Протеиназы, иммобилизованные на криогеле поливинилового спирта, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Беляева, Анастасия Валерьевна

• Беляева, Анастасия Валерьевна
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Беляева, Анастасия Валерьевна

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Модифицированные протеиназы как катализаторы синтеза пептидов в органической среде (обзор литературы)

1.1. Механизм катализа пептидного синтеза протеиназами

1.1.1. Механизм катализа пептидного синтеза металлопротеиназами 11 на примере термолизина

1.1.2. Механизм катализа пептидного синтеза сериновыми 14 протеиназами

1.2. Влияние различных факторов на синтазную активность 15 ферментов

1.3. Синтез пептидов, катализируемый модифицированными 17 протеиназами

1.3.1. Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными 17 протеиназами

1.3.1.1. Нековалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе 18 пептидов

1.3.1.2. Ковалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе 27 пептидов

1.3.1.3. Протеиназы, модифицированные альтернативными 36 способами, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде

1.3.2. Влияние содержания воды в реакционной среде на 42 эффективность проведения пептидного синтеза, катализируемого модифицированными протеиназами

1.3.3. Субстратная специфичность нативных и модифицированных 45 протеиназ в пептидном синтезе в органической среде

1.3.3.1. Субстратная специфичность металлопротеиназ в реакциях 46 пептидного синтеза на примере термолизина

1.3.3.2. Субстратная специфичность сериновых протеиназ в реакциях 48 пептидного синтеза в органической среде

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Протеиназы, иммобилизованные на криогеле поливинилового спирта, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде»

Синтез пептидов, катализируемый протеипазами, является одним из наиболее перспективных подходов к получению практически важных биологически активных веществ. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и возрастает растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает ингибирующее воздействие на ферменты, лишая их необходимой для осуществления каталитических функций гидратной оболочки. Эффективным подходом для стабилизации протеиназ в органических средах является их ковалентная и нековалентная фиксация на нерастворимых подложках. Однако протеиназы, закрепленные на носителе за счет физической адсорбции, находят ограниченное применение в пептидном синтезе из-за опасности вымывания их в раствор и значительной инактивации. Ферменты, ковалентно фиксированные на инертной матрице, лишены этих недостатков. В этой связи актуальной представляется разработка эффективной биокаталитической системы, адаптированной к условиям синтеза пептидов в органической среде, на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на подходящем макропористом носителе.

Мы предлагаем новые биокатализаторы на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта. Целью работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта, как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде.

1. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ КАК КАТАЛИЗАТОРЫ СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ В ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

При определенных условиях протеиназы могут выступать как катализаторы образования пептидной связи. Для этого используют большинство коммерчески доступных сериновых, металло-, аспартильных эндо- и экзопептидаз [1]. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и увеличивается растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает негативное воздействие на каталитическую функцию ферментов, приводя к их инактивации [2].

Одной из причин ингибирования фермента в органическом растворителе является прямой контакт растворителя с биокатализатором. Следствием такого контакта является нарушение гидратной оболочки фермента, а также изменение состояния ионизации полярных групп на поверхности фермента (по сравнению с водной средой), что может приводить к частичному изменению его структуры. Существенную роль в стабилизации ферментов играет вода, а также факторы, вызывающие влияние на степень гидратации ферментов. Для понижения инактивации ферментов в среде органических растворителей применяют различные подходы: добавление солей, введение краун-эфиров при лиофилизации, ковалентную и нековалентпую иммобилизацию на различных инертных носителях, образование нековалентных комплексов с ПАВ [3-9].

Наиболее эффективным способом стабилизации протеиназ в неводных средах является их модификация [3]. В данном литературном обзоре будут рассмотрены сведения о поведении и возможности использования модифицированных протеиназ различных классов - сериновых и металлопротеиназ, в частности, термолизина, в качестве катализаторов синтеза пептидов. Основное внимание будет уделено ферментам, иммобилизованным на нерастворимых подложках, а также протеиназам, ковалентно или нековалентно модифицированным «сшивающими» или полимерными реагентами.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Беляева, Анастасия Валерьевна

выводы

1. Получены и охарактеризованы препараты трипсина, термолизина, химотрипсина и субтилизина, иммобилизованных на криогеле ПВС.

2. Показана возможность использования полученных препаратов в качестве эффективных катализаторов синтеза пептидов в органической среде. Изучена каталитическая эффективность иммобилизованных субтилизина и термолизина в пептидном синтезе в зависимости от состава реакционной смеси, концентрации исходных реагентов и количества биокатализатора. С использованием иммобилизованных протеиназ с высокими выходами получены ди-, три- и тетрапептиды разного строения.

3. На основании исследования биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов установлено, что в органической среде для иммобилизованного субтилизина наблюдается «расширение» субстратной специфичности, в то время как иммобилизованный термолизин сохраняет свою субстратную специфичность.

4. Показана возможность многократного использования одного и того же образца иммобилизованных термолизина и химотрипсина в синтезах различных пептидов в органической среде без регидратации биокатализаторов в течение, по крайней мере, 6 циклов.

5. Разработана схема синтеза хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ в препаративных количествах под действием иммобилизованных ферментов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне признателен руководителям работы Ирине Юрьевне Филипповой и Елене Николаевне Лысогорской за ценные советы в ходе выполнения работы и огромную моральную поддержку во время ее написания. Автор также признателен руководителю со стороны ИНЭОС РАН Владимиру Иосифовичу Лозинскому за советы по выполнению экспериментов и написанию работы. Автор особенно благодарен Е. С. Оксенойт за синтез отдельных исходных соединений. Автор чрезвычайно признателен отделу хроматографии НИИ ФХБ им. Белозерского в лице Л. А. Баратовой, Н. В. Федоровой, А. Л. Ксенофонтова и А. В. Тимофеевой за помощь в изучении структуры синтезированных пептидов и анализе хроматографических данных. Автор хотел бы выразить отдельную благодарность А. В. Бачевой за помощь в поиске литературы и ценные советы по написанию работы, Т. А. Семашко, 10. А. Смирновой и О. А. Аникиной за помощь в выполнении отдельных экспериментов и моральную поддержку в ходе написания работы, а также всем сотрудникам лаборатории химии белка Химического факультета МГУ и Лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН за внимание и полезные советы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как следует из литературного обзора, как ковалентно, так и нековалентно модифицированные ферменты могут обладать достаточно высокой эффективностью в синтезе, в связи с чем решающим фактором выбора биокатализатора для пептидного синтеза в органической среде является высокая технологичность, связанная с легкостью о тделения продукта реакции и регенерации катализатора, а также отсутствием диффузионных ограничений. Все эти качества удачно сочетает в себе метод ковалентной иммобилизации на макропористых носителях [101]. В основном, за активностью полученных биокатализаторов следят по реакциям гидролиза и переэтерификации, данных же по использованию иммобилизованных протеиназ в синтезе меньше.

В литературе описаны случаи «расширения» субстратной специфичности модифицированных протеиназ при использовании их в качестве катализаторов пептидного синтеза в органических средах, в то время как субстратная специфичность термолизина в органической среде преимущественно сохраняется.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как следует из литературного обзора, ковалентно иммобилизованные протеиназы, по-видимому, являются наиболее удобными катализаторами для проведения синтеза пептидов в органической среде. Целью настоящей работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта (криоПВСГ), как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде.

В работе решались следующие задачи:

1. Получение и характеристика препаратов трипсина, субтилизина, термолизина и химотрипсина, иммобилизованных на криоПВСГ;

2. Выявление оптимальных условий протекания реакции пептидообразования, катализируемого данными биокатализаторами;

3. Изучение биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов в реакциях пептидного синтеза;

4. Синтез ряда хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ с использованием ферментов, иммобилизованных на криоПВСГ.

2.1. Получение и характеристика биокатализаторов на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта

2.1.1. Выбор протеиназ для иммобилизации

Для иммобилизации были использованы ферменты различных классов -трипсин, химотрипсин и микробные ферменты субтилизин и термолизин. Химотрипсин, трипсин и субтилизин принадлежат к классу сериновых протеиназ, который получил свое название благодаря присутствию остатка серина в активном центре. Химотрипсин и субтилизин характеризуются стабильностью и широкой субстратной специфичностью. Для трипсина свойственна высокая избирательность, он гидролизует только те пептидные связи, карбонильная группа которых принадлежит аргинину и лизину. Термолизин относится к классу металлопротеиназ и содержит в активном центре ион цинка; этот фермент гидролизует пептидные связи, образованные аминогруппой таких гидрофобных аминокислот, как изолейцин и валин. Выбор этих отличных по своей природе и каталитическому механизму ферментов был связан с их доступностью, стабильностью и высоким синтетическим потенциалом в реакциях пептидной конденсации.

Известно, что для успешного осуществления ковалентной иммобилизации ферментов требуется, чтобы белок образовывал с носителем не менее четырёх-шести ковалентных связей, а соответствующие аминокислотные остатки, участвующие в их образовании, располагались как можно дальше от активного центра белка [102]. Из литературных данных известно [11], что молекулы всех иммобилизуемых ферментов содержат достаточное количество остатков лизина (8-14), причем все они расположены на поверхности глобулы на значительном удалении от активного центра, что позволило провести ковалентное присоединение протеиназ к носителю.

2.1.2. Получение носителей для иммобилизованных ферментов, базирующихся на криогелях поливинилового спирта

В качестве матрицы для ковалентной фиксации ферментов был выбран криоПВСГ. Уникальной особенностью криоПВСГ является его макропористая структура, а также совместимость как с водной, так и с полярной органической средой. Эти свойства носителя обеспечивали возможность иммобилизации на нем крупных молекул ферментов, минимизируя затрудненную диффузию субстрата, а также инактивацию биокатализатора в органической среде [103105].

КриоПВСГ образуется при замораживании, выдерживании в замороженном состоянии и последующем оттаивании с определенной скоростью концентрированного водного раствора данного полимера. При замерзании раствора ПВС сначала кристаллизуется чистый растворитель, а растворенные вещества концентрируются ещё в жидкой части образца [106]. Такие неглубоко замороженные растворы поливинилового спирта представляют собой как минимум двухфазные системы, включающие кристаллическую фазу замороженного растворителя и фазу высококонцентрированного раствора полимера - так называемую незамерзшую жидкую микрофазу (схема 1). Подобное криоконцентрирование существенно усиливает взаимодействия полимер-полимер, что, в конце концов, приводит к образованию устойчивых узлов пространственной сетки криогеля. Поскольку кристаллизация чистого растворителя и концентрирование растворенного вещества протекают в гетерогенной системе, то после её оттаивания получается гетерогенный гель. В нем под действием кристаллов замерзшего растворителя формируются поры различной величины и геометрии. Таким образом, растворитель играет роль порообразователя. Ярко выраженная гетерогенность, т.е. наличие микро- и макропор, характерна для любых криогелей поливинилового спирта [106, 107]. (в) Исходная снсгсма (Ь) Замороженная (с)Опаявшая система система

5 8

Рис. 4. Образование криогелей. 1) высокомолекулярные гелеобразователи, 2) растворитель, 3) низкомолекулярные гелеобразователи или вещества в растворе, 4) поликристаллы замороженного растворителя, 5) незамерзшая жидкая микрофаза, 6) полимерный каркас криогеля (гелевые стенки макропор), 7) макропоры, 8) растворитель.

В ходе экспериментов был получены образцы криогеля ПВС по стандартной методике [108] и криоПВСГ с диаметром пор, примерно в 10 раз большим (рис. 5 и 6). Для этого при приготовлении раствора ПВС добавляли в него додецилсульфат натрия (SDS) с тем, чтобы конечная концентрация ПАВ составляла 0.75 ККМ; а затем проводили криогрануляцию. В ходе работы использовали криоПВСГ в виде сферических гранул диаметром около 1 мм (рис.

7), полученных с помощью специальной криогрануляционной установки; в случае получения криогеля в присутствии SDS размер гранул составил 0.3-0.8 мм.

Рис. 5. Криогель поливинилового спирта.

Рис. 6. Криогель поливинилового спирта, полученный из раствора ПВС, содержащего SDS.

100 u III

I I

Рис. 7. Гранулы криоПВСГ.

2.1.3. Иммобилизация протеиназ на криогеле поливинилового спирта Процесс ковалентной иммобилизации белков на криоПВСГ включал две основные стадии: введение реакционноспособных группировок в матрицу носителя (активация криогеля) и присоединение молекул фермента по этим группировкам [109, 110]. Для прививки реакционноспособных группировок к криоПВСГ использовали известные методики химической модификации этого носителя - активацию диальдегидами в кислой среде (схема 7а) и активацию дивинилсульфоном (ДВС) в щелочной среде (схема 76) [111].

ОН

ОН

ОНС-(СН2)з-СНО н

СН(СН2)з-СС п / х и н

H?N —ФЕРМЕНТ

•О.

0^>CH(CH2)3-CH=N -ФЕРМЕНТ б) о

II о н сн2 =сн - сн=сн2 о о

Ln 'I о —сн2-сн2 о

11 2n —фермент

-сн=сн оно о - ch2-ch2-^-ch2-ch2-nh - фермент о fl

II

Схема 7. Схема иммобилизации ферментов на криоПВСГ, содержащем а) альдегидные и б) винилсульфоновые реакционноспособные группировки.

2.1.3.1. Иммобилизация трипсина на криогеле поливинилового спирта

В качестве объекта для отработки методики получения иммобилизованных ферментов был использован трипсин, который является доступной и хорошо охарактеризованной протеиназой.

Активацию криоПВСГ с помощью ДВС проводили по методике [111], но специально исследовалось влияние различных концентраций раствора NaOH (0.05, 0.1, 0.25 и 0.5 М) на результаты реакции носителя с ДВС (схема 76). Было установлено, что все полученные активированные носители плавились при 65°С. В дальнейшей работе при модификации носителя ДВС использовали 0.1 М раствор NaOH, но обработку проводили разными количествами ДВС. Присоединение трипсина к активированной матрице проводили в водном буфере при рН 7.5. Следует заметить, что в результате реакции трипсина с таким производным криоПВСГ образуется стабильная C-N связь, более прочная, чем альдиминная, формирующаяся при реакции белков с матрицей, активированной диальдегидами. Результаты экспериментов по иммобилизации трипсина на гранулах криоПВСГ, модифицированных в среде 0.1 М NaOH разными количествами ДВС, представлены в таблице 3. Видно, что с повышением концентрации активирующего агента возрастали как содержание иммобилизованного белка, так и удельная ферментативная активность препаратов биокатализатора, но после их хранения в течение 25 суток у изначально более активных образцов активность заметно снижалась.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Беляева, Анастасия Валерьевна, 2006 год

1. Gill I., Lopez-Fandino R., Jorba X. and Vulfson E. N. Biologically active peptides and enzymatic approaches to their production. // Enz. Microb. Techn. 1996, 18, 162-183.

2. Gorman L.S., Dordick J. Organic solvents strip water off enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 1992,39,392-397.

3. C. O'Fagain. Enzyme stabilization recent experimental progress. // Enz. Microb. Technol. 2003,33,137-149.

4. Sears P., Witte K., Wong C. The effect of counterion, water concentration and stirring on the stability of subtilisin BPN' in organic solvents. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1999,6, 297-304.

5. Meyer J., Kendryck В., Matsuura J. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotiypsin in organic solvents via hydrophobic ion pairing. // Int. J. Peptide Protein Res. 1996,47,177-181.

6. Kendryck В., Meyer J., Matsuura J., Manning M. Hydrophobic ion pairing as a method for enhancing structure and activity of lyophilized subtilisin BPN' suspended in isooctane. // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1997, 1, 113118.

7. Wangikar P. P., Michels P. C., Clark D. S., Dordick J. S. Structure and function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 70-76.

8. Okazaki S., Goto M., Furusaki. Surfactant-protease complex as novel biocatalyst for peptide synthesis in hydrophilic organic solvents. // Enz. Microb. Technol. 2000,26,159-164.

9. Pelmenschikov V., Blomberg M.R.A., Siegbahn P.E. M. A theoretical study of the mechanism for peptide hydrolysis by thermolysin. // J. Biol. Inorg. Chem. 2002, 7, 284-298.

10. Cassells J.M., Hailing P.J. Protease-catalyzed peptide synthesis in aqeous-organic two-phase systems: reactant precipitation and interfacial inactivation. // Enz. Microb. Tecnol. 1990,12,755-759.

11. Hailing P.J. Effect of thermodynamic water activity on protease-catalyzed peptide synthesis in mainly organic media. // Biomed. Biochim. Acta, 1991, 50, 61-66.

12. Cassells J.M., Hailing P.J. Protease-catalyzed peptide synthesis in low-water organic two-phase systems and problems affecting it. // Biotechnol. Bioeng. 1989, 33,1489-1494.

13. Proteolytic enzymes. A practical approach. Ed. by RJ.Beynon, J.S.Bond // IRL Press, Oxford. 1988,125-143.

14. Kullmann W. Enzymatic peptide synthesis. // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. 1987.

15. Wayne S.I., Fruton J.S. Thermolysin-catalyzed peptide bond synthesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80,3241-3244.

16. Oyama K., Kihara K., Nonaka Y. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1981,2, 356-360.

17. Riechmann L., Kasche V. Reaction mechanism, specificity and pH-dependence of peptide synthesis catalyzed by the metalloproteinase thermolysin. // Biochim. Biophys. Acta. 1986, 872,269-276.

18. Степанов B.M. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. А.С. Спирина. Москва. Высшая школа. 1996. с. 220-233.

19. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. // Ann. Rev. Biochem. 1977,46,331-338.

20. Антонов В. К. Химия протеолиза. // Москва. Наука. 1983. С. 135-147.

21. Stepanov V.M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996, 68,1335-1339.

22. H.-D. Jakubke. Enzymatic synthesis. // In: Future aspects in peptide chemistry. Ed. by W. Voelter, G. Fisher. Collection. 1999,1,47-67.

23. Ulijn R.V., Erbeldinger M., Hailing P.J. Comparison of methods for thermolysin-catalyzed peptide synthesis including a novel more active catalyst. // Biotechnol. Bioeng. 2000,69,633-638.

24. Cassells J.M., Hailing P.J. Effect of thermodynamic water' activity on Thermolysin-catalysed peptide synthesis in organic two-phase systems. // Enzyme Microb. Technol. 1988,10,486-491.

25. Clapes P., Torres J.-L., Adlercreutz P. Enzymatic peptide synthesis in low-water systems: preparative enzymatic synthesis of Leu.- and [Met]- enkephalin derivatives. // Bioorg. Med. Chem. 1995,3,245-255.

26. Ruiz S., Feliu J.A., Caminal G., Alvaro G., Lopez-Santin J. Reaction engineering for consecutive enzymatic reactions in peptide synthesis: application to the synthesis of a pentapeptide. // Biotecnnol.Prog. 1997, 13,783-787.

27. Inouye K. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysin. // J. Biochem. 1992, 112,335-340.

28. K. Inouye, S.B. Lee, and B. Tonomura. Effect of amino acid residues at the cleavable site of substrates on the remarkable activation of thermolysin by salts. // Biochem. J. 1996,315(1), 133-138.

29. Trusek-Holownia A. Synthesis of Z-Ala-Phe-OMe, the precursor of bitter dipeptide in the two-phase ethyl acetate-water system catalyzed by thermolysin. // J. Biotechnol. 2003, 102,153-163.

30. Березин И.В., Мартинек К.М. Химическая эизимология // Москва. Издательство Московского Университета, 1983.

31. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К.М., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. // Иммобилизованные ферменты. Биотехнология. М.: Высшая школа. 1987.

32. L. Cao. Immobilised enzymes: science or art? // Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, 9, 217-226.

33. A. Triantafyllou, D. Wang, E. Wehtje, P. Adlercreutz. Polyacrylamides as immobilization supports for use of hydrolytic enzymes in organic media. // Biocat. Biotransform. 1997,15, 185-203.

34. G.-W. Xing, X. Li, G. Tian, Y. Ye. Enzymatic peptide synthesis in organic solvent with different zeolites as immobilization matrixes. // Tetrahedron. 2000, 56, 35173522.

35. M. Yu. Gololobov, V. M. Stepanov, T. L. Voyushina, I. P. Morozova, P. Adlercreutz. Side reactions in enzymatic peptide synthesis in organic media: effects of enzyme, solvent, and substrate concentrations. // Enz. Microb. Technol. 1994,16, 522-528.

36. D. Unen, J. Engbersen, D.N. Reinhoudt. Sol-gel immobilization of serine proteases for application in organic solvents. // Biotechn. Bioeng. 2001, 75, 154158.

37. Martin M.T., Sinisterra J.V., Heras A. Influence of the modification procedure of support materials on the microenvironment of immobilized a-chymotrypsin. // J. Mol.Cat. 1993,80,127-136.

38. Magnin D., Dumitriu S., Chornet E. Immobilization of enzymes into a polyionic hydrogel: ChitoXan. //J. Bioact. Compat. Pol. 2003,18, 355-373.

39. Miyazawa Т., Hiramatsu М., Murashima Т., Yamada Т. Bacillus licheniformis protease-catalyzed synthesis via kinetically controlled approach using the carbamoylmethyl ester as an acyl donor in anhydrous acetonitrile. // Lett. Pept. Sci. 2002, 9, 173-177.

40. Miyazawa Т., Masaki S., Yanagihara R., Yamada T. Peptide synthesis mediated by Bacillus subtilis protease. // Pept. Sci. 1999: N. Fujii (Ed.), 133-134.

41. Valivety R. H., Hailing P. J., Peilow A. D., Macrae A. R. Relation between water activity and catalytic activity of lipases in organic media. // Eur. J. Biochem. 1994, 222,461-466.

42. Basso A., Martin L., Gardossi L., Linda P. High isolated yields in thermodynamically controlled peptide synthesis in toluene catalyzed by thermolysin adsorbed on Celite R-640. // Chem. Commun. 2000,467-468.

43. M.P. Bemquerer, P. Adlercreutz, M. Tominaga. Pepsin-catalyzed peptide synthesis in organic media: studies with free and immobilized enzyme. // Int. J. Pept. Protein Res. 1994,44,448-456.

44. X. Zhang, X. Wang, S. Chen, X. Fu, X. Wu, C. Li. Protease-catalyzed small peptide synthesis in organic media. // Enz. Microb. Technol. 1996,19, 538-544.

45. Ferreira L., Ramos M.A., Dordick J., Gil M.H. Influence of different silica derivatives in the immobilization and stabilization of a Bacillus licheniformis protease (subtilisin Carlsberg). // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2002,21,189-199.

46. C. Mateo, O. Abian, R. Fernandez-Lafuente, J.M. Guisan. Increase in conformational stability of enzymes immobilized on epoxy-activated supports byfavoring additional multipoint covalent attachment. // Enz. Microb. Technol. 2000,26,509-515.

47. Kondo A., Fukuda H. Preparation of thermo-sensitive magnetic microspheres and their application to bioprocesses. // Colloids Surfaces A: Physiochemical and engineering Aspects. 1999,153,435-438.

48. Wang P., Sergeeva M.V., Lim L., Dordick J.S. Biocatalytic plastics as active and stable materials for biotransformations. //Nat. Biotechnol. 1997,15,789-793.

49. S. Novick, J. Dordick. Investigating the effects of polymer chemistry on activity of biocatalytic plastic materials. // Biotechn. Bioeng. 2000, 68,665-671.

50. Y. Kim, J. Dordick, D. Clark. Siloxane-based biocatalytic films and paints for use as reactive coatings. // Biotechn. Bioeng. 2001,72,475-482.

51. G.D. Altun, S.A. Setinus. Immobilization of pepsin on chitosan beads. // Food Chem. 2005,100,964-971.

52. Hinze W. L., Uemasu I., Dai F., Braun J. M. Analytical and related applications of organogels. // Curr. Opinion in Colloid & Interface Science. 1996,1,502-513.

53. G.P. Royer. Immobilized enzyme catalysis. // Catal. Rev.-Sci. Eng., 1980, 22(1), 29-73.

54. P. Lozano, T. De Diego, M.P. Belleville, G.M. Rios, J.L. Iborra. A dynamic membrane reactor with immobilized a-chymotrypsin for continuous kyotorphin synthesis in organic media. // Biotechn. Lett. 2000,22, 771-775.

55. Blanco R.M., Rakels J.L., Guisan J.M., Hailing P.J. Effect of thermodynamic water activity on amino-acid ester synthesis catalyzed by agarose-chymotrypsin in 3-pentanone. // Biochim Biophys Acta. 1992,1156,67-70.

56. R. Blanco et al. Immobilization-stabilization of proteases as a tool to improve the industrial design of peptide synthesis. // Biomed. Biochim. Acta. 1991, 50, 110113.

57. Ueno Y., Morihara K. The use of immobilized trypsin for semisynthesis of human insulin. // Biotechnol. Bioeng. 1989,33,126-128.

58. Blanco R. M., Guisan J. M., Hailing P. J. Agarose-chymotrypsin as a catalyst for peptide and amino acid ester synthesis in organic media. // Biotechnol. Lett. 1989, 11,811-816.

59. Kunugi S., Morikawa Y., Kondoh Т., Nomura A. Effect of acylation on peptide synthesis by immobilized thermolysin. // Polymer J. 1988,20,945-947.

60. S.M. Cramer, C. Horvath. Peptide synthesis and deamidation with chemically modified immobilized carboxypeptidase Y. // Enz. Microb. Techn. 1989, 11, 7479.

61. P. Adlercreutz, B. Mattiasson, M. Otamiri. Synthetic polymers as solubilizing vehicles for enzymes in water-poor media. // Bioorg. Med. Chem. 1994, 2, 529533.

62. A. Gladilin et. al. Enzyme-polyelectrolyte noncovalent complexes as catalysts for reactions in binary mixtures of polar organic solvents with water // Biotechn. Lett. 1995,17,1329-1324.

63. E. Kudryashova et. al. Enzyme-polyelectrolyte complexes in water-ethanol mixtures: negatively charged groups artificially introduced into a-chymotrypsin provide additional activation and stabilization effects. // Biotechn. Bioeng. 1997, 55,267-277.

64. A. Vakurov et. al. Peptide synthesis in dimethylformamide-based organic media catalysed by non-covalent chymotrypsin-polyelectrolyte complexes. // Biocatal. Biotrans. 1999,17,283-291.

65. A. Murphy, C. O'Fagain. Stability characteristics of chemically modified soluble trypsin. // J. of Biotechnology. 1996,49,163-171.

66. A. Murphy, C. O'Fagain. Dipeptide synthesis using acetylated trypsin derivative. //Biotechn. Techniques. 1997,11,13-16.

67. A. Murphy, C. O'Fagain. Chemically stabilized trypsin used in dipeptide synthesis. // Biotechn. Bioeng. 1998, 58, 366-373.

68. Ferjancic A., Puigserver A., Gaertner H. Unusual specificity of polyethylene glycol-modified thermolysin in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Biotecnnol. Lett. 1988,10,101-106.

69. Gaertner H., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by polyethylene glycol-modified chymotrypsin in organic solvents. // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 1988,3,130-137.

70. Gaertner H., Watanabe Т., Sinisterra J.V., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by modified a-chymotrypsin in low-water organic media. // J. Org. Chem. 1991,56,3149-3153.

71. Dordick J.S., Khmelnitsky Y.L., Sergeeva M.V. The evolution of biotransformation technologies. // Curr. Opin. Microbiol. 1998,1, 311-8.

72. Novick S. J., Dordick J. S. Preparation of active and stable biocatalytic hydrogels for use in selective transformations. // Chem. Mater. 1998,10, 955-958.

73. P. Wang, S. Dai, S. D. Waezsada, A. Tsao, B. Davison. Enzyme stabilization by covalent binding in nanoporous sol-gel glass for nonaqueous biocatalysis. // Biotechn. Bioeng. 2001, 74,249-255.

74. Partrige J., Hutcheon G., Moore В., Hailing P. Exploiting hydration hysteresis for high activity of cross-linked subtilisin crystals in acetonitrile. // J. Am. Chem. Soc. 1996,118(51), 12873-12877.

75. Y. Ito, H. Fujii, Y. Imanishi. Catalytic peptide synthesis by trypsin modified with polystyrene in chloroform. // Biotechnol. Prog. 1993,9,128-130.

76. Zaks A. In: Biocatalysts for Industry. Dordick J.S. Ed., Plenum: New-York. 1991, 161-180.

77. Hailing P.J. Effect of thermodynamic water activity on protease-catalyzed peptide synthesis in mainly organic media. // Biomed. Biochim. Acta, 1991, 50, 61-66.

78. L. Gardossi. Immobilization of Enzymes and Control of Water Activity in Low-Water Media: Properties and Applications of Celite R-640 (Celite Rods). // Methods in Biotechnology. 2001,15, 151-172.

79. Xing G.-W., Tian G.-L., Ye Y.-H. Influence of reaction conditions on syntheses of sweetener precursors catalyzed by thermolysin in tert-amyl alcohol. // J. Peptide Res. 1998, 52,300-304.

80. Shin J., Kim B. Revisiting the effect of water content on enzymatic peptide synthesis in non-aqueous medium. // Biotechnology Letters. 2002,24,1903-1905.

81. Reslow M., Adlercreutz P., Mattiasson B. The influence of water on protease-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile/water mixtures. // Eur. J. Biochem. 1988,177,313-318.

82. Schechter I., Berger A. Size of the active site in proteinases. (I) Papain. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967,27,157-162.

83. Kimura Y., Muraya K., Araki Y., Matsuoka H., Nakanishi K., Matsuno R. Synthesis of peptides consisting of essential amino acids by a reactor system using three proteinases and an organic solvent. // Agric. Biol. Chem., 1990, 54, 33313333.

84. Cheng E., Machini de Miranda M.T., Tominaga M. Thermolysin and a-chymotrypsin mediated synthesis of tripeptides containing proline. // Int. J. Peptide Protein Res. 1988,31,116-125.

85. Machini de Miranda M.T., Cheng E., Muradian J., Seidel W.F., Tominaga M. Thermolysin as a catalyst in enzymatic synthesis of asparagine-containing peptides.//Bioorg. Chem. 1986,14, 182-193.

86. Fernandez M.M., Margot A.O., Blanch H.W., Clark D.S. Enzymatic synthesis of peptides containing unnatural amino acids. // Enzyme Microb. Technol. 1995, 17, 964-971

87. Morihara К., Oka T. The complex active sites of bacterial neutral proteases in relation to their specificities. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968, 30, 625630.

88. Gaertner H., Puigserver A. Kinetics and specificity of serine proteases in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1989,181,207-213.

89. Watanaba К., Ueji S. Dimethyl sulfoxide-induced high enantioselectivity of subtilisin Carlsberg for hydrolysis of ethyl-2(4-substituted phenoxy)propionates. // Biotecnnol. Lett. 2000,22, 599-603.

90. Adlercreutz P., Clapes P. Catalytic properties of a-chymotrypsin in organic media. // Biomed. Biochem. Acta. 1991,50, 55-60.

91. M.Yu. Gololobov, V.M. Stepanov, T.L. Voyushina, P. Adlercreutz. Organic solvents changes the chymotrypsin specificity with respect to nucleophiles. // FEBS Lett. 1992,307,309-312.

92. A. Alcantara et al. Organic reactions catalyzed by insolubilized enzymes. Part III. Synthesis of peptides, catalyzed by a-chymotrypsin immobilized on graft copolymers. // J. Mol. Cat. A: Chemical. 1995,101,255-265. v.

93. O'Fagain C. Understanding and increasing protein stability. // Biochim. Biophys. Acta. 1995,1252,1-14.

94. В.И. Лозинский. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта // Усп. Хим. 1998, 67(7), 641-655.

95. В.И.Лозинский. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Усп. Хим. 2002, 71(6), 559-585.

96. Сергеев Г.Б., Батюк B.A. Криохимия. M.: Наука. 1978.

97. A. c. 2036095 РФ; Бюлл. изобрет. 1995. 15.

98. Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов A.JI. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул. // Биотехнология. 1995,1-2, 32-37.

99. Гладилин A.K., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. // Биохимия. 1998, 63(3), 408-421.

100. Oh Y., Shih I. I., Tzeng Y., Wang S. Protease produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab shell wastes. // Enz. Microb. Technol. 2000,27(1-2), 3-10.

101. ИЗ. Акпаров B.X., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Степанов В.М. Субтилизин 72 сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизинуКарлсберг. //Биохимия. 1979,44,886-890.

102. Bacheva A.V., Plieva F.M., Lysogorskaya E.N., Filippova I.Yu., Lozinsky V.I. Peptide synthesis in organic media with subtilisin 72 immobilized on polyvinyl alcohol)-cryogel carrier. // Bioorg.& Med. Chem. Lett. 2001, 11, 10051008.

103. Klein J. U., Prykhodzka A., and Cerovsky V. The applicability of subtilisin Carlsberg in peptide synthesis. // J. Pept. Sci. 2000,6, 541-549.

104. C.R. Wescott, A.M. Klibanov. The solvent dependence of enzyme specificity. //Biochim. et Biophys. Acta. 1994,1206,1-9.

105. Stepanov V. M., Voyushina T. L., Terent'eva E. Yu., Golobov M. Yu. Subtilisin or a-chymotrypsine catalyzed synthesis of peptides containing arginine or lysine p-nitroanilides as C-terminal moieties. // Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 479-485.

106. Voyushina T.L., Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M. The synthesis of chromogenic peptide substrates containing p-nitroanilides of arginine and lysine, catalyzed by proteinases adsorbed on support material. // Biomed. Biochim. Acta. 1991,50,209-212.

107. Milgotina E.I., Shcheglov A.S., Lapa G.B., Chestukhina G.G., Voyushina T.L. Enzymatic synthesis of chromogenic substrates for Glu,Asp-specific proteinases. // J. Pept. Res. 2001, 58,12-16.

108. Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M. Voyushina T.L. Enzymatic synthesis of YIGSR laminine pentapeptide fragment - derivatives. // Bioorg. Med. Chem. 1995,5,2523-2526.

109. Jakubke H.-D., Kuhl. P., Konnecke A. Basic Principles of Protease-Catalyzed Peptide Bond Formation. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1985, 24, 8593.

110. Chichkova N.V., Kim S.H., Titova E.S. et al. A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. // The plant cell. 2004,16, 157-171.

111. М.Ю. Гололобов, И.П. Морозова, Т.Л. Воюшина, E.A. Тимохина, B.M. Степанов. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991,56,228-240.

112. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. // М.: Мир. 1976, с. 443-444.

113. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Химический синтез пептидов // Киев. Наукова Думка. 1992.

114. Erlanger B.F., Kokowsky N., Gohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. // Arch. Biochem. Biophys. 1961, 95(2), 271-278.

115. Люблинская Л. А., Хайду И., Баландина Г. Н., Филиппова И. Ю., Маркарян А. Н., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С., Степанов В. М. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорг. химия. 1987,13,748-753.