Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта: Экспериментальное исследование тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Панкратов, Андрей Александрович

• Панкратов, Андрей Александрович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Панкратов, Андрей Александрович

Сокращения и условные обозначения, принятые в тексте.

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Роль активных форм кислорода и свободных радикалов различной химической структуры в биологических процессах.

Глава 2. Свободные радикалы в консервативной терапии злокачественных новообразований.

Глава 3. Бинарные каталитические системы (БКС) - источники активных форм кислорода и свободных радикалов как потенциальные противоопухолевые средства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

РАЗДЕЛ I. Противоопухолевые свойства БКС на основе комплексов кобальта и аскорбиновой кислоты.

Глава 1. Скрининг БКС на основе металлокомплексов кобальта и аскорбиновой кислоты in vivo.

Глава 2. Разработка методических подходов к изучению противоопухолевой эффективности БКС in vivo

Глава 3. Противоопухолевая эффективность БКС "Оксикобаламин+Аскорбиновая кислота" ("Ок+Ак") в монорежиме.

Глава 4. Противоопухолевая эффективность

БКС "Ок + Ак" в схемах полихимиотерапии.

РАЗДЕЛ И.Доклиническое изучение БКС «Ок+Ак».

Глава 1. Токсичность БКС «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио» при однократйом применении.;.

Глава 2. Токсичность БКС «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио» при многократном применении.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта: Экспериментальное исследование»

1. Актуальность проблемы.

Одним из ведущих методов в комплексном лечении злокачественных новообразований является химиотерапия.

К настоящему моменту в клинической практике используется более 50 1 противоопухолевых лекарственных средств. Это препараты платины (цис-платин, карбоплатин, цикл оплатам и другие), акилирующие агенты (цикло-фосфан, сарколизин, эмбихин тиофосфамид и другие), антиметаболиты ( ме-тотрексат, 5-фторурацил, меркаптопурин и другие), антибиотики (адриами-цин, блеомицин, дактиномицин и другие), вещества растительного происхождения и ферменты (винбластин, винкристин, виндезин, кампто и другие), гормональные препараты (тамоксифен и другие), а также синтетические ци-тостатики относящиеся к различным классам (дакарбазин, натулан, милтекс, спиробромин и другие ) [67].

Принято считать, что в настоящее время нет оснований надеяться открыть препарат против рака, который был бы эффективен при всех видах злокачественных опухолей. Действительно, существует более 200 типов злокачественных опухолей человека и между опухолями даже одного органа имеются различия в гистологическом строении, в особенностях роста, во взаимодействии с организмом и т.д. Как правило, спектр действия того или иного цитостатика ограничивается несколькими, а иногда только одной опухолью или ее морфологическим вариантом. В то же время в современной химиотерапии можно усмотреть тенденцию к созданию противоопухолевых препаратов имеющих широкий спектр противоопухолевого действия.

Применение химиотерапии лимитировано высокой токсичностью противоопухолевых препаратов, которое обуславливает поражение не только ткани опухоли, но и поражение нормальных тканей, и, прежде всего тканей, обладающих высокой пролиферативной активностью : костного мозга, желудочно-кишечного тракта, лимфатической системы, тканей репродуктивных органов [13, 242].

Разработка путей повышения эффективности химиотерапии опухолей развивается по разным направлениям. Главными из них является создание новых, более избирательно действующих на опухолевые клетки препаратов, разработка комбинированного применения двух и более цитостатиков (полихимиотерапия), оптимизация методик применения противоопухолевых агентов, совершенствование химиотерапии, как звена или этапа комплексного и комбинированного лечения больных со злокачественными опухолями, применение других фармакологических средств с целью уменьшения побочного действия противоопухолевых препаратов и т.д. Большое внимание уделяется изучению механизмов действия цитостатиков, их фармакокинетике и фарма-кодинамике. На основе полученных данных разрабатываются рациональные методы использования известных противоопухолевых лекарственных средств и определяются пути создания новых эффективных противоопухолевых препаратов.

Новая стратегия в терапии опухолей предполагает использование оригинальных, нетрадиционных подходов. Одним из таких подходов является бинарная терапия опухолей, включающая два компонента, необходимых для получения терапевтического эффекта, каждый из которых в отдельности не проявляет противоопухолевого действия. К этому виду лечения относится фото динамическая терапия, сочетающая применение фотосенсибилизатора с местным лазерным облучением [69]. Данный метод противоопухолевой терапии основан на образовании высокореактивных продуктов (активных форм кислорода (АФК) и других свободных радикалов (СР), обладающих цитоток-сическими и цитостатическими свойствами), при взаимодействии фотосенсибилизатора с лазерным излучением определенных длин волн [35]. Этот метод лечения проходит клиническую апробацию во всем мире.

Новое направление в бинарной терапии опухолей было предложено в 1995 г академиком М.Е.Вольпиным, член-кореспондентом РАН Г.Н.Воржцовым и мэром г. Москва Ю.М.Лужковым. Этими учеными-химиками в качестве потенциальных противоопухолевых агентов были предложены бинарные каталитические системы (БКС), которые эффективно генерировали АФК и СР при взаимодействии двух химических соединений, одно из которых является катализатором (металлокомплексы (Мк) переходных металлов), а другое восстановителем [21]. В дальнейшем этот потенциальный метод противоопухолевой терапии получил название - бинарная каталитическая терапия (БКТ). Теоретически этому виду терапии могут быть доступны опухоли любой локализации.

Разработка этого метода противоопухолевого лечения проводится, кооперированно рядом научно-исследовательских институтов : ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», ИНЭОС РАН, МНИОИ им. П.А.Герцена, РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и других.

В России, в ИНЭОС РАН и ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» на протяжении последних двадцати лет ведутся исследования каталитических свойств широкого круга комплексов переходных металлов в реакциях окисления природных восстановителей (аскорбиновая кислота, тиолы и др.) с целью поиска новых комплексов переходных металлов (кобальта, железа, марганца и других), проявляющих активность в биологических системах. Эти исследования позволили выявить новые источники АФК и СР среди комплексов кобальта и железа с макроциклическими и хелатирующими лигандами и комплексов ор-ганокобальта с тридентантными основаниями Шиффа [12, 16, 57, 244].

Поскольку одним из механизмов цитотоксического и цитостатического действия таких методов консервативной противоопухолевой терапии, как лучевая терапия [41, 73, 77], фотодинамическая терапия [35, 37] и химиотерапия при использовании ряда препаратов (блеомицин, антрациклиновые антибиотики) [25, 29], является поражение структурных элементов опухолевой ткани АФК и CP, то бинарные каталитические системы «Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота» были исследованы в бесклеточных химических системах на способность вызывать деструкцию различных биомолекул (ДНК, РНК, Сахаров и др) и апробированы в системе in vitro на опухолевых клетках человека в качестве цитотоксических агентов. В этих тест-системах было показано, что бинарные каталитические системы «Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота» вызывают деградацию ДНК, РНК, углеводов и других биомолекул [12] и обладают цитотоксическими свойствами. Выявленная in vitro высокая цитотоксическая активность бинарных каталитических систем свидетельствовала о целесообразности всестороннего изучения их противоопухолевых свойств in vivo на животных с опухолями в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

2. Цель исследования.

Целью исследования являлось изучение противоопухолевых и токсических свойств бинарных каталитических систем на основе комплексов кобальта и аскорбиновой кислоты на экспериментальных моделях in vivo.

3. Задачи исследования. Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. провести скрининг бинарных каталитических систем «металлокомплекс + аскорбиновая кислота» in vivo;

2. разработать методические подходы к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем in vivo: на мышах с перевиваемыми опухолями изучить зависимость противоопухолевой эффективности бинарных каталитических систем "Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота" от дозы металлокомплекса, молярного соотношения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты, временного интервала между их применением, а также последовательности введения животным металлокомплекса и аскорбиновой кислоты; 3. провести доклиническое изучение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота»: изучить противоопухолевую эффективность бинарной каталитической системы на основе оксикобаламина на животных с перевиваемыми опухолями различного гистогенеза и с различной формой опухолевого роста в монорежиме и схемах полихимиотерапии; изучить общетоксическое действие (безвредность) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио на мелких лабораторных животных - мышах и крысах («острую» токсичность и «хроническую» токсичность).

• ч • i

3. Научная новизна исследования.

В результате проведенных исследований показано, что бинарные каталитические системы на основе комплексов кобальта с фталоцианиновыми лигандами, корриновыми лигандами, тридентантными основаниями Шиффа в сочетании с аскорбиновой кислотой обладают выраженной противоопухолевой активностью in vivo.

Впервые на животных с асцитной (АОЭ) и солидной (Са-755) опухолях на примере двух бинарных каталитических систем: «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» и «ЭТФ + Аскорбиновая кислота» разработаны методические подходы к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем in vivo. Показано, что противоопухолевая эффективность бинарных каталитических систем «Металлокомплекс + Восстановитель» зависит от дозы металлокомплекса и дозы восстановителя, их молярного соотношения, временного интервала между введением, металлокомплекса и восстановителя, последовательности их применения, а также от пути и длительности введения бинарной каталитической системы животным.

На мышах и крысах с перевиваемыми опухолями - Р-388, L-1210, АОЭ, Са-755, LLC, В-16 и Рс-1 изучена противоопухолевая эффективность бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» в монорежиме и схемах полихимиотерапии:

-определены терапевтические дозы и схемы применения бинарной каталитической системы для лечения животных с асцитными опухолями, солидными опухолями и гемобластозами;

-определен спектр опухолей, чувствительных к лечению бинарной каталитической системой;

-установлено, что бинарная каталитическая система «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» обладает химиомодифицирующими свойствами, усиливая противоопухолевую эффективность препарата цисплатин.

Проведено доклиническое изучение общетоксического действия (безвредности) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио на мелких лабораторных животных - мышах и крысах:

-дана количественная и качественная характеристика токсического и побочного действия препарата оксикобаламин-лио и бинарной каталитической системы на его основе при однократном и многократном применений животным;

-установлена зависимость токсического действия бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио от дозы и пути введения животным;

-выявлен наиболее чувствительный вид животных к токсическому действию бинарной каталитической системы и препарата оксикобаламин-лио;

-установлено токсическое и побочное действие бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» на периферическую кровь, почки», сосудистую систему и ЦНС животных;

-на основании данных по количественной токсичности бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» рекомендована безопасная («стартовая») доза бинарной каталитической системы для человека при ее клиническом изучении по I фазе.

4. Научно-практическая значимость. Научно-практическая значимость работы заключается в методическом совершенствовании подходов к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем «Металлокомплекс + Восстановитель» ш vivo.' ' .

Проведено полное доклиническое изучение бинарной каталитической системы на основе препарата оксикобаламин-лио. На основании данных, полученных при изучении противоопухолевых и общетоксических свойств (безвредности), бинарная каталитическая система «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» была рекомендована для проведения клинических испытаний. Полученные в работе данные вошли в отчеты по специфической противоопухолевой активности и общетоксическому действию (безвредности) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбино-. 'i вая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио», представленные в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на I фазу клинического изучения указанных лекарственных средств. В настоящее время проводится клиническое изучение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» по II фазе.

5. Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на семинарах отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им.

П.А.Герцена, XVI Менделеевском съезде в Санкт-Петербурге (1998); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» в Москве (1999); Ninth International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris (1999) и V Всероссийском съезде онкологов в Казани (2000). • ч б.Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ среди них - два патента на изобретение № 2114623 и № 2000110353, в которых изложены основные положения проведенного исследования.

7. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 разделов и 6 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, , выводов и списка литературы. Список литературы включает 244 источника. Работа иллюстрирована 23 рисунками, 20 таблицами и 2 схемами.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Панкратов, Андрей Александрович

выводы Бинарные каталитические системы (БКС) «Металлокомплекс(Мк) + Аскорбиновая кислота(Ак)» на основе терафтала (Тф), пропиленгликолевого эфира терафтала (ЭТФ), оксйкобаламина (Ок) и ипрокола (Ипк) in vivo обладают противоопухолевой активностью, убывающей в следующем ряду: «Ок + Ак» > «ЭТФ + Ак» > «Тф + Ак» » «Ипк + Ак». Металлокомплексы и аскорбиновая кислота вне бинарной каталитической системы не оказывают противоопухолевого действия. Противоопухолевая эффективность бинарных каталитических систем зависит от дозы металлокомплекса, дозы аскорбиновой кислоты, молярного соотношения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты, временного интервала между их применением, а также последовательности введения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты. Оптимальными режимами введения компонентов БКС «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» и «ЭТФ + Аскорбиновая кислота» являются:

Мк, 1 -15 минут -*Ак (молярное соотношение Мк:Ак - 1:30) - для легния животных с асцитными опухолями;

Мк, 60 минут -»Ак (молярное соотношение Мк:Ак — 1:10 и 1:30) — для лечения животных с солидными опухолями. Оптимальными схемами применения бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» в монорежиме при лечении животных с различными опухолями являются: а) внутрибрюшинно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по оксикобаламину), равной 75 мг/кг, при молярном соотношении окси-кобаламина и аскорбиновой кислоты - 1:30, и временном интервале между их введением, соответствующем 15 минутам (АОЭ и Р-388, асцитный вариант); б) внутривенно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по оксикобаламину), равной 50 мг/кг, при молярном соотношении оксикобала-мина и аскорбиновой кислоты - 1:10, и временном интервале между их введением, соответствующем 1 часу (Са-755, LLC, Рс-1 и Р-388, солидный вариант). Бинарная каталитическая система «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» имеет широкий спектр противоопухолевого действия и среднюю противоопухолевую эффективность. Чувствительность перевиваемых опухолей мышей и крыс к этой бинарной каталитической системе убывает в следующем ряду: АОЭ > Р-388 (привитый под кожу) > Р-388 (привитый в брюшную полость) > Са-755 > LLC = Рс-1 » В-16 = L-1210. Включение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» в схемы традиционной противоопухолевой терапии повышает эффективность лечения мышей с опухолями по показателю средней продолжительности жизни (СПЖ) при АОЭ на 280±39% (БКС + «Цисплатин»); при Са-755 на 22±3% (БКС + «Цисплатин») и на 17+5% (БКС + «5-Фторурацил»), , На основе количественных и качественных характеристик токсического и побочного действия препарата «Оксикобаламин-лио» (Ок-лио) и бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» при однократном и многократном применении животным определены их индексы кумуляции, обратимость токсического эффекта, коэффициенты видовой чуствительности и степень опасности. БКС «Ок-лио + Ак» классифицирована как умеренно опасное (острое токсическое действие) и малоопасное (хроническое токсическое действие) лекарственное средство; препарат «Ок-лио» по степени опасности относится к малоопасным лекарственным средствам, независимо от характера токсического действия. Сферами избирательной токсичности бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио» при Их применении в токсических дозах являются эритроцит ты, тромбоциты, почки, сосудистая система и центральная нервная система.

Бинарная каталитическая система «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» не вызывает токсической лейкопении- и гранулоцитопении. Отсутствует интестинальная токсичность и анорексия. ). Определена начальная безопасная («стартовая») доза бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» для человека при проведении I фазы клинического изучения: а) для интраперитонеального применения - 33 мг/м (по Ок-лио;

Ок-лио:Ак - 1:30; Ок-лио, 15 минут + Ак) л б) для внутривенного применения - 59 мг/м (по Ок-лио; Оклио :Ак - 1:10; Ок-лио, 60 минут + Ак).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа посвящена экспериментальному изучению противоопухолевых г токсических свойств бинарных каталитических систем на основе комплек-;ов кобальта и аскорбиновой кислоты - источников активных форм кислоро-са (АФК) и других свободных радикалов (СР).

Являясь высоко реакционными частицами, АФК и СР обладают высо-:им цитотоксическйм потенциалом - вступая во взаимодействие с различными биологическими субстратами в клетке (белками, нуклеиновыми кисло-ами, липидами, углеводами) АФК и СР приводят к структурным и биохими-[еским изменениям в клетке и в большинстве случаев к ее гибели. В силу ;ысочайшей реакционной способности эти химические частицы не могут >ыть получены и использованы как обычные лекарственные средства. Для [ечения больных со злокачественными новообразованиями разработаны и [спользуются методы генерации АФК и других высокоактивных окислите-[ей непосредственно в опухолевой ткани - лучевая и фото динамическая те->апия. Однако эти методы консервативной противоопухолевой терапии ис-юльзуются только для локального или л око-регионарного лечения.

АФК и СР участвуют также и в реализации цитотоксического и цито-татического действия ряда противоопухолевых препаратов и, в частности, нтрациклиновых антибиотиков (доксорубицин, фарморубицин, дауноруби-[ина и других) и антибиотиков относящихся к классу флеомицинов (блеоми-рин, блеомицитин). Однако в отличии от лучевой терапии и фотодинамиче-кой терапии выброс АФК и СР в зоне опухоли при использовании этих хи-[иотерапевтических препаратов не столь мощный.

В 1987 г появилась работа Полинга с соавт в которой авторы изучали ротивоопухолевые свойства каталитических систем на основе комплексов ереходных металлов и Ак, генерирующих АФК и СР. Однако разработать акую систему применительно к терапии рака не удалось по причине того, то выбранные Мк были неустойчивы в физиологических условиях, а про

• 'i укты их распада оказались очень токсичными для организма животных.

В России эти исследования были начаты в конце восьмидесятых годов ЮД руководством академика М.Е.Вольпина [21] и продолжены в последую-цем как в ИНЭОСе, так и ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» под руководством чл-:ор. РАНГ.Н.Ворожцовым [16, 57$ЦЧ].

В ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и ИНЭОС РАН было синтезировано более 10 комплексов кобальта и железа с макроциклическими и хелатирующими [игандами, а также комплексов органокобальта с тридентантными основаиями Шиффа, которые в сочетании с восстановителем - Ак эффективно ге

• 'i ерировали АФК и СР.

Наиболее активные в катализе Мк, а их оказалось более 40, были пересаны в МНИОИ им. П.А.Герцена и РОНЦ им. Н.Н.Блохина для изучения их [ротивоопухолевых свойств в составе БКС «Мк + Ак» в скрининговой тест-истеме in vitro.

Основными критериями при отборе субстанций Мк для дальнейшего вучения их противоопухолевых свойств в составе БКС в скрининговой тест-истеме in vivo являлись высокая цитотоксическая активность БКС in vitro и (тсутствие таковой для отдельных ее компонентов. Кроме того, учитывались шзико-химические свойства Мк, которые в той или иной степени определя-эт его биосовместимость (растворимость, стабильность в водных растворах [ хидких средах организма), а также технологичность получения.

Исходя из вышесказанного пятнадцать БКС «Мк + Ак» на основе ком-шексов кобальта и железа с фталоцианиновым лигандом, корриновым ли-андом и тридентантными основаниями Шиффа были отобраны для даль-[ейшего изучения противоопухолевых свойств.

В нашей работе были исследованы четыре БКС на основе натриевой оли окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта (терафтала), его производного пропиленгликолевого эфира окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта

ЭТФ); Coa - [a - (5,6 - диметилбензимидазолил)] - CoP - оксикобамида гид-юхлорида (оксикобаламина) и изо-пропил-мер-|К-(2-аминоэтил)-ацетил аце-илидениминато] кобальт(+1) бромида (ипрокола).

На мышах с АОЭ установлено, что тестируемые Мк и Ак вне БКС не (бладают собственной противоопухолевой активностью. В то время как БКС Тф + Ак", "ЭТФ + Ак" и "Ок + Ак" оказывали выраженное противоопу-:олевой действие значительно увеличивая продолжительность жизини швотных с опухолью. Причем противоопухолевая активность этих БКС бы-ia сопоставима с таковой для официнального препарата цисплатин. БКС на юнове ипрокола в этой биологической системе оказалась менее ффективной.

Проведенные исследования (in vitro и in vivo) подтвердил идею, выска-анную академиком'М.Е.Вольпиным, о возможности использования БКС на юнове Мк переходных металлов в качестве потенциальных противоопухоле-,ых средств. На основании полученных данных для доклинического изучения противоопухолевых свойств на экспериментальных моделях in vivo были »тобраны три БКС: «Тф + Ак», «ЭТФ + Ак» и «Ок + Ак».

Первые два комплекса кобальта являются производными окта-4,5-:арбоновой кислоты фталоцианина кобальта - терафтал является ее натриевой солью, а ЭТФ - ее пропиленгликолевым эфиром. Наличие восьми карбоксильных групп в молекуле терафтала придает этому соединению ряд не-[0CTáTK0B, среди которых особо следует отметить агрегацию молекул тераф-ала в водных растворах и жидких средах организма (что приводит к сниже-[ию его каталитической активности) и способность связывать ионы 2-х ва-¡ентных металлов и, в первую очередь, ионы кальция и магния (что может [риводить к нежелательным побочным токсическим эффектам при введении того соединения животным). В отличие от терафтала, ЭТФ является эфиром. )тсутствие активных гидроксильных групп придает этому соединению ряд [риимуществ по сравнению с терафталом. Так, молекулы ЭТФ не агрегирузт в водных растворах и жидких средах орагнизма и не являются комплек-онами. Однако субстанция ЭТФ предстовляет собой смесевой продукт следствие различного количества оксиэтильных групп в эфирной компонен-е молекулы (рис .4 Б), что создает определенные трудности при создании тандартной субстанции.

Третий комплекс кобальта - оксикобаламин (ОН-СЫ, Ок) относится к - 'i риродным корринам. Наряду с цианкобаламином," метилкобаламином и аде-[озинкобаламинамином, оксикобаламин входит в группу структурно и био-югически родственных соединений - кобаламинов. В отличии от фталоциа-[иновых комплексов кобальта - терафтала и ЭТФ, кобаламины являются эн-[обиотиками и относятся к витаминным препаратам группы В12, которые интезируются в организме человека и животных микрофлорой кишечника и аироко представлены в тканях человека и животных.

Следует отметить, что клетки различных тканей имеют различную экс-[рессию рецепторов к транскобаламину II. Наибольшее количество этих ре-[епторов находится на клетках интенсивно пролиферирующих тканей, в том меле и на опухолевых, что обуславливает определенную исбирательность »пухолевых клеток для кобаламинов [79,100,186].

В связи с тем, что БКС «Металлокомплекс + Восстановитель» в каче-;тве противоопухолевых средств изучаются впервые, то первоочередной задачей являлось разработка методических подходов к изучению их противо-»пухолевых свойств ш vivo на животных с перевиваемыми опухолями.

Поскольку цитотоксические и цитостатические АФК и CP образуются фи взаимо действии двух химических соединений - катализатора (комплек-;а кобальта) и субстрата окисления (восстановителя, Ак) необходимо было юдобрать оптимальные режимы введения катализатора и востановителя животным с опухолью при которых, терапевтическая эффективность БКС была )ы максимальной.

В связи с этим, на двух экспериментальных опухолевых моделях - мо-,ели асцитной опухоли (мыша АОЭ) и модели солидной опухоли (мыши с ✓а-755) изучена зависимость противоопухолевого эффекта двух БКС - «Ок + ис» и «ЭТФ + Ак» от дозы Мк, молярного (дозового) соотношения Мк и Ак, ременного интервала между их применением, а также последовательности ведения Мк и Ак животным. Установлено, что эффективность исследуемых ¡КС как при внутрибрюшинном (мышам с АОЭ), так и при внутривенном мышам с Са-755) применении повышалась с увеличением дозы Мк при фик-ированом молярном соотношении Мк и Ак и молярного соотношения Мк и ус при фиксированной дозе Мк.

Противоопухолевая эффективность исследуемых БКС при внутри-рюшинном применении мышам с АОЭ в большей степени зависит от мо-ярного соотношения Мк и Ак, чем от дозы Мк. Максимальная эффектив-юсть БКС «Ок + Ак» и «ЭТФ + Ак» при внутрибрюшинном введении ком-тентов БКС была отмечена при их молярном соотношении, равном 1:30 щс'^Щ. При внутривенном применении БКС на основе оксикобаламина мы-1ам с Са-755 ее противоопухолевая эффективность в равной степени зависи-а как от дозы Ок, тйк и от молярного соотношения Ок и Ак (табл. 2).

Очень важным для реализации противоопухолевого эффекта БКС ока-ался временной интервал между введением катализатора и восстановителя, ак, внутрибрюшинное введение мышам с АОЭ Мк с последующим, через 1 15 минут, введением Ак было наиболее эффективным. Увеличение времен-:ого интервала между введениями Ок или ЭТФ и Ак с 30 минут до 1 часа ффективность этих БКС резко снижалась и увеличивалась их токсичность рис. ). При внутривенном применении БКС «Ок + Ак» мышам с Са-755 аблюдали обратную зависимость терапевтического и токсического эффек-ов этой БКС от временного интервала между введением ее компонентов, ак, последовательное применение Ок и Ак с временным интервалом между х введением от 1 минуты до 15 минут было не эффективным и токсичным.

Максимальный противоопухолевый эффект БКС на основе Ок при внутри-енном применении животным был достигнут только при временном интер-але между введением Ок и Ак, равным 1 часу (рис$).

Установленная зависимость противоопухолевого эффекта БКС «Ок + ус» и «ЭТФ + Ак» от интервала времени между введением катализатора и осстановителя связана с различиями в биодоступности и фармакокинетике )к, ЭТФ и Ак при внутрибрюшинном и внутривенном путях их введения.

При изучении противоопухолевой эффективности БКС «Ок + Ак» и ЭТФ + Ак» в зависимости от последовательности введения животным ме-аллокомплекса и восстановителя эффективным оказался только один режим: начале введение металлокомплекса, затем восстановителя.

В результате этих исследований определены оптимальные режимы нутрибрюшинного и внутривенного введения Мк (Ок и ЭТФ) и Ак для ле-ения животных с асцитными и солидными опухолями, соответственно:

Мк, 0-15 минут-»Ак (молярное соотношение Мк:Ак-1:30);

Мк, 60 минут ->Ак (молярное соотношение Мк:Ак - 1:10 и 1:30).

Высокая противоопухолевая активность БКС «Мк + Ак» выявленная в крининговой тест-системе in vivo послужила основанием для принятия решения о проведении полного доклинического изучения БКС на основе Тф, )ТФ и Ок в качестве, оригинальных противоопухолевых средств.

Доклиническое изучение противоопухолевых и токсических свойств ¡КС «Тф + Ак» проведено в РОНЦ им. Н.Н.Блохина. Другая, эффективная в [ротивоопухолевом отношении БКС «ЭТФ + Ак» находится на стадии разработки стандартной субстанции и лекарственного препарата на ее основе в [>ГУП «ГНЦ «НИОПИК» и МНИОИ им. П.А.Герцена. В нашей лаборатории ¡ыло проведено доклиническое изучение противоопухолевых и токсических совместно с РОНЦ им. Н.Н.Блохина) свойств БКС на основе Ок.

Доклиническое изучение противоопухолевой эффективности БКС «Ок - Ак» в монотерапии было проведено на мышах и крысах с перевиваемыми

Пухолями различного гистогенеза и формой опухолевого роста - АОЭ, Р-88, L-1210, Са-755, LLC, В-16 и Рс-1.

На первом этапе этих исследований на двух опухолевых моделях - мо-;ели асцитной опухоли (мыши с АОЭ) и модели солидной опухоли (мыши с "а-755) определен диапазон терапевтических доз БКС «Ок + Ак» при внут-ибрюшинном и внутривенном, соответственно, введении оксикобаламина и скорбиновой кислоты для лечения животных с асцитными и солидными пухолями(рис.13 и W).

Далее на мышах и крысах с асцитными и солидными опухолями, а акже гемобластозами была изучена противоопухолевая эффективность БКС Ок + Ак» в режиме монотерапии в зависимости от количества ее введений сивотным. Показано, что с увеличением количества введений животным IKC увеличивается не только ее противоопухолевая эффективность но и ток-ичность. В результате проведенных исследований были установлены тера-евтические дозы и схемы применения БКС «Ок + Ак» для лечения живот-:ых с асцитными опухолями, солидными опухолями и гемобластозами:

- внутрибрюшинно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по Ок), равной 75 мг/кг (суммарная доза 225 мг/кг) при молярном соотношении Ок и Ак, равном 1:30 - для лечения животных с опухолями, привитыми в брюшную полость (асцитные опухоли и гемобластозы привитые в брюшную полость);

- внутривенно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по Ок), равной 50 мг/кг (суммарная доза 150 мг/кг) при молярном соотношении Ок и Ак, равном 1:10 - для лечения животных с солидными опухолями и гемобластозами привитыми под кожу.

Используя оптимальные терапевтические дозы и режимы введения Ок Ак определен спектр перевиваемых опухолей мышей и крыс чувствитель-ых к лечению БКС «Ок + Ак». Показано, что эта БКС оказывала выражен-ое противоопухолевое действие в отношении 5 из 7 изученных опухолей сивотных. Наиболее чувствительными опухолями к терапии БКС на основе к были АОЭ (УПЖ - 102%) и лимфолейкоз Р-388, привитый под кожу (ТРО а уровне 85% - 57% сохранялось в течение 10 дней после лечения); сред-юю чувствительность имели лимфолейкоз Р-388, привитый в брюшную по-ость (УПЖ - 25%) и солидные опухоли Са-755, LLC и Рс-1 (ТРО на уровне 7% - 51% сохранялось в течение 19 - 21 дня после лечения); лимфолейкоз L-210, привитый в брюшную полость и солидная меланома В-16 оказались пухолямй не чувствительными к лечению БКС «Ок + Ак». Полученные анные свидетельствуют о том, что БКС «Ок + Ак» имеет широкий спектр ротивоопухолевого действия и среднюю противоопухолевую эффектив-ость. Следует отметить, что эффективность этой бинарной каталитической истемы у мышей с АОЭ и лимфолейкозом Р-388, привитым под кожу сопос-авима с эффективностью препарата цисплатин.

Широкий спектр противоопухолевого действия БКС на основе Ок сви-етельствует об отсутствии избирательности ее специфического действия.

В отличие от БКС, Ок и Ак не обладают противоопухолевой активно-тью в отношении большинства использованных в исследовании опухолевых ггаммов. Только лймфолейкоз Р-388, привитый под кожу оказалася опухо-ью, чувствительной к Ок. Так, многократное применение Ок в суммарных озах, равных 150 мг/кг и 250 мг/кг, приводило к статистически достоверно-[у ингибированию роста опухоли на 76% - 50%. Противоопухолевая актив-ость Ок в отношении лимфолейкоза Р-388, привитого под кожу, может быть бусловлена рядом обстоятельств. Так, клетки лимфолекоза Р-388 могут экс-рессировать относительно высокий (по сравнению с другими опухолями :ивотных) уровень рецепторов к транскобаламину II, что способствует акоплению Ок в этих опухолевых клетках. Кроме того, известно, что ргацизм мышей способен синтезировать эндогенную Ак. В результате чего )к может катализировать окисление Ак непосредственно в клетках опухоли образованием цитотоксических количеств АФК и СР. Помимо этого, можно редположить, что в клетках лимфолейкоза Р-388 недостаточна активность ндогенных антиоксидантов элиминирующих АФК и CP, что также способтвует накоплению - цитотоксических количеств АФК и других активных кислителей, образующихся в результате каталитического окисления эндо-енной Ак в клетках лимфолейкоза Р-388.

Современная химиотерапия - интенсивный вид противоопухолевого ечения, сочетающий применение нескольких противоопухолевых препара-ов одновременно или в различной последовательности, что приводит к по-ышению эффективности проводимого лечения.

Для повышения результатов лечения животных с опухолями БКС «Ок Ак» была изучена ее противоопухолевая эффективность в сочетании с тра-иционными цитостатическими препаратами по схеме «БКС + Цитостатик». ^следования были проведены на двух экспериментальных опухолевых мо-елях - асцитной опухоли (мыши с АОЭ) и солидной опухоли (мыши с Са-55). Наиболее эффективным оказалось внутрибрюшинное комбинированное рименение БКС «Ок + Ак» и препарата цисплатин мышам с АОЭ. Так, со-етанное применение БКС и цисплатина приводило к увеличению продолжи-ельности жизни мышей с этой опухолью на 234% - 340% и полному излече-ию от опухоли 17% - 30% животных.

Внутривенное комбинированное применение БКС «Ок + Ак» и циспла-ина, а также БКС и 5-фторурацила мышам с Са-755 повышало эффектив-ость лечения на 22% и 17%, соответственно, по сравнению с эффективно-тью этих противоопухолевых препаратов используемых в монотерапии.

Ярко выраженный синергизм противоопухолевого действия комбини-ованного применения БКС «Ок + Ак» и препарата цисплатин позволяет редположить наличие у этой БКС химиомодйфицирующих свойств в отно-1ении противоопухолевой активности этого цитостатика.

Ок вне БКС как при внутрибрюшинном, так и при внутривенном вве-ении мышам с АОЭ и Са-755, соответственно, не оказывал влияния на тера-евтическую эффективность доксорубицина, циклофосфана и 5-»торурацила. Однако комбинированное применение Ок и цисплатина у мы

1ей с АОЭ повышало эффективность проводимого лечения на 22 % по срав-ению с эффективностью этого цитостатика, используемого в монотерапии.

В настоящее время нами проводятся исследования по изучению хи-[иомодифицирующих свойств БКС «Ок + Ак», направленные на снижение оз высокотоксичных противоопухолевых препаратов. По предварительным анным включение этой БКС в схему лечения животных с опухолями препа-атом цисплатин позволяет снизить дозу высокотоксичного цитостатика в 2 -раза без снижения эффективности проводимого лечения. Химиомодифици-ующие свойства в отношении противоопухолевой активности цисплатина ыли выявлены и у других БКС - «Тф + Ак» и «ЭТФ + Ак».

Свободнорадикальный механизм противоопухолевого действия БКС, а акже синергизм противоопухолевого действия БКС на основе Ок, Тф и ЭТФ цисплатина послужили основанием к изучению этих лекарственных редств в качестве модификаторов лучевой терапии поскольку поиск эффек-ивных радиомодификаторов также является одной из актуальнейших про-лем клинической онкологии. Эти исследования проводятся совмесно с [ТЭБ РАН в рамках Московской Программы «Борьба со злокачественными овообразованиями». Предварительные данные, полученные в ИТЭБ РАН видетельствуют о синергизме противоопухолевого действия БКС на основе ф и Ок и лучевой терапии. Установлено, что эти БКС в сочетании с лучевой грапией значительно увеличивают выживаемость мышей с опухолями, в то ремя как лучевая терапия или БКС в отдельности практически не оказывали ечебного действия.

Широкий спектр противоопухолевого действия, а также синергизм ротивоопухолевого действия БКС «Ок + Ак» и традиционных цитостатиче-ких препаратов и, прежде всего, препарата цисплатин свидетельствовали о елесообразности апробации этой БКС в клинике. В связи с этим было пройдено доклиническое изучение общетоксического действия (безвредности) КС «Ок + Ак». Предклинические токсикологические исследования БКС «Ок Ак» были проведены с использованием новой лекарственной формы Ок репарата оксикобаламин-лио (Ок-лио), который был разработан в МНИОИ м. П.А.Герцена.

Параллельно с изучением общетоксического действия (безвредности) КС «Ок-лио + Ак» была изучена безвредность препарата «Ок-лио» в новой екарственной форме - оксикобаламина лиофилизированного предназначен-ого для парентерального применения в высоких дозах.

При предклиническом токсикологическом изучении БКС «Ок-лио + ло> строго учитывались рекомендуемые в клинику способ и режим введения >к-лио и Ак:

-в брюшную полость, ежедневно в течение 3-х дней; Ок-лио, 15 минут Ак, Ок-лио: Ак - 1:30;

-внутривенно, ежедневно в течение 3-х дней; Ок-лио, 60 минут + Ак, >к-лио:Ак- 1:10.

В нашей работе было изучено общетоксическое действие (безвред-ость) БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» на мелких лабораторных квотных - мышах и крысах («острая» токсичность и «хроническая» ток-нчность). Исследования на крупных животных - кроликах и собаках, а так-:е изучение местно-раздражающего действия и аллергогенности БКС «Окно + Ак» и препарата «Ок-лио» были проведены в РОНЦ им. Н.Н.Блохина в аборатории фармакологии и токсикологии лекарств [28].

В результате изучения «острой» токсичности БКС «Ок-лио + Ак» и репарата «Ок-лио» на мелких лабораторных животных (мыши, крысы) дана эличественная оценка токсичности этих лекарственных средств при одно-ратном внутрибрюшинном и внутривенном применении по критериям рас-зтных доз: ЬБ10 (МПД), IX»)6,1Ю50 и (табл. 10 -12 ).

При анализе данных по количественной токсичности БКС «Ок-лио + к» определены «широкая» широта токсического и смертельного действия КС. Показано, что БКС «Ок-лио + Ак» при внутрибрюшинном применение элее токсична, чем при внутривенном. Установлено отсутствие зависимости жсичности БКС «Ок-лио + Ак» от пола животных.

Сопоставляя данные по количественной токсичности БКС «Ок-лио + ,к» на грызунах, установлено, что наиболее чувствительным видом из мел-их грызунов к токсическому действию БКС при внутривенном применении дозах, расчитанных как на массу тела, так и на поверхность тела, являются ыши. При внутрибрюшинном применении БКС «Ок-лио + Ак» в дозах, рас-итанных на массу тела мыши и крысы, одинаково чувствительны к токсиче-кому действию бинарной каталитической системы, а в дозах, расчитанных а поверхность тела, мыши являются более чувствительным видом живот-ых, чем крысы. В' лаборатории фармакологии и токсикологии лекарств ОНЦ им. Н.Н.Блохина при изучении «острой» токсичности на собаках было становлено, что собаки более чувствительны к БКС при ее внутривенном рименении, чем мыши в дозах, расчитанных на массу тела, и менее чувствй-зльны, чем мыши и крысы при применении в дозах, расчитанных на по-зрхность тела (ВТД (МПД) - 150 мг/кг или 3000 мг/м2).

При сопоставлении данных по количественной токсичности, на разных [ивотных (мышах, крысах, и собаках) определен коэффициент видовой чув-гвительности (КВЧ) БКС «Ок-лио + Ак». Коэффициент видовой чувстви-гльности БКС «Окглио + Ак» определен как отношение 1ЛЗю для крыс к ТД (МПД) для собак при однократном внутривенном применении и соста-нл величину, равную 1,8 (из расчета на массу тела животных), что соответ-гвует невыраженным различиям в видовой чувствительности животных к КС «Ок-лио + Ак». КВЧ бинарной каталитической системы «Ок-лио + Ак» ри ее внутривенном применении животным в дозах, расчитанных на по-зрхность тела, составил величину, равную 5 (отношение ЫЗю для мышей к ТД (МПД) для собак), что соответствует средневыраженным различиям в адовой чувствительности животных к БКС. Полученные данные дают осно-ание полагать, что ожидать особую видовую чувствительность человека к КС «Ок-лио + Ак» нет оснований.

В результате проведенных исследований установлена причина смерти эызунов от однократного внутрибрюшинного и внутривенного применения

КС «Ок-лио + Ак» в летальных дозах. Данные клинической картины инток-икации и результату патологоанатомического исследования погибших жи-отных свидетельствуют о том, что причиной смерти грызунов (мышей и рыс) от однократного применения БКС «Ок-лио + Ак» в летальных дозах вляется сердечно-сосудистая недостаточность. Летальные дозы БКС «Окно + Ак» для собак установлены не были.

Учитывая широту токсического и смертельного действия и индекс ши-оты терапевтического действия (1Х)50/ТД) БКС «Ок + Ак» по степени опас-ости острого токсического действия можно классифицировать как умеренно пасное лекарственное средство.

В отличие от БКС «Ок-лио + Ак», препарат «Ок-лио» вне БКС по сте-ени опасности острого токсического действия относится к малоопасным ле-арственным средствам. При изучении «острой» токсичности препарата «Окно» на различных видах животных (мышах, крысах, кроликах и собаках) аиболее чувствительными оказались крысы (табл. 12).

При изучении «хронической» токсичности БКС «Ок-лио + Ак» и пре-арата «Ок-лио» на крысах установлено токсическое и побочное действие гих лекарственных средств на органы и системы организма животных при ногократном применении (ежедневно в течение 15 дней). Определены три ровня токсических доз для БКС «Ок-лио + Ак» (ВТД = МПД, НТД и ВНТД) два уровня токсических доз для Ок-лио (НТД и ВНТД), характеризующих жсичность БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» при многократном рименении (табл. 13 и 18).

В результате проведенных исследований установлено, что сферами из-нрательной токсичности БКС «Ок-лио + Ак» при однократном и многоратном применении крысам являются: эритроциты, тромбоциты, почки, тсуды и ЦНС. В связи с этим выявлены специфические токсические и по-эчные осложнения у животных при применении БКС «Ок-лио + Ак», кото-ые имели дозозависимый и обратимый характер. Это прежде всего токсиче-сое действие БКС на сосудистую систему, которое проявлялось расширеним периферических сосудов, нарушением проницаемости сосудистой стенки, азвитием гемморрагического синдрома (кровоизлияния в паренхиму легких почек). Отмечено неблагоприятное влияние БКС «Ок-лио + Ак» на почки.

Нефротоксическое действие БКС возможно обусловлено специфиче-ким повреждением'активными формами кислорода и свободными радика-ами структурно-функциональной единицы почек - нефрона. К клиническим роявлениям нефротоксичности относились увеличение суточного диуреза эазвитие полиурии) и увеличение количества мочевины и креатинина в сы-оротке крови животных.

Отмечено токсическое действие БКС «Ок-лио + Ак» на перифериче-кую кровь, связанное с высокой тропностью оксикобаламина к эритроцитам тромбоцитам. Влияние БКС «Ок-лио + Ак» на периферическую кровь ха-актеризуется снижением числа эритроцитов, количества гемоглобина и воз-икновением ранней тромбоцитопении. Зафиксирована также тенденция к величению общего числа лейкоцитов за счет увеличения абсолютного и от-осительного числа нейтрофилов (нейтрофилез) и кратковременной абсо-ютной и относительной лимфоцитопении.

Установлено токсическое влияние БКС «Ок-лио + Ак» в высоких ток-ических дозах при однократном и многократном применении на централь-ую нервную систему (ЦНС) животных, которое проявлялось развитием у их гиподинамии, адинамии, миорелаксации, атаксии с креном влево и катаепсии различной степени выраженности (I или III степени), потерю болевой

-. ' > увствительности задних конечностей, что позволяет предположить угне-ающее влияние БКС на ЦНС.

Все вышеописанные токсические и побочные эффекты БКС «Ок-лио + 1К» были выявлены только при введении БКС «Ок-лио + Ак» животным в етальных, высоких токсических и низких токсических дозах. Функциональ-ая обратимость токсических и побочных эффектов после однократного и ногократного применения БКС «Ок-лио + Ак» составляла 15-60 дней.

Применение БКС «Ок-лио + Ак» в высоких нетоксических дозах не вы-ывало токсических эффектов у животных. '

Проведенные исследования безвредности БКС «Ок-лио + Ак» позволи-и констатировать отсутствие пневмотоксичности, гатроинтестинальной ток-нчности и кардиотоксичности.

Полученные данные по «хронической» токсичности БКС «Ок-лио + .к» на крысах позволили сопоставить их с данными по «острой» токсично-ги на крысах и расчитать индекс кумуляции (1к) БКС «Ок-лио + Ак»: 1к - [(МПД! - МПДП) / ((п-1) х (МПДП))] х 100% где, МПД - максимальнопереносимая доза при однократном и п-кратном ведении.

1к = [(81 - 1080) / (14 х 1080)] х 100% = -7.

Расчитанная величина 1к (-7) свидетельствует об отсутствии кумуля-явных свойств у БКС и обратимости ее токсических эффектов. Учитывая дозовый уровень токсического действия, индекс кумуляции обратимость токсических и побочных эффектов, БКС «Ок-лио + Ак» по гепени опасности «хронического» токсического действия можно классифи-ировать как малоопасное лекарственное средство.

Анализ данных по предклиническому изучению токсичности БКС «Окно + Ак» на различных видах животных (мыши, крысы, кролики, собаки) ыявил отсутствие повреждающего действия этой БКС на нормальные ткани выраженной пролиферативной активностью. За исключением небольшого эличества, все противоопухолевые цитостатики, используемые в клинике, ызывают угнетение гемопоэза и диспепсический синдром. БКС «Ок-лио + .к» не вызывала токсической лейкопении, гранулоцитопении, лимфоцито-ении. Отсутствовала также интестинальная токсичность и анорексия.

Данные по количественной токсичности препарата «Ок-лио» на крысах оказали, что препарат «Ок-лио» при многократном применении менее ток-нчен, чем БКС на его основе примерно в 2 раза.

Применение препарата «Ок-лио» в низкой токсической дозе приводило усилению белоксинтезирующей функции печени; увеличинению числа гйкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и количества гемоглобина в перифе-ической крови животных.

Однократное и многократное применение препарата «Ок-лио» в ле-эльных и максимально переносимых оказывало токсическое действие на |НС животных преимущественно угнетающего характера (вялость, адина-ия, гиподинамия, миорелаксация, атаксия, каталепсия). В лаборатории фар-акологии и токсикологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина установлено, что препа-ат «Ок-лио» при внутривенном введении крысам оказывает дозозависимое пияние на артериальное давление животных, вызывая умеренное гипотен-звное действие. Функциональная обратимость токсических и побочных эф-екгов после однократного и многократного применения препарата «Окно» составляла 15-60 дней.

Применение этого препарата не оказывало токсического действия на ункции сердца, почек, печени и желудочно-кишечного тракта.

Применение Ок-лио в высоких нетоксических дозах не вызывло токси-зских и побочных эффектов у животных.

На основании данных по количественной токсичности БКС «Ок-лио + .к», расчитана начальная безопасная (стартовая) доза для человека при ее циническом изучении по I фазе у больных со злокачественными новообра-званиями (схема 2)[123]: для интраперитонеального применения - 33 мг/м2 ю Ок-лио; Ок-лио:Ак - 1:30); для внутривенного применения - 59 мг/м2.(по 'к-лио; Ок-лио :Ак - 1:10), с последующей эскалацией доз по модифициро-шному методу Fibonacci [101].

СХЕМА УСТАНОВЛЕНИЯ НАЧАЛЬНОЙ (СТАРТОВОЙ) БЕЗОПАСНОЙ ДОЗЫ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА на I фазу клинических испытаний [123 ].

Мыши

Собаки

Эквивалентная доза

Эквивалентная 1Л)10, (МЕЫ)ю V

1/10 МЕЬБю мг/м2

Эквивалентная доза

Человек

I фаза: стартовая доза 1/10 МЕЬБ10

Начальная (стартовая) безопасная доза препарата «Оксикобаламин-лио» в составе БКС при I фазе клинических испытаний составляет: -дляинтраперптонеайьногоприменения - 33 мг/м (по Ок-лио; Ок-лио: Ак - 1:30; Ок, 15 минут —> Ак); -для внутривеноого применения - 59 мг/м2 (по 0Эк-лио; Ок-лио :Ак- 1:10; Ок, 60 минут .-> Ак).

Таким образом, в работе экспериментально обоснована возможность ^пользования БКС на основе Мк переходных металлов в качестве потенци-1ьных противоопухолевых средств для лечения больных со злокачествен->ши опухолями.

Разработаны методические подходы к изучению противоопухолевой ¡зфективности БКС «Мк + Ак» в эксперименте. Совместно с РОНЦ им. .Н.Блохина проведено полное доклиническое изучение БКС на основе пре-зрата «Ок-лио», включающее изучение специфической противоопухолевой [)фективности на животных (мышах и крысах) с перевиваемыми опухолями токсичности (безвредности) на различных видах животных (мышах, кры-IX, морских свинках, кроликах и собаках). Полученные в работе данные воли в отчеты по специфической противоопухолевой активности и общеток-иескому действию (безвредности) БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-ю», представленные в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на клини-;ские испытания по I фазе этих лекарственных средств у онкологических шьных.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Панкратов, Андрей Александрович, 2002 год

1. Витамины. М.: Медицинаю-1974.

2. Витамины Bi2 в животном организме.-М.: Наука.-1976.

3. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы вкивых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. -1991. -т.29,- с. 1.

4. Вольпин М.Е., Кнорре Д.Г., Новодарова Г.Н. // Докл.АН CCCP.-1989.-t.298, N2.-c.363.

5. Вольский H.H., Кашлакова Н.В., Козлов В.А. Влияние супероксидного >адикала на пролиферацию лимфоцитов, стимулированную митогеном // фитология.-1988,-т. 30, № 7,-с.898.

6. Вощинников Е.И. Дитотоксическое действие конъюгатов блеомицина с нсулином и пептидами, содержащими последовательность RGD. //Дис. :анд. биол. наук. М. -1996.

7. Эмалей Й.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула // фитология.-1996.-т. 38, № 12.-с. 1233.аузе Г.Ф., Дудник Ю.В. Противоопухолевые антибиотики. М.: Медицина. -987.

8. Ъленко О.Д., Мясищева Н.В., Раушенбах М.О. и др. //Вопр. мед. химии.-974.-N 5.-с.549-554.

9. Зенков Н.К., Ланкин Е.Б., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс: Зиохимический и патофизиологический аспекты. -М.: VLAHK/Интерпериодика. -2001.

10. Карпова Е.С. Эндоскопическая электро-лазерная деструкция и |юто динамическая терапия на этапах консервативного лечения рака шщевода. //автореф. на соискание ученой степени кандидата биол. наук. М. ■1997.

11. Красновский A.A. Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. // Итоги *ауки и техники. -1992. -т. 3. -с. 63.

12. Зед. Е.С.Киселевой. М.: Медицина. -1996.1и Д.Э. Действие радиации на живые клетки. М. -1962.

13. У1азюк J1.B., Переводчикова H.H. Клиническая оценка противоопухолевого штибиотика из группы блеомицинов блеомицетина. // Антибиотики. -1982. -с. 372.

14. Метелица Д.Н. Активация кислорода ферментными системами. М.: Наука, 982.

15. Методические указания по изучению противоопухолевой активностифармакологических веществ /Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова

16. MC. и др.// Руководство по экспериментальному (доклиническому изучениюювых фармакологических веществ. М.: ИИА Ремедиум, -2000, -с.319.

17. Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основериродных хлорофиллов. // Рос. химич. Журнал. -1998, -т. XLII, -№ 5. -с.23.

18. Мясищева Н.В., Левина Г.Д., Лорие Ю.И. и др. // Пробл. гематол.- 1969,->14.-с.20.

19. Мясищева Н.В. Характеристика обмена соединений В12 (кобаламинов) при ейкозе. Дис. докт.М., -1972.

20. Состояние онкологической помощи населению России в 2000 г/ под. ред. З.И.Чиссова, В.В.Старинского. М.: МНИОИ им. П.А.Герцена, 2001. Зофьина З.П.//Вопр. 0HK0n.-1976.-N 4.-С.82-96.

21. Гараховский A.M., Жмарева E.H., Ромоданов С.А. Роль системы )бразования и детоксикации супероксидных радикалов в механизме фотивоопухолевого эффекта адриамицина. // Бюл. экспер. биол. -1983. -т. >6. -№11. -с. 86.

22. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / под ред. Н.Тица. 4.:Лабинформ. -1997.

23. Vruoma O.I., Halliwell В. DNA-damage and free radicals // Chem. Brit. -991.-v. 27.-p. 149'.

24. Jailly C., Houssin R, Bernier J.L., Henichart J.P. Interaction de la bleomycine ,vec la membrane plasmique: modification de la fluidite et peroxydation desipides.//J Bull.Can,-1989.-v. 76.-p. 835.

25. Birnboim H.G. A superoxide actions induced DNA strand-break metabolic »athway in human leukocytes: effects of vanadose // Biochem. Cell. Biol. 988 v. 66 p. 374.

26. Buchanan J.E., Phillis J.W. The role of nitric oxide in the regulation of cerebral >lood now // Brain Res. -1993. -v. 610. -p. 248.

27. Burdon R.H., Gill V., Evans C.R. Active oxygen species and heat shock protein nduction // Stress Proteins. Induction and Function. Berlin: Springer-Verlag, -990. -p. 19-25.

28. Burdon R.H. Released active oxygen species as intercellular signals: their role in egulation of normal and tumour cell proliferation // Biol. Chem./Hoppe-Seyler. -992.-v. 373.-p. 739.

29. Burger R.M., Blanchard J.S., Horwitz S.B., Deisach J. The redox state of ictivated bleomycin. // J. Biol. Chem. -1985. -v. 260. -p. 15406. Byczkowski J.Z., Gessner T. Biological role of superoxide ion-radical // Int. J. Biochem.-1988.-v. 20.-p. 569.

30. Buettner G.R., Jurkiewicz B.A. Catalytic metals, ascorbate and free radicals: ;ombinations to avoid // Radiat. Res.-1996.-v.145, № 5.-p.532.

31. Burger R.M., Drlica K., Birdsall B. The DNA cleavage pathway of iron Neomycin. Strand scission precedes deoxyribose 3-phosphate bond cleavage. // J. Biol. Chem.-1994. -v. 269.-p. 25978.

32. Cheung K., Archibald A., Robinson F. Luminol-dependcnt chemiluminescence jroduced by neutrophils stimulated by immune complexes // Austr. J. Exp. Biol, ind Med. Sci. -1984. -v. 62, Pt. 4. -p 403.

33. Hiriolo M.R., Magliozzo R.S., Peisach I. Microsome stimulated activation of153errOus bleomycin in the presence of DNA. // J. Biol. Chern. -1987. -v. 262. -p. .290.

34. Collins D.A., Hogenkamp H.P. //J.Nucl.Med.-1997.-v.38, N 5.-p.717. Collins J.M., Zaharko et al D.S. Potential roles for preclinical pharmacology inihase I clinical trials // Cancer. Treat. Rep. -1986. -v. 70. -N 1. -p. 73.

35. Crawford D., Zbinden I., Amstad P., Cerutti P. Oxidant stress induces theiroto-oncogenes c-fos and c-myc in mouse epidermal cells // Oncogen. -1988. -v.-p. 27.

36. Datta R., Hallahan D.E., Kharbanda S.M. et al. Involvement of reactive ixygen intermediates in the induction ofc-jun gene transcription by ionizing adiation//Biochemistry.-1992.-v. 31.-p. 8300.

37. Datta R., TanejaN. Sukhatme V.P. et al. Reactive oxygen intermediates target .C(A/T)6GG sequences to mediate activation of the early growth response-1 ranscription factor gene by ionizing radiation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -993.-v. 90.-p. 2419.

38. Dimascio P. , Briviba K., Sasaki S.T. et al. The reaction of peroxynitrite with ert-butyl hydroperoxide produces singlet molecular oxygen // Biol. Chem. -1997. v. 378.-p. 1071.

39. Dizdaroglu M., Bergtold D.S. Characterization of free radical-induced base lamage in DNA at biologically relevant levels // Ann. Biochem. -1986. -'.156.-p. 182.

40. Dumoulin MJ., Chahine R., Atanasiu R., nadeau R., Mateescu ^//Comparative antioxidant and cardioprotective effects of ceruloplasmin, uperoxide dismutase and albumin // Arzneimittelforschung -1996,-sep 46(9).-'•855.

41. Duwe A.K., Werkmeister J , Roder J.C. et al. Natural killer cell-mediated lysis nvolves an hydroxy'l radical-dependent step // J. Immunol. -1985. -v. 134. -p. 1631.

42. Eliot H., Gianni L., Myers C. Oxidative destruction of DNA by the adriamicinron complex. //Biochemistry. -1984. -v.23. -N 5. -p.928. , Fenton HJ.H. Oxidation of tartaric acid in the presence of iron // J. Chem. Soc. 1894.-v.65.-p.899.

43. Garner M.H., Spector A. Selective oxidation of cysteine and methionine in lormal and senile cataractous lenses // Proc. Natl. Acad. Sci, USA. -1980. -v. 77. p. 1274.

44. Gershoff S.N. Vitamin C (ascorbic acid): new roles, new requirment // Nutr. lev. -1993.-v.51.-№ ll.-p.313.

45. Gey K.F. Vitamins E plus C and interacting conutrients required for optimal lealth. A critical and constructive review of epidemiology and supplementation lata, regarding cardiovascular disease and cancer // Biofactors -1998.-7(1-2).-). 113-174.

46. Giri S.N., Chen Z.L., Younker W.R., Schiedt M.J. Effects of intratracheal idministration of bleomycin on GSH-shuttle enzymes, catalase, lipid peroxidation ind collagen content in the lungs of hamsters. // Toxic. App. Pharmac. -1983. -v. 'l.-p. 132.

47. Glass G.B.J., Lee Duk Ho.// Blood.- 1966.-v.27, N2.-p.227. . Grieshaber C.K., Marsoni S.M. Relation of preclinical toxicology to finding inarly clinical trials // Treat. Rep. -1986. -v. 70, -N 1. -p.65.

48. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. -)xford: Clarendon Press, 1986.-346 p.

49. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. The antioxidant of human extracellular luids // Arch. Biochem. Biophys. -1990. -v.280. -p. 1.

50. Halliwell B., Aruoma O.I. DNA damage by oxygen-derived species. Its aechanism and measurement in mammalian systems // FEBS Lett. -1992. -.307. -p. 108.

51. Henderson B., L. Vaughan, D. Bellnier et al. Photosensitizeation of murine amor, vasculature and skin by using 5-aminolevulinic acid-induced porphyrin // »hotochem. Photobiol. 62:780-789, 1995.

52. Handerson B. Biological background and implications of vascular damage in TO.//Lasers Surg and Med.-1994.-N 6.-p 39.

53. Jacob R.A., Burri B.J. Oxidative damage and defense //Am. J. Clin. Nutr.-996.-v:63.-№6.-p. 985S.

54. Jansen E.H., Van Den Berg R.H., Bergman J.J. Effect of iron chelates on uminol chemiluminescence in the presence of xanthine oxidase // Anal. Chim. teta. —1989. -v. 227. -p.57.

55. Jacques P.F., Sulsky S.I., Perrone G.A. et al. Ascorbic acid and plasma lipids ' Epidemiology .-1994.-V.5. -№ l.-p.l26.

56. Johnson P., Bellnier D., Henderson et al. Combination PDT targeting vessel nd tumor cell usin anionic and cationic photosensitizers. // Photochem. hotobiol. 57:50, 1993.

57. Kanofsky J R. Singlet oxygen production by biological systems // Chem.-Biol nteract-1989.-v.70.-p 1.

58. Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by human red cell ghosts // 'hotochem. and Photobiol. -1991. -v. 53. -p. 93.

59. Kikuchi K., Nagano T., Hayakawa H. et al. Real time measurement of nitric xide produced ex vivo by lummol-H202 chemiluminescence method // J. Biol. :hem.-1993.-v. 268,-p.23106.

60. Kimel S., Gottfrid V., Berns M.W. Vascular responce in photodynamic therapi ' Lasers Surg, and Med.-1994, Suppl.-N. 6.-p. 39.

61. Kiryu C., Makiuchi M., Miyazaki J. et al. Physiological production of singlet lolecular oxygen in the myeloperoxidase-^CVchloride system // FEBS Lett. -999.-v. 443 -p. 154.

62. Knight J.A. Diseases related to oxygen-derived free radicals//Am. Clin. ,ab. Sci. -1995. -v. 25. -N2. -p.lll.

63. Koga S., Nakano M., Uehara K. Mechanism for the generation of superoxide nion and singlet oxygen during heme compound-catalyzed linoleic acid ydroperoxide decomposition// Arch. Biochem. and Biophys. -1991. -v. 289. -p. 23. '

64. Kondo H., Iseki T., Isawa S et al.// Acta Haematol.-v.81, N 2.-p.61-69.

65. Killander A et al. // J.Lab. Clin. Med.-1961.-v.57.-p.553.

66. Kralik P.M., Xu B., Epstein P.N. Catalase transfection decreases hydrogeneroxide toxicity in a pancreatic beta cell line // Endocr. Res.-1998.-v.24.- №1,1.79.

67. Krinsky N.I., Deneke S.M. Interaction of oxygen and oxy-radicals with arotenoids//J.Nat.cancer.Inst.-1982.-v. 69.-p.205.

68. Legrand-Poels S., Vaira D., Pincemail J. et al. Activation of human mmunodeficiency virus type 1 by oxidative stress // AIDS Res. and Human tetroviruses. -1990. -v. 6. -p. 1389.

69. The Mac Milan Press. -1983. -p. 283.

70. Masaki H., Okano Y., Sakurai H. Differential role of catalase and glutathione )eroxidase in cultured human fibroblasts under exposure of H202 or ultraviolet B ight // Arch. Dermatol. Res.-l998.-290 (3).-p.l 13.

71. Mendiratta S, Qu Z., May J.M. Erythrocyte defenses against hydrogen peroxide: the role of ascorbic acid // Biochem. Biophys. Acta.-1998.-1380 (3).-p.389.

72. Mlakaar A., Bothe A., Dudda A., Spiteller G. // Free Radical. Res. -1996. -v.25(6).-p. 525.

73. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, iathophysiology and pharmacology // Pharmacol. Revs. -1991. -v. 43. -p. 109.

74. Moncada S. The L-arginine: nitric oxide pathway // Acta Physiol. Scand. -992.-v. 145.-p. 201.

75. Mortensen A.,Skibsted L.H. Relative stability of-carotenoids radical cations nd homologue tocopheroxyl radicals. A real time kinetic study of antioxidant ierarchy// FEBS Lett.-1997.-417(3).-p.261.

76. Muindi J.R.F., Sinha B.K., Gianni L. et al. Hydroxyl radical production and )NA damage induced by anthracycline iron complex. - FEBS Lett. -1984. -^.172. -N 2. -p. 226.'

77. Murugesan N., Ehrenfeld G.M., Hecht S.M. Oxygen transfer from bleomycinnetal complexes. // J. Biol. Chem. -1983. -v. 257. -p. 8600.

78. Nagano T., Fridovich I. Does the aerobic xanthine oxidase reaction generatesinglet oxygen? //Photochem, andPhotobiol. -1985. -v. 41. -p. 33.

79. Nakane M., Schmidt H.H., Pollock J.S. et al. Cloned human brain nitric oxidesynthase is highly expressed in skeletal muscle // FEBS Lett. -1993. -vol. 316. -p.175.

80. Nogueira N. Intracellular mechanisms of killing // Contemporary Topics in mmunobiology.-N.Y.;L.-1984.-p.53.

81. Nishizawa Y., Yamamoto T., Terada N. et al.//Int.J.Vitam.Nutr.Res.-1997.-/.67, -N 3.-p.l64.

82. Omaye S.T., Tappel A.L. Glutathione peroxidase, glutatione reductase and :hiobarbituric acid reactive products in muscles of chicken and mice with genetic musculas dystrophy. // Life Sci. -1984. -v. 15. -p. 137.

83. Ota M., Crofton J.T., Festavan G.T., Share L. Evidence that nitric oxide can ct centrally to stimulate vasopressin release // Neuroendocrinol. —1993. —v. 57. p. 955.

84. Pantopoulos K., Hentze M.W, Nitric oxide signalling to iron-regulatory rotein: Direct control of ferritin mRNA translation and transferrin receptor iRNA stability in transfected fibroblasts //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. -v. 2. -p. 1267.

85. Parkinson D. Oxygen free radicals: in search of a unifying theory ofisease // Intensive Crit. Care Nurs. -1995. -v. 11. -N 6. -p. 336.

86. Pass H. PDT in oncology: Mechanisms and clinical use. //J. Nat. Cancer Inst.15 (6): 443-456,1993. ^

87. Perez H.D. Generation of a chemotactic lipid from arachidonic acid byxposure to a superoxide-generating system // Inflammation. -1980. -v. 4. -p. 313.

88. Petrone W.F., English O.K., Wong K., McCord J.M. Free radicals andnflammation: superoxide-dependent activation of a neutrophil chemotactic factorn plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1980. -v. 77. -p. 1159.

89. Poydock M.E. Effect of combined ascorbic acid and B-12 on survival of mise vith implantid Ehrlieh carcinoma and L-1210 ieukemia //Am.J.Clin.Nutr.-1991-'.54.-p.lS-5S.

90. Pronai L., Ichimori K., Saigusa Y., Nakazawa H. 5,5-dimethyl-l-pyrroline-N->xide alone enhances the spontaneous superoxide generation by primaquine // ^rch. Biochem. and Biophys.-1991.-v. 288.-p. 276.

91. Radtke K., Lornitzo F.A., Byrnes R.W., Antholine W.E., Petering D.H. Ironequirement for cellular DNA damage and growth inhibition by hydrogeneroxide and bleomycin. // Biochemical Journal. -1994. Part 3. -p. 655.

92. Ramanujam H.S., Seetharam S.,Ramasamy M, Seetharam B.//Am. J.Physiol.-991.-v.260 (3Ptl): G416.

93. Rannug U., Holme J.A., Hongslo J.K., Sram R. International ommission br Protection against Environmental Mutagens and Carcinogens. An ;valuation of the genetic toxicity of paracetamol // Mutat. Res. -1995. -v. 327. -p. 179.

94. Rodrigues L.O., Hecht S.M. Iron(II)-bleomycin. Biochemical and spectral iroperties in the presence of radical scavengers. // BBRC. -1982 -v. 104. -p. 1470.

95. Roots R., Okada S. Estimation of life times and diffusion distances of radicals tivolved in X-ray-induced DNA strand breaks or killing of mammalian cells // tadiat. Res.-1975.-v. 64.-p. 306.

96. Rubanyi C.M. Vascular effects of oxygen-derived free radicals // Free Radical Biol, and Med. -1988.-v.4.-p. 107.

97. Samokyszyn V.M., Thomas C.E., Reif D.W. et al. Release of iron from ferritin ind its role on oxygen radicals toxicities // Drug Metab. Rev. -1988. -v. 19. -p. >83.

98. Scarpa M., Stevanato R., Viglino P., Rigo A.J. // Biol. Chem., -1983. -v. 258. -p. 6695.

99. Scarpa M., Vianello F., Signor L. et al // Inorg. Chem. -1996. -v.35(18). -p. 5201.

100. Schreck R., Rieber P., Baeuerle P.A. Reactive oxygen intermediates as ipparently widely used messengers in the activation of the NF-k-B transcription äctor and HIV-1 // EMBO J. -1991 -v. 10-p. 2247.

101. Schleinitz N., Costello R., Veit V. et al. // Leuk. Res.-1998. v.22, -N 3.-287. . Schubert J , Wilmer J.W. Does hydrogen peroxide exist "free" in biologicalsystems? // Free Radical Biol, and Med. -1991. -v. 11. -p. 545.

102. Selman S., M. Kreimer-Birnbaun, K. Chaudhuri et al. Photodynamic theatment

103. Df transplantable bladder tumors in rodent after pretreatment withhloroaluminium tetrasulfophthalocyanine. //J. Urol. 136:141-145, 1986.

104. Shi X., Dalai N.S. Flavoenzymes reduce vanadium (V) and molecular oxygenmd generate hydroxyl radical // Arch. Biochem. and Biophys. -1991. -v. 289. -p.355.

105. Siegel K., Fingar V., Wieman T. et al. Mechanisms of tumor destruction using hotofrin, HPPH and N Peb.// Photochem. photobiol. 57:20, 1993.

106. Simic M.G., Bergtold D.S., Karam L.R. Generation of oxy radicals in iosystems // Mutat. Res. -1989. -v. 214. -p. 3.

107. Schwertnerova E., Wagnerova D. M. et al//Idit.-1979.-v.44.-p. 2893.

108. Sneddon J M , Vane J R Endothelium-denved relaxing factor reduces platelet dhesion to bovine endothelial cells // Proc Nati Acad Sci USA -1988 v. 85 -p. 800

109. Sohal R S , Svensson I, Sohal B H , Brunk U T Superoxide anion radical roduction in different animal species // Mech Ageing and Develop -1989 -v 49 -p 29.

110. Sohal R S , Svensson I, Brunk U T Hydrogen peroxide production by liver litochondna in different species // Mech Ageing and Develop -1990 -v 53 -p 209.

111. Solomon L.R., Berelli R.D., Moseley P.L. Bleomycin-iron can degrade DNA l the presence of excess ethylenediaminetetraacetic acid in vitro. // Biochem., -989, -v.28, -p. 9932.

112. Spitz D.R , Dewey W.C., Li G.C. Hydrogen, peroxide or heat shock induces distance to hydrogen peroxide in Chinese hamster fibroblasts // J. Cell. Physiol. 1987.-v. 131 -p.364.

113. Stogner S.W., Payne D.K. Oxygen toxicity // Ann. Pharmacotherapy. -992.-v. 26.-p. 1554.

114. Sugiura I., Suzuki T. Nucleotide sequence specifity of DNA cleavage by on-bleomycin alteration on ethidium bromide-, actinomycin-, distamycin -itercalated DNA. // J.Biol.Chem. -1982. -v. 257. -p. 10544.

115. Sundqvist T. Bovine aortic endothehal cells release hydrogen peroxide // J. :ell Physiol. -1991. -v 148.-p. 152.

116. Takahama U. Hydrogen peroxide-dependent generation of singlet molecular xygen by human saliva: Its detection by chemiluminescence from a cypridina iciferin analog//Photochem. and Photobiol.-1993.-v. 57.-p. 376.

117. Terashima T., Takabe I., Katsumata T., Watanabe M., Umezawa H. Effect of leomycin on mammalian cell survivae. // J. Natl. Can. Inst., -1972. -v. 49, -p. 093.

118. Togashi H., Sakuma I., Yoshioka M. et al. A central nervous system dction of itric oxide in blood pressure regulation // J. Pharmacol, and Exp. Ther. 1992.262. -p. 343.

119. Tsao C., Miyashita K., Loung M. // Pathobiology.-l990.-v.58, N 5 p.292.

120. Tomelli M.V., Dianzani M.U. Free radicals in inflammatory disease // Free

121. Radicals in Molecular Biology, Aging and Disease. N.Y.: Raven Press. -1984. -.355-379.

122. Tsukahara K., Ushio H., Yamamoto Y. // Chem. Lett. -1980. -p. 1137.

123. Tsukahara K., Yamamoto Y. // Bull. Chem. Soc. Jap. -1981. -v. 54. -N 9. -p. 642.

124. Thomas S., Lowe J.E., Hadjivassiliou V., Knowles R.G. et al. Use of the "omet assay to investigate the role of superoxide in glutathion-induced DNA amage // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998. -v.243. № 1. -p.24'1.

125. Uehara J., Hori M., Umezawa H. Specifity of transport of bleomycin and obalt-bleomycin in L 5178Y cells. // BBRS, -1982, -v. 104, -p. 416.

126. Urano M., Fucuda N., Koike S. The effects of bleomycin on survivae and nmor growth in a C3H mouse mammary carcinoma. // Can.Res., -1973, -v. 33, -1.2849, ,

127. Vanasbeck B.S. Involvement of oxygen radicals and blood cells in the iathogenesis of ARDS by endotoxin and hyperoxia // Appl. Cardiopulm. and •athophysiol. -1991. v. 4. -p. 127.

128. Verma A., Hirsch D.J„ Glatt C.E. et al. Carbon monoxide: A putative neural lessenger//Science.-1993.-v. 259.-p. 381.

129. Wallerath T., Gath I., Aulitzky W.E. et al. Identification of the NO synthase soforms expressed in. human neutrophil granulocytes, megakaryocytes and ilatelets//Thromb. and Haemost.-1997.-v. 77.-p. 163.

130. Wagnerova D.M., Blanck J., Smettan G. et al // J. Collect. Czech. Chem. Communs.-1978.-v. 43.-p. 2105.I

131. Wagnerova D.M., Votruba J., Blanck J. // Idit. -1982. -v. 47. -p. 744.

132. Wagnerova D.M., Stopka p., Repin H. et al // Idit. -1982. -v.46. -p. 457.

133. Wagnerova D.M., Blanck J., Veprek-Siska // Idit. -1982. -v. 47. -p. 755.

134. Weiss S.J. Tissue destruction by neutrophils // New Engl. J. Med. -1989. -v. 20. -p. 365.

135. Wendel A. Enzymes acting against reactive oxygen // Enzymes: Tools and targets. Basel: Karger. -1988.-p. 161.

136. Winyard P.G., Lunec J., Brailsford S.B., Blake D.R. Action of Iree radicalenerating systems upon the biological and immunological properties of eruloplasmm // Int. J. Biochem. -1984. -v. 16.-p. 1273.

137. Whiteacre C.A., Cathcart M.K. Oxygen free radical generation and regulation f proliferative activity of human mononuclear cells responding to different litogens // Cell. Immunol. -1992. -v. 144. -p. 287.

138. Wiseman H., Kaur H., Halliwell B. DNA damage and cancer: measurement nd mechanism // Cancer Lett. -1995. -v. 93. -p. 113.

139. Wolff D.J., Datto G.A. Identification and characterization of a calmoduliniependent nitric oxide synthase from GH3 pituitary cells // Biochem. J. -1992. -v. 85.-p. 201.

140. Wolff S.P., Dean R.T. Fragmentation of proteins by free radicals and its effect in their susceptibility to enzymic hydrolysis // Biochem. J. -1986. -v. 234. -p. 99.

141. Yang K.D., Shaio M.-F. Hydroxyl radical as an early signal involved in ihorbol ester-induced monocyte differentiation of HL60 cells // Biochem. and Jiophys. Res. Commun. -1994. -v.200. -p. 1650.

142. Yu B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species // »hysiol. Revs.-1994,-v. 74.-p. 139.

143. Zweier J. L. Redaction of О by iron-adriamycin. .//J. Biol. Chem. -1984. -v. :59.-N 10.-p. 6056.

144. Михайлова JIM. Токсикология новых отечественных ротивоопухолевых препаратов // Дис. д.б.н., М. -1995. , Чернов В.А. Методы экспериментальной химиотерапии. М.: Медицина. -971.