Разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата и оценка эффективности его использования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Солдатова, Любовь Сергеевна

• Солдатова, Любовь Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Солдатова, Любовь Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Химотрипсин: структура молекулы и механизм катализа.

1.2. Классификация носителей для иммобилизации ферментов.

1.3. Классификация методов иммобилизации ферментов.

1.4. Особенности комплексной биотехнологической переработки керагинсодержащего сырья.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Организация выполнения работы.

2.2. Используемые материалы.

2.3. Используемое оборудование.

2.4. Методы исследований.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение физических характеристик и химического состава частиц Ге304, используемых в качестве носителей для иммобилизации 52 химотрипсина.

3.2. Оптимизация параметров иммобилизации химотрипсина на немодифицированные частицы Ре304 и частицы Ре304, 63 модифицированные аминогруппами и карбоксильными группами.

3.3. Характеристика физико-химических свойств иммобилизованного ферментного препарата.

ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Изучение физико-химических параметров гидролиза кератина пера нативным и иммобилизованным химотрипсином.

4.2. Изучение молекулярно-массового распределения пептидов в гидролизатах кератина, полученных с использованием нативного и 87 иммобилизованного химотрипсина.

4.3. Изучение динамики накопления свободных аминокислот в процессе ферментативного гидролиза кератина нативным и иммобилизованным 92 химотрипсином.

4.4. Изучение аминокислотных последовательностей в высвобождаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза кератина 101 иммобилизованным химотрипсином.

4.5. Использование полученных закономерностей при разработке кормовых добавок на основе ферментативных гидролизатов кератина.

4.6. Расчет экономической эффективности выработки кормовой добавки па основе кератинового гидролизата.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата и оценка эффективности его использования»

Ферменты широко используются в различных областях деятельности: медицине, сельском хозяйстве, химическом синтезе, пищевой промышленности. Промышленные процессы с применением ферментов внедрены, прежде всего, в фармацевтическую и пищевую промышленность. В пищевой отрасли с участием ферментов идут процессы получения глюкозо-фруктозных сиропов, яблочной и аспарагиновой кислот, оптически активных Ь-аминокислот, безлактозного молока, Сахаров из молочной сыворотки и т.д. Однако повсеместное использование ферментов до последнего времени сдерживалось из-за таких факторов, как снижение каталитической активности в процессе реакции, трудоемкость отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции, нестабильность ферментов при хранении и под воздействием различных факторов, высокая стоимость чистых фсрмёйтааетшретщррядвпроблем, связанных с использованием ферментов, характерен для молочной промышленности. Важным сегментом молочной индустрии является сыродельная отрасль. Так, за 2009 год продажи сыра в России составили около 634 тыс. т. Основополагающей операцией в производстве сычужных сыров является ферментативное свертывание молока, в результате которого образуется сгусток, содержащий концентрат казеина и жира молока. Традиционно для этой цели используют молокосвертывающие ферментные препараты. На стадии образования молочного сгустка (свертывания молока) закладывается основа качества сыра и творога. Возможность лишь однократного использования ферментных препаратов и трудность их отделения от продуктов реакции представляют собой серьезный недостаток, который выражается, прежде всего, в значительных за тратах на приобретение протеолитических ферментов.

Одним из наиболее хорошо изученных протеолитических ферментов является химотрипсин - фермент, секретируемый из поджелудочной железы в тонкий кишечник в виде неактивного предшественника, или зимогепа, называемого химотрипсиногеном. Химотрипеиноген образован одной по-липепшдной цепыо, состоящей из 245 аминокислотных остатков. Цепь связана пячыо дисульфидиыми мостиками. Химотрипеиноген практически полное 1ью лишен ферментативной активности. Однако оп превращается в активный фермент, когда под действием трипсина расщепляется пептидная связь между аргинином-15 и изолейцином-16. Образующийся активный фермеш. называемый я-химотрипсином, действует затем на другие молекулы 71-химо I рипсина. В результате удаления еще двух пептидов образуется С1абильная форма фермента - а-химотрипсии. Особенность /денного процесса состоит в том, что расщепление лишь одной специфической пептидной связи превращает белок из каталитически неактивной формы в полностью активную.

Химо трипсин способен гидролизовать с высокой скоростью далеко не всякую пептидную связь. Он действует избирательно на пептидные связи, образованные карбоксильными группами аминокислот с ароматическими боковыми цепями — тирозина, триптофана и фенилаланина, а также аминокислот с гидрофобными остатками большого рашер}{щ(шир0оди1т1)шя описанных трудностей, связанных с применением-ферментных препаратов, целесообразно использование иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж. Нельсон и Е. Гриффин адсорбировали на угле иивертазу и показали, что она сохраняс! в таком виде каталитическую активность. Сам термин «иммобилизованные ферменты» узаконен в 1971 году и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд очевидных преимуществ перед растворимыми катализаторами; это возможность отделения биокатализатора от реакционной среды, непрерывность проведения технологического процесса с направленным регулированием скорости и выхода реакции, целенаправленное изменение свойств фермента, высокая стабильность по о тношению к денатурирующим факторам окружающей среды.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в разработке технологий иммобилизованных ферментных препаратов для использования в различных областях деятельности. По данным многочисленных исследований существует большое разнообразие органических и неорганических носителей и способов иммобилизации биомолекул на инертной матрице. Однако следует отметить не всегда эффективным использование дорогостоящих реагентов и многостадийных процессов, требующих значительных временных затрат и вьюокЗшаш1ШШ5БИШйогшп€рр§?дввж[шястве носителей для иммобилизации ферментов представляют нанообъекты. Повышенное внимание к папоматериалам обусловлено тем, что при переходе в наноразмерное состояние происходит изменение ряда важных свойств вещества. Одним из главных факторов, определяющих физические характеристики наноразмерпых объектов, выступает развитая поверхность, что способствует преобладанию поверхностных явлений. Благодаря своим размерам, сопоставимым с размерами клеток, вирусов, белков, ДНК, паночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и свя-зыват(Циж 1Йгоотехнологического применения наночастиц необходимо выполнить ряд требований, главным из которых является образование устойчивой коллоидной системы в водных растворах и других биосовместимых растворителях. Однако ввиду высокой реакционной активности для наночастиц практически не существует инертной среды. Одной из особенностей поведения наночастиц в растворе является их склонность к агрегации, поэтому практическое использование растворов наночастиц сопряжено с их стабилизацией (нанесение покрытия на поверхность магнитного «ядра», добавление стабилизаторов, подбор растворителей).

Помимо защиты от агрегации, окисления, кислотной и щелочной коррозии, покрытие может играть роль спейсера для присоединения биомолекул к носителю. Можно модифицировать поверхность наночастиц различными функциональными группами: азидо-, амино-, карбоксильными, сульфгидрильиыми, гидроксильными, имидными и другими, что позволяет ковалентно связывать наночастицы с биологическими веществами.

Важно отметить, что иммобилизация на поверхности наночастицы приводит к стабилизации биомолекул и служит защитой от деградации под воздействием различных факторов. Показано, что ДНК, иммобилизованная на поверхности наночастицы, сохраняет свою стереометрию и устойчива к действию нуклеаз. При иммобилизации белков и ферментов на паночастицах их стабилизация достигается, главным образом, за счет стабилизации конформационной структуры и предотвращения ферментативной деградации. Благодаря малым размерам соединение с наночастицей не приводит к денатурации белковых молекул.

Магнитные свойства наночастиц лежат в основе создания методов выделения и очистки нуклеиновых кислот и белков. На основе магнитных наночастиц разработаны методы пробоподготовки биообъектов для дальнейших исследований.

Цель и задачи исследований. Целыо работы является разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина и оценка эффективности его использования.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- изучить физические характеристики и химический состав частиц 17е30,|, используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина;

- оптимизировать параметры иммобилизации химотрипсина на немодифицированиые частицы Ре30,| и частицы Ре30,|, модифицированные амино- и карбоксильными группами;

- охарактеризовать физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата;

- разработать технологию получения иммобилизованной формы ф е р м е і гш о г о и р е 11 ар а га; оценить эффективность применения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина при ферментативном гидролизе вторичного кератинсодержащего сырья.

Научная новизна работы. Показано, что реакция гидролиза смеси хлоридов железа (II) и (III) в щелочной среде приводит к получению агломератов диаметром от 0,2 до 80,0 мкм, состоящих из частиц диаметром от 10 до 100 нм.

Установлен химический состав наночастиц, соответствующий формуле Ре30,|. Показано, что обработка наночастиц Ре30,і аминопропилтриэтоксисиланом приводит к модификации поверхности частиц реакционноспособными аминогруппами, а обработка полиакриловой кислотой - к модификации реакционноспособными карбойряюгншскр^ипамаиимость работы заключается в разработке методики, позволяющей упростить модификацию поверхности наночастиц Ре30,| реакционноспособными функциональными группами: карбоксильными в случае карбодиимидной иммобилизации и аминогруппами - в случае глутаральдегидной иммобилизации. Разработанная методика позволяет удешевить технологию получения иммобилизованного препарата и продуктов, полученных с его исполь-зовашйшработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Физические свойства и химический состав частиц Ре30,ь используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина.

2. Оптимальные параметры иммобилизации химотрипсина на немодифицированные наночастицы Ре304 и модифицированные аминогруппами и карбоксильными группами.

3. Физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата.

4. Технология получения иммобилизованной формы ферментного препарата химотрипсина.

5. Оптимальные параметры гидролиза кератина иммобилизованным химотрипсином.

6. Технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

Апробация работы. Материалы по разработке технологии получения иммобилизованного ферментного препарата представлены на II Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово, 2009); на II Международном форуме по нанотехнологиям ЯизпапоІесЬ (г. Москва, 2009); на Всероссийской конференции «Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах» (г. Кемерово, 2009); на XXV Всероссийском открытом конкурсе научно-исследовательских, изобретательских и творческих работ «Национальное Достояние России» (г. Москва, 2010); на III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Солдатова, Любовь Сергеевна

выводы

1. Установлено, что реакция гидролиза смеси хлоридов железа (II) и (III) в щелочной среде приводит к получению жестких агломератов состава Ре304 размером от 0,2 мкм до 80,0 мкм, состоящих из наночастиц диаметром от 10 нм до 100 нм. Получена средняя величина полной удельной поверхности порошка Ре304, равная 3,142 ±0,103 м2/г.

2. Оптимальные параметры иммобилизации химотрипсина на модифицированные и немодифицированные наночастицы Ре304: концентрация глутарового альдегида - 10%, концентрация карбодиимида - 1%; концентрация химотрипсина - 25%>. Установлено влияние иммобилизации химотрипсина на оптимальные условия действия фермента: рН и температуру.

3. Удельная активность химотрипсина, иммобилизованного адсорбционным способом, составляет 27,0 ед/мг, глутаральдегидным способом - 47,0 ед/мг, карбодиимидным способом - 45,0 ед/мг. Кинетические параметры иммобилизованного химотрипсина: Ут = 2,506 мМ/(мин-мл); Кт = 0,694 мМ.

4. Оптимальные параметры гидролиза кератина иммобилизованным химотрипсином: температура 35°С, рН 8,0, фермент-субстратное соотношение 1:50, продолжительность процесса от 12,00±0,05 до 24,00±0,05 ч.

5. Разработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Солдатова, Любовь Сергеевна, 2011 год

1. Адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на амфотерных полиэлектролитах / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев и др. //

2. Журнал физической химии.- 2001.- Т.75.- №11.- С. 2080-2010.

3. Андреева, И.Н. Иммобилизация ферментов и других биологически активных веществ: учебное пособие / И.Н. Андреева, A.B. Пантю-хин, Б.Б. Сысуев.- Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2001.- 340 с.

4. Антипова, JI.B. Применение ферментов в переработке вторичного молочного сырья / Л.В. Антипова,- М: АгроНИИТЭИММП, 1992,- 234 с.

5. Антипова, Л.В. Использование вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности / Л.В. Антипова, И.А. Глотова.-Санкт-Петербург: Гиорд, 2006.- 382 с.

6. Антипова, Л.В. Биохимические характеристики ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья птицеперерабатывающей промышленности / Л.В. Антипова, Ч.Ю. Шамханов, О.С. Осминин // Известия Вузов. Пищевая технология.- 2003.- №5.- С.59-64.

7. Антипова, Л.В. Совершенствование технологии производства керопеп-тида из перо-пухового сырья / Л.В. Антипова, Ч.Ю. Шамханов, О.С. Осминин // Мясная индустрия.- 2004.- №3.- С. 44-47.

8. Артемьев, Ю.М. Введение в гетерогенный фотокатализ / Ю.М. Артемьев, В.К. Рябчук.- СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 1999.- 304 с.

9. Ю.Березин, И.В. Биотехнология: учебное пособие для вузов. Кн.7. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин.- M.: Высшая школа, 1987.- 159 с.

10. Березин, И.В. Введение в прикладную энзимологию / И.В. Березин.-M.: Изд-во МГУ, 1982.- 384 с.

11. Березин, И.В. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы. Т. 1 / под. ред. И.В. Березина, В.К. Антонова и К. Мартинека.- М.: Изд-во МГУ, 1976.- 296 с.

12. Березин, И.В. Инженерная энзимология / И.В. Березин, A.A. Клесов, В.К. Швядос.- М, 1987.- 187 с.

13. Березин, И.В. Исследования в области ферментативного анализа и инженерной энзимологии / И.В. Березин.- M.: Наука, 1990.- 234 с.

14. Березин, И.В. Основы физической химии ферментативного катализа / И.В. Березин, К. Мартинек М.: Высшая школа, 1977.- 280 с.

15. П.Большаков, О.В. Реализация концепции государственной политики в области здорового питания / О.В. Большаков // Холодильная техника.- 2000.-№1.- С. 10-12.

16. Варфоломеев, С.Д. Кинетические методы в биохимических исследованиях / С.Д. Варфоломеев, C.B. Зайцев.- М.: Изд-во МГУ, 1982.- 343 с.

17. Влияние режимов предварительной обработки на ферментативный гидролиз пера / В.Г. Волик, Н.М. Ильина, В.В. Алексенко и др. // Научные разработки в птицеперерабатывающей и клеежелатиновой промышленности: сб. науч. трудов.- М, 1985.- С. 70-73.

18. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова.- Новосибирск: Изд-во СО РАН, 1999,- 252 с.

19. Вудворд, Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Дж. Вудворд.- М.: Мир, 1988.- 215 с.

20. Гершкович, A.A. Синтез пептидов. Реагенты и методы / A.A. Гер-шкович, В.К. Кибирев.- Киев: Наукова думка, 1987.- 264 с.

21. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности.- Введ. 01.01.1989.- М.: Изд-во стандартов, 1988.- 15 с.

22. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева.-М.: Агропромиздат, 1985.- 502 с.

23. Донченко, JI.B. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания / J1.B. Донченко, В.Д. Надыкта.- М.: Пищевая промышленность, 1999.- 352 с.

24. Магнитные наночастицы: методы получения, строение и свойства / С.П. Губин, Ю.А. Кокшаров, Г.Б Хомутов и др. // Успехи Химии.-2005.- Т. 6.- С. 539-574.

25. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб.- М.: Мир, 1982.- 345 с.

26. Иванова, H.A. Развитие инновационных процессов в производстве и переработке молока: (на материалах Ульяновской области): монография / H.A. Иванова, В.Климова.- Ульяновск: ГСХА, 2007.- С. 47-65.

27. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / С.П. Бодей, П. Броделиус, И.М.А. Кабрал и др.- М.: Мир, 1988.- 215 с.

28. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П.Синицын, Е.И Райнина, В.И. Лозинский и др.- М.: Изд-во МГУ, 1994,- 288 с.

29. Инихов, Г.С. Методы анализа молока и молочных продуктов / Г.С. Инихов, Н.П. Врио.- М.: Пищевая промышленность, 1971.- 424 с.

30. Карпов, О.В. Наночастицы в атмосферном воздухе. Методы измерения / О.В. Карпов, Д.М. Балаханов, Е.В. Лесников // Измерительная техника.- 2011.- №3.- С. 31-34.

31. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 // А.Е. Китова, Т.Н. Ку-вичкина, А.Ю. Аринбасарова и др. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2004.- Т. 40.- №3.- С. 307-311.

32. Зависимость термостабильности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы от концентрации ионов водорода / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев и др. // Журнал физической химии.-2001.- Т. 75.- №12.- С. 2292-2293.

33. Зб.Золотов, Ю.А. Основы аналитической химии. Книга 1. Общие вопросы. Методы разделения / Ю.А. Золотов, E.H. Дорохова, В.И. Фадеева.- М.: Высшая школа, 2002.- 351 с.

34. Кобаяси, Н. Введение в нанотехнологию / Н. Кобаяси М.: Бином. Лаборатория знаний, 2007.- 134с.

35. Ковалева, Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинамичесикие аспекты свободной и иммобилизованной амилаз / Т.А. Ковалева.-Воронеж: ВГУ, 1998.- 421 с.

36. Коваленко, Г.А. Иммобилизация ферментов на углеродминеральных носителях. Некоторые закономерности адсорбционной иммобилизации ферментов / Г.А. Коваленко, М.П. Ванина // Биотехно л огия.-1997.- №4.- С. 3-24.

37. Коваленко, Л.В. Биологически активные нанопорошки железа / Л.В. Коваленко, Г.Э. Фолманис.- М.: Наука, 2006.- 124 с.

38. Кулис, Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов / Ю.Ю. Кулис.- Вильнюс: Моклас, 1981.- С. 110-123.

39. Ленинджер, А. Основы биохимии. Т. 1 / А. Ленинджер.- М.: Мир, 1985.-367 с.

40. Можаев, В.В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии /В.В. Можаев // Успехи биологической химии.- 1983.- Т. 24.- С. 99-134.

41. Москвичев, Б.В. Проблемы и перспективы применения иммобилизованных ферментов и других биологически активных веществ в медицине / Б.В. Москвичев, С.А. Шуколюков, A.A. Шучихина.- М.: Центральное бюро научно-технической информации, 1983.- 187 с.

42. Патент №3301992 Российская Федерация, МПК7, C12N11/16. Иммобилизованная каталаза / Благородов, С.Г.- №4953337/13, заявл. 03.06.1991, опубл. 30.07.1994, Бюл. №21.

43. Патент №2181770 Российская Федерация, МПК7, C12N11/08, 9/34. Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы / заявитель и патентообладатель Воронежский госуниверситет.- №2000116346/13, заявл. 20.06.2000, опубл. 27.04.2002, Бюл. №12.- 6 с.

44. Патент №1572418 Российская Федерация, МПК7, C12N11/08. Способ получения иммобилизованных ферментов / Горленко, Л.Е.-№93008907/13; заявл. 16.02.1993; опубл. 20.02.1996, Бюл. №12.

45. Патент №1280834 Российская Федерация, МПК5, С07К17/00. Активированная матрица для иммобилизации белков / Зенюк A.A.; заявитель и патентообладатель Институт биоорганической химии АН БССР.- №3031253/14; заявл. 02.11.1981; опубл. 30.01.1994.

46. Патент №1314672 Российская Федерация, МПК6, С12Ш/56, С12Ш1/14, А2313/00. Способ получения белковых гидролизатов / Коваленко Г.А.- №3776134/13; заявл. 02.08.1984; опубл. 27.09.1999.

47. Патент №2026685 Российская Федерация, МПК6, А61К38/43. Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином / Кирпиченок Л.Н.- №5064945/14; за-явл. 13.10.1992; опубл. 20.01.1995.

48. Патент №2054481 Российская Федерация, МПК6, C12N11/08. Способ получения иммобилизованных ферментов / Горленко Л.Е.-№93008907/13; заявл. 16.02.1993; опубл. 20.02.1996.

49. Першина, А.Г. Использование магнитных наночастиц в биомедицине / А.Г. Першина, А.Э. Сазонов, И.В. Мильто // Бюллетень сибирской медицины.- 2008,- №2,- С. 70-78.

50. Повышение эффективности производства комбикормов / A.A. Шевцов, А.Н. Остриков, Л.И. Лыткина и др.- М.: ДеЛи Принт, 2005.

51. Полторак, О.М. Физико-химические основы ферментативного катализа / О.М. Полторак, Е.С. Чухрай.- М.: Высшая школа, 1971.- 311с.

52. Пушкарь, В.Г. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов / В.Г. Пушкарь, И.М. Климова, В.И. Ефременко: мет. рек.- Волгоград, 1984.- 15 с.

53. Сапожникова, А.И. Оптимизация получения кератинсодержащего препарата из овечьей шерсти / А.И. Сапожникова, О.В. Баранцева // Ветеринарная медицина 2009 - № 1-2 - С. 16 - 17.

54. Термоинактивация глюкоамилазы, иммобилизованной на амфотер-ных ионообменниках АНКБ-2 и АНКБ-35 / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев и др. // Журнал физической химии.- 2001.1. Т. 75.-№12.-С. 2290-2291.

55. Тиховская, Н.В. Некоторые проблемы физики наночастиц / Н.В. Ти-ховекая, К.Н. Югай // Вестник Омского университета.- 2009.- №2.- С. 100-106.

56. Устинова, А.В. Мясные продукты для детского питания / А.В. Устинова, Н.В. Тимошенко М.: ВНИИ мясной промышленности, 1997 - 252 с.

57. Фершт, Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фершт.-М.: Мир, 1980.-432 с.

58. Халгаш, Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш.-М.: Мир, 1991.-204 с.

59. Хиггинс, И. Биотехнология / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса.- М.: Мир, 1988.- 479 с.

60. Черкасов, А.Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А.Н. Черкасов, В.А. Пасечник.- JL: Химия, 1991.- 239 с.

61. Шпигун, О.А. Новые высокоэффективные сорбенты для одновременного ионохроматографического определения разнозарядных ионов / О.А. Шпигун, О.В. Крохин, П.Н. Нестеренко // Информационный бюллетень РФФИ.- 1995.- Т. 3,- №3.- С. 337.

62. Activity of Candida rugosa lipase immobilized on gamma-Fe203 magnetic nanoparticles / A. Dyal, K. Loos, M. Noto, et al. // J. Am. Chem. Soc.-2003.- 125.-P. 1684-1685.

63. Acute toxicity and irritation of water-based dextran coated magnetic fluid injected in mice / Y. Zhai, X. Wang, X. Wang, et al. // J. Biomed. Mater. Res. A.- 2008,- 85.- P. 582-587.

64. A new method for the synthesis of magnetoliposomes / C. Sangregorio, J.K. Wiemann, C.J. O'Connor, et al. // J. Appl. Phys.- 1999.- 85.- P. 5699-701.

65. A new precursor for the immobilization of enzymes inside sol-gel-derived hybrid silica nanocomposites containing polysaccharides / Yu.A. Shchipunov, T.Yu. Karpenko, I.Yu. Bakunina, et al. // J. Biochem.

66. Biophys. Meth.- 2004.- №58.- P. 25-39.

67. Aniline dimer-COOH assisted preparation of well-dispersed polyaniline-Fe304 nanoparticles / X. Lu, Y. Yu, L. Chen, et al. // Nanotechnology. -2005.- 16.- P. 1660-1665. ,

68. Application of citrate-stabilized gold-coated ferric oxide composite nanoparticles for biological separations / P. Hien, T. Thao, C. Cao, et al. // J. Magn. Magn. Mater.- 2008.- 320.- P. 2049-2055.

69. Berry, C. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine / C. Berry, A. Curtis // J. Phys. D. Appl. Phys.- 2003.- V. 3.- P. 36.

70. Bioconjugation of papain on superparamagnetic nanoparticles decorated with carboxymethylated chitosan / Y.Y. Liang, L.M. Zhang, Y.Y. Liang, et al. // Biomacromolecules.- 2007.- 8.- P. 1480-1486.

71. Biofimctionalized magnetic nanoparticles for in vitro labeling and in vivo locating specific biomolecules / C.C. Wu, L.Y. Lin, L.C Lin / Appl. Phys. Lett.- 2008.- 92.- P. 142504-142504.

72. Bionanotechnology based on silica nanoparticles / W. Tan, K. Wang, X. He, et al. // Medicinal Research Reviews.- 2004.- V. 24.- №5.- P. 621-638.

73. Blood-specific whole-body electromagnetic hyperthermia / M. Babincova, P. Sourivong, D. Leszczynska, et al. // Med. Hypotheses.- 2000.- 55.- P. 459-460.

74. Bruce, I.J. Surface modification of magnetic nanoparticles with alkoxysilanes and their application in magnetic bioseparations / I.J. Bruce, T. Sen // Langmuir.- 2005,- V. 21.- P. 7029-7035.

75. Cao, X. Spindly cobalt ferrite nanocrystals: preparation, characterization and magnetic properties / X. Cao., L. Gu // Nanotechnology.- 2005.-№16.-P. 180-185.

76. Characterization, electrical and magnetic properties of polyaniline / maghemite nanocomposites / P. Dallas, N. Moutis, E. Devlin, et al. / Nanotechnology.- 2006.- 17.- P. 5019-5026.

77. Chaubey, G.S. Synthesis and stabilization of FeCo nanoparticles / G.S.

78. Chaubey, C. Barcena, N. Poudyal // J. Am. Chem. Soc.- 2007.- №129.- P. 7214-7215.

79. Chemical modification of alkalize precursors / C. Sanchez, J. Livage, M. Henry, et al. // Journal of Non-Crystalline Solids.- 1988.- 100,- P. 65-76.

80. Chen, S. Temperature-responsive agnetite PEO-PPO-PEO block copolymer nanoparticles for controlled drug targeting delivery / S. Chen, Y. Li, C. Guo // Langmuir.- 2007.- №23.- P. 12669-12676.

81. Cheng, J. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery / J. Cheng, B.A. Teply, I. Sherifi // Elsevier. -2008.- 28.-P. 869-876.

82. Chiang, C.L. Application of superparamagnetic nanoparticles in purification of plasmid DNA from bacterial cells / C.L. Chiang, C.S. Sung, T.F. Wu // J. of Chromatography B.- 2005,- V. 822.- P. 54-60.

83. Collection of trace amounts of DNA/mRNA molecules using genomagnetic nanocapturers / X.X. Zhao, R. Tapec-Dytioco, K. Wang, et al. // Anal. Chem.- 2003.- V. 75 (14).- P. 3476-3483.

84. Composition dependent magnetic properties of iron oxide-polyaniline nanoclusters / R. Sharma, S. Lamba, S. Annapoorni, et al. // J. Appl. Phys.-2005.- 97.-P. 014311-014311.

85. Connolly, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine / J. Connolly, S.K. Jones, J.J. Dobson // Phys. D: Appl. Phys.- 2003.- 36.- P. R167-R181.

86. Dramatic increase in stability and longevity of enzymes attached to monodispersive iron nanoparticles / A. Sharma, Y. Qiang, J. Antony, et al. / IEEE Trans. Magn.- 2007.- 43.- P. 2418-2420.

87. Effect of growth temperature on the shape and crystallinity of chemically produced Fe-Pt nanoparticles / T. Hachisu, T. Yotsumoto, A. Sugiyama, et al. // Chem. Lett.- 2008.- 37.- P. 840-841.

88. Electrocatalysis of horseradish peroxidase immobilized on cobalt nanoparticles modified ITO electrode // C. Wei, M. Yang, J. Hu, et al. // Anal. Lett.- 2007.- 40.- P. 182-3194.

89. Examination of cholesterol oxidase attachment to magnetic nanoparticles / Kouassil G. K. et al. // Journal of Nanobiotechnology.-2005.- Vol. 3.- P. 354-356.

90. FTIR study of surfactant bonding to FePt nanoparticles / N. Shukla, C. Liu, P.M. Jones, et al. // JMMM.- 2003.- №266.- P. 178-184.

91. Fuentes, M. Detecting minimal traces of DNA using DNA covalently attached to superparamagnetic nanoparticles and direct PCR-ELISA / M. Fuentes, C. Mateo, A. Rodriguez // Biosensors and Bioelectronics.- 2006.- V. 21,- P. 1574-1580.

92. Functionalized magnetic micro- and nanoparticles: optimization and application to chip tryptic digestion / Z. Bilkova, M. Slovakova, N. Mine, et al. // Electrophoresis.- 2006,- 21.- P. 1811-1824.

93. Georgelin, T. Functionalization of Fe2Ü3 nanoparticles through the grafting of an organophosphorous ligand / T. Georgelin, B. Moreau, N. Bar // Sens. Actuat. B.- 2008.- 134.- P. 451-454.

94. Glaser, A.N. The chemical modification of proteins by groupspecific and site-specific reagents / A.N. Glaser // The Protein.-1976,-Vol. 2,-P. 1-103.

95. Gorin, D.A. Magnetic/gold nanoparticle functionalized biocompatible microcapsules with sensitivity to laser irradiation / D.A. Gorin, S.A. Portnov, O.A. Inozemtseva // Phys. Chem. Chem. Phys.-2008,- 10.-P. 6899-6905.

96. Gu, H. Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection / H. Gu, K. Xu, C. Xu // J. of the American Chemical Society Chem. Commune.- 2006.- P. 941-949.

97. Gupta, A.K. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications / A.K. Gupta, M. Gupta // Biomaterials.- 2005,- 26.- P. 3995-4021.

98. He, X.X. Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage / X.X. He, K. Wang, W. Tan // J. Am. Chem. Soc.- 2003.- V. 125,- P. 7168-1769.

99. Huang, S.H. Direct binding and characterization of lipase onto magnetic nanoparticles / S.H. Huang // Biotechnol. Prog.- 2003.- Vol. 19.- P. 1095-1100.

100. Hudson, B.J.F. Immobilized enzymes / B.J.F. Hudson // Chem. Ind.- 1975,- №2.- P. 1059-1060.

101. Immobilization of proteins and enzymes to fine magnetic particles / M. Koneracka, P. Kopcansky, M. Antalik, et al. // J. Magn. Magn. Mater. -1999,- V. 201,- P. 427.i

102. Immobilisation of synthetically useful enzymes by condensation polymerization / A. Pollak, R.L. Baughn, O. Adalsteinsson, et al. // J. Amer. Chem. Soc.- 1978.- №7.- P. 302-304.

103. Iron/iron oxide core-shell nanoclusters for biomedical applications / Y. Qiang, J. Antony, À. Sharma, et al. // Journal of Nanoparticle Research.- 2006.- №8.- P. 489-496.

104. Iron oxide nanoparticles-chitosan composite based glucose biosensor / A. Kaushik, R. Khan, P.R. Solanki, et al. // Biosens. Bioelectron.- 2008.- 24.- P. 676-683.

105. Ito, A. Medical application of functionalized magnetic nanoparticles / A. Ito, M. Shincai, H. Honda // J. of bioscience and bioengineering.- 2005.- V. 100.- P. 1-11.

106. Katz, E. Nanobiotechnology: integrated nanoparticle-biomolecule hybrid systems: synthesis, properties, and applications / E. Katz, I. Willne // Angew. Chem. Int. Ed.- 2004.- 43.- P. 6042-6108.

107. Kim, M.J. Functionalization of magnetite nanoparticles for protein immobilization / M.J. Kim, G.H. An, Y.H. Choa // Diffus. Defect Data, Pt. B.- 2007.- P. 895-898.

108. Kim, D.K. Protective coating of superparamagnetic iron oxide nonoparticles / D.K. Kim, M. Mikhaylova, Y. Zhang // Chem. Mater.- 2003.-V. 15,-P. 1617-1627.

109. Jeng, J. Using high-concentration trypsin-immobilized magnetic nanoparticles for rapid in situ protein digestion at elevated temperature / J. Jeng, M.F. Lin, F.Y. Cheng // Rapid Commun. Mass Spectrom.- 2007.- V. 21.-P. 3060-3068.

110. Liao, M.H. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase on magnetic nanoparticles for improving its stability / M.H. Liao, D.H. Chen // Biotechnology Letters.- 2001.- V. 23.- P. 1723-1727.

111. Li, Y. The synthesis of amine-capped magnetic (Fe, Mn, Co, Ni) oxide nanocrystals and their surface modification for aqueous dispersibility / Y. Li, M/ Afzaal, P. O'Brian // J. Mater. Chem.- 2006.-№16.-P. 2175-2180.

112. Lin, X.M. Synthesis, assembly and physical properties of magnetic nanoparticles /X.M. Lin, A.C.S. Samia // JMMM.- 2006.- №305.- P. 100-109.

113. Massart, R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media // IEEE Trans. Magn.- 1981.- Mag-17, 2.- P. 1247-1248.

114. Majewski, P. Superparamagnetic magnetite (Fe3C>4) nanoparticles for bioapplications // P. Majewski, B. Thierry // Recent Pat. Mater. Sci.-2008,- l.-P. 116-127.

115. Martina, M.S. Generation of superparamagnetic liposomes revealed as highly efficient MRI contrast agents for in vivo imaging / M.S.

116. Martina, J.P. Fortin, C. Mefnager // J. Am. Chem. Soc.- 2005.- V. 127,- P. 10676-10685.

117. Molday, R.S. Immunospecifc ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells / R.S. Molday, D. MacKenzie // J.Immunol. Methods.- 1982.- V. 52.- P. 353-367.

118. Mornet, S. Magnetic nanoparticle design for medical applications / S. Mornet, S. Vasseur, F. Grasset // Prog. Solid State Chem.- 2006,- 34.-P. 237-247.

119. Mosbach, K. Enzymes bound to artifical matrixes / K. Mosbach // Sci. Am.- 1971.- №4.- P. 26-33.

120. Neiderberger, M. Organic reaction pathways in the nonaqueous synhesis of metal oxide nanoparticles / M. Neiderberger, G. Garnweitner // Chem. Eur. J.- 2006,- №12,- P. 7282-7302.

121. Niemeyer, C.M. Nanoparticles, proteins, and nucleic acids: biotechnology meets materials science / C.M. Niemeyer // Angew. Chem. Int. Ed.- 2001.- 40.- P. 4128-4158.

122. Niemeyer, C.M. Functional hybrid devices of proteins and inorganic nanoparticles / C.M. Niemeyer // Angew. Chem. Int. Ed.-2003.- 42,- P. 5796-5800.

123. Nicolais, L. Metal-polymer nanocomposites / L. Nicolais, G. Carotenuto // New York, Wiley Interscience.- 2005.- №43.- P. 300.

124. Novel method for immobilization of enzymes to magnetic nanoparticles / A. Johnson, A. Zawadzka, L. Deobald, et al. // Journal of Nanoparticle Research.- 2008.- №10.- P. 1009-1025.

125. Pankhurst, Q.A. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine / Q.A. Pankhurst, J. Connoly, S.K. Jones // J. Phys. D.-2003.-№36,-P. 167-181.

126. Park, H.Y. Fabrication of magnetic core-shell Fe oxide-Au nanoparticles for interfacial bioactivity and bio-separation / H.Y. Park, M.J. Schadt, L. Wang // Langmuir.- 2007.- 23.- P. 9050-9056.

127. Peng, S. Synthesis and stabilization of monodisperse Fe nanoparticles / S. Peng, C. Wang, S. Sun // J.Am. Chem. Soc.- 2006.-№128.-P. 10676-1067.

128. Peng, Z.G. Selective and sequential adsorption of bovine serum albumin and lysozyme from a binary mixture on nanosized magnetic particles / Z.G. Peng, K. Hidajat, M.S. Uddin // J. Colloid Interface Sci.-2005.- 281.- P. 11-17.

129. Perez, J.M. Magnetic relaxation switches capable of sensing molecular interactions / J.M. Perez, L. Josephson, T. O'Loughlin // Nat. Biotechnol. 2002.- V. 20.- P. 816-820.

130. Polyaniline-coated Fe304 nanoparticle-carbon-nanotube composite and its application in electrochemical biosensing / Z. Liu, J. Wang, D. Xie et al // Small.- 2008.- 4.- P. 462-466.

131. Preparation and characterization of hydrophobic superparamagnetic magnetite gel / X. Liu, M.D. Kaminski, Y. Guan, et al. // JMMM.- 2006,-№306,- P. 248-253.

132. Preparation and application of polymergrafted magnetic nanoparticles for lipase immobilization / Y. Yong, Y. Bai, Y. Li, et al. // J. Magn. Magn. Mater.- 2008,- 320.- P. 350-2355.

133. Qiu, J. Ferrocene modified Fe304-Si02 magnetic nanoparticles as building blocks for construction of reagentless enzyme-based biosensors / J. Qiu, H. Peng, R. Liang // Electrochem. Comm.- 2007.- 9.- P. 2734-2738.

134. Rosevear, A. Immobilized biocatalysts a critical review / A. Rosevear//J. Chem. Technol. Biotechnol.- 1984.- 34 B.- P. 127-150.

135. Sergeev, G.B. Encapsulation of small metal particles in solid organic matrices / G.B. Sergeev, M.A. Petrukhina // Prog. Solid. St. Chem.- 1996.-№24.-P. 183-211.

136. Shchipunov, Yu.A. Hybrid polysaccharide-silica nanocomposites prepared by the sol-gel technique / Yu.A. Shchipunov, T.Yu. Karpenko // Langmuir.- 2004.- №20.- P. 3882-388.

137. Shukoor, M.I. Fabrication of a silicacoating on magnetic-Fe203 nanoparticles by an immobilized enzyme / M.I. Shukoor, F. Natalio, H.A. Therese / Chem. Mater.- 2008.- 20.- P. 3567-3573.

138. Silica- and alokoxysilane-coated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles: a promising tool to label cells for magnetic resonance imaging / C. Zhang, B. Wangler, B. Morgenstern, et al. // Langmuir.-2007.-№23.-P. 1427-1434.

139. Simple synthesis of functionalized superparamagnetic magnetite/silica core/shell nanoparticles and their application as magnetically separable high-performance biocatalysts / J. Lee, Y. Lee, J.K. Youn, et al. // Small.- 2008.- 4.- P. 143-152.

140. Size-controlled preparation of magnetite nanoparticles in the presence of graft copolymers / S. Wan, J. Huang, H. Yan, et al. // J. Mater. Chem.- 2006.- №16.- P. 298-303.

141. Skimer, K.J. Enzymes technology / K.J. Skimer // Chem. Eng. News.- 1975.-№5.-P. 23-42.

142. Stabilization of chymotrypsin by covalent immobilization on amine-functionalized superparamagnetic nanogel / J. Hong, P. Gong, D. Xu, et al. // J. of Biotechnology.- 2007.- V. 128.- P. 597-605.

143. Structural and magnetic properties of nanoscale iron oxide particles synthesized in the presence of dextran or polyvinyl alcohol / H. Pardoe, W. Chua-Anusorn, T. G. St. Pierre, et al. // J. Magn. Magn. Mater.- V. 225.- P. 41-46.

144. Sucking, C.J. Immobilized enzymes / C.J. Sucking // Chem. Soc. Rev.- 1976.- №6,- P. 215-233.

145. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling / H.T. Song, J.S. Choi, Y.M. Huh, et al. // J. Am. Chem. Soc.- 2005.- 127.- P. 9992-9993.

146. Synthesis of magnetite (Fe304) nanoparticles without surfactants atroom temperature /1. Martinez-Mera, M.E. Espinoza-Pesqueira, R. Perez-Hernandez, et al. // Materials Letters.- 2007.- №56.- P.- 4447-4451.

147. Synthesis of highly stable folic acid conjugated magnetite nanoparticles for targeting cancer cells / S. Mohapatra, S.K. Mallick, T.K. Maiti, et al. // Nanotechnology.- 2007.- №18.- P. 385102-385111.

148. Taylor, J.I. Application of magnetite and silica-magnetite composites to the isolation of genomic DNA / J.I. Taylor, C.D. Hurst, M.J. Davies // J. of Chromatography A.- 2000.- V. 890,- P. 159-166.

149. The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine / P. Tartaj, M.P. Morales, S. Veintemillas-Verdaguer, et al. // J. Phys. D.- 2003.- №36.- P. 182-R197.

150. Thermosensitive polymer coated nanomagnetic particles for separation of bio-molecules / N. Shamim, L. Hong, K. Hidajat, et al. // Sep. Purif. Technol.- 2007.- 53.- P. 164-170.

151. Thompkinson, D.K. Immobilisation of (3-galactosidase on macroporous anion exchange resin / D.K. Thompkinson // Bulletin of the IDF.- 1993.- №289.- P. 23-26.

152. Topoglidis, E. Factors that affect protein adsorbtion on nanostructured titania films. A novel spectroelectrochemical application to sensing / E. Topoglidis, C.J. Campbell, J.R. Durrant // Langmuir.-2001.-V. 17.-P. 7899-7906.

153. Wang, T.H. Immobilization of proteins on magnetic nanoparticles / T.H. Wang, W.C. Lee // Biotechnol. Bioprocess Eng.- 2003.- 8.- P. 263-267.

154. Using high-concentration trypsin-immobilized magneticnanoparticles for rapid in situ protein digestion at elevated temperature / J. Jeng, M.F. Lin, F.Y. Cheng, et al. // Rapid Commun. Mass Spectrom.-2007.-V. 21.-P. 3060-3068.

155. Xu, C. Dopamine as A robust anchor to immobilizefunctional molecules on the iron oxide shell of magnetic nanoparticles / C. Xu, K. Xu, H. Gu // J. Am. Chem. Soc.- 2004.- V. 126 (32).- P. 9938-9939.

156. Патент США №US006001587A, Int.Cl. C12P 1/00. Chemically specific patterning on solid surface immobilized enzymes / David C. Turner, Bruce P. Gaber.- №6,001,587; filed Apr. 8, 1997; Date of Patent Dec. 14, 1999.

157. Патент США №US20080293592A1, Int.Cl.C40B 40/04. Methods of covalently immobilising biomolecules on organic surface / Jürgen Ruhe, Holder Klapproth №US 2008/0293592 AI; filed Mar. 1, 2005; Pub. Date Nov. 27, 2008.