозг выполняет важную роль в

дифференцировке и работе В-лимфоцитов и плазматических клеток [80], а также содержит нишу для Т-клеток памяти [81]. В тимусе эпителиальные клетки (ТЭК) обеспечивают выживание и селекцию тимоцитов, при этом разные субпопуляции ТЭК обеспечивают положительную и отрицательную селекцию [82]. В отрицательной селекции большую роль играют дендритные клетки, активно презентирующие аутоантигены [83]. Также в тимусе важен мезенхимальный компартмент, роль которого заключается в поддержании функционирования и эпителиальных, и гемопоэтических клеток [84]. В совокупности строма способствует выходу из тимуса зрелых Т-лимфоцитов, способных к распознаванию чужеродных антигенов в контексте молекул MHC и при этом наименее агрессивных к собственным антигенам организма [85,86]. В лимфоузлах, белой пульпе селезенки и других вторичных и третичных лимфоидных органах строма привлекает зрелые иммунные клетки и обеспечивает презентацию антигенов и активацию Т- и В-лимфоцитов, приводящую к их дальнейшей дифференцировке, пролиферации и выполнению эффекторных функций [68]. Помимо этого, вторичные лимфоидные органы выполняют функцию поиска и захвата чужеродных антигенов из лимфотока (лимфоузлы) и кровотока (селезенка). Лимфоидные органы, ассоциированные с пищеварительной системой, играют важную роль в регуляции отношений организма с симбиотической микрофлорой, формировании толерантности к непатогенным бактериям и пищевым антигенам [87]. Стромальный компартмент является наименее изученной частью для всех лимфоидных органов, но при этом вносит решающий вклад в правильную организацию всех иммунных процессов. Наибольший интерес для биоинженерии представляют вторичные лимфоидные органы, в первую очередь, лимфатические узлы, так как в них происходит запуск адаптивного иммунного ответа [8].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Носенко Максим Андреевич, 2019 год

- —

Рисунок 19. Имплантация фиброин/желатиновых и коллагеновых матриксов приводит к инфильтрации имплантов макрофагами. Фиброин/желатиновые (А) и коллагеновые (Б) матриксы были имплантированы мышам дикого типа под капсулу почки. Через три недели был произведен анализ имплантов с помощью иммунофлуоресценции. Для окрашивания были использованы антитела к Б4/80 (желтый цвет). Для окрашивания ядер клеток был использован БЛР1 (синий). Показаны репрезентативные срезы, сделанные посередине имплантированных матриксов. Масштаб - 200мкм. п=5. Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов.

Таким образом, имплантация фиброин/желатиновых матриксов приводит к их васкуляризации через три недели после операции. При этом только фиброин/желатиновые матриксы вызывают значительную инфильтрацию имплантов Т- и В-лимфоцитами, которые кластеризуются и образуют примитивную лимфоидную ткань. Этот процесс более выражен при имплантации фиброин/желатиновых матриксов, заселенных МЭФ.

3.2.3. Активация LTPR на МЭФ не приводит к увеличению количества инфильтрирующих лимфоцитов при имплантации фиброин/желатиновых матриксов.

Лимфоидная ткань, образующаяся при имплантации заселенных фиброин/желатиновых матриксов, является примитивной, поскольку не имеет ключевых маркеров зрелых стромальных клеток, а также содержит сравнительно небольшое количество лимфоцитов. Заселение матриксов МЭФ увеличивает количество инфильтрирующих лимфоцитов, как следует из данных проточной цитометрии (Рис. 20) что указывает на важность использования стромальных клеток в создании искусственной лимфоидной ткани.

CD45+VD*

50000

10000

контроль

МЭФ

WT

LT а КО TNF КО LTbR КО

Рисунок 20. Увеличение количества лимфоцитов, инфильтрирующих фиброин/желатиновые импланты при их заселении МЭФ, зависит от TNF, LTa и

LTßR. Фиброин/желатиновые матриксы, заселенные (МЭФ) или незаселенные (контроль) МЭФ, были имплантированы мышам дикого типа (WT), и нокаутным по LTa (LTa KO), TNF (TNF KO) или LTßR (LTbR KO) мышам под капсулу почки. Через три недели импланты были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Показано количество живых иммунных клеток (CD45+VD") в имплантах. n=4. Данные репрезентативны для двух независимых экспериментов.

Интересно, что увеличение инфильтрации лимфоцитами фиброин/желатиновых имплантов при их заселении МЭФ зависит от сигнальных путей ТОТ1 и ЬТ, так как имплантация заселенных МЭФ матриксов мышам с генетической инактивацией ТОТ1, ЬТа или ЬТрЯ приводила к снижению количества иммунных клеток в матриксах (Рис. 20). Мы предположили, что дополнительная стимуляция сигнального пути ЬТрЯ, ответственного за продукцию гомеостатических цитокинов и хемокинов в лимфоидной ткани, позволит значительно увеличить количество лимфоцитов в имплантах и стимулирует созревания искусственной лимфоидной ткани. Чтобы проверить эту гипотезу, было решено заселить матрикс трансдифференцированными клетками и имплантировать полученный стромальный компартмент мышам. Мы проверили возможность использования как активированных экзогенно с помощью scLTaP МЭФ, так и трансфицированных клеток с пролонгированной экспрессией лиганда LTpR. Однако в обоих случаях значительного повышения количества инфильтрирующих лимфоцитов в импланты, заселенные активированными МЭФ, обнаружено не было (Рис. 21).

В720*

Р4(804

О 40- Т § I х ^т

' 141

соз*

СР4*

Рисунок 21. Заселение фиброин/желатиновых матриксов МЭФ, активированных с помощью scLTaP, не приводит к увеличению количества инфильтрирующих имплант лимфоцитов. Показано содержание и количество В-клеток (А), макрофагов (Б) и Т-клеток (В), в том числе Т-хелперов (Г). Содержание иммунных клеток в имплантах незаселенных (Ф/Ж) или заселенных неактивированными (МЭФ), активированными в течение 24 часов БсЬТаР (актМЭФ) или трансфицированными плазмидой, кодирующей scLTaP (трМЭФ) МЭФ матриксов сравнивалось с паховыми лимфатическими узлами мыши (ЛУ). п=5. Данные репрезентативны для двух независимых экспериментов.

Также был проведен анализ экспрессии генов гомеостатических цитокинов и хемокинов ex vivo через три недели после имплантации, однако значительных различий между пустым либо заселенным активированными или неактивированными МЭФ фиброин/желатиновыми матриксами обнаружено не было (Рис. 22). Предположительно, это говорит о недостаточной выживаемости фибробластов в имплантах в первые недели после имплантации, когда еще не образовалось достаточное количество кровеносных сосудов.

Таким образом, заселение фиброин/желатиновых матриксов МЭФ с активированным LTpR не оказывает существенного влияния на инфильтрацию иммунных клеток в имплант, а также на экспрессию генов гомеостатических цитокинов и хемокинов в имплантированных матриксах. По-видимому, это связано с низкой выживаемостью активированной стромы в первые дни после имплантации матриксов.

л

X

СхсИЗ

л

I

Сс121

I

О

It I

iLiPUii

Ф/Ж МЭФ актМЭФ ЛУ £ Ф/Ж МЭФ актМЭФ ЛУ

л х

is

№

Liu

Ф/Ж МЭФ актМЭФ ЛУ

Рисунок 22. Заселение фиброин/желатиновых матриксов МЭФ, активированных с помощью scLTaP, не приводит к увеличению уровня экспрессии генов Il7, Cxcl13 и Ccl21 в имплантах. Фиброин/желатиновые матриксы, заселенные или незаселенные МЭФ, были имплантированы мышам дикого типа под капсулу почки. Через три недели из имплантов было произведено выделение РНК и проанализирована экспрессия генов с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов Cxcl13 (А), Ccl21 (Б) и Il7 (В) в имплантах незаселенных (Ф/Ж) или заселенных неактивированными (МЭФ) или активированными в течение 24 часов scLTaP МЭФ (актМЭФ) матриксов сравнивалось с паховыми лимфатическими узлами мыши (ЛУ). n=3. Данные репрезентативны для двух независимых экспериментов.

3.3. Характеристика прорегенеративного потенциала

фиброин/желатиновых и спидроиновых микрочастиц.

3.3.1. Фиброин/желатиновые и спидроиновые микроносители способствуют заживлению полнослойных ран кожи и препятствуют фиброзу.

Мы продемонстрировали, что 3D фиброин/желатиновые матриксы способствуют активации фибробластов in vitro и могут быть использованы для получения примитивной лимфоидной ткани при имплантации in vivo. Также ранее был продемонстрирован прорегенеративный потенциал этих скаффолдов [35]. Таким образом, биоматериалы на основе фиброина представляют большой интерес как в тканевой инженерии, так и в регенеративной медицине. Однако, как можно убедиться на примере имплантации матриксов под капсулу почки, макроскопический скаффолд не всегда удобен для применения, особенно in vivo, поскольку требует достаточной васкуляризации для доступа кислорода и питательных веществ для клеток внутри импланта.

В связи с этим, нашими коллегами с кафедры биоинженерии были разработаны микрочастицы на основе фиброин/желатина или спидроина, которые получены из полноразмерных скаффолдов путем измельчения и, следовательно, имеют аналогичную микроструктуру (Рис. 1). Однако такие микроносители удобнее в работе, не требуют длительной васкуляризации солидного импланта и могут быть внесены в организм с помощью инъекции взамен хирургической имплантации. Нас заинтересовала возможность сравнительного анализа двух видов частиц по их влиянию на клетки и по прорегенеративному потенциалу. Для этой цели была выбрана модель заживления полнослойных ран кожи у мышей. Мышам с помощью стилетов для биопсии наносили полнослойные раны, после чего делали подкожную инъекцию фиброин/желатиновых (Ф/Ж МЧ) или спидроиновых (Сп МЧ) микрочастиц. Контрольным мышам вводили фосфатно-солевой буфер (контроль). Динамику заживления проводили с использованием макрофотосъемки ран.

Было обнаружено, что введение фиброин/желатиновых частиц вызывает замедление стягивания раны на 1 день после начала эксперимента (Рис. 23А,Б). Однако в дальнейшем эта разница пропадала, и все три группы мышей имели полностью закрытые раны на 10 день после операции. Нашими коллегами также был проведен гистологический анализ срезов ран после терапии микрочастицами. Они обнаружили значительное ускорение реэпителиализации ран кожи в обеих группах, получавших

частицы, по сравнению с контрольной группой [51]. Полнослойные раны кожи обычно заживают с образованием рубцевой ткани [11]. Интересно, что инъекция обоих типов частиц снижала размер рубца по сравнению с контрольной группой, что говорит об антифибротическом потенциале микроносителей (Рис. 23В).

Таким образом, фиброин/желатиновые и спидроиновые микрочастицы обладают сопоставимым прорегенеративным и антифибротическим потенциалом в модели заживления полнослойных ран кожи.

дни после нанесения ран

1 7 10 21

>S О)

3

го с

с

>

о.

PBS

Ф/Ж

Сп

н 100 ■

О

о 80-

Z о

I X 60-

го л

Q. 40-

го

О. 3"

(1) го

г X 20-

m

ГО

CL 0-

дни после нанесения ран

Ф/Ж

Рисунок 23. Фиброин/желатиновые и спидроиновые частицы ускоряют заживление полнослойных ран кожи и препятствуют развитию фиброза у мышей.

Мышам в день 0 наносили полнослойные раны кожи и делали подкожную инъекцию фиброин/желатиновых (Ф/Ж) или спидроиновых (Сп) микрочастиц в месте раны. Контрольные мыши получали фосфатно-солевой буфер (PBS). На 0, 1, 7, 10 и 21 дни после операции раны мышей фотографировали (А - репрезентативные фотографии). Далее по фотографиям проводили вычисление размера раны относительно изначального (Б), а также определяли размер рубца на 21 день после операции (В). n=5; ****p < 0,0001 (one-way и two-way ANOVA с пост-тестом Холма-Сидока). Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов.

3.3.2. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микроносители вызывают умеренный провоспалительный ответ в МЭФ и макрофагах.

Оба вида микроносителей способствовали заживлению ран кожи, однако механизм этого действия может зависеть от типа материала, из которого изготовлены частицы. Для изучения этого вопроса было решено проанализировать влияние культивирования на Ф/Ж и Сп МЧ на три типа культур клеток, играющих ключевую роль в заживлении ран кожи - фибробласты, кератиноциты и макрофаги [128,212]. Клетки прикреплялись и пролиферировали на поверхности микроносителей, однако имели разную степень адгезии к двум видам частиц. Так стромальные клетки - МЭФ и кератиноциты - имели более высокую степень адгезии к Сп МЧ, чем к Ф/Ж МЧ, тогда как макрофаги более активно прикреплялись к Ф/Ж МЧ (Рис. 24).

МЭФ

Кератиноциты В

Мф

X

3 х х

га м о: ш и зс О

Ф

е;

ас

100

90

80-

70

1 100

х п X X

га м ч ш

U

зе О ь Ф

ас

95

90

85-

Ф/Ж

Сп

^ 80

Ф/Ж

Сп

5 80

к 3

I 60

л m о: ей

и

* 40-

0 ь ш е;

1 20

Ф/Ж

Сп

Рисунок 24. Фиброин/желатиновые частицы стимулируют адгезию макрофагов, тогда как спидроиновые частицы способствуют адгезии МЭФ и кератиноцитов.

МЭФ (А), кератиноциты (Б) и макрофаги (Мф, В) инкубировались в среде вместе с фиброин/желатиновыми (Ф/Ж) или спидроиновыми (Сп) микрочастицами (МЧ) в течение 1 часа в инкубаторе. Затем считали количество клеток, не связанных с частицами, и, на основании этого, вычисляли долю связанных клеток. n=4; *p < 0,05; ***p < 0,001 (критерий Стьюдента). Данные репрезентативны для минимум двух независимых экспериментов.

Поскольку полноразмерные фиброин/желатиновые матриксы имеют провоспалительные свойства, далее был проведен сравнительный анализ двух видов частиц на экспрессию провоспалительных генов МЭФ, кератиноцитами и макрофагами. В согласии с предыдущими данными, МЭФ и макрофаги имели повышенный уровень экспрессии генов молекул адгезии Icaml и Vcaml, что не наблюдалось в случае спидроиновых частиц (Рис. 25). Более того, эти два типа клеток экспрессировали провоспалительные цитокины TNF и IL-6 на уровне мРНК и белка после культивирования на Ф/Ж, но не Сп МЧ (Рис. 26).

Icami

л I

IL

m о

о.

>■

is 3 х л

iS

и □

X

Vcami

s SH s

u К U Ь 01 CL

С 4H и

S fl) 2 -

контроль Ф/Ж МЧ СП МЧ

МЭФ Кератиноциты Мф

МЭФ Кератиноциты Мф

Рисунок 25. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые частицы вызывают оверэкспрессию генов молекул адгезии Icaml и Vcaml в МЭФ и макрофагах.

МЭФ, кератиноциты и макрофаги (Мф) культивировали в стандартных условиях на пластике (контроль), на фиброин/желатиновых (Ф/Ж МЧ) или на спидроиновых (Сп МЧ) микрочастицах в течение 6 часов. Далее анализировали экспрессию генов Icaml (А) и Vcaml (Б). Уровень экспрессии нормировали на контрольные условия культивирования для каждого типа клеток. n=3; *p < 0,05; ***p < 0,001 (one-way ANOVA с пост-тестом Холма-Сидока). Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов.

контроль Ф/ж мч Сп МЧ

Кератиноциты

400

Li

2500

2000

1600

ID 1000

500

МЭФ

МЭФ Кератиноциты

Кератиноциты Мф

Рисунок 26. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микрочастицы вызывают продукцию провоспалительных цитокинов TNF и IL-6 МЭФ и макрофагами. МЭФ, кератиноциты и макрофаги (Мф) культивировали в стандартных условиях на пластике (контроль), на фиброин/желатиновых (Ф/Ж МЧ) или на спидроиновых (Сп МЧ) микрочастицах в течение 6 (А,Б) или 24 (В,Г) часов. Далее анализировали экспрессию генов Tnf (А) и Il6 (Б) клетками через 6 часов и продукция белков TNF (В) и IL-6 (Г) в культуральной среде через 24 часа культивирования. Уровень экспрессии нормировали на контрольные условия культивирования для

каждого типа клеток. n=3; ND - ниже порога детекции; *p < 0,05; ***p < 0,001;

****

<

0,0001 (one-way ANOVA с пост-тестом Холма-Сидока). Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов.

Интересно, что кератиноциты не изменяли уровень экспрессии провоспалительных молекул при культивировании на носителях. Также было обнаружено, что макрофаги более активно секретируют TNF, тогда как МЭФ приобретают высокий уровень продукции IL-6 в ответ на Ф/Ж МЧ. При этом культивирование МЭФ в присутствии растворимых мономерных форм фиброина и спидроина не оказывало влияния на экспрессию генов Tnf и Il6, что говорит о специфичности реакции в ответ на трехмерные фиброин/желатиновые частицы по аналогии с полноразмерным 3D матриксом (Рис. 27).

Рисунок 27. Растворимые фиброин и спидроин не вызывают воспалительного ответа в МЭФ. МЭФ культивировали в стандартных условиях (К) или в присутствии растворимых мономерных форм фиброина (рФ) или спидроина (рСп). Через 6 часов культивирования анализировали экспрессию генов Tnf (А) и Il6 (Б). n=3; ns -недостоверные различия (one-way ANOVA с пост-тестом Холма-Сидока). Данные репрезентативны для двух независимых экспериментов.

Поскольку введение обоих типов носителей снижало образование фиброзной ткани, была изучена экспрессия генов двух профибротических факторов, Ctgf и Fgf2, в МЭФ после их культивирования на Ф/Ж и Сп МЧ, а также в присутствии растворимых форм белков. В согласии с данными in vivo, было обнаружено снижение экспрессии этих генов в МЭФ, культивируемых на обоих видах частиц либо в присутствии растворимого фиброина или спидроина (Рис. 28). Экспрессия этих двух генов не была задетектирована в кератиноцитах или макрофагах (данные не представлены).

Таким образом, фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микроносители обладают провоспалительными свойствами в отношении МЭФ и макрофагов in vitro. При этом оба вида частиц снижают экспрессию профибротических факторов в фибробластах.

А Б

Ctgf Fgf2

Рисунок 28. Фиброин/желатиновые и спидроиновые микрочастицы обладают антифибротическим влиянием на культуру МЭФ. МЭФ культивировали в стандартных условиях (К), на фиброин/желатиновых (Ф/Ж) или спидроиновых (Сп) микрочастицах, а также в присутствии растворимых мономерных форм фиброина (рФ) или спидроина (рСп). Через 6 часов культивирования анализировали экспрессию генов Ctgf (А) и Fgf2 (Б). n=3; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 (one-way ANOVA с посттестом Холма-Сидока). Данные репрезентативны для минимум двух независимых экспериментов.

3.3.3. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микроносители вызывают воспалительный ответ при подкожной имплантации мыши

Далее мы поставили перед собой цель изучить провоспалительные и антифибротические свойства микроносителей in vivo при их подкожной инъекции мыши. Для этого вводили раствор частиц или буфер в качестве контроля, и через 24 часа проводили цитофлуориметрический и иммунофлуоресцентный анализ содержания иммунных клеток в сайтах инъекции, а также анализ экспрессии провоспалительных и профибротических генов.

Было обнаружено, что введение обоих видов носителей вызывает небольшое увеличение инфильтрации кожи миелоидными CD11b+ клетками (Рис. 29Б). При этом, в согласии с данными in vitro, подкожное введение Ф/Ж, но не Сп МЧ приводило к увеличению доли провоспалительных Ly6C+ моноцитов (Рис. 29А,В). Более того, Ly6C+ моноциты характеризовались повышенной экспрессией Ly6C, как видно из данных по средней интенсивности флуоресценции (MFI, Рис. 29Г). Чтобы подтвердить ассоциацию воспалительных моноцитов с Ф/Ж МЧ было сделано иммунофлуоресцентное ex vivo окрашивание носителей после их подкожной имплантации. Действительно, только Ф/Ж, но не Сп МЧ были инфильтрированы Ly6C+ миелоидными клетками, что подтверждает провоспалительные свойства этих частиц in vivo (Рис. 30).

Ly6C

Б В Г

ж 8 0x10*. CD11Ь* 7D Ly6G'Ly6C+ 50 Ly6G"Ly6C 4.0*10'■■ Ly6G"Ly6C+

g т _ --1160*10". T , 3.6x10'

I 4,-10-. ■ ■ 8 гЧ s ¿ т А | — ¿

о И В И НИИ 2эЖЖЖ 2.0x10- W Ш т

К Ф/Ж Сп

К Ф/Ж Сп

К Ф/Ж Сп

К Ф/Ж Сп

Рисунок 29. Фиброин/желатиновые микрочастицы вызывают значительную инфильтрацию провоспалительных моноцитов в кожу при подкожной инъекции.

Мышам подкожно вводили фосфатно-солевой буфер (контроль), фиброин/желатиновые (Ф/Ж) или спидроиновые (Сп) микрочастицы. Через 24 часа из кожи выделяли иммунные клетки и анализировали с помощью проточной цитометрии. Представлены репрезентативные дот-плоты окрашивания CD11b+ клеток по Ly6G и Ly6C (А), общее количество CD11b+ клеток (Б), долю воспалительных (Ly6C+) и прорегенеративных (Ly6C-) моноцитов (В), а также среднюю интенсивность окрашивания Ly6C среди положительных клеток (Г). n=5; *p < 0,05; **p < 0,01 (oneway ANOVA с пост-тестом Холма-Сидока). Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов.

Далее мы проанализировали экспрессию провоспалительных и профибротических генов в коже после введения носителей. К нашему удивлению, уровень экспрессии генов Tnf и Il6 достоверно не отличался в трех группах, что, по-видимому, указывает на незначительный вклад Ф/Ж МЧ в дополнительную продукцию провоспалительных цитокинов при повреждении кожи в результате инъекции (Рис. 31 А). Однако введение обоих видов частиц достоверно увеличивало экспрессию гена хемокина Ccl2, что коррелирует с повышенной инфильтрацией миелоидных клеток в кожу (Рис. 31Б). В согласии с данными in vitro, оба вида частиц способствовали снижению экспрессии гена Fgf2 и в меньшей степени Ctgf (Рис. 31В).

Таким образом, только фиброин/желатиновые частицы индуцировали инфильтрацию провоспалительных миелоидных клеток в коже, в то время как оба вида частиц вызывали снижение экспрессии генов профибротических факторов in vivo.

Ядра

Ly6C

Наложение Светлое поле

Ф/Ж

Сп

Рисунок 30. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микрочастицы вызывают адгезию провоспалительных моноцитов при подкожной имплантации.

Мышам подкожно вводили фиброин/желатиновые (Ф/Ж) или спидроиновые (Сп) микрочастицы. Через 24 часа их выделяли из кожи и анализировали с помощью иммунофлуоресценции. Представлено окрашивание ядер с помощью Hoechst 33342 (синий), Ly6C (красный). Также представлена фотография микрочастиц в режиме «светлое поле» для определения морфологии частицы. Масштаб - 50мкм. Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов.

л

I

О) CD

0

Ii

5 ° 1 s

1 а

1 % 1.0 Я)

......Il.ll

Tnf Iis а Ccl2 СхсИО

В

I 151 т

Piul L

СхсИО

контроль Ф/Ж МЧ Сп МЧ

Ctgf

Fgf2

Рисунок 31. Фиброин/желатиновые и спидроиновые микрочастицы снижают экспрессию профибротических факторов при подкожной имплантации. Мышам подкожно вводили фосфатно-солевой буфер (контроль), фиброин/желатиновые (Ф/Ж МЧ) или спидроиновые (Сп МЧ) микрочастицы. Через 24 часа из кожи выделяли РНК и анализировали экспрессию генов провоспалительных цитокинов Tnf и Il6 (А), хемокинов Ccl2 и Cxcl10 (Б), и профибротических факторов Ctgf и Fgf2 (В). Уровень экспрессии нормировали на контрольную группу мышей. n=5; *p < 0,05; ***p < 0,001 (one-way ANOVA с пост-тестом Холма-Сидока). Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

В последнее время большое внимание уделяется применению биоматериалов как в фундаментальной науке, так и в прикладных областях, таких как тканевая инженерия и регенеративная медицина [15,66,213]. Чаще всего речь идет об их использовании в качестве структурного каркаса для доставки клеток или лекарственных средств [181,182]. Однако гораздо реже поднимается вопрос об их возможном влиянии непосредственно на фенотип клеток. С одной стороны, знания в этой области необходимы для безопасного использования биоматериалов в клинике и минимизации возможных побочных эффектов терапий нового поколения. С другой стороны, исследование этого вопроса может помочь выяснить новые уникальные свойства материалов, которые могут иметь значение для решения тех или иных задач. Более того, принимая во внимание большой упор современной науки в сторону персонализированной медицины, вполне можно ожидать, что для разных пациентов биоматериалы с разными собственными свойствами могут оказать различный терапевтический эффект, и подбор материала для конкретного больного представляется предпочтительным по сравнению со стандартным для всех подходом. Перспективными для применения в клинике материалами являются полимеры на основе белков шелка, в первую очередь фиброина и спидроина [26]. Матриксы на их основе обладают оптимальными механическими характеристиками, они прочные, но при этом элластичные и биодеградируемые. Оба материала обладают значительным прорегенеративным потенциалом in vivo [47,64]. Однако, несмотря на большое количество работ с их использованием, механизмы влияния белков шелка на свойства клеток недостаточно изучены.

В нашей работе мы впервые проанализировали воздействие фиброиновых матриксов на фенотип стромальных клеток, а именно мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). В нашей работе мы использовали в основном модификацию фиброиновых матриксов с помощью желатина [35]. Такие композитные матриксы имеют преимущество перед однокомпонентными, поскольку повышают адгезию и пролиферацию клеток [214]. Мы предположили, что при культивировании на матриксах МЭФ, будучи слабодифференцированными клетками [215], могут начать дифференцироваться в более зрелые популяции стромы. Это характеризуется, в том числе, индукцией экспрессии молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 , которые

необходимы для обеспечения взаимодействия стромы с иммунными клетками. И действительно, мы обнаружили быструю индукцию экспрессии генов Icam-1 и Vcam-1 в МЭФ после культивирования на 3D фиброин/желатиновых матриксах (Рис. 7,8,9). Мы предположили, что такое влияние может быть опосредовано как свойствами фиброина или желатина, так и пространственной организацией матрикса. В последнее время большое внимание уделяется 3D культивированию, так как такие условия наиболее приближены к ситуации в организме, что особенно важно для клеток, имеющих значительное количество контактов в разных плоскостях, таких как стромальные клетки и нейроны. Чтобы разделить возможное влияние трехмерного культивирования и компонентов матрикса, мы взяли в качестве контроля 2D фиброин/желатиновую пленку. Интересно, что только 3D конфигурация фиброин/желатиновых матриксов индуцировала экспрессию молекул адгезии в МЭФ (Рис. 8). Причем, этот эффект был связан с общей индукцией провоспалительного ответа, так как мы также обнаружили повышение экспрессии ключевых провоспалительных цитокинов (TNF, IL-6, IL-1ß) в МЭФ после культивирования на 3D матриксах (Рис. 11). Этот результат согласуется с опубликованными данными о культивировании человеческих моноцитов в 2D и 3D фиброиновых матриксах, где также был обнаружены провоспалительные свойства 3D конфигурации фиброиновых матриксов [39]. Авторы объясняли это разным способом полимеризации фиброина в двух типах матриксов, что, возможно, приводит к появлению сайтов связывания рецепторов врожденного иммунитета. Интересно, что при этом 2D культивирование также оказывало незначительное влияние на экспрессию генов Il6 и Illb, но не Tnf, что говорит о возможной роли именно TNF в индукции экспрессии молекул адгезии МЭФ. Важно, что сама молекула фиброина не обладает провоспалительными свойствами, так как раствор фиброина не вызывает экспрессии генов провоспалительных цитокинов (Рис. 27). На сегодняшний день источник провоспалительных свойств 3D фиброиновых матриксов не установлен. Интересно, что при получении микрочастиц путем измельчения полноразмерного фиброин/желатинового матрикса, их влияние на клетки остается прежним. Фиброин/желатиновые микроносители сохраняют провоспалительные свойства (Рис. 26), что, по-видимому, связано с сохранением микроструктуры скаффолда (Рис. 1).

Еще меньше известно о провоспалительных свойствах фиброиновых матриксов in vivo. Имеются данные, что введение раствора фиброина в кожу вызывает активацию NFkB в

кератиноцитах [40]. Также известно, что рассасывание хирургических нитей из фиброина ассоциировано с воспалительным ответом [38]. В ходе нашей работы мы продемонстрировали применение провоспалительных свойств трехмерных фиброин/желатиновых матриксов in vivo в двух моделях: модели имплантации под капсулу почки и модели заживления полнослойных ран кожи.

Известно, что de novo образование лимфоидной ткани во взрослом организме связано с воспалительным ответом [216]. Так, хроническое воспаление с участием TNF, а также IL-17 вызывает образование третичных лимфоидных органов в очагах поражения [217,218]. Несмотря на то, что в хронических заболеваниях третичная лимфоидная ткань играет скорее отрицательную роль, амплифицируя воспаление, этот механизм может быть использован для контролируемого создания de novo искусственных лимфоидных органов и их дальнейшего применения для модуляции иммунного ответа [219]. Такие органоиды могут быть интересны в качестве сайта индукции противоопухолевого иммунного ответа или, наоборот, для стимуляции регуляторных клеток для подавления аутоиммунных заболеваний. Преимуществом использования искусственных органов является возможность их локальной имплантации и последующего удаления после окончания заболевания. Более того, благодаря достижениям геномного редактирования появилась возможность генетически модифицировать клетки, в том числе стромальные, входящие в состав органоида, чтобы улучшить их функциональность. Так, известно, что стромальные клетки лимфатических узлов поддерживают иммуносупрессорное микроокружение в этих органах, что является одной из причин частых метастазов опухолей в лимфоузлы [220]. Возможно, имплантация в сайт опухоли искусственных лимфатических узлов с отредактированными стромальными клетками, лишенными регуляторных функций, и насыщенными антиген-презентирующими клетками с опухолевыми антигенами может запустить эффективный противоопухолевый иммунный ответ. При этом после избавления от рака такие органоиды могут быть немедленно удалены во избежание возможной аутоиммунной реакции.

Мы предположили, что провоспалительные свойства фиброин/желатиновых матриксов могут быть использованы для локальной индукции воспаления и стимуляции образования искусственной лимфоидной ткани. Действительно, имплантация таких матриксов вызывала инфильтрацию лимфоцитов по сравнению с коллагеновыми матриксами, не обладающими провоспалительными свойствами (Рис. 16,17). Более

того, лимфоциты в имплантированных фиброин/желатиновых скаффолдах, особенно заселенных МЭФ, кластеризовались с образованием примитивной лимфоидной ткани (Рис. 18). Зрелая лимфоидная ткань характеризуется наличием определенных типов стромальных клеток, в первую очередь ФРК и ФДК, а также наличием венул с высоким эндотелием (HEV) [91]. Их присутствие можно задетектировать с помощью окрашивания по определенным маркерам, таким как FDC-M1 для ФДК [92]и PNAd или MAdCAM-1 для HEV [221]. Мы провели иммуногистохимическое окрашивание срезов имплантов на эти маркеры, однако не обнаружили достоверного положительного сигнала, что свидетельствует об отсутствии зрелых стромальных клеток в имплантированных матриксах (данные не представлены). Тем не менее, лимфоидная ткань характеризуется также экспрессией гомеостатических цитокинов и хемокинов, таких как CXCL13, CCL19, CCL21, IL-7 и BAFF [222]. В подтверждение того, что кластеры лимфоцитов в имплантах образуют примитивную лимфоидную ткань, мы обнаружили экспрессию генов некоторых из этих факторов (Cxcl13, Ccl21 и Il7) в образцах имплантированных матриксов (Рис. 22). Это свидетельствует о наличии примитивных стромальных клеток, продуцирующих гомеостатические цитокины и хемокины в имплантах, что говорит в пользу формирования примитивной лимфоидной ткани. Дальнейшая стимуляция лимфонеогенеза необходима для созревания этой ткани. К сожалению, в ходе нашей работы нам не удалось достичь полноценной дифференцировки лимфоидной стромы. Известно, что этот этап зависит от передачи сигнала через LTPR [105]. Мы проверили различные способы активации этого пути на МЭФ с использованием агонистических антител и одноцепочечных лигандов LTPR (Рис. 4). Этот подход приводил к индукции экспрессии генов гомеостатических лимфоидных цитокинов и хемокинов (Рис. 13), но не оказывал влияния на инфильтрацию лимфоцитов in vivo (Рис. 21). Мы предполагаем, что полноразмерные фиброин/желатиновые матриксы при имплантации недостаточным образом снабжаются кислородом и питательными веществами, что приводит к гибели стромальных клеток внутри импланта. Возможно, подход с первоначальной имплантацией пустого матрикса и последующим введением активированных МЭФ после формирования сосудистой сети позволит избежать этой проблемы.

Не менее важным направлением применения биоматериалов является регенеративная медицина. Полимерные матриксы могут не только представлять собой структурный каркас для адгезии, миграции и пролиферации клеток, вовлеченных в процесс

регенерации, но и активировать их за счет своих функциональных групп или связанных лекарственных средств [21,223]. При этом, различные по свойствам матриксы могут использоваться для разных задач, отвечая требованиям персонализированной медицины. Так, известно, что воспалительный ответ в коже является необходимым этапом в процессе заживления ран, а ключевые провоспалительные цитокины TNF и IL-6 необходимы для полноценной и функциональной регенерации кожного покрова [146,157,158,165]. В то же время, избыточное воспаление, например при хронических инфекциях или диабете, приводит к замедлению заживления ран кожи, а также к формированию рубца [155]. Для терапии в таких случаях могут быть использованы биоматериалы, препятствующие развитию фиброза. Так, мы показали прямой антифибротический эффект двух видов микрочастиц на основе фиброина и спидроина в модели полнослойных ран кожи (Рис. 23). Он связан со снижением продукции профибротических факторов фибробластами при их взаимодействии с микрочастицами (Рис. 31). При этом, по-видимому, механизм влияния двух видов частиц на скорость реэпителиализации отличается, так как мы наблюдали различную динамику закрытия раны при терапии фиброин/желатиновыми или спидроиновыми частицами (Рис. 23). Вероятно, фиброин/желатиновые частицы влияют на контракцию раны за счет сокращения подкожной мускулатуры у мышей, что не будет характерно для ран человека. Для более детального понимания прорегенеративных свойств двух видов частиц необходимо исследовать их в модели шинированной полнослойной раны кожи, которая более приближена к ситуации у людей за счет предотвращения контракции [140]. Тем не менее, провоспалительный потенциал фиброин/желатиновых матриксов может быть полезен в ряде случаев, например при терапии ран, осложненных хронической инфекцией или иммунодефицитными состояниями. В этом случае, стимуляция воспалительного ответа может помочь перейти с этапа воспаления на этап реэпителиализации. Также интересным направлением представляется использование комбинации нескольких видов носителей для создания комплексного препарата, ускоряющего заживление кожи. Так, мы показали, что фиброин/желатиновые частицы способствуют адгезии макрофагов, тогда как спидроиновые носители активно взаимодействуют с фибробластами и кератиноцитами (Рис. 24), что указывает на возможность использования смеси этих частиц для активации адгезии всех основных участников процесса кожной регенерации. Наконец, микрочастицы могут быть использованы для адоптивного переноса клеток, обладающих прорегенеративным потенциалом,

например мезенхимальных стволовых клеток (МСК), в том числе аутологичных. Это может иметь значение в случае хронически незаживающих ран кожи, не поддающихся другому лечению, например для диабетических язв [141,224].

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, мы продемонстрировали провоспалительные свойства фиброин/желатиновых матриксов in vitro и in vivo, а также возможность их использования для задач тканевой инженерии и регенеративной медицины.

По результатам работы можно сделать следующие выводы:

1. Культивирование на трехмерных (3D), но не двумерных (2D) фиброин/желатиновых матриксах приводит к увеличению уровня экспрессии провоспалительных цитокинов и молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 в мышиных эмбриональных фибробластах.

2. Имплантация фиброин/желатиновых, но не коллагеновых матриксов под капсулу почки мыши вызывает инфильтрацию и кластеризацию в имплантах иммунных клеток, в том числе Т- и В-лимфоцитов.

3. Заселение фиброин/желатиновых матриксов культурой мышиных эмбриональных фибробластов приводит к повышенной инфильтрации имплантов лимфоцитами с образованием примитивной искусственной лимфоидной ткани. При этом, активация LTPR на фибробластах не приводит к увеличению количества лимфоцитов и не влияет на продукцию гомеостатических цитокинов и хемокинов в имплантах.

4. Фиброин/желатиновые и спидроиновые микрочастицы способствуют заживлению кожи и препятствуют образованию фиброза в мышиной модели полнослойной раны кожи.

5. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микрочастицы индуцируют экспрессию генов провоспалительных факторов в фибробластах и макрофагах, а также снижают уровень экспрессии генов профибротических факторов в фибробластах.

6. Фиброин/желатиновые, но не спидроиновые микрочастицы вызывают повышенную инфильтрацию кожи провоспалительными моноцитами при их подкожном введении.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю огромную благодарность своим научным руководителям, Сергею Артуровичу Недоспасову и Марине Сергеевне Друцкой за возможность поучаствовать в оригинальном и многогранном проекте, помощь в организации работы, планирование и обсуждение экспериментов, ценные замечания и предложения по работе, жизненные советы и бесценный опыт работы в научной лаборатории. Отдельно хочу поблагодарить за предоставленные возможности поучаствовать в научных коллаборациях, стажировках и конференциях, которые помогли мне получить знания, необходимые для работы по проекту и дальнейшей научной деятельности, а также освоить новые методы.

Также я благодарен всем сотрудникам лаборатории молекулярных механизмов иммунитета ИМР РАН за помощь в постановке экспериментов, прекрасную дружественную атмосферу, организацию научной и вненаучной деятельности. Отдельно хочу сказать огромное спасибо Камар-Сулу Атретханы за постоянную поддержку, готовность помочь, интересные идеи и позитивное отношение к жизни.

Большое спасибо Мойсеновичу Михаилу Михайловичу, а также сотрудникам лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ (особенно Анастасии Архиповой и Анастасии Мойсенович) за предоставление матриксов и других материалов, без которых эту работу невозможно было бы представить, ударное и продуктивное сотрудничество, регулярные семинары с ценными обсуждениями.

Отдельно хочу поблагодарить Шебзухова Юрия Владимировича и Киташова Андрея Владимировича за неоценимую моральную поддержку, обучение новым методам, ценнейшие научные и околонаучные обсуждения, а также за большую роль в моем саморазвитии.

Я благодарен преподавателям и сотрудникам кафедры иммунологии МГУ за ценнейшую, интенсивную и широкую программу обучения, которая не только снабдила полезными знаниями в области иммунологии, но и позволила сформировать особый взгляд на биологическую науку в целом. Также спасибо всем студентам, аспирантам и выпускникам кафедры за дружественную обстановку и взаимовыручку. Отдельное спасибо Рафаелу Шаэновичу Казаряну за организационную помощь на многих этапах работы, жизненные советы и приятное времяпровождение в

лаборатории. Также спасибо Дмитрию Борисовичу Киселевскому и Нине Владимировне Взоровой за организацию образовательного процесса.

Также хочу поблагодарить отечественных и зарубежных коллабораторов за предоставленные ресурсы, обучение методам и советы: Владимира Григорьевича Богуша за спидроиновые матриксы, Гарольда Вайанта за лиганды ЬТрЯ и кодирующие их плазмиды, Джеймса Шарпе и Джима Свогера за помощь с иммунофлуоресцентным окрашиванием и ознакомление с методом микроскопии БРГМ, Андрея Круглова, Алексея Туманова, Такеши Ватанабе за ценные советы по выполнению проекта.

Наконец, я хотел бы сказать огромное спасибо моим родителям, родным и друзьям за их бесценную поддержку и веру в меня даже в самые тяжелые моменты работы, большое количество жизненных советов и всяческую помощь.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Hussain A., Takahashi K., Sonobe J., Tabata Y., Bessho K. (2014) Bone regeneration of rat calvarial defect by magnesium calcium phosphate gelatin scaffolds with or without bone morphogenetic protein-2. J. Maxillofac. Oral Surg. 13, 29-35.

2. Rose F.R.A.J., Oreffo R.O.C. (2002) Bone tissue engineering: hope vs hype. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 1-7.

3. Rezwan K., Chen Q.Z., Blaker J.J., Boccaccini A.R. (2006) Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3413-3431.

4. Lutolf M.P., Hubbell J.A. (2005) Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 4755.

5. Nayak S., Dey S., Kundu S.C. (2013) Skin equivalent tissue-engineered construct: co-cultured fibroblasts/ keratinocytes on 3D matrices of sericin hope cocoons. PLoS One. 8, 1-17.

6. Sun B.K., Siprashvili Z., Khavari P.A. (2014) Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science (80-. ). 346, 941-945.

7. Scarrit M.E., Pashos N.C., Bunnell B.A. (2015) A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Front. Bioeng. Biotechnol. 3, 43.

8. Tan J.K.H., Watanabe T. (2010) Artificial engineering of secondary lymphoid organs. Advances in Immunology. 1st ed. 105, 131-157 p.

9. Cupedo T., Stroock A.D., Coles M.C. (2012) Application of tissue engineering to the immune system: development of artificial lymph nodes. Front. Immunol. 3, 1-6.

10. Giese C., Demmler C.D., Ammer R., Hartmann S., Lubitz A., Miller L., Müller R., Marx U. (2006) A human lymph node in vitro - challenges and progress. Artif. Organs. 30, 803-808.

11. White E.S., Mantovani A.R. (2013) Inflammation, wound repair, and fibrosis: Reassessing the spectrum of tissue injury and resolution. J. Pathol. 229, 141-144.

12. O'Brien F.J. (2011) Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Mater. Today. 14, 88-95.

13. Sadtler K., Wolf M.T., Ganguly S., Moad C.A., Chung L., Majumdar S., Housseau F., Pardoll D.M., Elisseeff J.H. (2018) Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415.

14. Carmagnola I., Ranzato E., Chiono V. (2018) Scaffold functionalization to support a tissue biocompatibility. Funct. 3D Tissue Eng. Scaffolds. 255-277.

15. Gloria A., De Santis R., Ambrosio L. (2010) Polymer-based composite scaffolds for tissue engineering. J. Appl. Biomater. Biomech. 8, 57-67.

16. Chiono V., Nardo T., Ciardelli G. (2014) Bioartificial Biomaterials for Regenerative Medicine Applications. Regen. Med. Appl. Organ Transplant. 113-136.

17. Zhang Q., Johnson J.A., Dunne L.W., Chen Y., Iyyanki T., Wu Y., Chang E.I., Branch-Brooks C.D., Robb G.L., Butler C.E. (2016) Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomater. 35, 166-184.

18. Somuncu Ö.S., Co§kun Y., Ballica B., Temiz A.F., Somuncu D. (2019) In vitro artificial skin engineering by decellularized placental scaffold for secondary skin problems of meningomyelocele. J. Clin. Neurosci. 59, 291-297.

19. Jiang W.C., Cheng Y.H., Yen M.H., Chang Y., Yang V.W., Lee O.K. (2014) Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617. Verstegen M.M.A., Willemse J., van den Hoek S., Kremers G.-J., Luider T.M., van Huizen N.A., Willemssen F.E.J.A., Metselaar H.J., IJzermans J.N.M., van der Laan L.J.W., de Jonge J. (2017) Decellularization of Whole Human Liver Grafts Using Controlled Perfusion for Transplantable Organ Bioscaffolds. Stem Cells Dev. 26, 1304-1315.

Faulk D.M., Badylak S.F. (2014) Natural Biomaterials for Regenerative Medicine Applications. Regen. Med. Appl. Organ Transplant. 101-112.

Samavedi S., Poindexter L.K., Van Dyke M., Goldstein A.S. (2014) Synthetic Biomaterials for Regenerative Medicine Applications. Regen. Med. Appl. Organ Transplant. 81-99.

Neves L.S., Rodrigues M.T., Reis R.L., Gomes M.E. (2016) Current approaches and future perspectives on strategies for the development of personalized tissue engineering therapies. Expert Rev. Precis. Med. Drug Dev. 1, 93-108. Brown B.N., Badylak S.F. (2014) Biocompatibility and Immune Response to Biomaterials. Regenerative Medicine Applications in Organ Transplantation 151-162. Melke J., Midha S., Ghosh S., Ito K., Hofmann S. (2016) Silk fibroin as biomaterial for bone tissue engineering. Acta Biomater. 31, 1-16.

Jao D., Mou X., Hu X. (2016) Tissue regeneration: A silk road. J. Funct. Biomater. 7, 22.

Kasoju N., Bora U. (2012) Silk fibroin in tissue engineering. Adv. Healthc. Mater. 1, 393-412.

Rockwood D.N., Preda R.C., Yücel T., Wang X., Lovett M.L., Kaplan D.L. (2011) Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protoc. 6, 1612. Zaoming W., Codina R., Fernandez-Caldas E., Lockey R.F. (1996) Partial characterization of the silk allergens in mulberry silk extract. J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 6, 237-241.

Kunz R.I., Brancalhao R.M.C., Ribeiro L.D.F.C., Natali M.R.M. (2016) Silkworm Sericin: Properties and Biomedical Applications. BiomedRes. Int. 2016, . Martínez-Mora C., Mrowiec A., García-Vizcaíno E.M., Alcaraz A., Cenis J.L.J.L., Nicolás F.J., Martinez-Mora C., Mrowiec A., Garcia-Vizcaino E.M., Alcaraz A., Cenis J.L.J.L., Nicolas F.J. (2012) Fibroin and sericin from Bombyx mori Silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PLoS One. 7, e42271. Yang Y., Chen X., Ding F., Zhang P., Liu J., Gu X. (2007) Biocompatibility evaluation of silk fibroin with peripheral nerve tissues and cells in vitro. Biomaterials. 28, 1643-1652.

Wani S.U.D., Veerabhadrappa G.H. (2018) Silk Fibroin Based Drug Delivery Applications: Promises and Challenges. Curr. Drug Targets. 19, 1177-1190. Thurber A.E., Omenetto F.G., Kaplan D.L. (2015) In vivo bioresponses to silk proteins. Biomaterials. 71, 145-157.

Мойсенович М.М., Архипова А.Ю., Орлова А.А., Друцкая М.С., Волкова С.В., Захаров С.Е., Агапов И.И., Кирпичников М.П. (2014) Композитные матриксы на основе фиброина шелка, желатина и гидроксиапатита для регенеративной медицины и культивирования клеток в трехмерной культуре. Acta Naturae. 1, 2026.

Orlova A.A., Kotlyarova M.S., Lavrenov V.S., Volkova S. V., Arkhipova A Y. (2014) Relationship between Gelatin Concentrations in Silk Fibroin-Based Composite Scaffolds and Adhesion and Proliferation of Mouse Embryo Fibroblasts. Bull. Exp. Biol. Med. 158, 88-91.

Meinel L., Hofmann S., Karageorgiou V., Kirker-Head C., McCool J., Gronowicz G.,

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

Zichner L., Langer R., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D.L. (2005) The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. Biomaterials. 26, 147-155. Panilaitis B., Altman G.H., Chen J., Jin H.J., Karageorgiou V., Kaplan D.L. (2003) Macrophage responses to silk. Biomaterials. 24, 3079-3085.

Bhattacharjee M., Schultz-Thater E., Trella E., Miot S., Das S., Loparic M., Ray A.R., Martin I., Spagnoli G.C., Ghosh S. (2013) The role of 3D structure and protein conformation on the innate andadaptive immune responses to silk-based biomaterials. Biomaterials. 34, 8161-8171.

Park Y.R., Sultan M.T., Park H.J., Lee J.M., Ju H.W., Lee O.J., Lee D.J., Kaplan D.L., Park C.H. (2017) NF-kB signaling is key in the wound healing processes of silk fibroin. ActaBiomater. 67, 183-195.

Sangkert S., Meesane J., Kamonmattayakul S., Chai W.L. (2016) Modified silk fibroin scaffolds with collagen/decellularized pulp for bone tissue engineering in cleft palate: Morphological structures and biofunctionalities. Mater. Sci. Eng. C. 58, 1138-1149. Bhumiratana S., Grayson W.L., Castaneda A., Rockwood D.N., Gil E.S., Kaplan D.L., Vunjak-Novakovic G. (2011) Nucleation and growth of mineralized bone matrix on silk-hydroxyapatite composite scaffolds. Biomaterials. 32, 2812-2820. Dong Y., Dong P., Huang D., Mei L., Xia Y., Wang Z., Pan X., Li G., Wu C. (2015) Fabrication and characterization of silk fibroin-coated liposomes for ocular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 91, 82-90.

Hazra S., Nandi S., Naskar D., Guha R., Chowdhury S., Pradhan N., Kundu S.C., Konar A. (2016) Non-mulberry Silk Fibroin Biomaterial for Corneal Regeneration. Sci. Rep. 6, 21840.

Liu J., Lawrence B.D., Liu A., Schwab I.R., Oliveira L.A., Rosenblatt M.I. (2012) Silk fibroin as a biomaterial substrate for corneal epithelial cell sheet generation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4130-4138.

Tian L., Prabhakaran M.P., Hu J., Chen M., Besenbacher F., Ramakrishna S. (2015) Coaxial electrospun poly(lactic acid)/silk fibroin nanofibers incorporated with nerve growth factor support the differentiation of neuronal stem cells. RSC Adv. 5, 4983849848.

Moisenovich M.M., Plotnikov E.Y., Moysenovich A.M., Silachev D.N., Danilina T.I., Savchenko E.S., Bobrova M.M., Safonova L.A., Tatarskiy V. V, Kotliarova M.S., Agapov I.I., Zorov D.B. (2018) Effect of Silk Fibroin on Neuroregeneration After Traumatic Brain Injury. Neurochem. Res. in press.

Guan G., Bai L., Zuo B., Li M., Wu Z., Li Y., Wang L. (2010) Promoted dermis healing from full-thickness skin defect by porous silk fibroin scaffolds (PSFSs). Biomed. Mater. Eng. 20, 295-308.

Bhardwaj N., Sow W.T., Devi D., Ng K.W., Mandal B.B., Cho N.-J. (2015) Silk fibroin-keratin based 3D scaffolds as a dermal substitute for skin tissue engineering. Integr. Biol. 7, 53-63.

Архипова А.Ю., Носенко М.А., Малюченко Н.В., Зварцев Р.В., Мойсенович А.М., Жданова А.С., Васильева Т.В., Горшкова Е.А., Агапов И.И., Друцкая М.С., Недоспасов С. А., Мойсенович М.М. (2016) Влияние фиброиновых микроносителей на воспаление и регенерацию полнослойных ран кожи у мышей. Биохимия. 81, 1251-1260.

Nosenko M.A., Moysenovich A.M., Zvartsev R. V, Arkhipova A.Y., Zhdanova A.S., Agapov I.I., Vasilieva T. V, Bogush V.G., Debabov V.G., Nedospasov S., Moisenovich M.M., Drutskaya M.S. (2018) Novel biodegradable polymeric microparticles facilitate scarless wound healing by promoting re-epithelialization and inhibiting fibrosis. Front. Immunol. 9, 2851.

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

Farokhi M., Mottaghitalab F., Fatahi Y., Khademhosseini A., Kaplan D.L. (2018) Overview of silk fibroin use in wound dressings. Trends Biotechnol. 36, 907-922. Bhardwaj N., Nguyen Q.T., Chen A.C., Kaplan D.L., Sah R.L., Kundu S.C. (2011) Potential of 3-D tissue constructs engineered from bovine chondrocytes/silk fibroin-chitosan for in vitro cartilage tissue engineering. Biomaterials. 32, 5773-5781. Wang J., Yang Q., Cheng N., Tao X., Zhang Z., Sun X., Zhang Q. (2016) Collagen/silk fibroin composite scaffold incorporated with PLGA microsphere for cartilage repair. Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. 61, 705-711. Mottaghitalab F., Farokhi M., Shokrgozar M.A., Atyabi F., Hosseinkhani H. (2015) Silk fibroin nanoparticle as a novel drug delivery system. J. Control. Release. 206, 161-176.

Yin Z., Kuang D., Wang S., Zheng Z., Yadavalli V.K., Lu S. (2018) Swellable silk fibroin microneedles for transdermal drug delivery. Int. J. Biol. Macromol. 106, 48-56. Rising A., Widhe M., Johansson J., Hedhammar M. (2011) Spider silk proteins: recent advances in recombinant production, structure--function relationships and biomedical applications. Cell. Mol. Life Sci. 68, 169-184.

Lazaris A., Arcidiacono S., Huang Y., Zhou J.-F., Duguay F., Chretien N., Welsh E.A., Soares J.W., Karatzas C.N. (2002) Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science (80-. ). 295, 472-476. Богуш В.Г., Сазыкин А.Ю., Давыдова Л.И., Мартиросян В.В., Сидорук К.В., Глазунов А.В., Акишина Р.И., Шматченко Н.А., Дебабов В.Г. (2006) Получение, очистка и прядение рекомбинантного аналога спидроина 1. Биотехнология. 4, 312.

Morgan A.W., Roskov K.E., Lin-Gibson S., Kaplan D.L., Becker M.L., Simon C.G.J. (2008) Characterization and optimization of RGD-containing silk blends to support osteoblastic differentiation. Biomaterials. 29, 2556-2563.

Xu J., Dong Q., Yu Y., Niu B., Ji D., Li M., Huang Y., Chen X., Tan A. (2018) Mass spider silk production through targeted gene replacement in Bombyx mori . Proc. Natl. Acad. Sci. 115, 8757-8762.

Bogush V.G., Sokolova O.S., Davydova L.I., Klinov D. V., Sidoruk K. V., Esipova N.G., Neretina T. V., Orchanskyi I.A., Makeev V.Y., Tumanyan V.G., Shaitan K. V., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P. (2009) A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins. J. Neuroimmune Pharmacol. 4, 17-27.

Moisenovich M.M., Pustovalova O.L., Yu Arhipova A., Vasiljeva T. V., Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Sevastianov V.I., Kirpichnikov M.P., Agapov I.I. (2011) In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of spidroin 1 scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 96 A, 125-131. Moisenovich M.M., Pustovalova O.L., Shackelford J., Vasiljeva T. V., Druzhinina T. V., Kamenchuk Y.A., Guzeev V. V., Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P., Agapov I.I. (2012) Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds. Biomaterials. 33, 3887-3898.

Sittinger M., Bujia J., Rotter N., Reitzel D., Minuth W.W., Burmester G.R. (1996) Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17, 237-242. Guven S., Chen P., Inci F., Tasoglu S., Erkmen B., Demirci U. (2015) Multiscale assembly for tissue engineering and regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33, 111.

Носенко М.А., Друцкая М.С., Мойсенович М.М., Недоспасов С.А. (2016) Биоинженерия искусственных лимфоидных органов. Acta Naturae. 8, 10-23.

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

Bajenoff M., Egen J.G., Koo L.Y., Laugier J.P., Brau F., Glaichenhaus N., Germain R.N. (2006) Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, 989-1001.

Mueller S.N., Germain R.N. (2009) Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629. Buettner M., Pabst R., Bode U. (2010) Stromal cell heterogeneity in lymphoid organs. Trends Immunol. 31, 80-86.

Mionnet C., Mondor I., Jorquera A., Loosveld M., Maurizio J., Arcangeli M.L., Ruddle N.H., Nowak J., Aurrand-Lions M., Luche H., Bajenoff M. (2013) Identification of a new stromal cell type involved in the regulation of inflamed B cell follicles. PLoS Biol. 11, e1001672.

Jarjour M., Jorquera A., Mondor I., Wiener! S., Narang P., Coles M.C., Klauschen F., Bajenoff M. (2014) Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J. Exp. Med. 211, 1109-1122.

Rodda L.B., Lu E., Bennett M.L., Sokol C.L., Wang X., Luther S.A., Barres B.A., Luster A.D., Ye C.J., Cyster J.G. (2018) Single-Cell RNA Sequencing of Lymph Node Stromal Cells Reveals Niche-Associated Heterogeneity. Immunity. 48, 1014-1028.e6. Golub R., Tan J., Watanabe T., Brendolan A. (2018) Origin and Immunological Functions of Spleen Stromal Cells. Trends Immunol. 39, 503-514. Onder L., Ludewig B. (2018) A Fresh View on Lymph Node Organogenesis. Trends Immunol. 39, 775-787.

Facchetti F., Blanzuoli L., Ungari M., Alebardi O., Vermi W. (1998) Lymph node pathology in primary combined immunodeficiency diseases. Springer Semin. Immunopathol. 19, 459-478.

Owen J.J., Jordan R.K., Raff M.C. (1975) The development of the thymus in the nude mouse. Eur. J. Immunol. 5, 653-655.

Dieu-Nosjean M.-C., Goc J., Giraldo N.A., Sautes-Fridman C., Fridman W.H. (2014) Tertiary lymphoid structures in cancer and beyond. Trends Immunol. 35, 571-580. Anthony B.A., Link D.C. (2014) Regulation of hematopoietic stem cells by bone marrow stromal cells. Trends Immunol. 35, 32-37.

Clark B.R., Keating A. (1995) Biology of Bone Marrow Stroma. Ann. N. Y. Acad. Sci. 770, 70-78.

Di Rosa F. (2016) Two niches in the bone marrow: A hypothesis on life-long T cell memory. Trends Immunol. 37, 503-512.

Abramson J., Anderson G. (2017) Thymic Epithelial Cells. Annu. Rev. Immunol. 35, 85-118.

Cosway E.J., Lucas B., James K.D., Parnell S.M., Carvalho-Gaspar M., White A.J., Tumanov A. V., Jenkinson W.E., Anderson G. (2017) Redefining thymus medulla specialization for central tolerance. J. Exp. Med. 214, 3183-3195. Anderson G., Jenkinson E.J. (2001) Lymphostromal interactions in thymic development and function. Nat. Rev. Immunol. 1, 31-40.

Rodewald H.-R. (2008) Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388. Manley N.R., Richie E.R., Blackburn C.C., Condie B.G., Sage J. (2011) Structure and function of the thymic microenvironment. Front. Biosci. 17, 2461-2477. Mowat A.M. (2003) Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nat. Rev. Immunol. 3, 331-341.

Crivellato E., Vacca A., Ribatti D. (2004) Setting the stage: an anatomist's view of the immune system. Trends Immunol. 25, 210-217.

Eto D., Lao C., DiToro D., Barnett B., Escobar T.C., Kageyama R., Yusuf I., Crotty S. (2011) IL-21 and IL-6 are critical for different aspects of B cell immunity and

redundantly induce optimal follicular helper CD4 T cell (Tfh) differentiation. PLoS One. 6, e17739.

90. Koning J.J., Mebius R.E. (2012) Interdependence of stromal and immune cells for lymph node function. Trends Immunol. 33, 264-270.

91. Chang J.E., Turley S.J. (2014) Stromal infrastructure of the lymph node and coordination of immunity. Trends Immunol. 36, 30-39.

92. Aguzzi A., Kranich J., Krautler N.J. (2014) Follicular dendritic cells: origin, phenotype, and function in health and disease. Trends Immunol. 35, 105-113.

93. Steinman R.M. (1991) The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu. Rev. Immunol. 9, 271-296.

94. Sixt M., Kanazawa N., Selg M., Samson T., Roos G., Reinhardt D.P., Pabst R., Lutz M.B., Sorokin L. (2005) The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, 19-29.

95. Matloubian M., Lo C.G., Cinamon G., Lesneski M.J., Xu Y., Brinkmann V., Allende M.L., Proia R.L., Cyster J.G. (2004) Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427, 355-360.

96. Mebius R.E. (2003) Organogenesis of lymphoid tissues. Nat. Rev. Immunol. 3, 292303.

97. Randall T.D., Carragher D.M., Rangel-Moreno J. (2008) Development of secondary lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 627-650.

98. Astarita J.L., Acton S.E., Turley S.J. (2012) Podoplanin: emerging functions in development, the immune system, and cancer. Front. Immunol. 3, 1-11.

99. Acton S.E., Astarita J.L., Malhotra D., Lukacs-Kornek V., Franz B., Hess P.R., Jakus Z., Kuligowski M., Fletcher A.L., Elpek K.G., Bellemare-Pelletier A., Sceats L., Reynoso E.D., Gonzalez S.F., Graham D.B., Chang J.E., Peters A., Woodruff M.C., Kim Y.A., Swat W., Morita T., Kuchroo V., Carroll M.C., Kahn M.L., Wucherpfennig K.W., Turley S.J. (2012) Podoplanin-rich stromal networks induce dendritic cell motility via activation of the C-type lectin receptor CLEC-2. Immunity. 37, 276-289.

100. Cremasco V., Woodruff M.C., Onder L., Cupovic J., Nieves-Bonilla J.M., Schildberg F.A., Chang J., Cremasco F., Harvey C.J., Wucherpfennig K., Ludewig B., Carroll M.C., Turley S.J. (2014) B cell homeostasis and follicle confines are governed by fibroblastic reticular cells. Nat. Immunol. 15, 973-981.

101. Veerman K., Tardiveau C., Martins F., Coudert J., Girard J.-P. (2019) Single-Cell Analysis Reveals Heterogeneity of High Endothelial Venules and Different Regulation of Genes Controlling Lymphocyte Entry to Lymph Nodes. Cell Rep. 26, 3116-3131.e5.

102. Onder L., Mörbe U., Pikor N., Novkovic M., Cheng H.-W., Hehlgans T., Pfeffer K., Becher B., Waisman A., Rülicke T., Gommerman J., Mueller C.G., Sawa S., Scandella E., Ludewig B. (2017) Lymphatic Endothelial Cells Control Initiation of Lymph Node Organogenesis. Immunity. 47, 80-92.e4.

103. Castagnaro L., Lenti E., Maruzzelli S., Spinardi L., Migliori E., Farinello D., Sitia G., Harrelson Z., Evans S.M., Guidotti L.G., Harvey R.P., Brendolan A. (2013) Nkx2-5+islet1+ mesenchymal precursors generate distinct spleen stromal cell subsets and participate in restoring stromal network integrity. Immunity. 38, 782-791.

104. van de Pavert S.A., Olivier B.J., Goverse G., Vondenhoff M.F.R., Greuter M., Beke P., Kusser K., Höpken U.E., Lipp M., Niederreither K., Blomhoff R., Sitnik K., Agace W.W., Randall T.D., de Jonge W.J., Mebius R.E. (2009) Chemokine CXCL13 is essential for lymph node initiation and is induced by retinoic acid and neuronal stimulation. Nat. Immunol. 10, 1193-1099.

105. Benezech C., White A., Mader E., Serre K., Parnell S., Pfeffer K., Ware C.F.,

106

107