Получение и характеристика 2D- и 3D-культур клеток респираторного эпителия из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для моделирования и разработки терапии муковисцидоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Демченко Анна Григорьевна
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 144
Оглавление диссертации кандидат наук Демченко Анна Григорьевна
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы диссертационного исследования
Степень разработанности темы
Цель исследования
Задачи исследования
Научная новизна
Теоретическая и практическая значимость
Методология и методы исследования
Положения, выносимые на защиту
Степень достоверности результатов
Апробация результатов исследования
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Личный вклад автора в проведение исследования
Публикации
Структура и объем диссертации
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Муковисцидоз
1.1.1 Определение и эпидемиология муковисцидоза
1.1.2 Молекулярно-генетические аспекты патогенеза муковисцидоза
1.1.3 Терапия муковисцидоза
1.2 Клеточные модели муковисцидоза
1.2.1 Иммортализованные клеточные линии
1.2.2 Первичные клеточные культуры
1.2.3 Клеточные модели респираторного эпителия человека, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
1.3 Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы исследования
2.2 Методы исследования
2.2.1 Получение и культивирование чиПСК
2.2.2 Получение и культивирование бронхиальных и легочных органоидов из чиПСК
2.2.3 Получение и культивирование базальных клеток респираторного эпителия из чиПСК
2.2.4 Получение и культивирование легочных органоидов из чиБК
2.2.5 Получение и культивирование первичных культур назальных эпителиальных клеток
2.2.6 Цилиогенез in vitro
2.2.7 Анализ клеточного индекса
2.2.8 Иммунофлуоресцентное окрашивание
2.2.9 Световая и флуоресцентная микроскопия
2.2.10 Конфокальная микроскопия
2.2.11 Проточная цитофлуориметрия
2.2.12 Выделение ДНК и определение концентрации
2.2.13 Выделение РНК и определение концентрации
2.2.14 Обратная транскрипция
2.2.15 Полимеразная цепная реакция
2.2.16 Полимеразная цепная реакция в реальном времени
2.2.17 Электрофорез нуклеиновых кислот
2.2.18 Молекулярно-генетический анализ комплексного аллеля гена CFTR
2.2.19 Массовое параллельное секвенирование гена CFTR
2.2.20 Форсколин-индуцированное набухание бронхиальных и легочных органоидов
2.2.21 Доставка генетических конструкций в чиБК методом электропорации
2.2.22 Доставка генетических конструкций в чиБК методом липофекции
2.2.23 Оценка жизнеспособности клеток после невирусной доставки генетических конструкций
2.2.24 Анализ изображений
2.2.25 Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Бронхиальные и легочные органоиды из чиПСК
3.1.1 Получение бронхиальных и легочных органоидов
3.1.2 Пассирование и криоконсервация органоидов
3.1.3 Анализ площади органоидов
3.1.4 Характеристика клеточного состава органоидов
3.2 Базальные клетки респираторного эпителия из чиПСК
3.2.1 Получение базальных клеток респираторного эпителия из чиПСК
3.2.2 Характеристика базальных клеток респираторного эпителия из чиПСК
3.3 Получение и характеристика легочных органоидов из чиБК
3.4 Форсколин-индуцированное набухание бронхиальных и легочных органоидов из чиПСК
3.5 Форсколин-индуцированное набухание легочных органоидов из чиПСК и чиБК в ответ на модуляторы CFTR-канала
3.6 Доставка генетических конструкций в чиБК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при
Минобрнауки России
Список публикаций в других изданиях
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АТ1, АТ2 - альвеолярные клетки типа 1,
БК - базальные клетки
БО - бронхиальные органоиды
ВКМ - внеклеточный матрикс
ВОЗ - всемирная организация здравоохранения
ДИ - доверительный интервал
ДМСО - диметилсульфоксид
ДЭ - дефинитивная эндодерма
кДНК - комплементарная ДНК
КИ - клеточный индекс
КО - кишечные органоиды
ЛО - легочные органоиды
МВ - муковисцидоз
мРНК - матричная РНК
ОФВ1 - объём форсированного выдоха за первую секунду ПБСД - полная бессывороточная среда для дифференцировки ПСК - плюрипотентные стволовые клетки ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
СО - стандартное отклонение
ФИН - форсколин-индуцированное набухание
чиБК - индуцированные базальные клетки легкого человека
чиБО - индуцированные бронхиальные органоиды человека
чиЛО - индуцированные легочные органоиды человека
чиПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека
чНЭК - назальные эпителиальные клетки человека
ЭПК - эндодерма передней кишки
2D - 2-dimensional (двумерный)
3D - 3-dimensional (трехмерный)
ALI - air-liquid interface (граница раздела воздух-жидкость) AUC - area under curve (площадь под кривой)
CFTR - cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (трансмембранный регулятор муковисцидоза)
CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats (кластерные регулярные короткие палиндромные повторы)
EMA - European Medicines Agency (Европейское агентство лекарственных средств)
FDA - Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за
качеством пищевых продуктов и медикаментов)
PDT - population doubling time (время удвоения популяции)
TEER - transepithelial electrical resistance (трансэпителиальное электрическое
сопротивление)
WT - wild type (дикий тип)
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Молекулярная эпидемиология муковисцидоза в РФ и комплексная оценка патогенетической роли вариантов гена CFTR на основе изучения функции эпителиальных ионных каналов (ENaC, CFTR, CaCCs)2023 год, кандидат наук Мельяновская Юлия Леонидовна
Клинико-иммунологический эффект вакцинации против синегнойной инфекции у детей с муковисцидозом и врождёнными пороками развития бронхов2020 год, кандидат наук Благовидов Дмитрий Алексеевич
Подходы к восстановлению поврежденной ткани роговицы глаза с использованием лимбальных стволовых и индуцированных плюрипотентных клеток2022 год, кандидат наук Хорольская Юлия Игоревна
Углеводные нарушения и сахарный диабет у взрослых пациентов с муковисцидозом2014 год, кандидат наук Самойленко, Виктор Александрович
Патология репродуктивной системы у мужчин с муковисцидозом2020 год, кандидат наук Репина Светлана Афанасьевна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика 2D- и 3D-культур клеток респираторного эпителия из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для моделирования и разработки терапии муковисцидоза»
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы диссертационного исследования
Муковисцидоз (МВ) - аутосомно-рецессивное заболевание, вызываемое патогенными вариантами в гене муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) [De Boeck, 2020]. На сегодняшний день по данным международного проекта CFTR2 описано 719 патогенных генетических вариантов гена CFTR, которые приводят к этому заболеванию, при этом мутация F508del самая распространённая у пациентов с муковисцидозом (https://cftr2.org). В результате мутации F508del развивается нарушения фолдинга и транспортировки белка CFTR к апикальной мембране эпителиальных клеток, что приводит к выраженному дефициту ионных каналов, которые кодируются геном CFTR [Marshall и др., 2021].
В настоящее время лечение МВ включает симптоматические и патогенетические подходы. Симптоматическая терапия направлена на купирование симптомов заболевания и включает в себя противовоспалительную, антибактериальную и фермент-заместительную терапию, терапию бронхоэктазов и др. [Каширская Н.Ю. и др., 2014]. Патогенетическая терапия заключается в коррекции структурных нарушений белка CFTR и/или восстановление проводимости CFTR-канала, что достигается за счет применения модуляторов CFTR [Амелина Е. Л. и др., 2017]. Однако, в связи с многообразием вариантов гена CFTR, не для всех мутаций разработаны эффективные препараты патогенетической терапии. Также на стадии разработок находятся подходы этиотропного лечения, такие как генная терапия и геномное редактирование, которые направлены на восстановление ДНК или мРНК CFTR или на коррекцию мутаций.
В рамках разработки терапии МВ важным является наличие релевантной клеточной модели для скрининга новых терапевтических соединений. Поскольку у большинства пациентов с МВ патология со стороны дыхательной системы является наиболее частой причиной летальных исходов [Каширская Н.Ю., 2021], то
наиболее актуально использовать для этого клетки респираторного эпителия. Первичные клеточные модели имеют гетерогенный клеточный состав и ограниченный пролиферативный потенциал, что приводит к необходимости повторного взятия биопсии. Современным направлением является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (чиПСК) с последующей их дифференцировкой в эпителиальные клетки дыхательных путей.
Описан ряд протоколов дифференцировки чиПСК в эпителий дыхательных путей [Kim и др., 2021; McCauley и др., 2017; Wong и др., 2012]. Среди клеток респираторного эпителия из чиПСК целесообразно получать индуцированные базальные клетки человека (чиБК), поскольку чиБК являются мультипотентными прогениторными клетками [Hawkins et al., 2021], что позволяет проводить длительные исследования по разработке этиотропной терапии, а также осуществлять дифференцировку в специализированные клетки легкого. В существующих протоколах по получению чиБК недостатками являются либо гетерогенная популяция клеток из-за культивирования на фидерном слое [Djidrovski и др., 2021] или из-за отсутствия обогащения методом клеточной сортировки [Wong и др., 2012], либо поддержание в культуре только в форме органоидов [Carvalho de и др, 2019; Hawkins и др, 2021].
Для оценки эффективности методов патогенетического и этиотропного лечения МВ необходимо проводить функциональный анализ CFTR-канала. Одним из распространенных методов является форсколин-индуцированное набухание (ФИН) органоидов [Boj и др., 2017]. Бронхиальные и легочные органоиды, полученные из чиПСК (чиБО и чиЛО, соответственно), являются перспективной моделью, поскольку содержат клетки с высокой экспрессией CFTR (реснитчатые, базальные и крупные секреторные клетки) [Okuda и др, 2021]. Ранее не проводился функциональный анализ CFTR-канала на чиЛО. ФИН на чиБО проводится научными группами для оценки возможности применения чиБО для тестирования модуляторов CFTR-канала при мутациях CFTR 1-3 классов [Berical и др, 2022; Wong и др, 2021].
Таким образом, несмотря на высокий интерес к лечению МВ, важным остается наличие пациент-специфичных клеточных моделей для доклинического скрининга терапевтических соединений и разработки новых подходов к лечению, включая генную терапию. Дальнейшие исследования должны быть направлены на стандартизацию методики воспроизводимого получения клеточных моделей и оценке, насколько ФИН органоидов, полученных из чиПСК, отражает тяжесть индивидуального заболевания или предсказывает клиническую эффективность терапии на примере модуляторов CFTR.
Степень разработанности темы
Получение базальных клеток и органоидов респираторного эпителия из чиПСК активно развивается последнее десятилетие. Одним из пионеров в получении базальных клеток из чиПСК является работа Wong с соавт. [Wong и др, 2012]. В ходе получения чиБК авторы не обогащали популяцию чиБК путем клеточной сортировки по поверхностному маркеру базальных клеток, а культивировали все полученные в ходе дифференцировки клетки. Дальнейшие работы [Carvalho de и др, 2019; Hawkins и др, 2021] усовершенствовали методику дифференцировки и ввели клеточную сортировку, однако в указанных работах не рассматривали культивирование полученных чиБК в 2D-культуре, а проводили культивирование только в форме органоидов.
Получение BD-культур эпителиальных клеток респираторного эпителия важно для проведения функциональной оценки CFTR-канала методом форсколин-индуцированного набухания органоидов. Исследования по ФИН на органоидах дыхательных путей, полученных из чиПСК, охватывают только чиБО [Berical и др, 2022; McCauley, Hawkins, Kotton, 2018; Wong и др, 2021]. До настоящей работы исследований по ФИН на чиЛО не опубликовано.
Разработки этиотропного лечения МВ методами генной терапии и геномного редактирования на чиБК нет. Однако чиБК являются перспективной клеточной моделью, поскольку обладают высоким пролиферативным потенциалом в
сравнении с другими клетками респираторного эпителия, способностью к дифференцировке в специализированные клетки легкого и экспрессии CFTR [Rock и др., 2009], что позволяет проводить длительные эксперименты и оценивать эффективность коррекции мутаций в гене CFTR.
Цель исследования
Получить и охарактеризовать базальные клетки и органоиды респираторного эпителия из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для моделирования и дальнейшего использования в разработке терапии муковисцидоза.
Задачи исследования
1. Получить и охарактеризовать бронхиальные и легочные органоиды из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.
2. Разработать протокол дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в базальные клетки респираторного эпителия.
3. Получить легочные органоиды из базальных клеток респираторного эпителия.
4. Установить оптимальные условия проведения форсколин-индуцированного набухания на легочных органоидах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.
5. Провести анализ форсколин-индуцированного набухания на легочных органоидах, полученных из базальных клеток респираторного эпителия.
6. Провести анализ форсколин-индуцированного набухания на легочных органоидах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и базальных клеток респираторного эпителия пациентов с муковисцидозом с гомозиготной мутацией F508del в гене CFTR, в ответ на модуляторы CFTR-канала.
7. Определить оптимальные условия невирусной доставки генетических конструкций в базальные клетки респираторного эпителия, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.
Научная новизна
В работе впервые исследованы способы оптимизации протокола получения базальных клеток респираторного эпителия, бронхиальных и легочных органоидов из чиПСК пациентов с муковисцидозом и здоровых доноров с подробной характеристикой полученных клеточных культур.
Впервые проведен функциональный анализ СБТЯ-канала методом форсколин-индуцированного набухания органоидов на легочных органоидах, полученных из чиПСК пациентов с муковисцидозом и здоровых доноров.
Впервые продемонстрирована возможность оценки восстановления функции СБТЯ-канала в легочных органоидах, полученных из чиПСК пациентов с муковисцидозом в ответ на СБТЯ модуляторы.
Впервые проведена доставка генетических конструкций в базальные клетки респираторного эпителия, полученных из чиПСК пациентов с муковисцидозом, методом липофекции.
Теоретическая и практическая значимость
Работа представляет собой оригинальное исследование по дифференцировке чиПСК в 2Э- и ЭЭ-культуры клеток респираторного эпителия и демонстрацию возможности функциональной оценки СБТЯ-канала в полученных ЭЭ-культурах. Разработанные протоколы дифференцировки позволяют воспроизводимо получать культуры клеток из чиПСК пациентов с МВ и здоровых доноров. По результатам работы написана Стандартная операционная процедура БК-01 «Протокол получения легочных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека», дата внедрения 23 декабря 2021 года, внедрен в ФГБНУ
«МГНЦ», и создан клеточный банк легочных органоидов.
Описанный в рамках диссертационной работы анализ функциональной активности CFTR-канала на легочных органоидах, полученных из чиПСК, может быть использован для тестирования новых терапевтических соединений при проведении лабораторных и доклинических исследований, а также оценки эффективности генетических модификаций гена СЕТЯ.
Подобранные условия невирусной доставки генетических конструкций в 2D-культуры клеток респираторного эпителия позволят проводить эксперименты для разработки генотерапевтических подходов для лечения наследственных заболеваний дыхательных путей.
Методология и методы исследования
Методологической и теоретической основой диссертационной работы являлись отечественные и зарубежные исследования в области клеточных моделей для разработки терапии муковисцидоза и оценки ее эффективности, а также работы, направленные на функциональную оценку СFTR-канала в пациент-специфичных культурах клеток. В работе использовались следующие методы: работа с культурами клеток эукариот, иммунофлуоресцентное окрашивание, проточная цитофлуориметрия, выделение нуклеиновых кислот, спектрофотометрия, полимеразная цепная реакция, гель-электрофорез нуклеиновых кислот, анализ экспрессии генов с помощью количественной ПЦР, глубокое таргетное секвенирование и статистические методы с учетом задач исследования и применяемых методов.
Положения, выносимые на защиту
1. Бронхиальные и легочные органоиды, полученные в ходе направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (чиПСК) в отсутствие обогащения популяции NKX2.1+ легочными прогениторами,
в клеточном составе содержат СБТЯ-экспрессирующие клетки, что позволяет их рассматривать в качестве модельной клеточной системы респираторного эпителия при муковисцидозе.
2. Разработанный протокол получения базальных клеток респираторного эпителия из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека позволяет получать клеточную модель со схожими с первичной культурой фенотипическими свойствами, но с большим пролиферативным потенциалом.
3. Индуцированные базальные клетки респираторного эпителия человека могут служить источником для получения легочных органоидов.
4. Легочные органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и индуцированных базальных клеток респираторного эпителия человека, можно применять для оценки функциональной активности СБТЯ-канала методом форсколин-индуцированного набухания органоидов.
5. Показана возможность применения легочных органоидов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и индуцированных базальных клеток респираторного эпителия пациентов с гомозиготной мутацией Б508ёе1 в гене СЕТЯ, в качестве клеточной модели для оценки эффективности модуляторов СБТЯ-канала.
6. Невирусный способ доставки генетических конструкций в индуцированные базальные клетки респираторного эпителия методом липофекции продемонстрировал наилучшую эффективность и воспроизводимость, в сравнении с электропорацией.
Степень достоверности результатов
Высокая степень достоверности результатов достигнута, благодаря использованию большого количества биологических и технических повторов в экспериментах с последующим анализом полученных результатов при использовании современных методов статистической оценки. Теоретическое обоснование работы основано на анализе многочисленных источников
отечественной и зарубежной литературы. В работе применялись современные методы исследования и оборудование, а полученные результаты работы согласуются с результатами других исследований. Поставленные в работе цели и задачи полностью выполнены и отражены в выводах.
Апробация результатов исследования
Материалы диссертационной работы доложены на 14 международных и всероссийских конференциях: European Human Genetics Conference 2022; European Human Genetics Conference 2023; European Cystic Fibrosis Society Diagnostic Network Working Group, 2022 г.; 45th European Cystic Fibrosis Conference, 2022 г.; Всероссийская школа-конференция «Биоресурсные коллекции биологических образцов пациентов с генетическими заболеваниями», 2022 г.; Вторая всероссийская школа-конференция «Биоресурсные коллекции биологических образцов пациентов с генетическими заболеваниями», 2023 г.; XIII научная конференция «Генетика человека и патология», 2022 г.; V Национальный конгресс по регенеративной медицине, 2022 г.; 26-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", 2023 г.; XVI Национальный конгресс «Муковисцидоз и наследственные заболевания легких», 2023 г.; StemCellBio-2023, 2023 г.; XXXIII Национальный конгресс по болезням органов дыхания, 2023 г.; XIX Международная (XXVIII Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция, 2024 г; VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 2024 г. Работа одобрена этическим комитетом при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» (ФГБНУ «МГНЦ»).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертация соответствует паспорту специальности 1.5.7. Генетика (биологические науки), и охватывает следующие направления исследования: 13. Генетика соматических клеток. Репрограммирование стволовых/соматических клеток; 14. Генетические основы биотехнологии. Генетическая и клеточная инженерия; 19. Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни.
Личный вклад автора в проведение исследования
В диссертации представлены результаты исследований, выполненных автором лично или при его активном участии в период с 2020 по 2024 годы. Личный вклад автора в настоящую работу состоит в анализе литературы, проведение экспериментальной работы, обработке и анализе полученных результатов, и их оформлении и представлении в виде научных докладов и публикаций.
Публикации
Материалы диссертационной работы представлены в 19 печатных работах, в том числе в 11 статьях (все в Web of Science и/или Scopus, 1 - К1), опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей ученой степени кандидата биологических наук, и в двух патентах на изобретение -№ 2815943 от 25.03.2024 «Способ получения базальных клеток легкого человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека» и № 2821564 от 25.06.2024 «Способ получения, культивирования и характеристики бронхиальных и легочных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека». В опубликованных научных работах полностью отражены основные результаты диссертации, положения и выводы.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 27 рисунков. Работа имеет следующую структуру: список сокращений и условных обозначений, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список научных трудов по теме диссертации, список цитируемой литературы, приложения. Библиографический указатель включает 177 наименований, из них 5 отечественных и 172 зарубежных источника.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Муковисцидоз 1.1.1 Определение и эпидемиология муковисцидоза
Муковисцидоз (МВ) вызывается мутациями в гене трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR), который располагается на длинном плече хромосомы 7 и кодирует белок из 1480 аминокислот [Ratjen, Döring, 2003]. CFTR кодирует цАМФ-зависимый, активируемый фосфорилированием анионный канал, который транспортирует хлорид и бикарбонат через апикальную плазматическую мембрану эпителиальных клеток. CFTR белок состоит из пяти доменов: двух трансмембранных доменов (TMD1 и TMD2), которые образуют канал хлорид-иона; двух нуклеотид-связывающих доменов (NBD1 и NBD2), содержащих несколько сайтов фосфорилирования, которые связывают и гидролизуют АТФ; и уникальной регуляторной (R) - области, которая открывает канал при фосфорилировании АТФ и цАТФ-зависимой протеинкиназой А [Riordan и др., 1989; Sheppard, Welsh, 1999]. В респираторном отделе легких белок CFTR находится в реснитчатых, базальных, альвеолярных и крупных секреторных клетках [Brochiero и др., 2004; LeSimple и др., 2013; Okuda и др., 2021], а наиболее высокий уровень CFTR экспрессируется в ионоцитах [Hawkins, Kotton, 2018]. Также было показано, что во взрослых альвеолярных клетках встречаются 50-250 функциональных каналов CFTR, которые могут вносить вклад в гомеостаз альвеолярной жидкости [Brochiero и др., 2004]. CFTR как переносчик хлоридов играет решающую роль в гидратации слизи на поверхности дыхательных путей [Boucher, 2007], а также способствует связыванию и отделению слизи за счет подщелачивания бикарбонатом [Shah и др., 2016].
К 2021 году в мире диагностировано более 160 000 случаев МВ и с каждым годом эта цифра растет [Guo, 2022]. МВ наиболее часто встречается у белого населения - 93,4% от всех пациентов с МВ, а у другой части населения встречается
в 20-25 раз реже. В России на 2021 год зарегистрировано 3969 человек пациентов с МВ с частотой 1/10 тыс. населения [Кондратьева и др., 2023]. Ранние проявления МВ характеризуются нарушением питания и желудочно-кишечными расстройствами, по мере прогрессирования появляются респираторные заболевания, которые являются наиболее тяжелым проявлением и наиболее частой причиной смерти или трансплантации легких [De Boeck, 2020]. Однако осложнения, такие как заболевания печени, диабет, связанный с МВ, носовые полипы, кишечные непроходимости, кровохарканье, аллергический бронхолегочный аспергиллез и многие другие, могут возникать почти во всех органах и увеличиваться с возрастом. Смертность в детстве от МВ в западном мире сейчас редка, а в странах с низким уровнем дохода по-прежнему остается высокой [Villanueva и др., 2017]. По данным Cystic Fibrosis Foundation за 2022 год, ожидаемая продолжительность жизни людей с МВ, родившихся в период с 2018 по 2022 год, прогнозируется на уровне 56 лет.
1.1.2 Молекулярно-генетические аспекты патогенеза муковисцидоза
Описано более 2000 генетических вариантов гена CFTR, из которых 719 являются патогенными [CFTR1 Database. Cystic Fibrosis Mutation Database, 2019]. Патогенные варианты можно сгруппировать в семь классов, которые представлены в таблице 1 [De Boeck, 2016]. Наиболее распространенной во всем мире мутацией является мутация II класса, вызванная делецией фенилаланина в положении 508 (F508del), мутация встречается у 70% от всех пациентов с МВ в Европе, из них 44,4% являются гомозиготными носителями, а 40,9% - гетерозиготными [Cystic Fibrosis Foundation. Patient registry: annual data report, 2021]. По данным Регистра пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации на 2021 год гомозиготная мутация F508del встречается в 28,2%, а гетерозиготная в 45,4% [Красовский и др., 2021].
Таблица 1 - Классы мутаций в гене СЕТЯ при муковисцидозе
Класс мутации Патология Наиболее частые мутации
I Белок не синтезируется G542X, W1282X, R553X
II Нарушение процессинга белка или транспорта F508del, N1303^ A455E, G85E
III Нарушение регуляции канала G551D, V520F, S549R
IV Снижение проводимости канала R117H, R334W, S1235R
V Снижение количества функционального белка A455E, 1680-886A>G, 2657+5G>A
VI Снижение стабильности белка Q1412X, rF508del
VII РНК не синтезируется CFTRdele2,3(21 kb), 1585-1G>A
Примечание: rF508del, г - rescued, функция CFTR восстанавливается большинства корректорами.
Мутация F508del характеризуется неправильным фолдингом домена NBD1 (рисунок 1А), что аллостерически влияет на сборку других доменов и в свою очередь приводит к нестабильности белка, который распознается механизмами контроля качества клеточного белка и разрушается протеасомами [Kleizen и др., 2020] (рисунок 1Б). В то время как нормальный белок после посттрансляционного фолдинга и гликозилирования в эндоплазматическом ретикулуме переходит в аппарат Гольджи, где он полностью гликозилируется, затем экспортируется к апикальной мембране эпителиальных клеток, где он функционирует как хлоридный и бикарбонатный канал.
Рисунок 1 - Строение и биосинтез белка CFTR. А - схематическое изображение CFTR белка с указанием мутации F508del. Б - процесс биосинтеза белка CFTR
дикого типа и с мутацией F508del
1.1.3 Терапия муковисцидоза
В течение многих лет лечение МВ было сосредоточено на симптоматической терапии хронической легочной инфекции, которая характеризуется кашлем и выделением мокроты, что приводит к прогрессирующему повреждению легких [Proesmans, 2017]. По мере лучшего понимания патогенеза заболевания стали появляется новые методы лечения, нацеленные на исправление основных дефектов мутаций - модуляторы, которые открыли больше возможностей для терапии пациентов с МВ.
Модуляторы при МВ:
1. Потенциаторы. Это соединения, которые увеличивают вероятность открытия канала, тем самым обеспечивая CFTR-зависимую анионную проводимость [Lopes-Pacheco, 2016]. Работают в отношении мутаций III и IV
классов. Наиболее известные представители этого класса: ивакафтор (VX-770), дейтерированный ивакафтор и ABBV-974 [Lopes-Pacheco, 2016]. Препараты по результатам испытаний показывают улучшение клинических результатов -снижают концентрацию хлорида в поте, улучшают показатель объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1) [Ramsey и др., 2011]. Также разрабатываются новые потенциаторы, такие как GLPG1837 и GLPG2451, которые по результатам клинических исследований показали свою эффективность в увеличении ОФВ1 и снижении концентрации хлорида в поте [Van der Plas и др., 2021].
2. Корректоры. Соединения, которые обеспечивают фолдинг, процессинг и транспортировку белка к плазматической мембране. Основной механизм работы
- повышение конформационной стабильности белка. Работают в отношении мутаций II класса, а именно F508del. Основные представители этого класса: лумакафтор (VX-809), тезакафтор (VX-661), элексакафтор (VX-445). По результатам IIa фазы клинических исследований лумакафтор не улучшает функции легких у пациентов с гомозиготной формой F508del [Clancy и др., 2012]. Значительное улучшение функции легких (3-4% для ОФВ1) и снижение частоты легочных обострений на 30-39% было обнаружено при совместном применении лумакафтора с ивакафтором [Boyle и др., 2014], поэтому в 2015 году FDA и EMA одобрили совместное лечение лумакафтором/ивакафтором (Orkambi®, Vertex Pharmaceuticals) для гомозиготных по F508del пациентов в возрасте >12 лет [Wainwright и др., 2015], а позднее было расширено для гомозиготных по F508del пациентов в возрасте >2 лет [McNamara и др., 2019]. Другой препарат этой группы
- тезакафтор - является корректором второго поколения, разработанным на основе структуры люмакафтора, но демонстрирующий лучшие фармакокинетические свойства и меньшее количество побочных эффектов. В клинических исследованиях совместное лечение тезакафтором/ивакафтором продемонстрировало сравнимые терапевтические результаты (концентрация хлорида пота, ОФВ1 и другие) с лечением люмакафтором/ивакафтором у гомозиготных по F508del пациентов [Donaldson и др., 2018; Taylor-Cousar и др., 2017]. В 2018 году FDA и EMA
одобрили совместное лечение тезакафтором/ивакафтором (Symdeko® или Symkevi®, Vertex Pharmaceuticals) для пациентов в возрасте >12 лет, гомозиготных по F508del, а затем расширили возраст до >6 лет. На основе тезакафтором/ивакафтором была разработана тройная комбинация с соединениями элексакафтор и бамокафтор, которые значительно увеличили ОФВ1, снизили концентрацию хлорида в поте, при этом побочные эффекты были от легких до умеренных [Heijerman и др., 2019; Taylor-Cousar и др., 2019]. Тройная комбинация тезакафтор/ивакафтор/элексакафтор (Trikafta™, Vertex Pharmaceuticals) была недавно одобрена FDA для лечения пациентов с МВ в возрасте >12 лет с мутацией F508del по крайней мере в одном аллеле. Также разрабатываются новые молекулы, например корректор PTI-80, который действует по схожему с VX-445 механизму и является его альтернативой [Ferreira и др., 2024]. В сочетании с другими корректорами (VX-661 или VX-809) PTI-80 частично устраняет дефекты стабильности и фолдинга, вызванные мутацией F508del/F508del.
3. Стабилизаторы. При мутациях VI класса CFTR белок является функциональным и присутствует на плазматической мембране, но имеет значительное сокращение периода полужизни [Haardt и др., 1999], вероятно, из-за ускоренного эндоцитоза. Представителем этой группы модуляторов, является кавосонстат. Препарат способствует стабильности мембраны путем ингибирования S-нитрозоглутатионредуктазы in vitro. Кавосонстат продемонстрировал снижение концентрации хлорида в поте у гомозиготных по F508del пациентов и отсутствие проблем с безопасностью при максимальной дозе [Donaldson и др., 2017]. Однако, не было показано каких-либо преимуществ в комбинации с люмакафтором/ивакафтором или ивакафтором в исследованиях фазы II и разработка кавосонстата была прекращена.
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Восстановление активности β-гексозаминидазы А с помощью генетически модифицированных клеток2023 год, кандидат наук Шаймарданова Алиса Алмазовна
Получение модельной системы спинальной мышечной атрофии на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека2016 год, кандидат наук Валетдинова, Камила Робертовна
Моделирование болезни Гентингтона с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека2015 год, кандидат наук Некрасов, Евгений Дмитриевич
Изучение роли сигнального пути Wnt в развитии аритмогенной кардиомиопатии на модели индуцированных плюрипотентных стволовых клеток2016 год, кандидат наук Худяков Александр Александрович
Вентиляционная функция легких у детей, больных муковисцидозом на современном этапе.2014 год, кандидат наук Тарасова, Ольга Владимировна
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Демченко Анна Григорьевна, 2024 год
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Амелина Е. Л., Красовский, С. А., Усачева, М. В. и др. Патогенетическое лечение муковисцидоза: первый клинический случай в России // Пульмонология. 2017. Т. 27. №. 2. С. 298-301.
2. Каширская Н. Ю. Муковисцидоз. Издание 2-е., переработанное и дополненное (под ред. Каширской Н.Ю., Капранова Н.И. и Кондратьевой Е.И.). - М.: ИД «МЕДПРАКТИКА-М», 2021, 680 с. ISBN 978-5-98803-450-6
3. Каширская Н. Ю., Капранов Н. И. Современные фармакотерапевтические подходы к лечению муковисцидоза // Фарматека. 2014. Т. 3. С. 38-43.
4. Кондратьева Е. И., Воронкова А.Ю., Каширская Н.Ю. et al. Российский регистр пациентов с муковисцидозом: уроки и перспективы // Пульмонология. 2023. Т. 33. № 2. С. 171-181.
5. Красовский С.А., Старинова М.А., Воронкова А.Ю. et al. Регистр пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации. 2021 год. - СПб.: Благотворительный фонд «Острова», 2023, С. 81.
6. Aisenbrey E. A., Murphy W. L. Synthetic alternatives to Matrigel // Nat Rev Mater. 2020. Т. 5. № 7. С. 539-551.
7. Amatngalim G. D., Rodenburg L. W., Aalbers B.L. et al. Measuring cystic fibrosis drug responses in organoids derived from 2D differentiated nasal epithelia // Life Sci Alliance. 2022. Т. 5. № 12. С. e202101320.
8. Awatade N. T., Uliyakina I., Farinha C. M. et al. Measurements of Functional Responses in Human Primary Lung Cells as a Basis for Personalized Therapy for Cystic Fibrosis // EBioMedicine. 2015. Т. 2. № 2. С. 147-153.
9. Awatade N. T., Wong S. L., Chris K Hewson C. K. et al. Human Primary Epithelial Cell Models: Promising Tools in the Era of Cystic Fibrosis Personalized Medicine // Front Pharmacol. 2018. Т. 9. С. 1429.
10. Barbry P., Marcet B., Caballero I. Where is the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator? // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2021. Т. 203. №. 10. С. 1214-1216.
11. Barkauskas C. E., Cronce M. J., Rackley C. R. et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung // J Clin Invest. 2013. T. 123. № 7. C. 3025-3036.
12. Baltus G. A., Kowalski, M. P., Zhai, H. et al. Acetylation of sox2 induces its nuclear export in embryonic stem cells // Stem cells. 2009. T. 27. №. 9. C. 2175 -2184.
13. Bengtson C., Silswal, N., Baumlin, N. et al. The CFTR amplifier nesolicaftor rescues TGF-ß1 Inhibition of modulator-Corrected F508del CFTR function // International Journal of Molecular Sciences. 2022. T. 23. №. 18. C. 10956.
14. Berical A., Rhianna E. L., Junjie E.L., Rhianna E. Lee, et al. A multimodal iPSC platform for cystic fibrosis drug testing // Nat Commun. 2022. T. 13. №2 1. C. 4270.
15. Berical A. C., Beermann M., Kiyokawa H. et al. Efficient Gene-editing of IPSC-derived Airway Basal Cells to Study Primary Ciliary Dyskinesia // A29. EPITHELIUM: FIRST LINE OF DEFENSE. : American Thoracic Society, 2023. C. A1254-A1254.
16. Berkers G., Mourik P., Vonk A. M. et al. Rectal Organoids Enable Personalized Treatment of Cystic Fibrosis // Cell Rep. 2019. T. 26. № 7. C. 1701- 1708.e3.
17. Bérubé K, Prytherch Z., Job C.,. et al. Human primary bronchial lung cell constructs: the new respiratory models // Toxicology. 2010. T. 278. № 3. C. 311318.
18. Boj S. F., Vonk A. M., Statia M. et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients // J Vis Exp. 2017. № 120. C. 55159.
19. Boucher R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease // J Intern Med. 2007. T. 261. № 1. C. 5-16.
20. Boyle M. P., Bell S. C., Konstan M. W. et al. A CFTR corrector (lumacafttor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial // Lancet Respir Med. 2014. T. 2. № 7. C. 527-538.
21. Brewington J. J., Filbrandt, E. T., LaRosa III, F. J. et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies // JCI insight. 2018a. T. 3. №. 13.
22. Brewington J. J., Filbrandt E. T., LaRosa F. J. et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids // J Cyst Fibros. 20186. T. 17. № 1. C. 26-33.
23. Brochiero E., Dagenais A., Privé A., et al. Evidence of a functional CFTR Cl(-) channel in adult alveolar epithelial cells // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004. T. 287. № 2. C. L382-392.
24. Bukowy-Bieryllo Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we? // Cell Commun Signal. 2021. T. 19. № 1. C. 63.
25. Butt M. H., Zaman, M., Ahmad, A. et al. Appraisal for the potential of viral and nonviral vectors in gene therapy: A review // Genes. 2022. T. 13. №. 8. C. 1370.
26. Calà G., Beatrice Sina B., Coppi P. D. et al. Primary human organoids models: Current progress and key milestones // Front Bioeng Biotechnol. 2023. T. 11. C. 1058970.
27. Carpenter A. E., Jones, T. R., Lamprecht, M. R. et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes // Genome biology. 2006. T. 7. C. 1-11.
28. Carvalho-Oliveira I., Efthymiadou A., Malho R. et al. CFTR localization in native airway cells and cell lines expressing wild-type or F508del-CFTR by a panel of different antibodies //Journal of Histochemistry & Cytochemistry. - 2004. - T. 52. - №. 2. - C. 193-203.
29. Carvalho A. L. R. T., Strikoudis A., Liu H-Y. et al. Glycogen synthase kinase 3 induces multilineage maturation of human pluripotent stem cell-derived lung progenitors in 3D culture // Development. 2019. T. 146. № 2. C. dev171652.
30. Castillon N., Hinnrasky J., Zahm J-M. et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture // Lab Invest. 2002. T. 82. № 8. C. 989-998.
31. Chen Y.-W., Ahmed A., Snoeck H-W. Generation of three-dimensional lung bud organoid and its derived branching colonies // Protocol Exchange. 2017.
32. Ciciriello F., Bijvelds M. J. C., Alghisi F. et al. Theratyping of the Rare CFTR Variants E193K and R334W in Rectal Organoid-Derived Epithelial Monolayers // J Pers Med. 2022. Т. 12. № 4. С. 632.
33. Clancy J. P., Rowe S. M., Accurso F. J. et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation // Thorax. 2012. Т. 67. № 1. С. 1218.
34. Clancy J. P., Cotton C. U., Donaldson S. H. et al. CFTR modulator theratyping: Current status, gaps and future directions // J Cyst Fibros. 2019. Т. 18. №2 1. С. 2234.
35. Commissioner O. of the. FDA expands approved use of Kalydeco to treat additional mutations of cystic fibrosis [Электронный ресурс].
36. Courcey F. de, Zholos A. V., Atherton-Watson H. et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology // Am J Physiol Cell Physiol. 2012. Т. 303. № 11. С. C1173-1179.
37. Crawford D. K., Mullenders J., Pott J. et al. Targeting G542X CFTR nonsense alleles with ELX-02 restores CFTR function in human-derived intestinal organoids // Journal of Cystic Fibrosis. - 2021. - Т. 20. - №. 3. - С. 436-442.
38. Cumplido-Laso G., Benitez D. A., Mulero-Navarro S. et al. Transcriptional Regulation of Airway Epithelial Cell Differentiation: Insights into the Notch Pathway and Beyond // Int J Mol Sci. 2023. Т. 24. № 19. С. 14789.
39. De Boeck K., Amaral M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis //The Lancet Respiratory Medicine. - 2016. - Т. 4. - №. 8. - С. 662-674.
40. De Boeck K. Cystic fibrosis in the year 2020: A disease with a new face // Acta Paediatr. 2020. Т. 109. № 5. С. 893-899.
41. Dekkers J. F., Alieva, M., Wellens, L. M. et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids // Nature protocols. 2019. Т. 14. №. 6. С. 1756-1771.
42. Dekkers J. F., Wiegerinck C. L., Jonge H.R. de et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids // Nat Med. 2013. T. 19. № 7. C. 939-945.
43. Dekkers J. F., Berkers G., Kruisselbrink E. et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis // Sci Transl Med. 2016. T. 8. № 344. C. 344ra84.
44. Demchenko A., Lavrov A., Smirnikhina S. Lung organoids: current strategies for generation and transplantation // Cell Tissue Res. 2022. T. 390. № 3. C. 317-333.
45. Deslee G., Dury S., Perotin J. M. et al. Bronchial epithelial spheroids: an alternative culture model to investigate epithelium inflammation-mediated COPD // Respir Res. 2007. T. 8. № 1. C. 86.
46. Dhaliwal N. K., Miri, K., Davidson, S. et al. KLF4 nuclear export requires ERK activation and initiates exit from naive pluripotency // Stem cell reports. 2018. T. 10. №. 4. C. 1308-1323.
47. Djidrovski I., Georgiou M., Hughes G. L. et al. SARS-CoV-2 infects an upper airway model derived from induced pluripotent stem cells // Stem Cells. 2021. T. 39. № 10. C. 1310-1321.
48. Donaldson S. H., Solomon G. M., Zeitlin P. L. et al. Pharmacokinetics and safety of cavosonstat (N91115) in healthy and cystic fibrosis adults homozygous for F508DEL-CFTR // J Cyst Fibros. 2017. T. 16. № 3. C. 371-379.
49. Donaldson S. H., Pilewski J. M., Griese M. et al. Tezacaftor/Ivacaftor in Subjects with Cystic Fibrosis and F508del/F508del-CFTR or F508del/G551D-CFTR // Am J Respir Crit Care Med. 2018. T. 197. № 2. C. 214-224.
50. Dvorak A., Tilley A. E., Shaykhiev R. et al. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome? // Am J Respir Cell Mol Biol. 2011. T. 44. № 4. C. 465-473.
51. Dye B. R., Hill D. R., Ferguson M. A. H. et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids // Elife. 2015. T. 4. C. e05098.
52. Dye B. R., Dedhia P. H., Miller A. J. et al. A bioengineered niche promotes in vivo engraftment and maturation of pluripotent stem cell derived human lung organoids // Elife. 2016. T. 5. C. e19732.
53. Ferreira F. C., Amaral, M. D., Bacalhau, M. et al. PTI-801 (posenacaftor) shares a common mechanism with VX-445 (elexacaftor) to rescue p. Phe508del-CFTR // European Journal of Pharmacology. 2024. C. 176390.
54. Fernandes-Silva H., Araüjo-Silva, H., Correia-Pinto, J. et al. Retinoic acid: a key regulator of lung development // Biomolecules. 2020. T. 10. №. 1. C. 152.
55. Fus-Kujawa A., Prus, P., Bajdak-Rusinek, K. et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro // Frontiers in bioengineering and biotechnology. 2021. T. 9. C. 701031.
56. Gecili E., Su W., Brokamp C. et al. Rapid cystic fibrosis lung-function decline and in-vitro CFTR modulation // J Cyst Fibros. 2021. T. 20. № 5. C. e69-e71.
57. Geraghty R. J., Capes-Davis, A., Davis, J. M. et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research // British journal of cancer. 2014. T. 111. №. 6. C. 1021-1046.
58. Gentzsch M., Boyles S. E., Cheluvaraju C. et al. Pharmacological Rescue of Conditionally Reprogrammed Cystic Fibrosis Bronchial Epithelial Cells // Am J Respir Cell Mol Biol. 2017. T. 56. № 5. C. 568-574.
59. Geurts M. H., Poel E. de, Pleguezuelos-Manzano C. et al. Evaluating CRISPR-based prime editing for cancer modeling and CFTR repair in organoids // Life Sci Alliance. 2021. T. 4. № 10. C. e202000940.
60. Giuliano K. A., Wachi S., Drew L. et al. Use of a High-Throughput Phenotypic Screening Strategy to Identify Amplifiers, a Novel Pharmacological Class of Small Molecules That Exhibit Functional Synergy with Potentiators and Correctors // SLAS Discov. 2018. T. 23. № 2. C. 111-121.
61. Goldfarbmuren K. C., Nathan D. J., Sajuthi S.P. et al. Dissecting the cellular specificity of smoking effects and reconstructing lineages in the human airway epithelium // Nat Commun. 2020. T. 11. № 1. C. 2485.
62. Gray T. E., Guzman K., Davis C. W. et al. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells // Am J Respir Cell Mol Biol. 1996. T. 14. № 1. C. 104-112.
63. Green M. D., Chen, A., Nostro, M. C. et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells // Nature biotechnology. 2011. T. 29. №. 3. C. 267-272.
64. Gruenert D. C., Willems M., Cassiman J. J. et al. Established cell lines used in cystic fibrosis research // J Cyst Fibros. 2004. T. 3 Suppl 2. C. 191-196.
65. Guimbellot J. S., Leach J. M., Chaudhry I. G. et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport // JCI Insight. 2017. T. 2. № 22. C. e95734, 95734.
66. Guo J., Garratt A., Hill A. Worldwide rates of diagnosis and effective treatment for cystic fibrosis //Journal of Cystic Fibrosis. - 2022. - T. 21. - №. 3. - C. 456-462.
67. Haardt M., Benharouga M., Lechardeur D. et al. C-terminal truncations destabilize the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator without impairing its biogenesis. A novel class of mutation // J Biol Chem. 1999. T. 274. № 31. C. 21873-21877.
68. Hao J., Daleo, M. A., Murphy, C. K. et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells // PloS one. 2008. T. 3. №. 8. C. e2904.
69. Hawkins F. J., Kotton D. N. Pulmonary Ionocytes Challenge the Paradigm in Cystic Fibrosis // Trends Pharmacol Sci. 2018. T. 39. № 10. C. 852-854.
70. Hayes D., Kopp B. T., Hil C. L. et al. Cell Therapy for Cystic Fibrosis Lung Disease: Regenerative Basal Cell Amplification // Stem Cells Transl Med. 2019. T. 8. № 3. C. 225-235.
71. Hawkins F., Kramer, P., Jacob, A. et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells // The Journal of clinical investigation. 2017. T. 127. №. 6. C. 2277-2294.
72. Hawkins F. J., Suzuki S., Beermann M. L. et al. Derivation of Airway Basal Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells // Cell Stem Cell. 2021. T. 28. № 1. C. 79- 95.e8.
73. Heijerman H. G. M., McKone E. F., Downey D. G. et al. Efficacy and safety of the elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor combination regimen in people with cystic fibrosis homozygous for the F508del mutation: a double-blind, randomised, phase 3 trial // Lancet. 2019. T. 394. № 10212. C. 1940-1948.
74. Hild M., Jaffe A. B. Production of 3-D Airway Organoids From Primary Human Airway Basal Cells and Their Use in High-Throughput Screening // Curr Protoc Stem Cell Biol. 2016. T. 37. C. IE.9.1-IE.9.15.
75. Hong K. U., Reynolds S. D., Watkins S. et al. Basal cells are a multipotent progenitor capable of renewing the bronchial epithelium // Am J Pathol. 2004. T. 164. № 2. C. 577-588.
76. Hou X., Zaks, T., Langer, R. et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery // Nature Reviews Materials. 2021. T. 6. №. 12. C. 1078-1094.
77. Huch M., Koo B.-K. Modeling mouse and human development using organoid cultures // Development. 2015. T. 142. № 18. C. 3113-3125.
78. Hug M. J., Derichs N., Bronsveld I. et al. Measurement of ion transport function in rectal biopsies // Methods Mol Biol. 2011. T. 741. C. 87-107.
79. Türker §ener L., Albeniz G., Dinf B. et al. iCELLigence real-time cell analysis system for examining the cytotoxicity of drugs to cancer cell lines //Experimental and therapeutic medicine. - 2017. - T. 14. - №. 3. - C. 1866-1870.
80. Ikpa P. T., Bijvelds M. J. C., Jonge H. R. de. Cystic fibrosis: toward personalized therapies // Int J Biochem Cell Biol. 2014. T. 52. C. 192-200.
81. Jaafarpour Z., Soleimani M., Hosseinkhani S. et al. Differentiation of Definitive Endoderm from Human Induced Pluripotent Stem Cells on hMSCs Feeder in a Defined Medium // Avicenna J Med Biotechnol. 2016. T. 8. № 1. C. 2-8.
82. Jacob J. T., Nair, R. R., Poll, B. G. et al. Keratin 17 regulates nuclear morphology and chromatin organization // Journal of cell science. 2020. T. 133. №. 20. C. jcs254094.
83. Jagga B., Edwards, M., Pagin, M. et al. Structural basis for nuclear import selectivity of pioneer transcription factor SOX2 // Nature communications. 2021. T. 12. №. 1. C. 28.
84. Jiang J. X., Wellhauser L., Laselva O. et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients // Stem Cell Reports. 2021. T. 16. № 11. C. 2825-2837.
85. Jordanova E. S., Corver, W. E., Vonk, M. J. et al. Flow cytometric sorting of paraffin-embedded tumor tissues considerably improves molecular genetic analysis // American journal of clinical pathology. 2003. T. 120. №. 3. C. 327-334.
86. Jung P., Sato T., Merlos-Suarez A. et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells // Nat Med. 2011. T. 17. № 10. C. 1225-1227.
87. Kerem E., Konstan M. W., Boeck K. D. et al. Ataluren for the treatment of nonsense-mutation cystic fibrosis: a randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 trial // Lancet Respir Med. 2014. T. 2. № 7. C. 539-547.
88. Kim J.-H., An G. H., Kim J-Y. et al. Human pluripotent stem-cell-derived alveolar organoids for modeling pulmonary fibrosis and drug testing // Cell Death Discov. 2021. T. 7. № 1. C. 48.
89. Kleizen B., Hunt J. F., Callebaut I. et al. CFTR: New insights into structure and function and implications for modulation by small molecules // J Cyst Fibros. 2020. T. 19 Suppl 1. C. S19-S24.Kondrateva E., Adilgereeva E., Amelina E. et al. Generation of induced pluripotent stem cell line (RCMGi001-A) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with p.F508del mutation // Stem Cell Res. 2020. T. 2. №48. C. 101933.
90. Kondrateva E., Demchenko A., Slesarenko Y. et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines (RCMGi004-A and -B) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with compound heterozygous F508del/W1282X mutations in CFTR gene // Stem Cell Res. 2021a. T. 52. C. 102232.
91. Kondrateva E., Demchenko A., Slesarenko Y. et al. Derivation of iPSC line (RCMGi002-A) from dermal fibroblasts of a cystic fibrosis female patient with homozygous F508del mutation // Stem Cell Res. 20216. T. 53. C. 102251.
92. Kondrateva E., Panchuk I., Demchenko A. et al. Generation of induced pluripotent stem cell line (RCMGi008-A) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with compound heterozygous F508del/CFTRdele2. 3 mutations in CFTR gene // Stem Cell Res. 2022. T. 63. C. 102854.
93. Kondratyeva E., Efremova, A., Melyanovskaya, Y. et al. Evaluation of the complex p.[Leu467Phe; Phe508del] CFTR allele in the intestinal organoids model: implications for therapy // International Journal of Molecular Sciences. 2022. T. 23. №. 18. C. 10377.
94. Kozlowski M. T., Crook C. J., Ku H. T. Towards organoid culture without Matrigel // Commun Biol. 2021. T. 4. № 1. C. 1387.
95. Kunisaki S. M., Jiang G., Biancotti J. C et al. Human induced pluripotent stem cell-derived lung organoids in an ex vivo model of the congenital diaphragmatic hernia fetal lung // Stem cells translational medicine. 2021. T. 10. №. 1. C. 98-114.
96. Lall N., Henley-Smith, C. J., De Canha, M. N. et al. Viability reagent, PrestoBlue, in comparison with other available reagents, utilized in cytotoxicity and antimicrobial assays // International journal of microbiology. 2013. T. 2013.
97. Laselva O., Conese M. Three-Dimensional Airway Spheroids and Organoids for Cystic Fibrosis Research // JoR. 2021. T. 1. № 4. C. 229-247.
98. Lavelle G. M., White M. M., Browne N. et al. Animal Models of Cystic Fibrosis Pathology: Phenotypic Parallels and Divergences // Biomed Res Int. 2016. T. 2016. C.5258727.
99. Lee C. E., Raduka A., Gao N. et al. 8-Bromo-cAMP attenuates human airway epithelial barrier disruption caused by titanium dioxide fine and nanoparticles // Tissue Barriers. 2024. C. 2300579.
100. Lee R. E., Miller S. M., Mascenik T. M. et al. Assessing Human Airway Epithelial Progenitor Cells for Cystic Fibrosis Cell Therapy // Am J Respir Cell Mol Biol. 2020. T. 63. № 3. C. 374-385.
101. Leibel S. L., McVicar R. N., Winquist A. M. et al. Generation of Complete Multi-Cell Type Lung Organoids From Human Embryonic and Patient-Specific
Induced Pluripotent Stem Cells for Infectious Disease Modeling and Therapeutics Validation // Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020. T. 54. № 1. C. el 18.
102. LeSimple P., Goepp J., Palmer M. L. et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is expressed in mucin granules from Calu-3 and primary human airway epithelial cells // Am J Respir Cell Mol Biol. 2013. T. 49. № 4. C. 511-516.
103. Leushacke M., Barker N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications // Gut. 2014. T. 63. № 8. C. 1345-1354.
104. Liu Z., Anderson J. D., Deng L., et al. Human Nasal Epithelial Organoids for Therapeutic Development in Cystic Fibrosis // Genes (Basel). 2020. T. 11. № 6. C. 603.
105. Llames S., García-Pérez E., Meana A. et al. Feeder Layer Cell Actions and Applications // Tissue Eng Part B Rev. 2015. T. 21. № 4. C. 345-353.
106. Loh Y.-H., Agarwal S., Park I-H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood // Blood. 2009. T. 113. № 22. C. 5476-5479.
107. Longmire T. A., Ikonomou, L., Hawkins, F. et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells // Cell stem cell. 2012. T. 10. №. 4. C. 398-411.
108. Lopes-Pacheco M. CFTR Modulators: Shedding Light on Precision Medicine for Cystic Fibrosis // Frontiers in Pharmacology. 2016. T. 7.
109. Lopes-Pacheco M. CFTR Modulators: The Changing Face of Cystic Fibrosis in the Era of Precision Medicine // Front Pharmacol. 2019. T. 10. C. 1662.
110. Lundberg A. S., Randell S. H., Stewart S. A. et al. Immortalization and transformation of primary human airway epithelial cells by gene transfer // Oncogene. 2002. T. 21. № 29. C. 4577-4586.
111. Marshall B., Faro A., Brown W. Cystic Fibrosis Foundation. Patient registry: annual data report, 2021. https://www.cff.org/sites/default/files/2021-11/Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf
112. Maurisse R., De Semir, D., Emamekhoo, H. et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages // BMC biotechnology. 2010. T. 10. C. 1-9.
113. McCauley K. B., Hawkins F., Serra M. et al. Efficient Derivation of Functional Human Airway Epithelium from Pluripotent Stem Cells via Temporal Regulation of Wnt Signaling // Cell Stem Cell. 2017. T. 20. № 6. C. 844- 857.e6.
114. McCauley K. B., Hawkins F., Kotton D. N. Derivation of Epithelial-Only Airway Organoids from Human Pluripotent Stem Cells // Curr Protoc Stem Cell Biol. 2018. T. 45. № 1. C. e51.
115. McNamara J. J., McColley S. A., Marigowda G. et al. Safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lumacaftor and ivacaftor combination therapy in children aged 2-5 years with cystic fibrosis homozygous for F508del-CFTR: an open-label phase 3 study // Lancet Respir Med. 2019. T. 7. № 4. C. 325-335.
116. Mendes F., Wakefield, J., Bachhuber, T. et al. Establishment and characterization of a novel polarized MDCK epithelial cellular model for CFTR studies // Cellular Physiology and Biochemistry. 2005. T. 16. №. 4-6. C. 281-290.
117. Miller A. J., Dye B. R., Ferrer-Torres D. et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro // Nat Protoc. 2019. T. 14. № 2. C. 518-540.
118. Mithal A., Capilla A., Heinzw D. et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells //Nature communications. -2020. - T. 11. - №. 1. - C. 215.
119. Mitchell A., Yu C., Zhao X. et al. Rapid Generation of Pulmonary Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells by Co-Culturing Endodermal and Mesodermal Progenitors for Pulmonary Disease Modelling // Biomedicines. 2023. T. 11. № 5. C. 1476.
120. Mou H., Brazauskas K., Rajagopal J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems // Pediatr Pulmonol. 2015. T. 50 Suppl 40. C. S14-23.
121. Mourik P. van, Beekman J. M., Ent C. K. van der. Intestinal organoids to model cystic fibrosis // Eur Respir J. 2019. T. 54. № 1. C. 1802379.
122. Nahm F. S. Receiver operating characteristic curve: overview and practical use for clinicians // Korean journal of anesthesiology. 2022. T. 75. №. 1. C. 25.
123. Narahashi T., Niki, T., Wang, T. et al. Cytoplasmic localization of p63 is associated with poor patient survival in lung adenocarcinoma // Histopathology. - 2006. T. 49. №. 4. C. 349-357.
124. Novakovsky G., Sasaki S., Fornes O. et al. In silico discovery of small molecules for efficient stem cell differentiation into definitive endoderm // Stem Cell Reports. 2023. T. 18. №. 3. C. 765-781.
125. Nusse R., Clevers H. Wnt/ß-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities // Cell. 2017. T. 169. № 6. C. 985-999.
126. Orenti A, Zolin A, Jung A, van Rens J et al, 2023; Annual Data Report 2021 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry, https://www.cff.org/medical-professionals/patient-registry
127. Okuda K., Dang H., Kobayashi Y. et al. Secretory Cells Dominate Airway CFTR Expression and Function in Human Airway Superficial Epithelia // Am J Respir Crit Care Med. 2021. T. 203. № 10. C. 1275-1289.
128. Pachitariu M., Stringer C. Cellpose 2.0: how to train your own model // Nature methods. 2022. T. 19. №. 12. C. 1634-1641
129. Panchuk I., Kondrateva E., Demchenko A. et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines (RCMGi005-A/B) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with homozygous F508del mutation in CFTR gene //Stem Cell Res. 2022. T. 64: C. 102896.
130. Peters-Hall J. R., Coquelin M. L., Torres M. J. et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018. T. 315. № 2. C. L313-L327.
131. Pranke I., Hatton A., Simonin J. et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators // Scientific Reports. 2017. T. 7. № 1.
132. Pranke I., Bidou L., Martin N. et al. Factors influencing readthrough therapy for frequent cystic fibrosis premature termination codons // ERJ Open Res. 2018. Т. 4. № 1. С. 00080-02017.
133. Proesmans M. Best practices in the treatment of early cystic fibrosis lung disease // Ther Adv Respir Dis. 2017. Т. 11. № 2. С. 97-104.
134. Rajendran V. M., Schulzke J.-D., Seidler U. E. Chapter 58 - Ion Channels of the Gastrointestinal Epithelial Cells // Physiology of the Gastrointestinal Tract (Sixth Edition) / под ред. H. M. Said. : Academic Press, 2018. С. 1363-1404.
135. Ramalho A. S., Fürstova, E., Vonk, A. M. et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of cystic fibrosis // European Respiratory Journal. 2021. Т. 57. №. 1.
136. Ramsey B. W., Davies L., McElvaney M. G. et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation // N Engl J Med. 2011. Т. 365. № 18. С. 1663-1672.
137. Rapiteanu R., Karagyozova T., Zimmermann N. et al. Highly efficient genome editing in primary human bronchial epithelial cells differentiated at air-liquid interface //European Respiratory Journal. - 2020. - Т. 55. - №. 5.
138. Ratjen F., Döring G. Cystic fibrosis // The Lancet. 2003. Т. 361. № 9358. С. 681689.
139. Ribeiro S., Mairhofer, J., Madeira, C. et al. Plasmid DNA size does affect nonviral gene delivery efficiency in stem cells // Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells"). 2012. Т. 14. №. 2. С. 130-137.
140. Richards S., Aziz, N., Bale, S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genetics in medicine. 2015. Т. 17. №. 5. С. 405-423.
141. Riordan J. R., Rommens J. M., Kerem B. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA // Science. 1989. Т. 245. № 4922. С. 1066-1073.
142. Rock J. R., Onaitis M. W., Eawlins E. L. et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium // Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. T. 106. № 31. C. 12771-12775.
143. Rock J. R., Gao X., Xue Y. et al. Notch-dependent differentiation of adult airway basal stem cells // Cell Stem Cell. 2011. T. 8. № 6. C. 639-648.
144. Rock J. R., Randell S. H., Hogan B. L. M. Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling // Dis Model Mech. 2010. T. 3. № 9-10. C. 545-556.
145. Rodenburg L. W., Metzemaekers M., Windt I.S. van der et al. Exploring intrinsic variability between cultured nasal and bronchial epithelia in cystic fibrosis // Scientific Reports. 2023. T. 13. № 1.
146. Rowe S. M., Daines C., Ringshausen F. C. et al. Tezacaftor-ivacaftor in residual-function heterozygotes with cystic fibrosis //New England Journal of Medicine. -2017. - T. 377. - №. 21. - C. 2024-2035.
147. Ruysseveldt E., Martens K., Steelant B. Airway Basal Cells, Protectors of Epithelial Walls in Health and Respiratory Diseases // Front Allergy. 2021. T. 2. C. 787128.
148. Sachs N., Papaspyropoulos A., Zomer-van Ommen D. D. et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling // EMBO J. 2019. T. 38. № 4. C. e100300.
149. Saigusa S., Tanaka, K., Toiyama, Y. et al. Correlation of CD133, OCT4, and SOX2 in rectal cancer and their association with distant recurrence after chemoradiotherapy // Annals of surgical oncology. 2009. T. 16. C. 3488-3498.
150. Salahudeen A. A., Choi, S. S., Rustagi, A. et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids // Nature. 2020. T. 588. №. 7839. C. 670-675.
151. Salikhova D. I., Leonov G.E., Bukharova T.B. et al. Comparative impact analysis of neuronal and glial progenitors conditioned medium on cerebellar neurons under glutamate exitotoxicity // Genes & Cells. 2019. T. 14. №. 4. C. 46-53.
152. Sato T., Van Es J.H., Snippert H.J. et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts // Nature. 2011. T. 469. №. 7330. C. 415-418.
153. Schmidt U., Weigert, M., Broaddus, C. et al. Cell detection with star-convex polygons // Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention-MICCAI 2018: 21st International Conference, Granada, Spain, September 16-20, 2018, Proceedings, Part II 11. Springer International Publishing, 2018. C. 265-273.
154. Schutgens F., Clevers H. Human Organoids: Tools for Understanding Biology and
Treating Diseases // Annu Rev Pathol. 2020. T. 15. C. 211-234.
155. Schwank G., Koo B-K., Sasselli V. et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients // Cell Stem Cell. 2013. T. 13. № 6. C. 653-658.
156. Sette G., Cicero S. L., Blacona G. et al. Theratyping cystic fibrosis in vitro in ALI
culture and organoid models generated from patient-derived nasal epithelial conditionally reprogrammed stem cells // Eur Respir J. 2021. T. 58. № 6. C. 2100908.
157. Shah V. S., Meyerholz D. K., Tang X. X. et al. Airway acidification initiates host
defense abnormalities in cystic fibrosis mice // Science. 2016. T. 351. № 6272. C. 503-507.
158. Shankaran A., Prasad K., Chaudhari S. et al. Advances in development and application of human organoids // 3 Biotech. 2021. T. 11. № 6. C. 257.
159. Sheppard D. N., Welsh M. J. Structure and function of the CFTR chloride channel
// Physiol Rev. 1999. T. 79. № 1 Suppl. C. S23-45.
160. Suzuki S., Crane A. M., Anirudhan V. et al. Highly Efficient Gene Editing of Cystic
Fibrosis Patient-Derived Airway Basal Cells Results in Functional CFTR Correction // Mol Ther. 2020. T. 28. № 7. C. 1684-1695.
161. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. T. 126. № 4. C. 663-676.
162. Taylor-Cousar J. L., Munck A., McKone E. F. et al. Tezacaftor-Ivacaftor in Patients
with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del // N Engl J Med. 2017. T. 377. № 21. C. 2013-2023.
163. Taylor-Cousar J. L., Mall A. M., Ramsey B. W. et al. Clinical development of triple-
combination CFTR modulators for cystic fibrosis patients with one or two F508del alleles // ERJ Open Res. 2019. T. 5. № 2. C. 00082-02019.
164. Vaidyanathan S., Salahudeen A. A., Sellers Z. M. et al. High-Efficiency, Selection-
free Gene Repair in Airway Stem Cells from Cystic Fibrosis Patients Rescues CFTR Function in Differentiated Epithelia // Cell Stem Cell. 2020. T. 26. № 2. C. 161- 171.e4.
165. Van der Plas S. E., Kelgtermans H., Mammoliti O. et al. Discovery of GLPG2451,
a novel once daily potentiator for the treatment of cystic fibrosis // Journal of Medicinal Chemistry. 2021. T. 64. №. 1. C. 343-353.
166. Van Goor F., Yu H., Burton B. et al. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function // J Cyst Fibros. 2014. T. 13. № 1. C. 29-36.
167. Valley H. C., Bukis K. M., Bell A. et al. Isogenic cell models of cystic fibrosis-
causing variants in natively expressing pulmonary epithelial cells //Journal of Cystic Fibrosis. - 2019. - T. 18. - №. 4. - C. 476-483.
168. Villanueva G., Marceniuk G., Murphy M. S. et al. Diagnosis and management of
cystic fibrosis: summary of NICE guidance // BMJ. 2017. T. 359. C. j4574.
169. Wainwright C. E., Elborn J. S., Ramse B. W. et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients
with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR // N Engl J Med. 2015. T. 373. № 3. C. 220-231.
170. Ngan S. Y., Quach, H. T., Laselva, O. et al. Stage-Specific Generation of Human
Pluripotent Stem Cell Derived Lung Models to Measure CFTR Function // Current Protocols. 2022. T. 2. №. 1. C. e341.
171. Wong A. P., Bear C. E., Chin S. et al. Directed differentiation of human pluripotent
stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein // Nat Biotechnol. 2012. T. 30. № 9. C. 876-882.
172. Yamamoto Y., Gotoh S., Korogi Y. et al. Long-term expansion of alveolar stem cells
derived from human iPS cells in organoids // Nat Methods. 2017. T. 14. № 11. C. 1097-1106.
173. Yu F., Liu F., Liang X. et al. iPSC-Derived Airway Epithelial Cells: Progress, Promise, and Challenges // Stem Cells. 2023. T. 41. № 1. C. 1-10.
174. Yu H., Burton B., Huang C-J. et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels
with gating mutations // J Cyst Fibros. 2012. T. 11. № 3. C. 237-245.
175. Yu X. et al. Foxj 1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic
program // Nature genetics. - 2008. - T. 40. - №. 12. - C. 1445-1453.
176. Zomer-van Ommen D. D., Poel E. de, Kruisselbrink E. et al. Comparison of ex vivo
and in vitro intestinal cystic fibrosis models to measure CFTR-dependent ion channel activity // J Cyst Fibros. 2018. T. 17. № 3. C. 316-324.
177. CFTR1 Database. Cystic Fibrosis Mutation Database. http://www.genet.sickkids.on.ca/Home.html. (accessed Nov 09th, 2019).
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.