Катализируемый субтилизином 72 пептидный синтез в органических растворителях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Гетун, Ирина Вячеславовна

• Гетун, Ирина Вячеславовна
• кандидат химических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гетун, Ирина Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ

1.1. Поведение сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.1. Растворимость и активность сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.2. Вторичная структура суспендированного и растворенного в органических растворителях субтилизина

1.1.3. Третичная структура сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.4. Структура активного центра сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.4.1. Геометрия активного центра фермента

1.1.4.2. Сольватация активного центра

1.1.5. Конформационная подвижность сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.6. Влияние воды на активность и конформационную подвижность сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.7. Способы активации ферментов в органических растворителях

1.1.7.1. Активация сериновых протеиназ в присутствии солей

1.1.7.2. Стабилизация сериновых протеиназ в присутствии аналогов субстрата и краун-эфиров

1.1.7.3. Стабилизация сериновых протеиназ в органических растворителях посредством образования гидрофобных ионных пар с поверхностно активными веществами

1.2. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протеиназами в органических растворителях.

1.2.1. Ферментативный синтез с использованием суспендированных сериновых протеиназ

1.2.2. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протеиназами, солюбилизированными в органических растворителях

1.2.3. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протеиназами, иммобилизованными на органических и неорганических носителях

1.3. Влияние органических растворителей на специфичность сериновых протеиназ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Катализируемый субтилизином 72 пептидный синтез в органических растворителях»

В последнее время довольно широко ведутся исследования в области так называемой "неводной этимологии". Органические растворители обладают рядом преимуществ перед традиционной водной средой при проведении ферментативных реакций, основными из которых являются сдвиг термодинамического равновесия в сторону целевых продуктов и решение проблемы растворимости гидрофобных реагентов.

Изучение особенностей протекания неводного биокатализа существенно расширяет представления о функциональных возможностях ферментов, об их устойчивости к различным денатурирующим воздействиям. В связи с этим весьма актуальным является проведение исследований, направленных на изучение каталитической эффективности ферментов в средах с высоким содержанием органических растворителей.

Решающее значение для оценки состояния ферментов имеют данные по определению каталитической активности. Однако традиционный подход контроля ферментативной активности протеолитических ферментов, основанный на измерении скорости гидролиза специфических субстратов, в безводных средах затруднен. Определение активности в таких системах возможно только после переноса пробы фермента в воду. Но полученная таким образом информация в большей мере отражает способность фермента к реактивации, чем дает представление об истинном состоянии протеиназы в среде органических растворителей. Поэтому весьма важна разработка новых путей и подходов, позволяющих оценивать активность ферментов в системах органических растворителей с низким содержанием воды в функционирующем состоянии непосредственно в ходе ферментативного процесса. Оценка состояния фермента в неводных средах наиболее адекватно может быть проведена из данных по синтетазной активности протеолитических ферментов.

Целью работы являлось изучение каталитических свойств нативного и модифицированного субтилизина в составе комплекса с додецилсульфатом натрия (Б Ов-субтилизин) в реакциях образования пептидной связи в средах полярных органических растворителей.

Работа состоит из двух частей:

1) изучения поведения нативного субтилизина 72, суспендированного в полярных органических растворителях в реакциях образования пептидной связи;

2) исследования свойств и биокаталитической активности комплекса ЗББ-субтилизин в реакциях ферментативного синтеза пептидов в средах полярных органических растворителей.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ

Сериновые эндопептидазы представляют собой хорошо изученный класс протеолитических ферментов, включающий, по меньшей мере, два семейства: химотрипсины и субтилизины. Эти семейства весьма обширны и объединяют протеиназы со значительно различающимися свойствами. Общим для данного класса ферментов является однотипность строения активных центров и сходство механизмов действия [1-6].

Распространенность, доступность, стабильность, широкая субстратная специфичность сериновых протеиназ создают предпосылки для их эффективного использования в качестве катализаторов образования пептидной связи [7-9].

Проведение ферментативного катализа в среде с малым содержанием воды или в практически безводных органических растворителях обладает рядом неоспоримых преимуществ. Во-первых, гидрофобные субстраты, слабо растворимые в воде, хорошо растворяются в органических растворителях. Кроме того, так как большинство ферментов не растворимо в органических растворителях, их легко выделить из реакционной смеси обыкновенным фильтрованием. Биокаталитические реакторы, использующие неводные растворители, не подвержены бактериальному заражению.

В данном литературном обзоре будет рассмотрено поведение и каталитическая эффективность сериновых протеиназ в системах с высоким содержанием полярных и гидрофобных органических растворителей.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Гетун, Ирина Вячеславовна

выводы

1. Изучена каталитическая эффективность сериновой протеиназы субтилизина 72, суспендированного или солюбилизированного за счет образования нековалентного комплекса с додецилсульфатом натрия в полярных органических растворителях.

2. Показано, что субтилизин, суспендированный в ацетонитриле, катализирует синтез п-нитроанилидов и амидов три-тетрапептидов с высокими выходами. Установлено, что увеличение содержания фермента в реакционной смеси в ряде случаев приводит к образованию побочных продуктов и соосаждению субтилизина с целевым соединением.

3. Впервые показана высокая эффективность субтилизина в составе комплекса с додецилсульфатом натрия для катализа образования пептидной связи в этаноле и изопропаноле. Изучена возможность синтеза три-гексапептидов различного состава, в том числе хромогенных и флуорогенных субстратов для различных классов протеиназ. Проведена олигомеризация трипептида с получением нона- и до декапептидов.

4. Исследовано влияние активации карбоксильной группы ацилирующего компонента на ход ферментативного синтеза под действием SDS - субтилизина в этаноле и установлено, что ацилирующие компоненты со свободными карбоксильными группами не менее эффективны, чем их эфирные аналоги.

5. Впервые показано, что SDS - субтилизин способен катализировать образование пептидной связи между Lys, Arg, His, Glu, Asp - аминокислотными остатками, содержащими незащищенные ионогенные группы в боковой цепи.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор бесконечно благодарен проф. В.М. Степанову, под руководством которого была начата эта работа, за его постоянный интерес к проводимым исследованиям, внимательное, плодотворное и критическое обсуждение полученных результатов и планирования эксперимента.

Автор глубоко признателен И.Ю. Филипповой и E.H. Лысогорской за обучение практическим навыкам, неоценимую помощь в обсуждении, постановке эксперимента и огромную моральную поддержку в ходе выполнения и в особенности оформления данной работы. Автор особенно благодарен Е.С. Оксенойт, осуществившей синтез исходных пептидов. Автор приносит искреннюю благодарность Г.И. Лавреновой, Г.Н. Баландиной и Г.Н. Руденской за полезные дискуссии и ценные практические советы. Автор благодарен A.B. Бачевой, C.B. Колобановой и В.В. Старовойтовой за помощь в проведении экспериментов и оформлении данной работы. Большую помощь при исследовании полученных соединений оказали сотрудники отдела хроматографии Л.А. Баратова, В.В. Меркулов и АЛ. Ксенофонтов. Автор чрезвычайно признателен сотруднику Гарвардской Медицинской Школы А.Ф. Киселеву за помощь, оказанную при поиске литературы. Автор благодарен сотруднику Канзасского Университета Д.Р. Бэнсону за помощь в проведении большей части масс-спектрометрических анализов.

1.4. Заключение.

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что в большинстве органических растворителей сериновые протеиназы не растворимы и образуют суспензию. При попадании в среду органического растворителя ферменты не претерпевают значительных конформационных перестроек. Вместе с тем, при этом может меняться степень сольватации и искажаться геометрия активного центра фермента, что сказывается на падении каталитической активности. Кроме того, наблюдаются некоторые изменения в динамических свойствах белковой молекулы. Существенную роль для стабилизации фермента в органической среде играет вода, присутствующая в системе, а также факторы, оказывающие влияние на степень гидратации фермента. Активность ферментов, суспендированных в органических растворителях, может значительно повышаться при введении в реакционную среду добавок различных солей и краун-эфиров, а также при поддержании необходимой для катализа конформации активного центра фермента с помощью импринтинга.

Синтетазная эффективность сериновых протеиназ в основном изучена в реакциях переэтерификации. Круг исследований, направленных на изучение сериновых протепиназ как катализаторов реакций образования пептидной связи, достаточно ограничен. В литературе в основном имеются сведения о синтезе в органических растворителях под действием сериновых протеиназ амидов дипептидов. Данных об использовании этих ферментов для синтеза более протяженных пептидов не приводится. Кроме того, биокаталитические системы в большинстве случаев оказываются гетерогенными, что накладывает ряд ограничений на протекание реакций.

Отмечается, что для перевода в гомогенную среду может использоваться метод солюбилизации-стабилизации фермента комплексообразованием с ПАВ. Однако подобные комплексы изучены, в основном, в реакциях переэтерификации, хотя и имеются данные образования пептидной связи, катализируемого химотрипсином-АОТ в изооктане. Между тем наиболее удобными для проведения пептидного синтеза являются полярные органические растворители, так как в них хорошо растворимы исходные соединения. В литературе не имеется данных об исследовании каталитической эффективности гидрофобных ионных комплексов ферментов с ПАВ для целей пептидного синтеза в полярных органических средах.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Целью данной работы являлось изучение пептидного синтеза, катализируемого субтилизином 72 в средах с высоким содержанием полярных органических растворителей.

Щелочная протеиназа субтилизин 72, секретируемая Bacillus subtilis штамм 72, была получена в высокоочищенном состоянии в 1979 г. в России. N-концевая последовательность субтилизина 72 (до 35 шага) оказалась схожей, за исключением двух позиций, с N-концевым фрагментом субтилизина Карлсберг. Высокая степень гомологии позволяет сделать предположение, что субтилизин 72 очень близок, хотя и не идентичен по свойствам субтилизину Карлсберг [135].

Субтилизин - распространенный, доступный фермент, обладающий широкой субстратной специфичностью и катализирующий разнообразные реакции образования пептидной связи [7, 8, 136-140].

Синтез пептидной связи в присутствии субтилизина происходит по схеме 1 (см. лит. обзор). Так как присутствующая в реакционной системе вода является конкурентным нуклеофилом по отношению к аминокомпоненту, как ацил-фермент, так и продукт реакции могут вступать с ней в реакции гидролиза, что влечет за собой ряд побочных процессов. Использование органических растворителей с низким содержанием воды как среды для проведения ферментативного пептидного синтеза с использованием субтилизина позволяет существенно сдвинуть термодинамическое равновесие реакций в сторону образования продукта, а также дает возможность проведения синтеза с гидрофобными субстратами [14, 16,141].

Как следует из литературных данных, при высоком содержании органического растворителя большинство ферментов не растворимо в реакционной среде, и система представляет собой суспензию частиц биокатализатора в органической среде. Полярные растворители, по сравнению с неполярными, оказывают более сильное инактивирующее воздействие на суспендированные ферменты, так как способны непосредственно воздействовать на фермент, лишая его необходимой для осуществления каталитических функций водной оболочки. Не смешивающиеся с водой растворители в большинстве случаев инертны по отношению к биокатализатору [30, 54, 142].

Между тем наиболее подходящими для проведения реакций ферментативного пептидного синтеза являются именно полярные органические растворители, так как большинство аминокислот, их производных и пептидов не растворяется в неполярных средах. Поэтому весьма актуальной задачей является разработка подходов для использования и адаптации ферментов к условиям функционирования в среде с высоким содержанием полярных органических растворителей.

II.I. Изучение поведения нашивного субтилизина в полярных органических растворителях.

Нами была изучена растворимость и стабильность нативного субтилизина 72 в ацетонитриле, диоксане, тетрагидрофуране, этаноле - органических растворителях наиболее удобных для проведения пептидного синтеза [143, 144]. Оценка, тем более количественная, состояния фермента, находящегося в растворенном состоянии в среде органических растворителей, не содержащих воды, весьма сложна и неоднозначна, поскольку трудно разграничить, находится ли фермент в растворе или в мелкодисперсном состоянии. Для изучения состояния фермента лиофильно высушенный субтилизин вносили в органический растворитель, образующуюся суспензию перемешивали, центрифугировали при 16000 g 10 мин, после чего определяли содержание и активность фермента в полученном супернатанте, который в дальнейшем мы будем называть низкоконцентрированной суспензией.

Количественно содержание субтилизина в органических растворителях оценивалось спектрофотометрически и по результатам аминокислотного анализа. УФ-спектр субтилизина в тетрагидрофуране (рис. 11) в наибольшей степени соответствовал спектру белка, растворенного в воде, и имел характерный максимум поглощения при 280 нм, что указывает на образование субтилизином истинного раствора. Содержание субтилизина в тетрагидрофуране составило 20 мкМ.

В спектре пробы субтилизина в диоксане отчетливого максимума при 280 нм не наблюдалось; значение А280 составило 0,35, что соответствует 11,7 нмоль/мл (табл. 9). Вероятно, в диоксане наряду с растворенным ферментом присутствовала и его взвесь.

Рис. 11. УФ-спектры раствора субтилизина в воде (/) и низкоконцентрированной суспензии субтилизина в ТГФ (2), диоксане (3) и ацетонитриле(¥). Кривая 5 получена после повторного центрифугирования суспензии суспензии в ацетонитриле.

В УФ-спектре пробы субтилизина в ацетонитриле максимума при 280 нм не наблюдалось, вид спектра свидетельствовал о сильном светорассеянии. По-видимому, субтилизин, по крайней мере, основная его часть, существует в ацетонитриле в виде суспензии, а не истинного раствора. После повторного центрифугирования суспензии субтилизина в ацетонитриле при 10 ООО g и 4°С спектр полученного супернатанта принял иной вид (рис. 11, кривая 5), видимо, в результате осаждения, по крайней мере частичного, белка, хотя осадка наблюдать не удалось из-за малого его содержания. Появился небольшой максимум при 280 нм, однако минимум при 260 нм был выражен неявно. Вероятно, и после повторного центрифугирования фермент в ацетонитриле нахфщлся в виде мелкодисперсной суспензии, хотя нельзя исключить, что часть его все же образовывала истинный раствор. Содержание фермента в появившемся пике по поглощению при 280 нм за вычетом вклада в спектр светорассеяния составило 0,36 нмоль/мл.

Мы оценили содержание субтилизина в ацетонитриле и диоксане также по данным аминокислотного анализа (табл. 9). Различия в величинах, полученных этими двумя способами, очевидно, свидетельствуют о вкладе в поглощение мелкодисперсной суспензии фермента в органическом растворителе. Следует отметить, что при спектральной оценке растворимости субтилизина его молярный коэффициент поглощения в органическом растворителе принимался равным этой величине для белка в воде. Кроме того, ошибка при определении малых значений молярного коэффициента и малых концентраций аминокислот очень велика. Таким образом, речь идет о полуколичественной оценке содержания фермента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Гетун, Ирина Вячеславовна, 2000 год

1. Степанов В.М. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. Спирина А.С. Москва. Высшая школа. 1996. С.220-233.

2. Антонов В.К. Химия протеолиза. // Москва. Наука. 1983. С.135-147.

3. Kraut J. Serine proteases: strucrure and mehanism of catalysis. // Ann. Rev. Biochem. 1977. V.46. P.331-338.

4. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов. // Биоорг. химия. 1994. Т.20. С.475-484.

5. Voet D., Voet J.G. // Biochemistry (Wiley, New York), 2nd Ed. 1995. P.397-399.

6. Siezen R.J., Leunissen J.A.M. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. // Protein Science. 1997. V.6. P.501-523.

7. Moree W.J., Sears P., Kawashiro K., Witte K., Wong C.-H. Exploitation of subtilisin BPN' as catalyst for the synthesis of peptides containing noncoded amino acids, peptide mimetics and peptide conjugates. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.3942 3947.

8. Stepanov V.M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996. V.68. P.1335-1339.

9. Isowa Y., Ohmori M., Ichikawa Т., Kurita H., Sato M., Mori K. The synthesis of peptides by means of proteolytic enzymes. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1977. V.50. P.2762-2767.

10. Гладилин A.K., Левашов A.B. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. // Биохимия. 1998. Т.63. С.408-421.

11. Narayan V.S., Klibanov A.M. Are water-immiscibility and apolarity of the solvent relevant to enzyme efficiency? // Biotechnol. Bioeng. 1993. V.41. P.390-393.

12. Dordick J.S. Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1989. V.ll. P. 194-211.

13. Dordick J.S. Designing enzymes for use in organic solvents. // Biotechnol. Prog. 1992. V.8. P.259-267.

14. Hailing P.J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V. 16. P. 178-206.

15. Chang N, Hen SJ, Klibanov A.M. Protein separation and purification in neat dimethyl sulfoxide. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V.176. P. 14621468.

16. Barbas C.F., Matos J.R., West J.B., Wong C.-H. A search for peptide ligase: cosolvent-mediated conversion of proteases to esterases for irreversible synthesis of peptides. //J. Am. Chem. Soc. 1988. V.110. P.5162-5166.

17. Chen S.-T., Chen S.-Y., Chen-Chen Т., Chiou S.-H., Wang K.-T. Physicochemical properties of alkaline serine proteases in alcohol. // J. Protein Chem. 1995. V.14. P.205-215.

18. Xu K., Griebenow K., Klibanov A.M. Correlation between catalytic activity and secondary structure of subtilisin dissolved in organic solvents. // Biotech. Bioeng. 1997. V.56. P.485-491.

19. Castro G. R. Enzymatic activities of proteases dissolved in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1999. V.25. P.689-694.

20. Практическая химия белка. // Под ред. Дарбре А. Москва. Мир: 1989. С291.

21. Lowry О.Н., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-275.

22. Rariy R.V., Klibanov A.M. Correct protein folding in glycerol. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.13520-13523.

23. H. Kise. Difference in catalytic activities of subtilisin Carlsberg and immobilization-activation for ester synthesis and transesterification in ethanol. // Bioorg. Chem. 1990. V.18. P.107-115.

24. Kise H., Fujimoto K. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. VIII. Medium effect and nucleophile specificity in subtilisin-catalyzed peptide synthesis in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1988, V.10. P.883-888.

25. Kise H., Shirato H. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. V. Medium effect on the esterification of aromatic amino acids by a-chymotrypsin. // Enzyme Microb. Technol. 1988. V.10. P.582-585.

26. Yamamoto Y., Kise H. Catalysis of enzyme aggregates in organic solvents. An attempt at evaluation of intrinsic activity of proteases in ethanol. // Biotechnol. Lett. 1993. Y.15.P.647-652.

27. A. Zaks, A.M. Klibanov. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.3194-3201.

28. A. Zaks, A.M. Klibanov. Enzymatic catalysis in organic media at 100 °C. // Science. 1984. V.244. P. 1249-1251.

29. Garza-Ramos G., Darszon A., Tuena de Gomez-Puyou M., Gomez-Puyou A. Enzyme catalysis in organic solvents with low water content at high temperatures. // Biochemistry. 1990. V.29. P.751-757.

30. Griebenow K., Klibanov A.M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? //Biotech. Bioeng. 1997. V.53. P.351 362.

31. Fitzpatrick P.A., Ringe D., Klibanov A.M. X-ray structure of cross-linked subtilisin Calsberg in water vs. acetonitrile. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V.198. P.675-681.

32. Fitzpatrick P.A., Steinmetz A.C.U., Ringe D., Klibanov A.M. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V.90. P.8653-8657.

33. Schmitke J.L., Stern L.J., Klibanov A.M. Comparison of x-ray structures of an acyl-enzyme intermediate of subtilisin Carlsberg formed in anhydrous acetonitrile and in water. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V.95. P.12918-12923.

34. Schmitke J.L., Stern L.J., Klibanov A.M. The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V.94. P.4250-4255.

35. Allen K.N., Bellamacina C.R., Ding X., Jeffery C.J., Mattos C., Petsko G.A., Ringe D. An eperimental approach to mapping the binding surfaces of crystalline proteins. // J. Phys. Chem. 1996. V.100. P.2605-2611.

36. Yennawar N.H., Yennawar H.P., Farber G.K. X-ray crystal structure of y-chymotrypsin in hexane. // Biochemistry. 1994. V.33. P.7326-7336.

37. Kidd R.D., Sears P., Huang D.-H., Witte K., Wong C.-H., Farber G.K. Breaking the low barrier hydrogen bond in a serine protease. // Protein Sei. 1999. V.8. P.410-417.

38. Zhu G., Huang Q., Wang Z., Qian M., Jia Y., Tang Y. X-ray studies on two forms of bovine ß-trypsin crystals in neat cyclohexane. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1429. P. 142-150.

39. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. A molecular dynamics study of the effect of carbon tetrochloride on enzyme structure and dynamics: subtilisin. // Protein Eng. 1996. V.9. P.485-492.

40. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. A molecular dynamics and quantum mechanics analysis of the effect of DMSO on enzyme structure and dynamics: subtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V.118. P.4175-4180.

41. Frey P.A., Whitt S.A., Tobin J.B. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases. // Science. 1994. V. 264. P. 1927-1930.

42. Burke P. Demonstration of structural integrity of an enzyme in organic solvents by solid-state NMR. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V.l 11. P.8290-8291.

43. Burke P.A., Griffin R.G., Klibanov A.M. Solid state NMR assessment of enzyme active center structure under nonaqueous conditions. // J. Biol. Chem. 1992. Y.267. P.20057-20064.

44. Schmitke J.L., Stern L., Klibanov A.M. Organic solvent binding in mostly aqueous media and in the neat solvents. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V.248. P.273-277.

45. Toba S., Merz K.M. The concept of solvent compatibility and its impact on protein stability and activity enhancement in nonaqueous solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.l 19. P.9939-9948.

46. Blinkovsky A.M., Martin B.D., Dordick J.S. Enzymology in monophasic organic media. // Curr. Opin. Biotechnol. 1992. V.3. P.124-129.

47. Gomez-Puyou M.T., Gomez-Puyou A. Enzymes in low water systems. // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1998. V.33. P.53-89.

48. Klibanov A.M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? // Trends Biotechnol. 1997. V.15. P.97-101.

49. Desai U.R., Klibanov A.M. Assessing the structural integrity of a lyophilized protein in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.l 17. P.3940-3945.

50. Affleck R., Haynes C.A., Clark D.S. Solvent dielectric effects on protein dynamics. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.5167-5170.

51. Affleck R., Xu Z.-F., Suzawa V., Frocht K., Clark D.S., Dordick J.S. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environments. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.l 100-1104.

52. Burke P.A., Griffin R.G., Klibanov A.M. Solid-state nuclear magnetic resonance investigation of solvent dependence of tyrosyl ring motion in an enzyme. // Biotechnol. Bioeng. 1993. V.42. P.87-94.

53. Gorman L.S., Dordick J.S. Organic solvents strip water off enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 1992. V.39. P.392-397.

54. Zaks A., Klibanov A.M. The effect of water on enzyme action in organic media. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.8017-8021.

55. Correa de Sampaio T., Melo R.B., Moura T.F., Michel S., Barreiros S. Solvent effects on the catalytic activity of subtilisin suspended in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50. P.257-264.

56. Kise H., Shirato H., Noritomi H. Protease catalyzed synthetic reactions and immobilization - activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents. // J. Biotech. 1990. V.14. P.239-254.

57. Partridge J., Dennison P.R., Moore B.D., Hailing P.J. Activity and mobility of subtilisin in low water organic media. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1386. P.79-89.

58. Bell G., Hailing P.J., Moore B.D., Partridje J., Rees D.G. Biocatalyst behaviour in low-water systems. // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P.468-473.

59. Bone S., Pethig R. Dielectric studies of protein hydration and hydration-induced flexibility. // J. Mol. Biol. 1985. V.181. P.323-326.

60. Bone S. Time-domain reflectrometry studies of water binding and structural flexibility in chymotrypsin. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V.916. P. 128-134.

61. Almarsson O., Klibanov A.M. Remarkable activation of enzymes in nonaqueous media by denaturating organic cosolvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.49. P.87-92.

62. Khmelnitsky Yu.L., Welch S.H., Clark D.S., Dordick J.S. Salts dramatically enhance activity of enzymes suspended in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V.116. P.2647-2648.

63. Dabulis K., Klibanov A.M. Dramatic Enhancement of enzymatic activity by lyoprotectants. //Biotech. Bioeng. 1993. V.41. P.566-571.

64. Unen D.-J., Sakodinskaya I.K., Engbersen J.F.J., Reinhoudt D.N. Crown ether activation of cross-linked subtilisin Carlsberg crystals in organic solvents. // J. Chem. Soc., PerkinTrans. 1998. V.l. P.3341-3343.

65. Khmelnitsky Yu.L., Rich J.O. Biocatalysis in nonaqueous solvents. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V.3. P.47-53.

66. Kazlauskas R.J., Weber H.K. Improving hydrolases for organic synthesis. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V.2. P.121-126.

67. Sears P., Witte K., Wong C.-H. The effect of counterion, water concentration, and stirring on the stability of subtilisin BPN' in organic solvents. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1999. V.6. P.297-304.

68. F.H. Enzyme engineering for nonaqueous solvents. II. Additive effects of mutations on the stability of subtilisin E in polar organic media. // Biotechnol. Prog. 1991. V.7. P.125-129.

69. Chen K., Arnold F.H. Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. N.12. P.5618-5622.

70. You L., Arnold F.H. Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide. // Protein Eng. 1996. V.9. P.77-83.

71. Zhong Z., Liu J.L.-C., Dinterman L.M., Finkelman M.A.J., Mueller W.T. Engineering subtilisin for reaction in dimethylformamide. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.l13. P.683-684.

72. Kise H., Shirato H. Synthesis of aromatic amino acid ethyl esters by a-chymotrypsin in solutions of high ethanol concentrations. // Tetrahedron Lett. 1985. V.26. P.6081-6084.

73. Sasaki T., Kise H. Effects of calcium ion on the catalytic activity of a-chymotrypsin in organic solvents. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V.58, P. 10501053.

74. Sasaki T, Kise H. Increase of catalytic activity of alpha-chymotrypsin by metal salts for transesterification of an amino acid ester in ethanol. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. V. 61. P. 1196-1197.

75. Yamamoto Y., Kise H. Unusual enhancement of protease activity in organic solvents by amines. // Chem. Lett. 1993. V.l 1. P.1821-1824.

76. Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. // Trends Biochem. Sci. 1989. V.14. P.141-144.

77. Costantino H.R., Griebenow K., Langer R., Klibanov A.M. On the pH memory of lyophilized compounds containing protein functional groups. // Biotech. Bioeng. 1997. V.53. P.345-348.

78. Yang Z., Zacher D., Russel A.J. pH Dependence of subtilisin dispersed in organic solvents. //J. Am. Chem. Soc. 1993. V.l 15. P.12251-12257.

79. Schulze B., Klibanov A.M. Subtilisins in neat organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1991. V. 38. P. 1001-1006.

80. Zacharis E., Hailing P.J., Rees D.G. Volatile buffers can override the "pH memory" of subtilisin catalysis in organic media. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.96. P.1201-1205.

81. Blackwood A.D., Curran L.J., Moore B. D., Hailing P.J. 'Organic phase buffers' control biocayalyst activity independent of initial aqueous pH. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1206. P.161-165.

82. Russell A.J., Klibanov A.M. Inhibitor-induced enzyme activation in organic solvents. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.l 1624-11626.

83. Klibanov A.M. Enzyme memory. What is remembered and why? // Nature. 1995. V.374. P.596.

84. Kawasaki Y., Takahashi Y., Nakatani M., Murakami M., Dosako S., Osaki H. Enzymatic functions of fatty-acid-modified chymotrypsin and trypsin in aqueous-organic media. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V.3. P.512-516.

85. Inada Y., Katsunobu T., Yoshimoto T., Ajima A., Matsushima A., Saito Y. Application of polyethylene glycol-modified enzymes in biotechnological processes: organic solvent-soluble enzymes. // Trends Biotechnol. 1986. V.ll. P. 190-194.

86. Yang Z., Domach M., Auger R., Yang F.X., Russell A.J. Polyethylene-glycol-induced stabilization of subtilisin. // Enzyme Microb. Technol. 1996. V.18. P.82-89.

87. Wong C.-H. Engineering enzymes for chemoenzymatic synthesis. Part 2: modifying proteases for peptide synthesis. // Trends Biotechnol. 1992. V.10. P.378-341.

88. Paradkar V.M., Dordick J.S. Extraction and solubilization of chymotrypsin into isooctane in the presence of low concentration of Aerosol OT in the absence of reversed micelles. // Biotechnol. Bioeng. 1994. V.43. P.529-540.

89. Powers M.E., Matsuura J., Brassell J., Manning M.C., Shefter E. Enhanced solubility of proteins and peptides in nonpolar solvents through hydrophobic ion pairing. //Biopolymers. 1993. V.33. P.927-932.

90. Matsuura J., Powers M.E., Manning M.C., Shefter E. Structure and stability of insulin dissolved in 1-octanol. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V.l 15. P. 1261-1264.

91. Meyer J.D., Kendrick B.S., Matsuura J.E., Ruth J.A., Bryan P.N., Manning M.C. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotrypsin in organic solvents via hydrophobic ion pairing. // Int. J. Peptide Protein Res. 1996. V.47. P. 177-181.

92. Paradkar V.M., Dordick J.S. Aqueous-like activity of a-chymotrypsin dissolved in nearly anhydrous organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V.l 16. P.5009-5010.

93. Wangikar P.P., Michels P.C., Clark D.S., Dordick J.S. Structure and function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.l 19. P.70-76.

94. Kendrick B.S., Meyer J.D., Matsuura J.E., Carpenter J.F., Manning M.C. Hydrophobic ion pairing as a method for enhancing structure and activity of lyophilized subtilisin BPN' suspended in isooctane. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V.347. P.113-118.

95. Meyer J.D., Matsuura J.E., Kendrick B.S., Evans E.S., Evans G.J., Manning M.C. Solution behavior of a-chymotrypsin dissolved in nonpolar organic solvents via hydrophobic ion pairing. // Biopolymers. 1995. V.35. P.451-456.

96. Gimel J.C., Brown W. A light scattering investigation of the sodium dodecyl sulfate-lysozyme system. // J. Chem. Phys. 1996. V.104. P.8112-8117.

97. Kullmann W. Enzymatic peptide synthesis. // Boca Raton. Florida CRC Press Inc. 1987.

98. Fruton J. Protease-catalyzed synthesis of peptide bonds. // Adv. Enzymol. 1982. V.53. P.239-306.

99. C.R. Wescott, A.M. Klibanov. Solvent variation inverts substrate specificity of an enzyme. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 1629-1631.

100. Zaks A., Klibanov A.M. Substrate specificity of enzymes in organic solvents vs. water is reversed. // J. Am. Chem. Soc. 1986. Y.108. P.2767-2768.

101. Homandgerg G.A., Mattis J.A., Laskowski M. Synthesis of peptide bonds by proteinases. Addition of organic cosolvents shifts peptide bond equilibria toward synthesis. // Biochemistry. 1978. V.17. P.5220-5227.

102. Cerovsky V., Martinek K. Free chymotrypsin-catalyzed synthesis of peptide bond in aliphatic alcohols with low water content. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1989. V.54. P.266-275.

103. Cerovsky V., Martinek K. Peptide synthesis catalyzed by native proteinase K in water-miscible organic solvents with low water content. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1989. V.54. P.2027-2041.

104. Cerovsky V. Free-trypsin-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile with low water content. // Biotechnol. Lett. 1990. V.12. P.899-904.

105. Ricca J.M, Crout D.H.G. Peptide synthesis catalyzed by chymotiypsin in organic solvents. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1989. V.l. P.2126-2127.

106. Wang Y.-F., Yakovlevsky K., Zhang B., Margolin A.L. Cross-linked crystals of subtilisin: versatile catalyst for organic synthesis. // J. Org. Chem. 1997. V.62. P.3488-3495.

107. Matsushima A., Okada M., Inada Y. Chymotrypsin modified with polyethylene glycol catalyzes peptide synthesis reaction in benzene. // FEBS Lett. 1984. V.178. P.275-277.

108. Gaertner H., Watanabe T., Sinisterra J.V., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by modified a-chymotrypsin in low-water organic media. // J. Org. Chem. 1991. V.56. P.3149-3153.

109. Gaertner H., Puigserver A. Kinetics and specificity of serine proteases in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1989. V. 181. P.207-213.

110. Gaertner H., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by polyethylene glycol-modified chymotrypsin in organic solvents. Proteins: Structure, Function and Genetics. 1988. V.3. P.130-137.

111. Ito Y., Fujii H., Imanishi Y. Catalytic peptide synthesis by trypsin modified with polystyrene in chloroform. // Biotechnol. Prog. 1993. V.9. P.128-130.

112. Sergeeva M.V. Paradkar V.M. Dordick J.S. Peptide synthesis using proteases dissolved in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1997. V.20. P.623-628.

113. Reslow M., Adlercreutz P., Mattiasson B. The influence of water on protease-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile/water mixtures. // Eur. J. Biochem. 1988. V.177. P.313-318.

114. Pugniere M., Skalli A., Coletti-Previero M.-A., Previero A. Peptide and ester synthesis in organic solvents catalyzed by seryl proteases linked to alumina. // Proteins: Structure, Function, Genetics. 1986. V.l. P. 134-138.

115. Coletti-Previero M.-A., Previero A. Alumina-phosphate complexes for immobilization of biomolecules. //Analytical Biochem. 1989. V.l 80. P. 1-10.

116. Kise H., Hayakawa A. Immobilization of proteases to porous chitosan beads and their catalysis for ester and peptide synthesis in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1991. V.13. P.584-588.

117. Kise H., Hayakawa A., Noritomi H. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. IV. Chitin-alpha-chymotrypsin complex as a catalyst for amino acidesterification and peptide synthesis in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1987. V.9. P.543-548.

118. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media: a comparative study of water-miscible and water-immiscible solvent systems. // J. Biotechnol. 1990. V.15. P.323-338.

119. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media. Nucleophile specificity and medium engineering in a-chymotrypsin catalyzed reactions. //Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. V.12. P.376-386.

120. Adlercreutz P., Clapes P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media. //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. V.613. P.517-520.

121. Clapes P., Adlercreutz P. Substrate specificity of a-chymotrypsin-catalyzed esterification in organic media. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.l 118. P.70-76.

122. Wescott C.R., Klibanov A.M. The solvent dependence of enzyme specificity. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1206. P.l-9.

123. Gololobov M.Yu., Voyushina T.L., Stepanov V.M., Adlercreutz P. Organic solvents changes the chymotrypsin specificity with respect to nucleophiles. // FEBS Lett. 1992. V.307. P.309-312.

124. Jonsson A., Wehtje E., Adlercreutz P., Mattiasson B. Temperature effects on protease catalyzed acyl transfer reactions in organic media. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 1996. V.2. P.43-51.

125. Cerovsky V., Jakubke H.-D. Acyl transfer reactions catalyzed by native and modified a-chymotrypsin in acetonitrile with low water content. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V.l6. P.596-600.

126. Cerovsky V., Jakubke H.-D. Nucleophile specificity of subtilisin in an organic solvent with low water content: Investigation via acyl transfer reactions. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.49. P.553-558.

127. Kise H., Tomiuchi Y., Nagashima T. Substrate specificity and stereospecificity of proteases in hydro-organic cosolvent systems. // Biomed. Biochim. Acta. 1991. V.50. P.127-130.

128. Schellenberger V., Jakubke H.-D. Protease-catalyzed kinetically controlled peptide synthesis. // Angew. Chem. Int. Ed/ Engl. 1991. V.30. P.1437-1449.

129. Schellenberger V., Schellenberger U., Mitin Y.V., Jakubke H.-D. Characterization of the S' subsite specificity of bovine pancreatic a-chymotrypsinvia acyl transfer to added nucleophiles. // Eur. J. Biochem. 1990. V.187. P. 163167.

130. Акпаров B.X., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Степанов В.М. Субтилизин 72- сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг. // Биохимия. 1979. Т.44. No 5. С.886-891.

131. Воюшина Т. Л., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфиров ацилпептидов в качестве карбоксильных компонентов. // Биоорг. химия. 1985. Т.2. С.738-744.

132. Morihara К., Oka Т. Peptide bond synthesis catalyzed by subtilisin, papain, and pepsin. //J. Biochem. (Tokyo). 1981. V.89. P.385-390.

133. Gron H., Meldal M., Breddam K. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching. // Biochemistry. 1992. V.31. P.6011-6018.

134. Gololobov M.Yu., Morozova I.P., Voyushina T.L., Timokhina E.A.,, Stepanov V.M. The influence of substrate structure, temperature and pH on catalytic properties. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.l 118. P.267-276.

135. Michels P.C., Khmelnitsky Yu.L., Dordick J.S., Clark D.S. Combinatorial biocatalysis: a natural approach to drug discovery. // Trends Biotechnol. 1998. V.16. P.210-215.

136. Wangikar P.P., Carmichael D., Clark D.S., Dordick J.S. Active-site titration of serine proteases in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50. P.329-335.

137. Гетун И.В., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н., Бачева А.В., Оксенойт Е.С. Пептидный синтез, катализируемый субтилизином 72 в органических растворителях. // Биоорг. химия. 1999. Т.25. No 8. С.591-596.

138. Колобанова C.B., Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Гетун И.В., Бачева

139. A.В., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. Сегментная конденсация пептидов на твердой фазе с помощью субтилизина в комплексе с додецилсульфатом натрия. Биоорг. химия. 2000. Т.26. No 6. С.411^116.

140. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Воюшина Т.Л., Тимохина Е.А., Степанов

141. B.М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.230-239.

142. Юсупова М.П., Новгородова С.А., Степанов В.М. Последовательное присоединение остатков аргинина к пептидам, катализируемое субтилизином. I. Влияние состава органического растворителя. // Биоорг. химия. 1996. Т.22. С.523-527.

143. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Выделение протеиназы Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.33-40.

144. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. // Пер. с англ. Москва. Мир. 1976.

145. Гершкович A.A., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. // Киев. Наукова Думка. 1992.