Противовирусная активность IFN-λ в отношении вируса гриппа А и других РНК-содержащих вирусов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ложков Алексей Александрович

• Ложков Алексей Александрович
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Ложков Алексей Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Классификация интерферонов

1.2 Интерфероны I типа: структура, функции

1.2.1Индукция синтеза интерферонов

1.2.2Действие интерферонов на клетку

1.2.3 Биологическая активность интерферонов I типа

1.2.4 Основные интерферон-стимулируемые гены

1.2.5 Интерфероны I типа и апоптоз

1.2.6 Ингибирование сигналинга интерферонов

1.3 Интерфероны III типа

1.3.1 Структура IFN-A,

1.3.2 Продукция IFN-X

1.3.3. Действие IFN-A, на клетку

1.3.4. Иммуномодуляторное действие IFN-A,

1.3.5. Противовирусная активность IFN-A,

1.4 Специфика действия IFN-A, при вирусе гриппа А

1.4.1 Нокаутные модели

1.4.2 Эксперименты in vitro

1.4.3 Плюсы и минусы использования рекомбинантных IFN-A,

1.4.4 Разработка РНК-препаратов на основе IFN-A,

1.5 Заключение по обзору литературы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные линии

2.2 Вирусы

2.3 Лабораторные животные

2.4 Инфицирование клеточных культур

2.5 Определение противовирусной активности интерферонов по отношению к вирусу везикулярного стоматита

2.6 Инфицирование мышей

2.7 Хроматографическая очистка и рефолдинг IFN-À,

2.8 Масс-спектрометрическая идентификация белков

2.9 Иммуноферментный анализ

2.10 Иммуноферментный анализ In-Cell

2.11 Экстракция РНК

2.12 Метод проведения ПЦР в режиме реального времени

2.13 Разработка ПЦР тест-системы для оценки реактогенности экзогенной мРНК

2.14 Получение мРНК-IFNL1 методом in vitro транскрипции

2.15 Статистический анализ результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Оценка кинетики экспрессии генов IFNL в клетках А549

3.1.1 Интерфероновый ответ клеток А549 на инфицирование респираторными вирусами

3.1.2 Оценка экспрессии важнейших интерферон-стимулируемых генов

3.1.3 Определение экспрессии субъединиц рецептора IFNXR

3.2 Получение рекомбинантных IFN-À,

3.2.1 Оптимизация последовательности

3.2.2 Индукция интерферонов

3.2.3 Анализ полученных белков

3.2.4 Индукция интерферон-стимулируемых генов

3.2.6 Противовирусная активность IFN-Á, по отношению к вирусу везикулярного стоматита

3.3 Оценка противовирусной активности hIFN-X1 in vitro

3.3.1 Определение токсичности hIFN-X1 по отношению к клеткам линий A549 и Vero

3.3.2 Стимуляция клеток Vero hIFN-X1

3.3.3 Определение противовирусной активности hIFN-X1 по отношению к вирусу гриппа А

3.3.4 Оценка противовирусной активности hIFN-X1 по отношению к SARS-CoV-2

3.3.5 Оценка противовирусной активности hIFN-X1 по отношению к вирусу лихорадки Чикунгунья

3.3.6 Оценка противовирусной активности hIFN-X1 по отношению к аденовирусу

3.4 Исследование противовирусной активности по отношению к вирусу гриппа А in vivo

3.5 Трансфекции клеток А549 и MDCK MPHK-IFNL1

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРИЛОЖЕНИЕ В

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Противовирусная активность IFN-λ в отношении вируса гриппа А и других РНК-содержащих вирусов»

Актуальность темы исследования

Интерфероны (IFN) - это группа сигнальных белков, которые подавляют распространение инфекции на ранних стадиях заболевания и формируют первую линию защиты против вирусных инфекций у млекопитающих [13, 20, 38, 56]. В зависимости от рецепторов, через который передается сигнал, IFN классифицируют на три основных типа. Наиболее изученными являются IFN I и II типов, в то время как IFN III типа (IFN-X) были открыты только два десятилетия назад. В отличие от других IFN, действие IFN-A, типа ограничено несколькими типами клеток, в первую очередь эпителиальными клетками слизистых оболочек. В силу локального действия IFN III типа можно рассматривать для направленной терапии респираторных вирусных инфекций [65].

В организме человека обнаружено четыре подтипа IFN-X: IFN-X1 (IL-29), IFN-X2 (IL-28A), IFN-X3 (IL-28B) и IFN-X4. Действие IFN-X на клетку осуществляется в результате связывания с локализованным на поверхности клетки рецептором IFNXR, состоящим из субъединиц IFNXR1 и IL10R2, которое приводит к активации экспрессии сотен интерферон-стимулируемых генов (ISGs) [92], к продуктам которых относятся проявляющие выраженную противовирусную активность белок устойчивости к миксовирусу (MxA), 2'5'-олигоаденилатсинтаза (OAS), протеинкиназа R (PKR), индуцированные интерфероном белки с тетратрикопептидными повторами (IFIT), индуцированные интерфероном трансмембранные белки (IFITM) [26, 56, 65, 92].

Селективность действия IFN III типа обусловлена особенностями экспрессии субъединиц IFNXR. Только эпителиальные клетки, кератиноциты, дифференцированные дендритные клетки и гепатоциты продуцируют субъединицу IFNXR1, в то время как экспрессия рецептора IFN I типа обнаружена почти повсеместно. Более того, в отличие от IFN I типа, действие IFN-A, не приводит к системной экспрессии широкой группы провоспалительных цитокинов и хемокинов. Таким образом, способность IFN-A, вызывать активацию

сравнительно узкой группы генов в ограниченной группе клеток-мишеней позволяет считать данный тип IFN перспективным средством терапии гриппа и других респираторных вирусных инфекций, которое может вызывать более локализованный противовирусный ответ, чем IFN I типа [20, 44].

Во всем мире ежегодные сезонные эпидемии гриппа являются причиной смерти до полумиллиона человек [13]. В силу высокой частоты мутаций в геноме вируса гриппа типа А (ВГА) на данный момент не представляется возможным создать универсальную вакцину, которая обеспечила бы надежную защиту против всех возможных штаммов этого вируса. Число противовирусных препаратов ограничено, а их использование сопряжено с риском возникновения резистентных штаммов. В связи с этим актуальной остается разработка новых подходов к профилактике и лечению гриппа, одним из которых является стимуляция компонентов врожденного иммунного ответа организма экзогенным IFN-Á, [13].

Степень разработанности темы исследования

IFN-Á, были открыты только около 20 лет назад и по этой причине их функции являются менее изученными по сравнению с IFN I и II типов. Являясь медиаторами врожденного иммунного ответа, IFN-Á, обладают потенциальной противовирусной активностью, подтвержденной в целом ряде исследований. На сегодняшний день в литературе показана противовирусная активность IFN-Á, по отношению к различным семействам РНК-содержащих вирусов: Orthomyxoviridae [35, 107], Paramyxoviridae [4, 5, 109], Arenaviridae [69], Flaviviridae [47, 82], Caliciviridae [77], Picornaviridae [14, 62]. Способность IFN-Á, преимущественно воздействовать на эпителиальные клетки позволяет считать IFN-Á, потенциальным противовирусным средством [65].

При гриппозной инфекции в исследованиях in vivo показано, что IFN-Á, обеспечивают индукцию противовирусных ISGs и подготавливают клетки респираторного эпителия к возможному вирусному заражению [16, 20], в отличие от IFN I типа не вызывая избыточную продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов [20, 35, 59]. Секреция IFN-Á, клетками эпителия является первичным

защитным механизмом респираторного тракта от ВГА. Только в том случае, когда этот первичный защитный барьер оказывается неэффективным, происходит индукция IFN I типа, зачастую приводящая к развитию неконтролируемых воспалительных процессов [35]. Характер вирусного ответа зависит от дозы инфицирования. У мышей при сублетальной гриппозной инфекции ключевую роль в формировании врожденного иммунного ответа в эпителиальных тканях играют IFN-X, в то время как при летальной инфекции, особенно на поздних этапах протекания заболевания, ведущую роль принято отводить IFN I типа [35].

В настоящем диссертационном исследовании была проведена оценка противовирусной активности IFN-Á, по отношению к ВГА in vitro и in vivo. Противовирусную активность на мышах линии Balb/c определяли при летальных дозах гриппозной инфекции, что позволяет расширить и дополнить ранее полученные результаты о протективном действии IFN-Á, [35], полученные в моделях сублетальной гриппозной инфекции. В силу того, что IFN-Á, способны к индукции ISGs, они проявляют противовирусное действие по отношению к обширной группе РНК-содержащих вирусов. Известно, что репликация вируса Чикунгунья (семейство Togaviridae) может быть подавлена действием IFN I типа [102]. Однако противовирусная активность IFN-Á, по отношению к этому вирусу ранее не была исследована. Мы показали, что IFN-Á, человека обладают противовирусным действием по отношению к РНК-содержащему вирусу Чикунгунья и коронавирусу SARS-CoV-2, что позволяет расширить представления об IFN-Á, как об универсальных противовирусных медиаторах врожденной иммунной системы. Особый интерес представляет перспектива применения препаратов на основе мРНК. В диссертационном исследовании впервые описана кодирующая IFN-X1 человека мРНК-конструкция.

Цель исследования

Целью исследования является получение IFN-X1 человека и оценка его противовирусной активности по отношению к вирусу гриппа А и другим РНК-содержащим вирусам.

Задачи исследования

1) Оценить динамику экспрессии генов IFNL, субъединиц рецептора IFNXR, интерферон-стимулированных генов (MxA, IFIT-1, RIG-1, MDA5) в ответ на инфицирование клеток А549 вирусами гриппа типов А и В;

2) Получить рекомбинантные белки IFN-X1 человека и IFN-X3 мыши, оценить их биологическую активность;

3) Оценить противовирусную активность рекомбинантного IFN-X1 человека in vitro по отношению к вирусу гриппа А и другим РНК-содержащим вирусам (SARS-CoV-2, вирус лихорадки Чикунгунья), а также ДНК-содержащему аденовирусу;

4) Оценить противовирусную активность рекомбинантного IFN-X1 человека и IFN-X3 мыши in vivo;

5) Получить мРНК, кодирующую IFN-X1 человека, и оценить ее противовирусную активность in vitro.

Научная новизна

В работе было показано снижение уровня экспрессии специфической субъединицы рецептора (IFNXR1), ассоциированное с ранней индукцией экспрессии IFNL и ISGs. Этот эффект можно рассматривать в качестве механизма негативной регуляции активности IFN-X-зависимой индукции ISGs. В силу того, что ранее не было информации о негативной регуляции IFN-X-зависимого сигналинга за счет подавления экспрессии специфической субъединицы рецептора IFNXR1 при заражении вирусом гриппа, предполаемый механизм является новым для IFN-X. В то же время, для рецептора к IFN I типа описан механизм клатрин-опосредованного эндоцитоза и лизосомальной деградации субъединиц IFNAR1 и IFNAR2 [106]. Вопрос о специфичности такого механизма подавления активности IFN-Á, для вируса гриппа В (ВГВ) остается открытым.

В работе показано, что полученный нами рекомбинантный IFN-X1 человека (hIFN-X1) обладает противовирусной активностью по отношению к вирусу лихорадки Чикунгунья in vitro. Рекомбинантный hIFN-X1 проявлял

противовирусную активность по отношению к SARS-CoV-2, эти данные были получены независимо и одновременно разными научными коллективами в мире [24, 105].

Показано, что рекомбинантный IFN-X3 мыши (mIFN-X3) способен стимулировать экспрессию ISGs в клетках аденокарциномы человека А549, при этом с помощью современных молекулярно-биологических методов впервые была проведена сравнительная оценка in vitro способности IFN-X1 человека и IFN-Х3 мыши к индукции экспрессии ISGs. Полученные данные позволяют дополнить имеющиеся представления о кросс-видовой активности IFN-X.

В исследовании впервые описана методика получения мРНК-препарата, кодирующего IFN-X1 человека (мРНК-IFNLl). Проведена оценка успешности трансфекции клеток линий А549 и MDCK мРНК-IFNLl, способности клеток А549 и MDCK к секреции IFN-X1 в межклеточное пространство. Для определения реактогенности мРНК была разработана оригинальная ПЦР тест-система для мультиплексной детекции экспрессии индуцируемого ретиноевой кислотой гена (RIG-1), MDA5 и IFIT-1. В результате разработки ПЦР системы был получен патент на изобретение «Многопараметрическая диагностическая тест-система для количественного определения уровня мРНК генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 человека». Впервые показана специфическая противовирусная активность мРНК-IFNL1 по отношению к ВГА.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость диссертационного исследования заключается в изучении специфических особенностей IFN-A, в формировании иммунного ответа по отношению к вирусу гриппа. Была произведена оценка профиля экспрессии генов IFNL и важнейших противовирусных ISGs в ответ на инфицирование клеток А549 вирусами гриппа и аденовирусами 5-го и 6-го серотипов. При заражении ВГВ нами показано ассоциированное с ранней индукцией IFNL и ISGs снижение экспрессии специфической субъединицы IFNXR1, что можно трактовать в качестве механизма негативной регуляции активности IFN-X-зависимых

сигнальных путей; впервые показана противовирусная активность IFN-A, по отношению к вирусу Чикунгунья, что позволяет дополнить наши представления о противовирусной активности IFN-A, по отношению к вирусам семейства Togaviridae. В исследованиях in vivo было показано, что интраназальное введение IFN-X3 мыши снижало летальность гриппозной инфекции и не было ассоциировано с потерей массы тела.

Практическая значимость заключается в получении, хроматографической очистке, оценке биологической и противовирусной активности hIFN-X1 и mIFN-А3. Показанная нами противовирусная активность hIFN-X1 по отношению к различным РНК-содержащим вирусам in vitro позволяет рассматривать данный рекомбинантный белок в качестве перспективного противовирусного препарата, предназначенного для профилактики и терапии респираторных вирусных инфекций.

Методология и методы исследования

В работе были использованы современные методы молекулярной биологии: электрофоретическое разделение белков и нуклеиновых кислот, иммуноферментный анализ (ИФА) в различных форматах (сэндвич-ИФА, In-Cell ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени, методы экстракции тотальной РНК, обратная транскрипция. Для определения первичной структуры рекомбинантных белков использовали MALDI-TOF масс-спектрометрию. Для получения мРНК-препаратов использовали методы клонирования, секвенирования, in vitro транскрипции, хроматографической очистки мРНК.

Особенную важность в данной работе имели методы получения и очистки рекомбинантных IFN-A, (молекулярное клонирование, металл-аффинная хроматография, катионообменная хроматография): продуцируемые E. coli IFN-A, локализованы в тельцах включения, в связи с чем требовалась разработка метода рефолдинга этих белков.

Для оценки противовирусной активности изучаемых IFN использовали современные вирусологические методы: протоколы по инфицированию клеток А549 и Vero, протоколы по инфицированию мышей, определение титра вируса по методу Рида и Менча, определение числа бляшкообразующих единиц (БОЕ).

Для статистической обработки данных и графической интерпретации результатов использовали программы Microsoft Office Excel 2007 и Graph Pad Prism 6.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Полученные рекомбинантные белки IFN-X1 человека и IFN-X3 мыши обладают биологической активностью. IFN-X1 человека проявляет противовирусную активность in vitro по отношению к РНК-содержащим вирусам: вирусу гриппа А, коронавирусу SARS-CoV-2 и арбовирусу лихорадки Чикунгунья.

2) Рекомбинантные IFN-Á, при профилактическом интраназальном введении обладают противовирусной активностью. IFN-X1 человека и IFN-X3 мыши снижают уровень белка NP вируса гриппа А в гомогенате легочных тканей инфицированных мышей. К снижению смертности при заражении мышей линии Balb/c вирусом A/California/07/09 (H1N1)pdm09 в летальной дозе приводит применение IFN-X3 мыши, но не IFN-X1 человека.

3) Трансфекция клеток А549 и MDCK полученной в процессе in vitro трансрипции экзогенной мРНК-IFNLl приводит к синтезу и секреции во внеклеточное пространство IFN-X1 человека, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов диссертационного исследования подтверждается использованием современных методов исследования, которые соответствуют цели работы и поставленным задачам. Во всех экспериментах in vitro количество биологических повторов соответствовало минимальному требуемому количеству

(не менее 3); в исследованиях in vivo размер выборки также позволял получать статистически досворерные результаты. Сформулированные в тексте диссертации научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на фактических данных, продемонстрированных в таблицах и рисунках. Статистический анализ и интерпретация полученных результатов проведены с использованием современных методов обработки информации и статистического анализа.

По результатам, представленным в данной работе, были опубликованы 4 научных статьи в рецензируемых журналах, индексируемых в международных базах данных, а также получено 3 патента на изобретение. Результаты работы были представлены на 5 научных конференциях международного уровня.

Личный вклад соискателя

Автор принимал непосредственное участие во всех этапах научно-исследовательской работы. Соискатель внес определяющий вклад в проведение исследований in vitro: оценке экспрессии IFN, цитокинов и ISGs, оценке биологической и противовирусной активности рекомбинантных IFN-X, получении мРНК препарата мРНК-LFNL!, разработке ПЦР тест-системы для одновременной детекции мРНК генов RIG-1, MDA5, IFIT-1. Также, автор диссертации принимал активное участие в получении рекомбинантных IFN-Á, (совместно с сотрудниками лаборатории генной инженерии и экспрессии рекомбинантных белков ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России) и оценке противовирусной активности IFN-Á, in vivo (совместно с сотрудниками лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России). При непосредственном участии автора диссертации был проведен полный комплекс исследований по всем разделам работы, проанализированы и обобщены результаты исследований, сформулированы выводы. Содержание работы было отражено в выступлениях на научных форумах и международных конференциях. Написание статей по теме диссертации и обсуждение результатов проводилось совместно с соавторами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Классификация интерферонов

ШК - белки семейства цитокинов, секретируемые клетками для регуляции иммунного ответа. Изначально, основываясь на чувствительности молекул к изменению рН среды, ШК были разделены на ШК I типа (стабильные к изменению рН) и II типа (рН чувствительные). После определения аминокислотной последовательности и пространственной структуры белков правомерность разделения на ШК I типа (ШК-а, ШК-Р) и II типа (ШК-у) была только подтверждена [114, 124, 125]. По мере дальнейшего изучения, семейство ШК I типа дополнили новые члены: ГРК-ю, ШК-т, ШК-е, ШК-5 и ШК-к [9]. В контексте обеспечения иммунного ответа по отношению к вирусным инфекциям, наибольший интерес среди ГРК I типа представляют ШК-а, ГРК-Р и ШК-ю [100]. ШК-Р и ГРК-ю - продукты единственных генов и IFNW1, соответственно, в

то время как для ГРК-а обнаружено 13 генов, кодирующих различные подтипы этого белка [114]. У человека кодирующие ШК I типа гены локализованы на 9-ой хромосоме. Ген IFNG, кодирующий ГРК-у, являющийся единственным представителем ГРК П-го типа, находится на 12-ой хромосоме. В начале XXI века семейство ШК пополнилось группой - ШК Ш-го типа, которые также известны как ШК-Х. Гены продуктами которых являются ГРК-Х, расположены на

хромосоме 19 [114]. Различается также и экзон-интронная структура генов ГРК Кодирующие ШК-а, ГРК-Р и ГРК-ю мРНК состоят из единственного экзона, в то время как мРНК ГРК-Х характеризуются мультиэкзонной структурой [114]. Важнейшие ГРК, вовлеченные в индукцию иммунного ответа, представлены в таблице 1.

Действие всех типов ГРК осуществляется благодаря связыванию с локализованным на поверхности клетки гетеродимерным рецептором. Мишенью действия всех ШК I типа является единственный рецептор ШКА^ состоящий из субъединиц ^КАЮ и ГРКАК2. ШК-у связывается с рецепторным комплексом IFNGR1-IFNGR2, ГРК-Х связывается с рецептором ШКХЯ, который состоит из

субъединиц ГРШЮ и IL10R2 [114]. Каждый гетеродимерный рецептор состоит из субъединицы с высокой аффинностью к IFN (IFNAR2, IFNGR1, IFNXR1) и низкой аффинностью (IFNAR1, IFNGR2, IL10R2). Все рецепторы IFN относятся к семейству спиральных цитокиновых рецепторов II класса [106]. Действие IFN направлено на индукцию экспрессии ISGs [114].

Таблица 1 - Основные ГР^ обеспечивающих противовирусную защиту

организма человека

ТИП ^ ГЕН мРНК БЕЛОК РЕЦЕПТОР

ШЛ1/13 ^М_024013.3 1 экзон МР_076918.1 24-189 а.о.

ШЛ2 ^М_000605.4 1 экзон Ш 000596.2 24-188 а.о.

Ш.Л4 ^М_021068.4 1 экзон т_066546.1 24-189 а.о.

Ш.Л5 NМ 002169.3 1 экзон Ш._0021601 22-189 а.о.

Ш.Л6 ММ_021002.2 1 экзон МР_066282.1 24-189 а.о.

IFNЛ7 ММ_021057.2 1 экзон МР 066401.2 24-189 а.о.

итс I ТИПА Ш.Л8 ЫМ_002170.4 1 экзон т._0021б1 24-189 а.о. IFNAR (субъединицы IРNAR1 и ^АЯ2)

IFNЛ10 ММ_002171.2 1 экзон МР_002162.1 24-189 а.о.

ШЛ1/13 ММ_006900.4 1 экзон Ш_008831.3 25-190 а.о.

IFNЛ14 ММ_002172.3 1 экзон Ш_002163.2 24-189 а.о.

IFNЛ16 ММ_002173.3 1 экзон №_002164.1 24-189 а.о.

IFNЛ17 ММ_021268.2 1 экзон МР_067091.1 24-189 а.о.

IFNЛ21 ММ_002175.2 1 экзон т_002Ш.2 24-189 а.о.

ШБ1 ММ_002176.4 №_002167

1 экзон 22-187 а.о.

IFNW1 NM 002177.3 1 экзон NP 002168 22-195 а.о.

IFN II ТИПА IFNG NM 000619.3 4 экзона NP000610 24-161 а.о. IFNGR (субъединицы IFNG1 и IFNG2)

IFN III ТИПА IFNL1 NM172140.2 5 экзонов NP_742152 20-200 а.о. IFNXR (субъединицы IFNXR1 и IL10R2)

IFNL2 NM172138.2 6 экзонов NP742150 26-200 а.о.

IFNL3 NM_00134693 7.2 6 экзонов NP 001333866 1-200 а.о.

NM172139.4 5 экзонов NP742151 22-196 а.о.

IFNL4 NM_001276254.2 5 экзонов NP 001263183 22-179 а.о.

NR_074079.1 5 экзонов Нет белкового продукта —

1.2 Интерфероны I типа: структура, функции

На данный момент больше всего известно об IFN I типа. IFN I типа имеют а-спиральную структуру и состоят из 6 структурных элементов: четырех а-спиралей (A, C, D, F), формирующих антипараллельный пучок спиралей и двух петель [114]. Подтипы IFN-а отличаются друг от друга не значительно, и их аминокислотные последовательности идентичны между собой примерно на 90%, в то время как идентичность IFN-а с другими IFN I типа не превышает 30% [101].

1.2.1Индукция синтеза интерферонов

К основным клеткам-продуцентам IFN принято относить эпителиальные клетки дыхательных путей, плазмоцитоидные дендритные клетки (ПДК) и макрофаги. Продукция IFN-а, в основном, связана с активацией иммунных клеток, в то время как эпителиальные клетки - основной продуцент IFN-A, [48]. В нормальных условиях уровень экспрессии IFN I типа крайне низок.

Для продукции IFN I и III типов требуется активация сенсорных компонентов врожденного иммунного ответа. Индукция IFN тесно ассоциирована

с активацией паттерн-распознающих рецепторов, ведущую роль среди которых играют RIG-I-подобные рецепторы (RLR) [94]. Все РНК-геликазы семейства RLR имеют центральный домен (DExD/H-box helicase domain), обладающий АТФ-азной активностью, и С-концевой домен. Функция этих доменов - связывание молекул чужеродной, в том числе вирусной, РНК. Структура геликаз RIG-I и MDA5 включает также N-концевой домен CARD (Caspase activation and recruitment domains), необходимый для передачи сигнала о проникновении вируса и индукции раннего иммунного ответа клетки. У третьего члена семейства RLR, РНК-геликазы LGP-2, отсутствует домен CARD. Считается, что LGP-2 необходима для регуляции активности RIG-I и MDA5 [94, 111]. Цитозольные сенсоры семейства RLR требуются для защиты организма от РНК-содержащих и ДНК-содержащих вирусов. Единственной группой вирусов, которые не активируют РНК-геликазы RIG-I и MDA5, являются одноцепочечные ДНК-содержащие вирусы [94].

В нормальных условиях РНК-геликазы RIG-I и MDA5 находятся в мономерной форме. Связывание с молекулой чужеродной РНК приводит к их олигомеризации. Только мультимерная форма RIG-I или MDA5 способна взаимодействовать с адаптором, митохондриальным белком антивирусного сигналинга (MAVS), который заякорен на мембранах митохондрий или пероксисом [111]. Этот адаптор взаимодействует с киназами TBK-1 (TANK-binding kinase-1) и IKK-e (IkB kinase-e), активируя интерферон-регуляторные факторы 3 и 7 (IRF-3 и IRF-7). Данные транскрипционные факторы необходимы для индукции интерферонового ответа клетки [94]. Таким образом, активацию РНК-геликаз RIG-1 и MDA5 можно рассматривать в качестве двух дополняющих друг друга механизмов, требуемых для индукции IFN [94].

Проникновение вируса индуцирует экспрессию IFN

^г Гетеродимерный

IFNI и III типа

К л еточн ая мембр ан а

Вирус активирует

РЬЖ (ТЫ?, ЕЬК, НЬЯ и цитозольные сенсоры нуклеиновых кислот)

PRR активируют молекулярные адаптеры

(MyD88, Mal, TRIF)

IN ■Н

1—

К < <

1Л

PRR активируют МАРК-завпспмые сигнальные пути

г

Мо лекуляр ны е адапторы активируют факторы транскрппщш (IRF-3, IRF-7, NF-кВ)

Транскрипционный комплекс

-isgf3

V,

IRf-3

Ядро клетки

гм f-H

< <

1Л <Л

llRF-9

ш

Экспрессия ISGs

1SR1

Рисунок 1 - Индукция и сигнальные пути IFN I и III типов. Адаптировано из [68]

В ответ на сигнал о проникновении вирусной инфекции клетка сначала синтезирует ^N-0, который за счет аутокринного действия стимулирует продукцию остальных IFN I типа. Данную особенность Ш^Р принято называть праймингом [92, 101]. Наиболее изучена индукция ^N-0 фибробластами. Для индукции Ш^Р требуется активация следующих транскрипционных факторов: ядерного фактора кВ (ОТ-кВ) и 1КБ-3. До получения сигнала о вирусной инфекции №-кВ и 1КБ-3 заякорены в цитоплазматической мембране клетки. После детекции вируса происходит транслокация ОТ-кВ и IRF-3 в ядро. Вместе с гетеродимером c-jun/ATF-2 факторы ОТ-кВ и 1КБ-3 образуют единый белковый комплекс, который собирается на промоторе гена и формирует так

называемую энхансосому. Фактор IRF-3 считается необходимым для индукции транскрипции, в то время как без гетеродимера c-jun/ATF-2 и фактора ОТ-кВ транскрипция лишь заметно ослабевает. Формирование энхансосомы облегчает

рекрутирование CREB-связывающего белка, который отвечает за сборку базальной машинерии транскрипции и активацию РНК-полимеразы II [92].

Показано, что преинкубация клеток с IFN в некоторых случаях приводит к усилению способности клетки продуцировать IFN. Прайминг предполагает позитивную ауторегуляцию, благодаря которой синтезированные клеткой IFN действуют на саму же клетку-продуцент и активируют дополнительные стимулирующие экспрессию IFN транскрипционные факторы. Одним из таких факторов является IRF-7. Конститутивную экспрессию фактора IRF-7 отмечают в ПДК или в клетках, уже ранее подвергавшихся активации IFN [92]. Следовательно, можно предположить следующую модель синтеза IFN: сначала клетка осуществляет опосредованную активацией IRF-3 и NF-кВ индукцию IFN-в, секретируемый IFN-в действует аутокринно или паракринно и, в свою очередь, индуцирует экспрессию IRF-7. Экспрессия IRF-7 также может быть усилена благодаря сигналу от сенсорных компонентов клетки о проникновении вирусной инфекции. Транскрипционный фактор IRF-7 связывается с промоторами IFNB и IFNA, и стимулирует экспрессию этих генов [56, 92].

1.2.2Действие интерферонов на клетку

IFN активируют механизмы противовирусной защиты клеток, подготавливая их к проникновению вирусной инфекции. Связывание IFN I типа со своим рецептором приводит к образованию троичного комплекса IFN-a/p/IFNAR1/IFNAR2. При формировании этого комплекса происходит активация тирозинкиназ: Янус-киназы-1 (JAK-1) и тирозинкиназы-2 (TYK-2) [85, 92]. IFN-y активируют Янус-киназы JAK1 и JAK2 [114]. Тирозинкиназы осуществляют фосфорилирование транскрипционных факторов семейства STAT (Преобразователь сигнала и активатор транскрипции, Signal transducer and activator of transcription) [85, 92].

В неактивной форме цитоплазматический участок низкоаффинной субъединицы рецептора (IFNAR1, IL10R2) связан с TYK2, а высокоаффинной субъединицы (IFNAR2, IFNLR1) - c JAK1. Внутриклеточные домены

низкоаффинных субъединиц имеют длину от 70 до 100 аминокислотных остатков, их основной функцией является взаимодействие с тирозинкиназой TYK2. Внутриклеточные домены высокоаффинных субъединиц имеют длину более 200 аминокислотных остатков, эти домены содержат много остатков тирозина и взаимодействуют с JAK1. Фосфорилирование тирозинкиназами JAK1 и TYK2 приводит к рекрутированию факторов транскрипции STAT и их последующему фосфорилированию [114]. Фосфорилированные формы STAT1 и STAT2 димеризуются и вместе с транскрипционным фактором IRF-9 образуют гетеротримерный комплекс ISGF3 (STAT1-STAT2-IRF-9) [92, 106]. За счет фактора IRF-9 данный комплекс связывается с регуляторным элементом ISRE (IFN-stimulated response element), присутствующим на промоторах большинства ISGs [92].

В свою очередь, действие IFN-y приводит к образованию гомодимера STAT1. Считается, что комплекс ISGF3 является примерно в 1000 раз более мощным индуктором ISGs, чем гомодимер STAT1. Если индукция IFN I и III типов происходит под действием лигандов паттерн-распознающих рецепторов, то синтез IFN-y наблюдается, в основном, в активированных антигенами Т-лимфоцитах. Таким образом, IFN-a/ß и IFN-A, относят к медиаторам врожденного иммунитета, которые обеспечивают быстрый ответ клетки на вирусную инфекцию, хотя эти IFN способны также влиять и на адаптивный иммунный ответ. Наоборот, IFN-y - медиаторы приобретенного иммунного ответа, они также являются активаторами макрофагов, что помогает организму противостоять микобактериям [114].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ложков Алексей Александрович, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Amanzada A. [et al.]. Interferon-X4 (IFNL4) Transcript Expression in Human Liver Tissue Samples // PLoS ONE. 2013. № 12 (8). C. e84026.

2. Amini-Bavil-Olyaee S. [et al.]. The Antiviral Effector IFITM3 Disrupts Intracellular Cholesterol Homeostasis to Block Viral Entry // Cell Host & Microbe. 2013. № 4 (13). C. 452-464.

3. Baltimore D. Expression of animal virus genomes. // Bacteriological Reviews. 1971. № 3 (35). C. 235-241.

4. Banos-Lara M. D. R. [et al.]. Impact and Regulation of Lambda Interferon Response in Human Metapneumovirus Infection // Journal of Virology. 2015. № 1 (89). C. 730-742.

5. Banos-Lara M. D. R., Ghosh A., Guerrero-Plata A. Critical Role of MDA5 in the Interferon Response Induced by Human Metapneumovirus Infection in Dendritic Cells and In Vivo // Journal of Virology. 2013. № 2 (87). C. 1242-1251.

6. Bogdanow B. [et al.]. The dynamic proteome of influenza A virus infection identifies M segment splicing as a host range determinant // Nature Communications. 2019. № 1 (10). C. 5518.

7. Candiano G. [et al.]. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis // ELECTROPHORESIS. 2004. № 9 (25). C. 1327-1333.

8. Cao Y. [et al.]. Differential responses of innate immunity triggered by different subtypes of influenza a viruses in human and avian hosts // BMC Medical Genomics. 2017. № S4 (10). C. 70.

9. Capobianchi M. [et al.]. Type I IFN family members: similarity, differences and interaction // Cytokine & growth factor reviews. 2015. № 2 (26). C. 103-111.

10. Chahal J. S., Qi J., Flint S. J. The Human Adenovirus Type 5 E1B 55 kDa Protein Obstructs Inhibition of Viral Replication by Type I Interferon in Normal Human Cells // PLoS Pathogens. 2012. № 8 (8). C. e1002853.

11. Chan R. W. Y. [et al.]. Tropism of and Innate Immune Responses to the Novel Human Betacoronavirus Lineage C Virus in Human Ex Vivo Respiratory Organ Cultures // Journal of Virology. 2013. № 12 (87). C. 6604-6614.

12. Chu H. [et al.]. Comparative Replication and Immune Activation Profiles of SARS-CoV-2 and SARS-CoV in Human Lungs: An Ex Vivo Study With Implications for the Pathogenesis of COVID-19 // Clinical Infectious Diseases. 2020. № 6 (71). C. 1400-1409.

13. Cole S. L., Ho L. P. Contribution of innate immune cells to pathogenesis of severe influenza virus infection // Clinical Science. 2017. № 4 (131). C. 269-283.

14. Contoli M. [et al.]. Role of deficient type III interferon-X production in asthma exacerbations // Nature Medicine. 2006. № 9 (12). C. 1023-1026.

15. Cormack B. P., Valdivia R. H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent

protein (GFP) // Gene. 1996. № 1 (173). C. 33-38.

16. Crotta S. [et al.]. Type I and Type III Interferons Drive Redundant Amplification Loops to Induce a Transcriptional Signature in Influenza-Infected Airway Epithelia // PLoS Pathogens. 2013. № 11 (9). C.e1003773.

17. Cuddihy A. R. [et al.]. The double-stranded RNA activated protein kinase PKR physically associates with the tumor suppressor p53 protein and phosphorylates human p53 on serine 392 in vitro // Oncogene. 1999. № 17 (18). C. 2690-2702.

18. Dai C., Krantz S. B. Interferon y Induces Upregulation and Activation of Caspases 1, 3, and 8 to Produce Apoptosis in Human Erythroid Progenitor Cells // Blood. 1999. № 10 (93). C. 3309-3316.

19. Davidson S. [et al.]. Pathogenic potential of interferon aß in acute influenza infection // Nature Communications. 2014. № 1 (5). C. 3864.

20. Davidson S. [et al.]. IFN X is a potent anti-influenza therapeutic without the inflammatory side effects of IFN a treatment // EMBO Molecular Medicine. 2016. № 9 (8). C. 1099-1112.

21. Dellgren C. [et al.]. Human interferon-X3 is a potent member of the type III interferon family // Genes & Immunity. 2009. № 2 (10). C. 125-131.

22. Diaz-San Segundo F. [et al.]. Antiviral activity of bovine type III interferon against foot-and-mouth disease virus // Virology. 2011. № 2 (413). C. 283-292.

23. Diegelmann J. [et al.]. Comparative Analysis of the Lambda-Interferons IL-28A and IL-29 regarding Their Transcriptome and Their Antiviral Properties against Hepatitis C Virus // PLoS ONE. 2010. № 12 (5). C. e15200.

24. Dinnon K. H. [et al.]. A mouse-adapted SARS-CoV-2 model for the evaluation of COVID-19 medical countermeasures. // bioRxiv : the preprint server for biology. 2020. (bioRxiv.).

25. Doyle S. E. [et al.]. Interleukin-29 uses a type 1 interferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes // Hepatology. 2006. № 4 (44). C. 896-906.

26. Egli A. [et al.]. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections // Emerging Microbes and Infections. 2014. № 1 (3). C. 1- 12.

27. Egli A. [et al.]. Immunomodulatory function of interleukin 28B during primary infection with cytomegalovirus // Journal of Infectious Diseases. 2014. № 5 (210). C. 717-727.

28. Espert L., Codogno P., Biard-Piechaczyk M. Involvement of autophagy in viral infections: antiviral function and subversion by viruses // Journal of Molecular Medicine. 2007. № 8 (85). C. 811.

29. Feeley E. M. [et al.]. IFITM3 inhibits influenza a virus infection by preventing cytosolic entry // PLoS Pathogens. 2011. № 10 (7).

30. Feld J. J. [et al.]. Peginterferon lambda for the treatment of outpatients with COVID-19: a phase 2, placebo-controlled randomised trial // The Lancet Respiratory Medicine. 2021. № 5 (9). C. 498-510.

31. Felgenhauer U. [et al.]. Inhibition of SARS-CoV-2 by type I and type III interferons // Journal of

Biological Chemistry. 2020. № 41 (295). C. 13958-13964.

32. Ferrantini M., Capone I., Belardelli F. Interferon-a and cancer: Mechanisms of action and new perspectives of clinical use // Biochimie. 2007. № 6-7 (89). C. 884-893.

33. Foster K. A. [et al.]. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism // Experimental Cell Research. 1998. № 2 (243). C. 359-366.

34. François-Newton V. [et al.]. USP18-based negative feedback control is induced by type I and type III interferons and specifically inactivates interferon a response // PLoS ONE. 2011. № 7 (6). C. e22200.

35. Galani I. E. [et al.]. Interferon-X Mediates Non-redundant Front-Line Antiviral Protection against Influenza Virus Infection without Compromising Host Fitness // Immunity. 2017. № 5 (46). C. 875890.

36. Griffiths S. J. [et al.]. A Systematic Analysis of Host Factors Reveals a Med23-Interferon-X Regulatory Axis against Herpes Simplex Virus Type 1 Replication // PLoS Pathogens. 2013. № 8 (9). C.e1003514.

37. Guo J., Peters K. L., Sen G. C. Induction of the Human Protein P56 by Interferon, Double-Stranded RNA, or Virus Infection // Virology. 2000. № 2 (267). C. 209-219.

38. Guo X. zhi J., Thomas P. G. New fronts emerge in the influenza cytokine storm // Seminars in Immunopathology. 2017. T. 39. C. 541-550.

39. Hadjadj J. [et al.]. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients // Science. 2020. № 6504 (369). C. 718-724.

40. Hale B. G. [et al.]. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses // Journal of General Virology. 2008. № 10 (89). C. 2359-2376.

41. Haller O. [et al.]. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity // Trends in microbiology.

42. Hamming O. J. [et al.]. Crystal Structure of Zebrafish Interferons I and II Reveals Conservation of Type I Interferon Structure in Vertebrates // Journal of Virology. 2011. № 16 (85). C. 8181-8187.

43. Hamming O. J. [et al.]. Interferon lambda 4 signals via the IFNX receptor to regulate antiviral activity against HCV and coronaviruses // EMBO Journal. 2013. № 23 (32). C. 3055-3065.

44. Hermant P., Michiels T. Interferon-X in the context of viral infections: Production, response and therapeutic implications // Journal of Innate Immunity. 2014. T. 6. C. 563-574.

45. Hernández P. P. [et al.]. Interferon-X and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection // Nature Immunology. 2015. № 7 (16). C. 698-707.

46. Hillyer P. [et al.]. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent // Immunology and Cell Biology. 2012. № 8 (90). C. 774-783.

47. Hsu Y.-L. [et al.]. Dengue virus infection induces interferon-lambda1 to facilitate cell migration // Scientific Reports. 2016. № 1 (6). C. 24530.

48. Ioannidis I. [et al.]. Toll-Like Receptor Expression and Induction of Type I and Type III Interferons in Primary Airway Epithelial Cells // Journal of Virology. 2013. № 6 (87). C. 3261-3270.

49. Iordanov M. S. [et al.]. Recruitment of TRADD, FADD, and caspase 8 to double-stranded RNA-triggered death inducing signaling complexes (dsRNA-DISCs) // Apoptosis. 2005. № 1 (10). C. 167176.

50. Jacobs S. [et al.]. Species Specificity of Type III Interferon Activity and Development of a Sensitive Luciferase-Based Bioassay for Quantitation of Mouse Interferon-X // Journal of Interferon & Cytokine Research. 2018. № 11 (38). C. 469-479.

51. Jaitin D. A. [et al.]. Inquiring into the Differential Action of Interferons (IFNs): an IFN-a2 Mutant with Enhanced Affinity to IFNAR1 Is Functionally Similar to IFN-ß // Molecular and Cellular Biology. 2006. № 5 (26). C. 1888-1897.

52. Jaks E. [et al.]. Differential Receptor Subunit Affinities of Type I Interferons Govern Differential Signal Activation // Journal of Molecular Biology. 2007. № 2 (366). C. 525-539.

53. Jewell N. A. [et al.]. Differential Type I Interferon Induction by Respiratory Syncytial Virus and Influenza A Virus In Vivo // Journal of Virology. 2007. № 18 (81). C. 9790-9800.

54. Jewell N. A. [et al.]. Lambda Interferon Is the Predominant Interferon Induced by Influenza A Virus Infection In Vivo // Journal of Virology. 2010. № 21 (84). C. 11515-11522.

55. Jordan W. [et al.]. Human interferon lambda-1 (IFN-X 1/IL-29) modulates the Th1/Th2 response // Genes & Immunity. 2007. № 3 (8). C. 254- 261.

56. Killip M. J., Fodor E., Randall R. E. Influenza virus activation of the interferon system // Virus Research. 2015. (209). C. 11-22.

57. Kim H. J. [et al.]. Nasal commensal Staphylococcus epidermidis enhances interferon-X-dependent immunity against influenza virus // Microbiome. 2019. № 1 (7). C. 80.

58. Kimura T. [et al.]. Ifit1 Inhibits Japanese Encephalitis Virus Replication through Binding to 5' Capped 2'-O Unmethylated RNA // Journal of Virology. 2013. № 18 (87). C. 9997-10003.

59. Klinkhammer J. [et al.]. IFN-X prevents influenza virus spread from the upper airways to the lungs and limits virus transmission. // eLife. 2018. (7). C. e33354.

60. Knosp C. A., Johnston J. A. Regulation of CD4 + T-cell polarization by suppressor of cytokine signalling proteins // Immunology. 2012. № 2 (135). C. 101-111.

61. Koch S., Finotto S. Role of Interferon-X in allergic asthma // Journal of Innate Immunity. 2015. T. 7. C. 224-230.

62. Koltsida O. [et al.]. IL-28A (IFN-X2) modulates lung DC function to promote Th1 immune skewing and suppress allergic airway disease // EMBO Molecular Medicine. 2011. № 6 (3). C. 348-

63. LACHOVA V. [et al.]. Comparison of transcriptional profiles of interferons, CXCL10 and RIG-1 in influenza infected A549 cells stimulated with exogenous interferons // Acta virologica. 2017. № 02 (61). C. 183-190.

64. Lasfar A. [et al.]. Characterization of the mouse IFN-X ligand-receptor system: IFN-Xs exhibit antitumor activity against B16 melanoma // Cancer Research. 2006. № 8 (66). C. 4468-4477.

65. Lazear H. M., Nice T. J., Diamond M. S. Interferon-X: Immune Functions at Barrier Surfaces and Beyond // Immunity. 2015. T. 43. C. 15-28.

66. Li M., Huang D. On-column refolding purification and characterization of recombinant human interferon-X1 produced in Escherichia coli // Protein Expression and Purification. 2007. № 1 (53). C. 119-123.

67. Li Y. [et al.]. Adenovirus expressing IFN-X1 (IL-29) attenuates allergic airway inflammation and airway hyperreactivity in experimental asthma // International Immunopharmacology. 2014. № 1 (21). C. 156-162.

68. Lozhkov A. A. [et al.]. The Key Roles of Interferon Lambda in Human Molecular Defense against Respiratory Viral Infections // Pathogens. 2020. № 12 (9). C. 989.

69. Lukacikova L. [et al.]. Antiviral Effect of Interferon Lambda Against Lymphocytic Choriomeningitis Virus // Journal of Interferon & Cytokine Research. 2015. № 7 (35). C. 540-553.

70. Magalhaes P. O. [et al.]. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. // Journal of pharmacy & pharmaceutical sciences : a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutiques. 2007. № 3 (10). C. 388404.

71. Major J. [et al.]. Type I and III interferons disrupt lung epithelial repair during recovery from viral infection // Science. 2020. № 6504 (369). C. 712-717.

72. Malakhova O. A. [et al.]. UBP43 is a novel regulator of interferon signaling independent of its ISG15 isopeptidase activity // EMBO Journal. 2006. № 11 (25). C. 2358-2367.

73. Miknis Z. [et al.]. Crystal structure of human interferon-X1 in complex with its high-affinity receptor interferon-XR1 // Journal of molecular biology. 2010. № 4 (404). C. 650-664.

74. Mordstein M. [et al.]. Interferon-X contributes to innate immunity of mice against influenza A virus but not against hepatotropic viruses // PLoS Pathogens. 2008. № 9 (4). C. e1000151.

75. Mordstein M. [et al.]. Lambda Interferon Renders Epithelial Cells of the Respiratory and Gastrointestinal Tracts Resistant to Viral Infections // Journal of Virology. 2010. № 11 (84). C. 56705677.

76. MORI Y. [et al.]. Virology of the Family Togaviridae // Uirusu. 2011. № 2 (61). C. 211-220.

77. Nice T. J. [et al.]. Interferon-X cures persistent murine norovirus infection in the absence of

adaptive immunity // Science. 2015. № 6219 (347). C. 269-273.

78. Niwa M. [et al.]. IL-17A Attenuates IFN-X Expression by Inducing Suppressor of Cytokine Signaling Expression in Airway Epithelium // The Journal of Immunology. 2018. № 8 (201). C. 23922402.

79. O'Brien T. R. [et al.]. Weak Induction of Interferon Expression by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Supports Clinical Trials of Interferon-X to Treat Early Coronavirus Disease 2019 // Clinical Infectious Diseases. 2020. № 6 (71). C. 1410-1412.

80. Onoguchi K. [et al.]. Viral infections activate types I and III interferon genes through a common mechanism // Journal of Biological Chemistry. 2007. № 10 (282). C. 7576-7581.

81. Osada N. [et al.]. The Genome Landscape of the African Green Monkey Kidney-Derived Vero Cell Line // DNA Research. 2014. № 6 (21). C. 673-683.

82. Palma-Ocampo H. K. [et al.]. Interferon lambda inhibits dengue virus replication in epithelial cells // Virology Journal. 2015. № 1 (12). C. 150.

83. Pardi N. [et al.]. mRNA vaccines — a new era in vaccinology // Nature Reviews Drug Discovery. 2018. № 4 (17). C. 261-279.

84. Planet P. J. [et al.]. Lambda Interferon Restructures the Nasal Microbiome and Increases Susceptibility to Staphylococcus aureus Superinfection // mBio. 2016. № 1 (7).

85. Platanias L. C. Mechanisms of type-I- and type-II-interferon-mediated signalling // Nature Reviews Immunology. 2005. T. 5. C. 375-386.

86. Pott J. [et al.]. IFN-X determines the intestinal epithelial antiviral host defense // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011. № 19 (108). C. 7944-7949.

87. Prendergast F. G., Mann K. G. Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea // Biochemistry. 1978. № 17 (17). C. 3448-3453.

88. Prokunina-Olsson L. [et al.]. A variant upstream of IFNL3 (IL28B) creating a new interferon gene IFNL4 is associated with impaired clearance of hepatitis C virus // Nature genetics. 2013. № 2 (45). C. 164-171.

89. Qian Z. [et al.]. Innate Immune Response of Human Alveolar Type II Cells Infected with Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2013. № 6 (48). C. 742-748.

90. Rabbani M. A. G. [et al.]. Identification of Interferon-Stimulated Gene Proteins That Inhibit Human Parainfluenza Virus Type 3 // Journal of Virology. 2016. № 24 (90). C. 11145-11156.

91. Ramos I. [et al.]. Innate Immune Response to Influenza Virus at Single-Cell Resolution in Human Epithelial Cells Revealed Paracrine Induction of Interferon Lambda 1 // Journal of Virology. 2019. № 20 (93). C. e00559-19.

92. Randall R. E., Goodbourn S. Interferons and viruses: An interplay between induction, signalling,

antiviral responses and virus countermeasures // Journal of General Virology. 2008. T. 89. C. 1-47.

93. Raychoudhuri A. [et al.]. ISG56 and IFITM1 Proteins Inhibit Hepatitis C Virus Replication // Journal of Virology. 2011. № 24 (85). C. 12881-12889.

94. Rehwinkel J., Gack M. U. RIG-I-like receptors: their regulation and roles in RNA sensing // Nature Reviews Immunology. 2020. № 9 (20). C. 537-551.

95. Rich H. E. [et al.]. Interferon lambda inhibits bacterial uptake during influenza superinfection // Infection and Immunity. 2019. № 5 (87).

96. Robertson C. M. [et al.]. Neutrophil Depletion Causes a Fatal Defect in Murine Pulmonary Staphylococcus aureus clearance // Journal of Surgical Research. 2008. № 2 (150). C. 278-285.

97. Sarasin-Filipowicz M. [et al.]. Alpha Interferon Induces Long-Lasting Refractoriness of JAKSTAT Signaling in the Mouse Liver through Induction of USP18/UBP43 // MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY. 2009. № 17 (29). C. 4841-4851.

98. Scorza F., Pardi N. New Kids on the Block: RNA-Based Influenza Virus Vaccines // Vaccines. 2018. № 2 (6). C. 20.

99. Shahbazi M. [et al.]. Linkage of Lambda Interferons in Protection Against Severe COVID-19 // Journal of Interferon & Cytokine Research. 2021. № 4 (41). C. 149-152.

100. Skorvanova, L.; Svancarova, P.; Svetlikova, D.; Betakova T. Protective efficacy of IFN-ro AND IFN-Xs against influenza viruses in induced A549 cells // Acta Virologica. 2015. № 4 (59). C. 4137.

101. Sommereyns C. [et al.]. IFN-lambda (IFN-X) is expressed in a tissue-dependent fashion and primarily acts on epithelial cells in vivo // PLoS Pathogens. 2008. № 3 (4). C. e1000017.

102. Sourisseau M. [et al.]. Characterization of Reemerging Chikungunya Virus // PLoS Pathogens. 2007. № 6 (3). C. e89.

103. Srinivas S. [et al.]. Interferon-X1 (interleukin-29) preferentially down-regulates interleukin-13 over other T helper type 2 cytokine responses in vitro // Immunology. 2008. № 4 (125). C. 492-502.

104. Staeheli P. [et al.]. Influenza virus-susceptible mice carry Mx genes with a large deletion or a nonsense mutation. // Molecular and Cellular Biology. 1988. № 10 (8). C. 4518-4523.

105. Stanifer M. L. [et al.]. Critical Role of Type III Interferon in Controlling SARS-CoV-2 Infection in Human Intestinal Epithelial Cells // Cell Reports. 2020. № 1 (32). C. 107863.

106. Stanifer M. L., Pervolaraki K., Boulant S. Differential Regulation of Type I and Type III Interferon Signaling // International Journal of Molecular Sciences. 2019. № 6 (20). C. 1445.

107. Sun Y. [et al.]. IFN-X: A new spotlight in innate immunity against influenza virus infection // Protein & Cell. 2018. № 10 (9). C. 832-837.

108. Takaoka A. [et al.]. Integration of interferon-a/ß signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence // Nature. 2003. № 6948 (424). C. 516-523.

109. Taniguchi M., Yanagi Y., Ohno S. Both type I and type III interferons are required to restrict

measles virus growth in lung epithelial cells // Archives of Virology. 2019. (164). C. 439-446.

110. Terenzi F. [et al.]. Distinct Induction Patterns and Functions of Two Closely Related Interferon-inducible Human Genes, ISG54 and ISG56 // Journal of Biological Chemistry. 2006. № 45 (281). C. 34064-34071.

111. Thompson M. R. [et al.]. Pattern Recognition Receptors and the Innate Immune Response to Viral Infection // Viruses. 2011. № 6 (3). C. 920-940.

112. virology P. C.-F., 2007 undefined Respiratory syncytial virus and metapneumovirus // ci.nii.ac.jp.

113. Wacher C. [et al.]. Coordinated Regulation and Widespread Cellular Expression of Interferon-Stimulated Genes (ISG) ISG-49, ISG-54, and ISG-56 in the Central Nervous System after Infection with Distinct Viruses // Journal of Virology. 2007. № 2 (81). C. 860-871.

114. Walter M. R. The Role of Structure in the Biology of Interferon Signaling. // Frontiers in immunology. 2020. (11). C. 606489.

115. Wang J. [et al.]. Differentiated Human Alveolar Type II Cells Secrete Antiviral IL-29 (IFN-X1) in Response to Influenza A Infection // The Journal of Immunology. 2009. № 3 (182). C. 1296-1304.

116. Wei H. [et al.]. Suppression of Interferon Lambda Signaling by SOCS-1 Results in Their Excessive Production during Influenza Virus Infection // PLoS Pathogens. 2014. № 1 (10). C. e1003845.

117. Yan Y. [et al.]. Inhibition of Lung Adenocarcinoma Transfected with Interleukin 28A Recombinant Adenovirus (Ad-mIFN-X 2 ) In Vivo // Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 2013. № 2 (28). C. 124-130.

118. Yap G. L. R. [et al.]. Annexin-A1 promotes RIG-I-dependent signaling and apoptosis via regulation of the IRF3-IFNAR-STAT1-IFIT1 pathway in A549 lung epithelial cells // Cell Death & Disease. 2020. № 6 (11). C. 463.

119. Yu D. [et al.]. Design and evaluation of novel interferon lambda analogs with enhanced antiviral activity and improved drug attributes. // Drug design, development and therapy. 2016. (10). C. 163-82.

120. Yu D. [et al.]. Design and evaluation of novel interferon lambda analogs with enhanced antiviral activity and improved drug attributes. // Drug design, development and therapy. 2016. № 8 (10). C. 163-82.

121. Zhang X. [et al.]. Cutting Edge: Ku70 Is a Novel Cytosolic DNA Sensor That Induces Type III Rather Than Type I IFN // The Journal of Immunology. 2011. № 8 (186). C. 4541-4545.

122. Zhou L. [et al.]. Induction of interferon-X contributes to TLR3 and RIG-I activation-mediated inhibition of herpes simplex virus type 2 replication in human cervical epithelial cells // Molecular Human Reproduction. 2015. № 12 (21). C. 917-929.

123. Байкова М. Л. Особенности методического подхода к определению специфической

активности интерферона альфа типа // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020. № 1 (20). С. 68-73.

124. Ершов Ф. И. Открытие биологического феномена и его последующее научное познание // Вопросы вирусологии. 2012. № 4 (57).

125. Симбирцев А. С. Цитокины-новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. 2002. (1). С. 3-5.

148

ПРИЛОЖЕНИЕ А.

Нуклеотидная последовательность вставки в плазмиду pJet1.2, кодирующую

мРНК гена IFNL1

1

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus

(1 (1 (1 (1

(12 (29 (50 (51

(62 (79 100 101

112 129

150

151

162 179 200 201

212 229

250

251

262 279

300

301

312 329

350

351

362 379

400

401

412 429

450

451

462 479

500

501

50

---------------------------------------CATATGGCTGC

----------------------TTTTTCAGCAAGATAATCATATGGCTGC

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGCCGC CAGAT C-TCATATGGCTGC

C GC AGAT TCATATGGCTGC 51 100

AGCTTGGACCGTGGTGCTGGTGACTTTGGTGCTAGGCTTGGCCGTGGCAG AGCTTGGACCGTGGTGCTGGTGACTTTGGTGCTAGGCTTGGCCGTGGCAG AGCTTGGACCGTGGTGCTGGTGACTTTGGTGCTAGGCTTGGCCGTGGCAG AGCTTGGACCGTGGTGCTGGTGACTTTGGTGCTAGGCTTGGCCGTGGCAG 101 150

GCCCTGTCCCCACTTCCAAGCCCACCACAACTGGGAAGGGCTGCCACATT GCCCTGTCCCCACTTCCAAGCCCACCACAACTGGGAAGGGCTGCCACATT GCCCTGTCCCCACTTCCAAGCCCACCACAACTGGGAAGGGCTGCCACATT GCCCTGTCCCCACTTCCAAGCCCACCACAACTGGGAAGGGCTGCCACATT 151 200

GGCAGGTTCAAATCTCTGTCACCACAGGAGCTAGCGAGCTTCAAGAAGGC GGCAGGTTCAAATCTCTGTCACCACAGGAGCTAGCGAGCTTCAAGAAGGC GGCAGGTTCAAATCTCTGTCACCACAGGAGCTAGCGAGCTTCAAGAAGGC GGCAGGTTCAAATCTCTGTCACCACAGGAGCTAGCGAGCTTCAAGAAGGC 201 250

CAGGGACGCCTTGGAAGAGTCACTCAAGCTGAAAAACTGGAGTTGCAGCT CAGGGACGCCTTGGAAGAGTCACTCAAGCTGAAAAACTGGAGTTGCAGCT CAGGGACGCCTTGGAAGAGTCACTCAAGCTGAAAAACTGGAGTTGCAGCT CAGGGACGCCTTGGAAGAGTCACTCAAGCTGAAAAACTGGAGTTGCAGCT 251 300

CTCCTGTCTTCCCCGGGAATTGGGACCTGAGGCTTCTCCAGGTGAGGGAG CTCCTGTCTTCCCCGGGAATTGGGACCTGAGGCTTCTCCAGGTGAGGGAG CTCCTGTCTTCCCCGGGAATTGGGACCTGAGGCTTCTCCAGGTGAGGGAG CTCCTGTCTTCCCCGGGAATTGGGACCTGAGGCTTCTCCAGGTGAGGGAG 301 350

CGCCCTGTGGCCTTGGAGGCTGAGCTGGCCCTGACGCTGAAGGTCCTGGA CGCCCTGTGGCCTTGGAGGCTGAGCTGGCCCTGACGCTGAAGGTCCTGGA CGCCCTGTGGCCTTGGAGGCTGAGCTGGCCCTGACGCTGAAGGTCCTGGA CGCCCTGTGGCCTTGGAGGCTGAGCTGGCCCTGACGCTGAAGGTCCTGGA 351 400

GGCCGCTGCTGGCCCAGCCCTGGAGGACGTCCTAGACCAGCCCCTTCACA GGCCGCTGCTGGCCCAGCCCTGGAGGACGTCCTAGACCAGCCCCTTCACA GGCCGCTGCTGGCCCAGCCCTGGAGGACGTCCTAGACCAGCCCCTTCACA GGCCGCTGCTGGCCCAGCCCTGGAGGACGTCCTAGACCAGCCCCTTCACA 401 450

CCCTGCACCACATCCTCTCCCAGCTCCAGGCCTGTATCCAGCCTCAGCCC CCCTGCACCACATCCTCTCCCAGCTCCAGGCCTGTATCCAGCCTCAGCCC CCCTGCACCACATCCTCTCCCAGCTCCAGGCCTGTATCCAGCCTCAGCCC CCCTGCACCACATCCTCTCCCAGCTCCAGGCCTGTATCCAGCCTCAGCCC 451 500

ACAGCAGGGCCCAGGCCCCGGGGCCGCCTCCACCACTGGCTGCACCGGCT ACAGCAGGGCCCAGGCCCCGGGGCCGCCTCCACCACTGGCTGCACCGGCT ACAGCAGGGCCCAGGCCCCGGGGCCGCCTCCACCACTGGCTGCACCGGCT ACAGCAGGGCCCAGGCCCCGGGGCCGCCTCCACCACTGGCTGCACCGGCT 501 550

CCAGGAGGCCCCCAAAAAGGAGTCCGCTGGCTGCCTGGAGGCATCTGTCA CCAGGAGGCCCCCAAAAAGGAGTCCGCTGGCTGCCTGGAGGCATCTGTCA CCAGGAGGCCCCCAAAAAGGAGTCCGCTGGCTGCCTGGAGGCATCTGTCA CCAGGAGGCCCCCAAAAAGGAGTCCGCTGGCTGCCTGGAGGCATCTGTCA 551 600

insert clon#8 consensus Consensus

insert clon#8 consensus Consensus 651

insert clon#8 consensus Consensus

(512) (529)

(550)

(551)

(562) (579) (600) (601)

(612) (629)

(650)

(651)

CCTTCAACCTCTTCCGCCTCCTCACGCGAGACCTCAAATATGTGGCCGAT CCTTCAACCTCTTCCGCCTCCTCACGCGAGACCTCAAATATGTGGCCGAT CCTTCAACCTCTTCCGCCTCCTCACGCGAGACCTCAAATATGTGGCCGAT CCTTCAACCTCTTCCGCCTCCTCACGCGAGACCTCAAATATGTGGCCGAT

601

GGGAACCTGTGTCTGAGAACGTCAACCCACCCTGAGTCCACCT

650 ^TCTAG

tG, CTI' C'C 'C'IT -ЛЧ C'TGATCTAG

tg, C'[t[,['[, , Ct[' C'C 'C'[t,['CC'TGATCTAG GGGAACCTGTGTCTGAGAACGTCAACCCACCCTGAGTCCACCTGATCTAG

700

A-------------------------------------------------

ATTAATCTTTCTA-------------------------------------

ATAAAGATCTCCTACAATATTCTCAGCTGCCATGGAAAATCGATGTTCTT ATAATTC

Рисунок А.1 - Секвенирование вставки и несущей кодирующую область мРНК гена IFNL1 плазмиды pJet1.2. Insert - нуклеотидная последовательность полученной в результате ОТ-ПЦР вставки; clon#8 - последовательность кодирующую область мРНК гена IFNL1 плазмиды pJet1.2; consensus -консенсусная последовательность. Синим цветом выделены старт-кодон ATG и стоп-кодон TGA; желтым цветом отмечен идентичный участок нуклеотидных

последовательностей

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Карта плазмиды pJetl.2

Рисунок Б.1 - Конструкция pJet1.2 со вставкой ампликона мРНК гена INFL1

человека. Размер плазмиды - 3549 пар оснований. Указаны координаты важнейших сайтов: orí - точка начала репликации; AmpR - сайт устойчивости к ампицилину; Т7 - Т7 промотор, промотор РНК-полимеразы для in vitro транскрипции; NotI - сайт рестрикции (GCGGCCGC); insertion seq -последовательность вставки (кодирующая часть гена IFNL1 человека); pJetF и

pJetR - последовательности нуклеотидов, на которые садятся праймеры для секвенирования вставки; F-qIFNL и R-qIFNL - последовательности вставки, на которые отжигаются праймеры к мРНК IFNL1 человека.

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Карта плазмиды pJet302 со вставкой гена IFNL1 человека (hIFNL1)

Рисунок В.1 - (а) Карта плазмиды pet302NT-His+hIFNL1, кодирующей ЫГЫ-И. Размер плазмиды - 6223 пар оснований. (Ь) Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка ЫГЫ-И. Дополнительные остатки аминокислот между 6xHis и зрелым ЫШЫ-Х1 (без сигнального пептида) отмечены курсивом. Обнаруженные методом масс-спектрометрии участки последовательности отмечены цветом: черные и белые прямоугольники соответствуют энзиматическому гидролизу пептидных связей при помощи трипсина и

химотрипсина, соответственно.

ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Карта плазмиды pet28a со вставкой гена IFNL3 мыши (mIFNL3)

Рисунок Г.1 - (а) Карта плазмиды pet28a+mIFNL3, кодирующей тШЫ-Х3. Размер плазмиды - 5821 пар оснований. (Ь) Схема конструкции, кодирующей

рекомбинантный белок тШЫ-Х3.