Изучение взаимодействия белков, участвующих в инициации транскрипции РНК-полимеразой II у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Лебедева, Любовь Александровна

• Лебедева, Любовь Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лебедева, Любовь Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Аппарат транскрипции у эукариот.

1. Промоторы генов класса II.

TATA-БОКС.

ИНИЦИАТОР.

2. РНК-полимераза II.

3. Транскрипционные факторы.

Щ TFIID.

TFIIB.

TFIIF.

TFIIH.

TFIIE.

TFIIA.

МЕДИАТОР.

4. Представления об инициации транскрипции iv vivo.

II. Хроматин. Модификация хроматина гистонацетилтрансферазами.

1. GNAT суперсемейство.

Hatl, Е1рЗ, Нра2, Nutl.

GCN5 и его гомологи. уНАТ-А2 комплекс.

AD А-комплекс.

SAGA-комплекс.

TFTC.

2. MYST - семейство.

SAS2 и SAS3 (YBF2).

NuA3 -комплекс.

ESA1.

NuA4.

Tip60.

MOZhMORF.

HBOl.,.

3. P300/CBP семейство.

4. Основные факторы транскрипции , обладающие HAT активностью.

TAF 1.

5. Гистонацетилтрансферазы, родственные гормонам.

SRC1.

ACTR (SRC3).

III. Гены теплового шока как модельная система.

1. Строение промотора.

2. Факторы теплового шока.

3.Транскрипция генов теплового шока на примере гена hsp70.

4. Реинициация транскрипции.

5. Гранулы теплового шока.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. Объект и задачи исследования.

II. Материалы и методы.

1. Реактивы.

Щ 2. Антитела.

3. Работа с дрозофилами.

4. Выделение геномной ДНК.

5. ПЦР в реальном времени.

6. Хроматин-иммунопреципитация (X-ChIP).

7. Выделение РНК и Нозерн-блот анализ.

8. Иммунопреципитация.

9. Хроматографическая очистка и Вестерн блот анализ.

10. Иммуноокрашивание политенных хромосом.

III. Результаты.

1. Анализ экспрессии генов ada2a и ada2b у D. melanogaster.

Нозерн-блот анализ полиА-РНК на разных стадиях развития дрозофилы.

Вестерн-блот анализ.

2. Анализ комплексов, в состав которых входят dADA2a и dADA2b.

Имунопреципитация.

Хроматографическая очистка.

Иммуноокрашивание политенных хромосом.

3. Исследование участия общих транскрипционных факторов и GCN5-HAT содержащих комплексов в активации транскрипции на модели гена hsp70 in vivo.

Иммуноокрашивание политенных хромосом D. melanogaster дикого типа.

Иммуноокрашивание политенных хромосом трансгенной линии D. melanogaster.

Хроматин-иммунопреципитация.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение взаимодействия белков, участвующих в инициации транскрипции РНК-полимеразой II у Drosophila melanogaster»

Активация транскрипции у эукариот - многоступенчатый процесс со сложной координированной регуляцией. Для обеспечения доступности специфических геномных локусов для РНК полимеразы II (RNAPII) в контексте хроматина необходимо взаимодействие основных факторов транскрипции, геноспецифических активаторов и различных кофакторов транскрипции.

Изучение механизма взаимодействия основных компонентов транскрипционного аппарата в процессе экспрессии того или иного геномного локуса является одной из наиболее интересных областей современных исследований в области регуляции транскрипции. В настоящее время установлено, что для инициации транскрипции необходимы так называемые общие факторы транскрипции - комплексы, обладающие постоянным белковым составом и участвующие в транскрипции основной части генов. В частности, в области промотора собирается большой преинициаторный комплекс, в свою очередь состоящий из нескольких мультибелковых комплексов, основным из которых является комплекс TFIID, содержащий в своем составе белок ТВР и ассоциированные с ним белки TAF (ТВР associated factors). Кроме TFIID в состав преинициаторного комплекса входят: белок TFIIB, необходимый для фиксации TFIID на старте транскрипции; комплекс TFIIF, обеспечивающий вхождение RNAPII в преинициаторный комплекс; комплекс TFIIH, обладающий АТФ-азной активностью и гиперфосфорилирующий CTD RNAPII при переходе ее от инициации к элонгации; комплексы TFIIE и TFIIA, стимулирующие сборку преинициаторного комплекса, а также комплекс Медиатор, необходимый для активированной транскрипции.

В активации транскрипции на хроматиновой матрице не менее важную роль играют комплексы, участвующие в посттрансляционной модификации гистонов. Одна из наиболее хорошо изученных модификаций - ацетилирование высококонсервативных N-концов гистонов гистоацетилтрансферазами (HAT). Ацетилирование изменяет высокоорганизованные фибриллы хроматина и таким образом увеличивает афинность транскрипционных факторов к ДНК. Многочисленные исследования выявили прямую связь между ацетилированием гистонов и активацией транскрипции. Таким образом, исследование белков и комплексов, обладающих HAT активностью, имеет большое значения для понимания процессов, проходящих при активации транскрипции у эукариот. Одним из наиболее хорошо изученных комплексов, является SAGA комплекс дрожжей, содержащий в своем составе GCN5 гистонацетилтрансферазу (GCN5 HAT), Ada белки, Spt белки, а также некоторые из белков TAF, которые, как было указано выше, одновременно являются компонентами основного преинициаторного комплекса TFIID. Гомологи GCN5 HAT были найдены у дрозофилы и человека. Комплекс, содержащий GCN5 HAT (TFTC) был охарактеризован у человека, однако у дрозофилы, аналогичный комплекс обнаружен не был.

Настоящая работа посвящена исследованию HAT комплекса Drosophila melanogaster и изучению взаимодействия общих факторов транскрипции РНК- полимеразы II, в активации экспрессии локуса Hsp70.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Аппарат транскрипции у эукариот.

У эукариот существует три разные системы транскрипции (кроме систем транскрипции хлоропластов и митохондрий):

- гены класса I кодируют 5,8S-, 18S- и 28S - рибосомальные РНК и транскрибируются РНК-полимеразой I.

- гены класса II кодируют все матричные РНК и ряд малых ядерных РНК и транскрибируются РНК-полимеразой II.

- гены класса III кодируют тРНК, 5S-pPHK и некоторые малые цитоплазматические РНК и транскрибируются РНК-полимезой III.

В данном обзоре рассматривается система транскрипции генов класса II и процесс ее инициации в частности.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Лебедева, Любовь Александровна

выводы.

1. Гомологичные гены ada2a и ada2b Drosophila melanogaster экспрессируются на всех стадиях развития и кодируют белки, которые отличаются по своим функциям и входят в состав GCN5 НАТ-содержащего комплекса.

2. Впервые обнаружено несколько GCN5 НАТ-содержащих комплексов у D.melanogaster, которые отличаются по своему белковому составу и могут участвовать в регуляции экспрессии различных геномных локусов.

3. При воздействии теплового шока общие транскрипционные факторы TFIID, TFIIF и TFIIB не обнаружены на промоторе при реинициации транскрипции.

4. В транскрипции генов теплового шока участвуют общие транскрипционные факторы TFIIH и Медиатор, а так же специфический HAT- комплекс, содержащий белки GCN5 и TRRAP, но не содержащий белков TAF и Ada2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лебедева, Любовь Александровна, 2005 год

1. Adelman, К., Marr, М.Т., Werner, J., Saunders, A., Ni, Z., Andrulis, E.D., Lis, J.T. (2005) Efficient release from promoter-proximal stall sites requires transcript cleavage factor TFIIS. Mol Cell 17,103-12

2. Ahn, S.G., Thiele, D.J. (2003) Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress. Genes Dev 17, 51628

3. Angus-Hill, M.L., Dutnall, R.N., Tafrov, S.T., Sternglanz, R., Ramakrishnan, V. (1999) Crystal structure of the histone acetyltransferase Hpa2: A tetrameric member of the Gcn5-related N-acetyltransferase superfamily. J Mol Biol 294,1311-25

4. Balasubramanian, R., Pray-Grant, M.G., Selleck, W., Grant, P.A., Tan, S. (2002) Role of the Ada2 and Ada3 transcriptional coactivators in histone acetylation . J Biol Chem 277, 7989-95

5. Barlev, N.A., Poltoratsky, V., Owen-Hughes, Т., Ying, C., Liu, L., Workman, J.L., Berger, S.L. (1998) Repression of GCN5 histone acetyltransferase activity viaл'

6. Bell, В., Тога, L. (1999) Regulation of gene expression by multiple forms of TFIID andother novel TAFII-containing complexes. Exp Cell Res 246,11-9

7. Bhaumik, S.R., Green, M.R. (2002) Differential requirement of SAGA components forrecruitment of TATA-box-binding protein to promoters in vivo. Mol Cell Biol 22, 7365-71

8. Bhaumik, S.R., Green, M.R. (2002) Differential requirement of SAGA components forrecruitment of TATA-box-binding protein to promoters in vivo. Mol Cell Biol 22, 7365-71

9. Biswas, D., Imbalzano, A.N., Eriksson, P., Yu, Y., Stillman, D.J. (2004) Role for Nhp6,

10. Gcn5, and the Swi/Snf complex in stimulating formation of the TATA-binding protein-TFILA-DNA complex. Mol Cell Biol 24, 8312-21

11. Boehm, A.K., Saunders, A., Werner, J., Lis, J.T. (2003) Transcription factor andpolymerase recruitment, modification, and movement on dhsp70 in vivo in the minutes following heat shock. Mol Cell Biol 23,7628-37

12. Boellmann, F., Guettouche, Т., Guo, Y., Fenna, M., Mnayer, L., Voellmy, R. (2004)

13. DAXX interacts with heat shock factor 1 during stress activation and enhances its transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA 101,4100-5

14. Bordoli, L., Netsch, M., Luthi, U., Lutz, W., Eckner, R. (2001) Plant orthologs ofрЗОО/СВР: conservation of a core domain in metazoan p300/CBP acetyltransferase-related proteins. Nucleic Acids Res 29, 589-97

15. Boudreault, A.A., et al (2003) Yeast enhancer of polycomb defines global Esalп

16. Brady, M.E., Ozanne, D.M., Gaughan, L., Waite, I., Cook, S., Neal, D.E., Robson, C.N.1999) Tip60 is a nuclear hormone receptor coactivator. J Biol Chem 274, 17599604

17. Brand, M., Yamamoto, K., Staub, A., Tora, L. (1999) Identification of TATA-bindingprotein-free TAFII-containing complex subunits suggests a role in nucleosome acetylation and signal transduction. J Biol Chem 274, 18285-9

18. Brou, C., Chaudhary, S., Davidson, I., Lutz, Y., Wu, J., Egly, J.M., Tora, L., Chambon,

19. P. (1993) Distinct TFIID complexes mediate the effect of different transcriptional activators. EMBO J12,489-99

20. Brownell, J.E., Zhou, J., Ranalli, Т., Kobayashi, R., Edmondson, D.G., Roth, S.Y., Allis,

21. C.D. (1996) Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homo log to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84, 843-51

22. Burke, T.W., Cook, J.G., Asano, M., Nevins, J.R. (2001) Replication factors MCM2 and

23. ORC1 interact with the histone acetyltransferase HBOl. J Biol Chem 276, 15397-408

24. Cantin, G.T., Stevens, J.L., Berk, A.J. (2003) Activation domain-mediator interactionspromote transcription preinitiation complex assembly on promoter DNA. Proc Natl Acad Sci USA 100, 12003-8

25. Cao, D., Wang, Z., Zhang, C.L., Oh, J., Xing, W., Li, S., Richardson, J.A., Wang, D.Z.,

26. Olson, E.N. (2005) Modulation of smooth muscle gene expression by association of histone acetyltransferases and deacetylases with myocardin. Mol Cell Biol 25, 364-76

27. Carrozza, M.J., Utley, R.T., Workman, J.L., Cote, J. ( 2003) The diverse functions ofhistone acetyltransferase complexes. Trends Genet 19,321-9

28. Champagne, N., Bertos, N.R., Pelletier, N., Wang, A.H., Vezmar, M., Yang, Y., Heng,

29. H.H., Yang, X.J. (1999) Identification of a human histone acetyltransferase related to monocytic leukemia zinc finger protein. J Biol Chem 274,28528-36

30. Chan, H.M., La Thangue, N.B. (2001 ) рЗОО/CBP proteins: HATs for transcriptionalbridges and scaffolds. J Cell Sci 114,2363-73

31. Chen, H.T., Hahn, S. (2004) Mapping the location of TFIIB within the RNA polymerase1. transcription preinitiation complex: a model for the structure of the PIC. Cell 119,169-80

32. Chinenov, Y. (2002) A second catalytic domain in the Elp3 histone acetyltransferases: acandidate for histone demethylase activity? Trends Biochem Sci 27,115-7

33. Chomczynski, P., Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162, 1569

34. Currie, R.A. (1998) NF-Y is associated with the histone acetyltransferases GCN5 and

35. P/CAF. J Biol Chem 273,1430-4

36. Dantonel, J.C., Murthy, K.G., Manley, J.L., Tora, L. ( 1997) Transcription factor TFIIDrecruits factor CPSF for formation of 3' end of mRNA. Nature 389,399-402

37. Davidson, I. (2003) The genetics of TBP and TBP-related factors. Trends Biochem Sci28, 391-8

38. Denegri, M., Moralli, D., Rocchi, M., Biggiogera, M., Raimondi, E., Cobianchi, F., Deл'

39. Carli, L., Riva, S., Biamonti, G. (2002) Human chromosomes 9, 12, and 15 contain the nucleation sites of stress-induced nuclear bodies. Mol Biol Cell 13, 2069-79

40. Deng, W.G., Wu, K.K. (2003) Regulation of inducible nitric oxide synthase expression by p300 and p50 acetylation. J Immunol 171, 6581-8

41. Dilworth, F.J., Seaver, K.J., Fishburn, A.L., Htet, S.L., Tapscott, S.J. (2004) In vitro transcription system delineates the distinct roles of the coactivators pCAF and p300 during MyoD/E47-dependent transactivation. Proc Natl Acad Sci USA 101,11593-8

42. Doyon, Y., Selleck, W., Lane, W.S., Tan, S., Cote, J. (2004) Structural and functional conservation of the NuA4 histone acetyltransferase complex from yeast to humans. Mol Cell Biol 24,1884-96

43. Eberharter, A., Sterner, D.E., Schieltz, D., Hassan, A., Yates, J.R. 3rd, Berger, S.L.,

44. Workman, J.L. (1999) The ADA complex is a distinct histone acetyltransferase complex in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 19, 6621-31

45. Ehrenhofer-Murray, A.E., Rivier, D.H., Rine, J. (1997) The role of Sas2, anacetyltransferase homologue of Saccharomyces cerevisiae, in silencing and ORC ^y function. Genetics 145, 923-34

46. Cote, J. (2001) The yeast NuA4 and Drosophila MSL complexes contain homologous subunits important for transcription regulation. J Biol Chem 276, 3484-91

47. Elsby, L.M., Roberts, S.G. (2004) The role of TFIIB conformation in transcriptional