Оценка эпителио-мезенхимной пластичности миграционной 3Д-клеточной модели немелкоклеточного рака легкого тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Шабалина Евгения Юрьевна

• Шабалина Евгения Юрьевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Шабалина Евгения Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Цели и задачи работы

Методология и методы диссертационного исследования

Теоретическая и практическая значимость

Структура и объём диссертации

Апробация работы и публикации

Положения, выносимые на защиту

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. НМРЛ in vivo

1.2. Роль ЭМП в условиях in vivo

1.3. Метастазирование НМРЛ

1.5. Двумерные (2Д) клеточные модели: применения и ограничения

1.6. Трехмерные (3Д) клеточные модели: отличия и преимущества

1.7. МКОС: методология и специфика морфологии

1.8. Дифференциальная экспрессия в 2Д- и 3Д-клеточных моделях

1.9. Клеточные модели как тест-системы для оценки эффективности лекарственных средств

1.10. Клеточные модели НМРЛ

1.11. Маркеры ЭМП применительно к 3Д-клеточной миграционной модели сфероида

1.12. Капецитабин: принцип действия, сфера использования, перспективы

применения

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.1. Культивирование клеточных линий

2.1.2. Получение 2Д-клеточной модели, постановка миграционного теста ^т^-тест)

2.1.3. Получение 3Д-клеточной модели, постановка миграционного теста для многоклеточного сфероида

2.1.4. Противоопухолевые агенты

2.1.5. Анализ клеточной миграции. Статистика

2.2.1. Выделение тотальной РНК из клеточного материала

2.2.2. Панель по оценке транскриптомного профиля клеток

2.2.3. Статистический анализ данных

2.2.4. Матрица смежности уровней серого (МСУС)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клеточные модели НМРЛ

3.1.1. Оценка миграционной активности клеток в составе 2Д-модели

3.1.2. Оценка скорости миграции клеток из тела 3Д-клеточного сфероида

3.2. Оценка транскриптомного профиля клеток в составе 2Д и 3Д-клеточных моделей

3.3. Оценка миграционной активности клеток в составе 3Д-клеточной модели в присутствии капецитабина

3.4. Матрица смежности уровней серого (МСУС)

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РЛ - рак легких;

НМРЛ - немелкоклеточный рак легких;

ТС - тимидилатсинтаза;

ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход;

МЭП - мезенхимально-эпителиальный переход;

ВКМ - внеклеточный матрикс;

ЦОК - циркулирующие опухолевые клетки;

ОМО - опухолевое микроокружение;

МКОС - многоклеточные опухолевые сфероиды;

МСУС - матрица смежности уровней серого.

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оценка эпителио-мезенхимной пластичности миграционной 3Д-клеточной модели немелкоклеточного рака легкого»

Актуальность темы исследования

Создание и применение in vitro тест-систем раковых опухолей, в частности, персонализированных, является одной из ключевых целей в изучении биологии опухолей и клеточного ответа на применяемую терапию. При решении задачи по моделированию метастатической опухоли in vitro необходимо учитывать и включать в тест-систему такие факторы, как внеклеточный матрикс (ВКМ), воссоздающий трехмерное (in vivo) опухолевое микроокружение (ОКО) и транскриптомный профиль клеток.

Рак легких (РЛ) занимает лидирующие позиции по частоте диагностирования независимо от пола, причем при соответствующем лечении его наиболее распространенная форма, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), завершается ремиссией в удручающих 42% случаев [1]. Пациентам с ранними стадиями солидных опухолей, в частности, РЛ, показана хирургическая операция [2], однако в результате хирургического вмешательства возможна диссеминация раковых клеток, что в свою очередь может послужить началом метастатического процесса [3, 4]. Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) попадают в систему кровообращения, перемещаясь единичными клетками или же образуя клеточные кластеры, что ведет к образованию вторичной опухоли [5]. Кластеры ЦОК обладают большим метастатическим потенциалом предположительно из-за изменений в уровне метилирования ДНК [6, 7]. Кроме того, процессы, сопутствующие высвобождению ЦОК, а именно реструктуризация внеклеточного матрикса (ВКМ) и изменение клетками фенотипа вследствие эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) [8], играют роль как в повышении инвазивного потенциала первичной опухоли, так и ее озлокачествлении. В то же время стоит учитывать, что хотя клетки первичной опухоли подвергаются ЭМП и, приобретя мезенхимальные свойства, более

склонны к миграции [9], после послеоперационной вторичной инвазии тканей ЦОК они могут претерпеть обратный процесс (МЭП). Тем не менее, есть основания предполагать, что хирургическое вмешательство, включая как диссекцию опухолевой ткани, так и взятие биопсии, способствует увеличению ЦОК, в частности, при НМРЛ [10], что в свою очередь повышает риск образования метастатических очагов в тканях-мишенях ЦОК. Так или иначе, опухолевое микроокружение (ОМО) вносит существенный вклад в повышение миграционной активности опухолевых клеток [11].

Хотя механизмы «классического» каскада метастазов хорошо изучены [13], существует пробел в знаниях о механизмах послеоперационной инвазии вторичных тканей ЦОК, поскольку современные знания о ЦОК в клеточной биологии очень ограничены. Поскольку поврежденная ткань может быть более благоприятной для инвазии ЦОК, предотвращение раннего послеоперационного распространения ЦОК имеет особое значение [14], особенно во время терапевтического окна между операцией и последующей химио- или лучевой терапией, поэтому клеточные in vitro модели, учитывающие такие важные свойства ЦОК, как способность к миграции и инвазии, и имитирующие условия in vivo, необходимы как для фундаментальной науки, так и в прикладных отраслях, в частности, в онкологии и клинической медицине, поскольку на их базе возможно создание более персонализированных тест-систем для подбора терапии и проведения скрининга противоопухолевых лекарственных средств [20; 21].

На сегодняшний день существует множество клеточных моделей, имитирующих прикрепление, миграцию и инвазию в ткани раковых клеток [15; 16; 17]. Наиболее физиологически и клинически значимыми моделями являются трехмерные модели клеточных культур, напоминающие архитектуру кластера ЦОК и включающие некоторые элементы микроокружения опухоли [18].

Многоклеточные опухолевые сфероиды (МКОС), по своей сути являющиеся объемными конструктами-скоплениями раковых клеток, являются одной из наиболее перспективных моделей клеточных культур в исследованиях миграции раковых клеток. Есть несколько важных моментов, которые необходимо учитывать при моделировании миграции клеток из кластеров ЦОК. На процесс миграции опухолевых клеток глубокое влияние оказывает тканевое микроокружение, включая внеклеточный матрикс (ВКМ), стромальные клетки и другие компоненты [23]. Большинство традиционных моделей миграции раковых клеток in vitro представляют собой монослойные 2Д-культуры, которые менее физиологически значимы, чем 3Д-культуры [24], поскольку клетки в составе последних синтезируют собственный ВКМ. Предложенная в данной работе методика позволяет оценить миграционную активность клеток, находящихся в составе МКОС, в первые сутки с достаточно большой детализацией, что позволяет обнаружить узкие временные промежутки, имеющие важное значение для протекания ранних этапов миграции. Наконец, оптимизация анализа клеточной реакции в составе модельных систем позволит в дальней перспективе достичь большой масштабируемости в том числе за счет снижения стоимости и временных затрат на проведение тестов.

Таким образом, как за рубежом, так и в отечественном научном сообществе изучение 3Д-клеточных сфероидов является передовым направлением исследований из-за их потенциала как скрининговой системы, так и основного модельного объекта персонализированной медицины, что в свою очередь подтверждает научную новизну текущей работы.

Актуальность исследования трехмерных клеточных сфероидов с точки зрения миграционной активности и ее взаимосвязи с уровнем экспрессии ЭМП-маркеров объясняется стремительным развитием 3Д-клеточных моделей как направления биотехнологии с дальнейшей перспективой использования в персонализированной медицине и определяется потребностью подробной

характеризации 3Д-клеточных моделей перед переходом от постоянных клеточных линий к первичному биологическому материалу.

Степень разработанности темы

Трехмерные клеточные модели, в частности, раковых опухолей являются объектом передовых исследований последнее десятилетие. Они широко используются для сборки моделей различных типов рака in vitro, например, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, легких, поджелудочной железы и предстательной железы [28]. Однако следует отметить, что в связи со значительным усложнением данной клеточной модели по сравнению с классической 2Д, а также с наличием множества факторов, оказывающих влияние на состояние клеток в процессе эксперимента, для более активной разработки ЗД-клеточных моделей и внедрения их в прикладные области науки необходима подробная характеризация ЗД-клеточных сфероидов. Следует отметить, что подбор и комбинация методик, необходимых и достаточных для наиболее исчерпывающей оценки состояния клеток, являются ключевыми задачами клеточной биологии.

ЗД-клеточные модели, являясь передовым направлением исследований в области клеточной биологии, требуют специализированного подхода на этапе пробоподготовки. Для получения ЗД-сфероидов как таковых существует множество методик - метод висячей капли, метод агарозных микромолдов и др. Получаемые на выходе ЗДсфероиды отличаются по размеру, форме, оптической плотности и ряду других параметров, что необходимо учитывать. Внимания заслуживает и тот факт, что существующие протоколы пробоподготовки адаптированы преимущественно для 2Д клеточных культур и больших объемов клеточного материала (порядка миллиона клеток на 1 образец и более).

В диссертации на соискание научной степени доктора наук от 2022 года [29] впервые были всесторонне охарактеризованы сфероиды, полученные из клеточных линий различных типов. В рамках упомянутой диссертации была

упомянута оценка кинетики расползания сфероидов как важный аспект оценки состояния клеток в составе ЗД-клеточной модели, их тканевой специфичности и выявления их динамического поведения. Также была постулирована проблема недостаточного описания ЗД-клеточных моделей (МКОС) из-за разрозненности проводимых исследований и различий в размерах / условиях культивирования, что не позволяет создать полноценный информационный базис для дальнейшего внедрения ЗДклеточных сфероидов в биотехнологию и медицину.

Исследование, изложенное в [29], также подчеркивает приоритетность изучения и характеризации ЗД-клеточных моделей и детального рассмотрения сфероидогенеза. Фокусируясь на выделении и дальнейшем использовании эпителиальных и мезенхимальных первичных клеток человека, автор проводит методом флуоресцентной микроскопии анализ экспрессии маркеров ЭМП, по зависимости которых от времени подтверждается либо ЭМП, либо МЭП. В то же время следует отметить, что в данном исследовании миграция клеток из тела сфероида отслеживалась путем измерения площади сфероида 1 раз в сутки. Подобные широкие временные диапазоны позволяют пронаблюдать пролонгированные эффекты на клеточное поведение, однако для постоянных клеточных линий требуются более узкие временные промежутки.

В диссертационной работе [30] для постоянных клеточных линий аденокарцином яичника человека была определена глубина проникновения низко- и высокомолекулярных терапевтических агентов внутрь сфероида. Автору удалось продемонстрировать, что за 24 часа инкубации DARPin-LoPE (М = 42 кДа) проник на глубину 70 мкм, когда как диаметр сфероида составлял около 300 мкм, т.е. на 1/2 радиуса, когда как при аналогичных условиях доксорубицин (М = 0,5 кДа) пропитал сфероид насквозь. Данная работа поднимает актуальные вопросы концентраций противоопухолевых лекарственных средств внутри опухоли in vivo и ЗД-сфероида in vitro, что является фронтиром исследований и также отражено и в текущей работе. В диссертационной работе [З1],

сосредоточенной на аденокарциномах молочной железы и колоректальной опухоли, подчеркивается необходимость исследования и усовершенствования 3Д-клеточных моделей в целях повышения их эффективности в скрининговых тестах лекарственных средств, а также использования в персонализированной медицине.

Изучение трехмерных опухолевых сфероидов можно вести, отслеживая различные параметры, такие как морфология, топография, размер, клеточная организация, экспрессия белков и генов и гетерогенность прохождения клеточного цикла [32], однако нельзя забывать, что данные параметры могут меняться с течением времени. В частности, транскриптомный профиль клеток в составе клеточной модели (2Д/3Д) не является константой, когда как большая часть описанных выше методов сфокусирована на изучении и описании сфероидов в статическом смысле, не в динамике. Этим можно объяснить частое наблюдение гетерогенного клеточного состава в 3Д-клеточной модели несмотря на использование единственной постоянной клеточной линии, и, как следствие, вариативность получаемых 3Д-клеточных конструктов. Таким образом, необходимо использовать комбинацию различных методик, чтобы отслеживать состояние клеток как в моменте, так и в динамике отслеживаемых процессов, в частности, миграции клеток из тела сфероида.

Предложенная в данной работе комбинация методов, позволяющая описать клеточную модель НМРЛ в качестве 3Д-сфероида как с точки зрения миграционной активности, так и экспрессионного профиля клеток в сравнении с 2Д-клеточной моделью, открывает новые перспективы развития 3Д-клеточных моделей как передовых.

Научная новизна исследования

В данной работе представлены оригинальные решения проблем анализа 3Дклеточных конструктов.

Во-первых, разработан алгоритм отслеживания и оценки миграционной активности клеток в составе 3Д-сфероида. Данная методика представляет собой измерение площади миграции клеток из тела сфероида. Анализ скорости миграции клеток по изменению площади покрытия клетками подложки в зависимости от времени в коротких временных промежутках (24 часа) не был описан ранее.

Во-вторых, разработана панель для оценки транскриптомного профиля клеток в составе клеточной модели. Результаты скрининга позволяют как подтвердить, так и дополнить полученные данные по активности миграции клеток, объяснить их с молекулярно-генетической точки зрения, что определяет принципиальную новизну и научную значимость использования комбинации данных методов. Данный подход к изучению 3Д-клеточных моделей раковых опухолей не имеет аналогов.

В-третьих, разработан подход скринингового анализа миграционного процесса клеток методом текстурного анализа микроизображений. Также определены критерии в рамках разработанного метода для оценки клеточного состояния и поведения в целях оценки эффективности низких концентраций противоопухолевых препаратов.

Цели и задачи работы

В качестве цели диссертационного исследования была определена сравнительная характеристика 2Д/3Д-клеточных моделей НМРЛ с точки зрения миграционной активности и транскриптомного профиля клеток.

Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Оценка миграционной активности клеток линий НМРЛ (Н1299 и А549) в составе 2Д-клеточного монослоя;

2. Оценка миграционной активности клеток линий НМРЛ (Н1299 и А549) в составе 3Д-клеточного сфероида;

3. Оценка миграционной активности клеток линий НМРЛ (Н1299 и А549) в составе ЗД-клеточного сфероида при воздействии действующего вещества -капецитабина;

4. Разработка панели для оценки экспрессии генов-маркеров эпителиально-мезенхимального перехода и др. клетками в составе клеточных моделей различных типов с учетом стадии миграционного процесса и наличия действующего вещества;

5. Определение корреляций между результатами миграционных тестов и транскриптомного анализа;

6. Разработка подхода скринингового анализа миграционного процесса клеток методом текстурного анализа микроизображений.

7. Определение критериев в рамках разработанного метода для оценки клеточного состояния и поведения в целях оценки эффективности низких концентраций противоопухолевых препаратов.

Методология и методы диссертационного исследования

В процессе исследования были использованы известные и оригинальные подходы к получению 2Д- и ЗД-клеточных моделей, оценке миграционной активности клеток и оценке уровня экспрессии маркеров ЭМП клетками в составе 2Д- и ЗД-клеточных моделей.

В исследовании эксперименты проводились с использованием клеточных линий НМРЛ - А549 и Н1299. Монослой считался таковым при достижении 90% конфлюентности. Далее оценка миграционной активности клеток в составе 2Д-клеточного монослоя производилась путем проведения стандартного scrateh-теста. Отслеживание площади, покрываемой мигрирующими клетками, проводилось посредством прижизненной фотофиксации состояния клеточного монослоя в системе клеточного имиджинга Се1епа S.

3Д-клеточные сфероиды были получены согласно методике агарозных микромолдов, основанной на использовании силиконовых форм MicroTissues 3Д Petri Dish (Sigma Aldrich). По готовности сфероиды высаживались на культуральный пластик в присутствии / отсутствии действующих агентов. Миграция клеток из тела сфероида отслеживалась посредством прижизненной фотофиксации состояния клеточного монослоя в системе клеточного имиджинга Celena S.

Анализ полученных изображений в случае scratch-теста производился в ПО Fiji ImageJ согласно опубликованной методике [33]. Что касается оценки миграции клеток из тела сфероида, то в Fiji ImageJ проводился замер площади сфероида и построение зависимости данной площади от времени. Также для ряда экспериментов проводился текстурный анализ изображений путем построения матрицы смежности уровней серого.

Выделение РНК проводилось согласно стандартному протоколу для выделения на микроколонках (RNA Solo, Евроген). Образцы клеток в случае 2Д-моделей брались в количестве, кратном посеву клеток для получения 3Д-клеточных сфероидов. Качество полученного материала отслеживалось методом спектрофотометрии, далее, согласно стандартному протоколу, проводилась qPCR-RT (OneTube qPCR-RT SYBR Green I, Евроген). Была разработана специализированная панель для оценки транскриптомного профиля клеток в составе 2Д/3Д-моделей.

Теоретическая и практическая значимость

В данной работе рассмотрен инновационный подход к исследованию 3Дклеточных моделей раковых опухолей на примере НМРЛ, который может быть востребован при изучении диагностических тест-систем и разработке противоопухолевых лекарственных препаратов. Разработанный подход заключается в оценке миграционной активности клеток в составе МКОС с параллельным анализом транскриптомного профиля клеток для определения

эпителиально-мезенхимального статуса. Полученные результаты позволяют отразить состояние клеток с морфологической, гистологической, динамо-миграционной и молекулярно-генетической точек зрения и провести необходимые корреляции в случае тестирования конкретных препаратов. В перспективе достигнутые результаты можно адаптировать и применить для создания ЗД-клеточных моделей на основе первичных клеточных линий, полученных из биоматериала онкопациентов, и разработки персонализированной диагностической тест-панели.

Необходимо отметить, что многофакторность ЗД-клеточной системы ставит вопросы о роли различных параметров в изменении клеточного ответа. Хотя изучение МКОС является передовым направлением исследований последние десять лет, имеющиеся данные недостаточны. Влияние формы культивирования на ЭМП-статус раковых клеточных линий и корреляции между миграционной активностью и транскриптомом клеток остаются открытыми вопросами ввиду объемности темы. Стандартизированный подход и сочетание предложенных в данной работе методик открывают возможность к всестороннему описанию ЗД-клеточных моделей НМРЛ благодаря мультидисциплинарному подходу.

Ожидаемое практическое применение ЗД-клеточных моделей и методического подхода к их изучению / описанию также связано с фундаментальными исследованиями. Применение ЗД-МКОС как диагностических тест-моделей является перспективным направлением развития данной технологии, однако этому должны предшествовать более точная характеризация ЗД-клеточных моделей раковых опухолей и выделение конкретных корреляций, свойственных для определенных условий культивирования, экспрессии генов и миграционных характеристик.

Предложенный метод оценки средней скорости миграции клеток из тела МКОС можно сочетать не только с предложенным в данной работе qPCR-RT, но

и другими методиками изучения МКОС на стандартном лабораторном оборудовании, что определяет практическую ценность изложенной работы.

Дополнительно следует отметить, что предложенный подход скринингового анализа миграционного процесса клеток методом текстурного анализа микроизображений позволяет оценить состояние клеток в составе ЗД-клеточной модели, определить не-нормотипичное клеточное поведение для более детального анализа, а также описать исследуемый объект как с цитологической, так и математической точек зрения.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из 109 страниц машинописного текста и включает в себя список сокращений и введение. В главе 1 представлен литературный обзор. Глава 2 представляет собой описание методологии проведенной работы. Глава З содержит в себе результаты проведенного исследования и их обсуждение с опорой на литературные источники, а также раздел с выводами и заключение. Работа содержит 4 таблицы и 21 иллюстрацию. Список цитируемой литературы включает в себя 130 источников.

Апробация работы и публикации

Достоверность результатов основана на использовании общепризнанных методологий с применением высокоточного оборудования. Реализованные в рамках данного исследования эксперименты являются воспроизводимыми, для каждой серии экспериментов набрано необходимое количество повторов, для анализа результатов были использованы статистические методы, определены погрешности определения значений параметров интереса.

Работа была апробирована в лаборатории биохимических исследований канцерогенеза федерального государственного автономного образовательного

учреждения высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)».

Результаты работы были доложены и опубликованы на 3-х российских и международных конференциях:

1. YU Skorova, E., Shabalina, E., Chudakova, D., Anikin, V., Reshetov, I., Mynbaev, O., & Petersen, E. (2020, November). Differential Response to the High Doses of Dimethyl Sulfoxide of the Several Human Cancer Cell Lines Cultured in 2Д Monolayer, Decellularized Matrix, and 3 Д Spheroid cell Culture Systems. In 2020 7th International Conference on Biomedical and Bioinformatics Engineering (pp. 165-170)

2. Е.В. Петерсен, Е.Ю. Шабалина, Д.А. Чудакова, А.А. Ширяев, П.А. Каралкин, И.В. Решетов ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВКМ ДЛЯ ПЕРСОНИФИКАЦИИ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ПОДБОРА ЛЕЧЕНИЯ ОНКОПАЦИЕНТОВ, XXVI Российский онкологический конгресс, 15-17 ноября 2022, Москва

3. Е. Ю. Шабалина, Е. Ю. Скорова, Е. С. Анчакова, Е. В. Петерсен. Оценка внеклеточного матрикса как регуляторного маркера поведения клеток в модели ЗД-сфероидов, Материалы VI Всероссийской конференции по молекулярной онкологии. Успехи молекулярной онкологии. 2021;8(4):5-163. https://doi.org/10.17650/2313-805X-2021-8-4-5-163

4. Е. С. Анчакова, Е. В. Петерсен, Е. Ю. Скорова, Е. Ю. Шабалина. Усиление мезенхимально-эпителиального перехода посредством чередования 2Д- и 3Д-культивирования, Материалы VI Всероссийской конференции по молекулярной онкологии. Успехи молекулярной онкологии. 2021;8(4):5-163. https://doi.org/10.17650/2313-805X-2021-8-4-5-163

По материалам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых изданиях:

1. Shabalina E. Y., Skorova, E. Y., Chudakova, D. A., Anikin, V. B., Reshetov, I. V., Mynbaev, O. A., & Petersen, E. V. The matrix-dependent 3D spheroid model of the migration of non-small cell lung cancer: a step towards a rapid automated screening // Frontiers in Molecular Biosciences. - 2021. - V. 8.

- P. 610407. doi:10.3389/fmolb.2021.610407

2. E.Petersen, D.Chudakova, E.Shabalina, A.Shiryaev, N.Sukortseva, G.Zhemerikin, P.Karalkin & I.Reshetov Biobanks as an important tool in modern translational oncology // Biological Communications . - 2022. - №267(4). - C. 301311.

3. Petersen E.V., Chudakova D.A., Erdyneeva D.B., Zorigt D., Shabalina E.Y., Karalkin P.A., Reshetov I.V. Cancer as a potential sequela of COVID-19

— should we modify 3D cell culture models 1 accordingly? // Biological Communications . - 2023. - №68(3). - C. 190-198.

4. Petersen E.V., Chudakova D.A., Shiryaev A.A., Khrushchova A.M., Shabalina E.Y., Shaker A.A.S., Chernov T.A., Karalkin P.A., Reshetov I.V. Perspectives and directions of biobanking in case of rare types of cancer // Head and Neck . - 2022. - №10(4)

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный метод оценки средней скорости миграции клеток из тела сфероида, позволяющий определить эффект низких концентраций противоопухолевых препаратов на состояние клеток в условиях in vitro ЗД-модели НМРЛ.

2. Разработанный подход можно использовать в качестве скрининговой оценки эффективности противоопухолевых препаратов, поскольку оценка особенностей морфологических и миграционных характеристик соответствует изменению экспрессии ЭМП-маркеров.

3. Разработанная тест-панель, включающая в себя прогнозные маркеры Е- и N-кадгерин, виментин и SNAIL, а также морфологическая оценка миграции клеток из ЗД-сфероида, может использоваться в качестве скрининговой тест-системы.

4. Для разработанной ЗД-клеточной модели НМРЛ уровень экспрессии тенасцина-С не соответствует миграционным и прогнозным изменениям, что на основе отсутствия корреляций не позволяет использовать тенасцин-С в качестве маркера.

5. Разработан подход скринингового анализа миграционного процесса клеток методом текстурного анализа микроизображений.

Личный вклад соискателя

Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены автором лично.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. НМРЛ in vivo

Рак легких (РЛ) занимает лидирующие позиции по частоте постановки подобного диагноза как среди мужчин, так и среди женщин. Летальность данного диагноза при этом составляет 58%. Разумеется, исход во многом зависит от стадии ракового заболевания, однако тем не менее РЛ можно с полной уверенностью считать социально значимым заболеванием.

Наиболее часто встречающейся формой РЛ является немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Как и вторая, менее распространенная форма мелкоклеточного РЛ (МРЛ), природа опухолевой ткани - эпителиальная, однако гистологически, т.е. при рассмотрении происхождения эпителиальных клеток, свойственных обоим подтипам, подтипы значительно отличаются друг от друга. МРЛ имеет смешанное либо явно выраженное нейроэндокринное происхождение, что в том числе является основанием для выбора одной из маркерных диагностических молекул, а именно адренокортикотропный гормон

(АКТГ).

НМРЛ с точки зрения гистологии более схож со здоровыми тканями-выстилками дыхательной системы человека. Наиболее часто встречающаяся его форма, аденокарцинома, относится к железистому эпителию, который, как известно, входит в слизистую оболочку верхних дыхательных путей человека вместе с покровным эпителием, от которого берет начало непосредственно плоскоклеточный рак, форма НМРЛ, занимающая второе место по частоте выявления. Также следует упомянуть о существовании третьего подтипа НМРЛ, а именно о крупноклеточном раке, так же известном как недифференцированная карцинома, однако учитывая, что на его долю приходится лишь 10-15% случаев диагностирования НМРЛ, данное диссертационное исследование фокусируется на аденокарциномах НМРЛ.

По сравнению с МРЛ, аденокарцинома НМРЛ локализуется в периферических отделах легких и проистекает в большинстве случаев без ярко

выраженной симптоматики вплоть до тяжелых стадий заболевания. В частности, с этим связана социальная опасность НМРЛ. Наиболее благоприятный исход лечения связывают с ранним обращением и диагностики опухоли на ранних стадиях, что возможно при качественной профилактической диспансеризации и осмотре, когда как жалобы возникают при значительном осложнении состояния организма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шабалина Евгения Юрьевна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Clark SB, Alsubait S. Non-Small Cell Lung Cancer. 2023 Sep 4. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2024 Jan-. PMID: 32965978.

2. Deboever N, Mitchell KG, Feldman HA, Cascone T, Sepesi B. Current Surgical Indications for Non-Small-Cell Lung Cancer. Cancers (Basel). 2022 Feb 28;14(5):1263. doi: 10.3390/cancers14051263. PMID: 35267572; PMCID: PMC8909782.

3. Tohme S, Simmons RL, Tsung A. Surgery for Cancer: A Trigger for Metastases. Cancer Res. 2017 Apr 1;77(7):1548-1552. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-16-1536. Epub 2017 Mar 22. PMID: 28330928; PMCID: PMC5380551.

4. Fares, J., Fares, M.Y., Khachfe, H.H. et al. Molecular principles of metastasis: a hallmark of cancer revisited. Sig Transduct Target Ther 5, 28 (2020). https://doi.org/10.1038/s41392-020-0134-x

5. Eslami-S Z., Cortes-Hernandez L. E., Alix-Panabieres C. Circulating tumor cells: moving forward into clinical applications //Precision Cancer Medicine. - 2020. - T. 3.

6. Micalizzi DS, Maheswaran S, Haber DA. A conduit to metastasis: circulating tumor cell biology. Genes Dev. 2017 Sep 15;31(18):1827-1840. doi: 10.1101/gad.305805.117. PMID: 29051388; PMCID: PMC5695084.

7. Gkountela S, Castro-Giner F, Szczerba BM, Vetter M, Landin J, Scherrer R, Krol I, Scheidmann MC, Beisel C, Stirnimann CU, Kurzeder C, HeinzelmannSchwarz V, Rochlitz C, Weber WP, Aceto N. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 2019 Jan 10;176(1-2):98-112.e14. doi: 10.1016/j.cell.2018.11.046. PMID: 30633912; PMCID: PMC6363966.

8. Ribatti D., Tamma R., Annese T. Epithelial-mesenchymal transition in cancer: a historical overview //Translational oncology. - 2020. - T. 13. - №. 6. - C. 100773.

9. Genna A, Vanwynsberghe AM, Villard AV, Pottier C, Ancel J, Polette M, Gilles C. EMT-Associated Heterogeneity in Circulating Tumor Cells: Sticky Friends on the Road to Metastasis. Cancers (Basel). 2020 Jun 19;12(6):1632. doi: 10.3390/cancers12061632. PMID: 32575608; PMCID: PMC7352430.

10.Li, S., Yan, W., Yang, X. et al. Less micrometastatic risk related to circulating tumor cells after endoscopic breast cancer surgery compared to open surgery. BMC Cancer 19, 1070 (2019). https://doi.org/10.1186/s12885-019-6158-3

11.Gay L. J., Malanchi I. The sleeping ugly: tumour microenvironment's act to make or break the spell of dormancy //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Cancer. - 2017. - Т. 1868. - №. 1. - С. 231-238.

12.Barr J, Chudasama D, Rice A, Karteris E, Anikin V. Lack of association between Screencell-detected circulating tumour cells and long-term survival of patients undergoing surgery for non-small cell lung cancer: A pilot clinical study. Mol Clin Oncol. 2020 Mar;12(3):191-195. doi: 10.3892/mco.2020.1981. Epub 2020 Jan 21. PMID: 32064093; PMCID: PMC7016525.

13.Mathias T. J. et al. Gauging the impact of cancer treatment modalities on circulating tumor cells (CTCs) //Cancers. - 2020. - Т. 12. - №. 3. - С. 743.

14.Алиева Т. Р. Определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов, уровней иммуноглобулинов классов E и G и гистамина в крови и лимфе при анафилактическом шоке и феномене Артюса в эксперименте //Казанский медицинский журнал. - 2018. - Т. 99. - №. 1. - С. 59-63.

15.Simeone, P., Weerasinghe, H. N., Burrage, P. M., Burrage, K., and Nicolau, D. V. (2019). Mathematical models of cancer cell plasticity. J. Oncol. 2019, 16878450. doi:10.1155/2019/2403483

16.Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., and Prakash, J. (2020). 3D in vitro model (R)evolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends Cancer 7, 249-264. doi:10.1016/j.trecan.2020.10.009

17. Caleb, J., and Yong, Т. (2020). Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture? Front. Mol. Biosci. 7, 33. doi:10.3389/fmolb.2020.00033

18.Zhang, Z., Shiratsuchi, H., Lin, J., Chen, G., Reddy, R. M., Azizi, E., et al. (2014). Expansion of CTCs from early stage lung cancer patients using a microfluidic co-culture model. Oncotarget 5 (23), 12383-12397. doi:10.18632/oncotarget.2592

19.Fong, E. L. S., Toh, T. B., Yu, H., and Chow, E. K.-H. (2017). 3D culture as a clinically relevant model for personalized medicine. SLAS Tech.: Translating Life Sci. Innovation 22, 245-253. doi:10.1177/2472630317697251

20.Abolhassani H, Zaer M, Shojaosadati SA, Hashemi-Najafabadi S. Rapid generation of homogenous tumor spheroid microtissues in a scaffold-free platform for high-throughput screening of a novel combination nanomedicine. PLoS One. 2023 Feb 17;18(2):e0282064. doi: 10.1371/journal.pone.0282064. PMID: 36800370; PMCID: PMC9937506

21.Popper, H. (2020). Primary tumor and metastasis-sectioning the different steps of the metastatic cascade. Transl. Lung Cancer Res. 9 (5), 2277-2300. doi:10.21037/tlcr-20-175

22.Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K.J. et al. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun 11, 5120 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-18794-x

23.Jensen C., Teng Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture? //Frontiers in molecular biosciences. - 2020. - Т. 7. - С. 33.

24.Miyazaki, K., Oyanagi, J., Hoshino, D., Togo, S., Kumagai, H., and Miyagi, Y. (2019). Cancer cell migration on elongate protrusions of fibroblasts in collagen matrix. Sci. Rep. 9, 292. doi:10.1038/s41598-018-36646-z

25.Kumari, N., Bhargava, A., and Rath, S. N. (2020). T-type calcium channel antagonist, TTA-A2 exhibits anti-cancer properties in 3D spheroids of A549, a lung adenocarcinoma cell line. Life Sci. 260, 118291. doi:10.1016/j.lfs.2020.118291

26. Сфероиды как универсальная исследовательская платформа, Докторская диссертация по специальности 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология (биол. науки), Автор: Кудан Елизавета Валерьевна, д.б.н., 2022

27.Nayak, P.; Bentivoglio, V.; Varani, M.; Signore, A. Three-Dimensional In Vitro Tumor Spheroid Models for Evaluation of Anticancer Therapy: Recent Updates. Cancers 2023, 15, 4846. https://doi.org/10.3390/cancers15194846

28. Сравнительное исследование эпителио-мезенхимной пластичности соматических клеток человека в условиях 3D культивирования, диссер., Зурина И.М., 2018

29. Роль межклеточных контактов в формировании резистентности опухолевых сфероидов к терапевтическим воздействиям, диссер., Кутова О.М. (2022)

30. Биохимические и генетические особенности сферообразования опухолевых клеток под влиянием индуцированных цитохалазином B мембранных везикул, диссерт., Гилазиева З.В. (2023)

31.Manduca N, Maccafeo E, De Maria R, Sistigu A, Musella M. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 2023 Apr 11;14:1175503. doi: 10.3389/fimmu.2023.1175503. PMID: 37114038; PMCID: PMC10126361.

32.Suarez-Arnedo A, Torres Figueroa F, Clavijo C, Arbelaez P, Cruz JC, Munoz-Camargo C. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 2020 Jul 28;15(7):e0232565. doi: 10.1371/journal.pone.0232565. PMID: 32722676; PMCID: PMC7386569.

33.Bedard P, Gauvin S, Ferland K, Caneparo C, Pellerin E, Chabaud S, Bolduc S. Innovative Human Three-Dimensional Tissue-Engineered Models as an Alternative to Animal Testing. Bioengineering (Basel). 2020 Sep 17;7(3):115. doi: 10.3390/bioengineering7030115. PMID: 32957528; PMCID: PMC7552665.

34.Singh N. et al. Drug discovery and development: introduction to the general public and patient groups //Frontiers in Drug Discovery. - 2023. - Т. 3. - С. 1201419.

35.Vernetti LA, Vogt A, Gough A, Taylor DL. Evolution of Experimental Models of the Liver to Predict Human Drug Hepatotoxicity and Efficacy. Clin Liver Dis.

2017 Feb;21(1):197-214. doi: 10.1016/j.cld.2016.08.013. PMID: 27842772; PMCID: PMC6325638.

36.Duval K, Grover H, Han LH, Mou Y, Pegoraro AF, Fredberg J, Chen Z. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology (Bethesda). 2017 Jul;32(4):266-277. doi: 10.1152/physiol.00036.2016. PMID: 28615311; PMCID: PMC5545611.

37.Joseph J. S., Malindisa S. T., Ntwasa M. Two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell culturing in drug discovery //Cell Culture. - 2018. - T. 2. - C.1-22.

38.Popova A. A. et al. Simple assessment of viability in 2D and 3D cell microarrays using single step digital imaging //SLAS technology. - 2022. - T. 27. - №. 1. -C. 44-53.

39.Abuwatfa, W.H., Pitt, W.G. & Husseini, G.A. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. J Biomed Sci 31, 7 (2024). https://doi.org/10.1186/s12929-024-00994-y

40.Kenny PA, Lee GY, Myers CA, et al. : The morphologies of breast cancer cell lines in threedimensional assays correlate with their profiles of gene expression

41.Luca AC, Mersch S, Deenen R, et al. : Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One 2013;8:e59689

42.Gilazieva Z. et al. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine //Cancers. - 2020. - T. 12. - №. 10. - C. 2727

43.Chaicharoenaudomrung N, Kunhorm P, Noisa P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 2019 Dec 26;11(12):1065-1083. doi: 10.4252/wjsc.v11.i12.1065. PMID: 31875869; PMCID: PMC6904866

44.Gaebler M. et al. Three-dimensional patient-derived in vitro sarcoma models: promising tools for improving clinical tumor management //Frontiers in Oncology. - 2017. - T. 7. - C. 203.

45.Amaral RLF, Miranda M, Marcato PD, Swiech K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Front Physiol. (2017) 8:605. doi: 10.3389/fphys.2017.00605

46.Hurrell T, Ellero AA, Masso ZF, Cromarty AD. Characterization and reproducibility of HepG2 hanging drop spheroids toxicology in vitro. Toxicol In Vitro. (2018) 50:86-94. doi: 10.1016/j.tiv.2018.02.013

47.Bresciani G, Hofland LJ, Dogan F, Giamas G, Gagliano T, Zatelli MC. Evaluation of Spheroid 3D Culture Methods to Study a Pancreatic Neuroendocrine Neoplasm Cell Line. Front Endocrinol (Lausanne). 2019 Oct 4;10:682. doi: 10.3389/fendo.2019.00682. PMID: 31636608; PMCID: PMC6787167.

48.Fontoura J. C. et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance //Materials Science and Engineering: C. -2020. - T. 107. - C. 110264.

49.Poornima K, Francis AP, Hoda M, Eladl MA, Subramanian S, Veeraraghavan VP, El-Sherbiny M, Asseri SM, Hussamuldin ABA, Surapaneni KM, Mony U, Rajagopalan R. Implications of Three-Dimensional Cell Culture in Cancer Therapeutic Research. Front Oncol. 2022 May 12;12:891673. doi: 10.3389/fonc.2022.891673. PMID: 35646714; PMCID: PMC9133474

50.Birgersdotter A, Sandberg R, Ernberg I: Gene expression perturbation in vitro— a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Semin Cancer Biol 2005;15:405-412

51.Zhao, Y., Shen, M., Wu, L. et al. Stromal cells in the tumor microenvironment: accomplices of tumor progression?. Cell Death Dis 14, 587 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06110-6

52.Dzi$gelewska Z., Gajewska M. Stromal-epithelial interactions during mammary gland development //Stromal Cells-Structure, Function, and Therapeutic Implications. - 2019.

53.Wouters O. J., McKee M., Luyten J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018 //Jama. - 2020. - T. 323. - №. 9. - C. 844-853.

54.Muguruma M. et al. Differences in drug sensitivity between two-dimensional and three-dimensional culture systems in triple-negative breast cancer cell lines //Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2020. - T. 533. -№. 3. - C. 268-274.

55.Dunn E, Chitcholtan K, Sykes P, Garrill A. The Anti-Proliferative Effect of PI3K/mTOR and ERK Inhibition in Monolayer and Three-Dimensional Ovarian Cancer Cell Models. Cancers (Basel). 2022 Jan 13;14(2):395. doi: 10.3390/cancers14020395. PMID: 35053555; PMCID: PMC8773481.

56.Nikdouz A, Orso F. Emerging roles of 3D-culture systems in tackling tumor drug resistance. Cancer Drug Resist. 2023 Nov 21;6(4):788-804. doi: 10.20517/cdr.2023.93. PMID: 38263982; PMCID: PMC10804388.

57.Fang Y, Eglen RM. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 2017 Jun;22(5):456-472. doi: 10.1177/1087057117696795. Erratum in: SLAS Discov. 2021 Oct;26(9):NP1. PMID: 28520521; PMCID: PMC5448717.

58.Gurski LA, Jha AK, Zhang C, Jia X, Farach-Carson MC: Hyaluronic acid-based hydrogels as 3D matrices for in vitro evaluation of chemotherapeutic drugs using poorly adherent prostate cancer cells. Biomaterials 2009;30:6076-6085

59.Rozenberg JM, Filkov GI, Trofimenko AV, Karpulevich EA, Parshin VD, Royuk VV, Sekacheva MI, Durymanov MO. Biomedical Applications of Non-Small Cell Lung Cancer Spheroids. Front Oncol. 2021 Dec 7;11:791069. doi: 10.3389/fonc.2021.791069. PMID: 34950592; PMCID: PMC8688758

60.Tchoryk A. et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids //Bioconjugate chemistry. - 2019. - T. 30. - №. 5. - C. 1371-1384.

61.Tian L, Pei R, Zhong L, Ji Y, Zhou D, Zhou S. Enhanced targeting of 3D pancreatic cancer spheroids by aptamer-conjugated polymeric micelles with deep

tumor penetration. Eur J Pharmacol. 2021 Mar 5;894:173814. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173814. Epub 2020 Dec 19. PMID: 33352182

62.Rovere M, Reverberi D, Arnaldi P, Palama MEF, Gentili C. Spheroid size influences cellular senescence and angiogenic potential of mesenchymal stromal cell-derived soluble factors and extracellular vesicles. Front Bioeng Biotechnol. 2023 Dec 12;11:1297644. doi: 10.3389/fbioe.2023.1297644. PMID: 38162179; PMCID: PMC10756914

63.Tung Y-C, Hsiao AY, Allen SG, Torisawa Y-s, Ho M, Takayama S: High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst 2011;136:473-478

64.Chitcholtan K, Asselin E, Parent S, Sykes PH, Evans JJ: Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exper Cell Res 2013;319:75-87

65.Swietach P, Hulikova A, Patiar S, Vaughan-Jones RD, Harris AL: Importance of intracellular pH in determining the uptake and efficacy of the weakly basic chemotherapeutic drug, doxorubicin. PLoS 0ne2012;7:e35949

66.Nam J-M, Onodera Y, Bissell MJ, Park CC: Breast cancer cells in three-dimensional culture display an enhanced radioresponse after coordinate targeting of integrin a5pi and fibronectin. Cancer Res2010;70:5238-5248

67.Osuna de la Pena, D., Trabulo, S.M.D., Collin, E. et al. Bioengineered 3D models of human pancreatic cancer recapitulate in vivo tumour biology. Nat Commun 12, 5623 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25921-9

68.Huo KG, D'Arcangelo E, Tsao MS. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Transl Lung Cancer Res. 2020 0ct;9(5):2214-2232. doi: 10.21037/tlcr-20-154. PMID: 33209645; PMCID: PMC7653147.

69.Hirano T, Yasuda H, Tani T, et al. In vitro modeling to determine mutation specificity of EGFR tyrosine kinase inhibitors against clinically relevant EGFR mutants in non-small-cell lung cancer. Oncotarget 2015;6:38789-803. 10.18632/oncotarget.5887

70.Yang JC, Ahn MJ, Kim DW, et al. Osimertinib in Pretreated T790M-Positive Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer: AURA Study Phase II Extension Component. J Clin Oncol 2017;35:1288-96. 10.1200/Jœ.2016.70.3223

71. Shahzadi C, Di Serafino A, Aruffo E, Mascitelli A, Di Carlo P. A549 as an In Vitro Model to Evaluate the Impact of Microplastics in the Air. Biology (Basel). 2023 Sep 15;12(9): 1243. doi: 10.3390/biology12091243. PMID: 37759642; PMCID: PMC10525880.

72.Hadifar S, Mostafaei S, Behrouzi A, Fateh A, Riahi P, Siadat SD, Vaziri F. Strain-specific behavior of Mycobacterium tuberculosis in A549 lung cancer cell line. BMC Bioinformatics. 2021 Mar 25;22(1):154. doi: 10.1186/s12859-021-04100-z. PMID: 33765916; PMCID: PMC7992940

73.Tieche CC, Peng RW, Dorn P, Froment L, Schmid RA, Marti TM. Prolonged pemetrexed pretreatment augments persistence of cisplatin-induced DNA damage and eliminates resistant lung cancer stem-like cells associated with EMT. BMC Cancer. 2016;16(1):125.

74.Tieche CC, Gao Y, Buhrer ED, Hobi N, Berezowska SA, Wyler K, Froment L, Weis S, Peng RW, Bruggmann R, et al. Tumor initiation capacity and therapy resistance are differential features of EMT-related subpopulations in the NSCLC cell line A549. Neoplasia. 2019;21(2):185-96

75.Shindo-Okada N, Takeuchi K, Han BS, Nagamachi Y. Establishment of cell lines with high and low metastatic potential from A549 human lung adenocarcinoma. Jpn J Cancer Res. 2002 Jan;93(1):50-60. doi: 10.1111/j.1349-7006.2002.tb01200.x. PMID: 11802808; PMCID: PMC5926868 76.Gu, J., et al., Study of EGCG induced apoptosis in lung cancer cells by inhibiting PI3K/Akt signaling pathway. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci, 2018. 22(14): p. 4557-4563

77.Sun, W., et al., SPARC acts as a mediator of TGF-ß1 in promoting epithelial-to-mesenchymal transition in A549 and H1299 lung cancer cells. Biofactors, 2018. 44(5): p. 453-464

78.Shen, X.-Y., et al., A study on the mechanism of bruceine D in the treatment of non-small cell lung cancer H1299 cells. World Journal of Traditional Chinese Medicine, 2020. 6(4): p. 500

79.Wu JS, Jiang J, Chen BJ, Wang K, Tang YL, Liang XH. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Transl Oncol. 2021 Jan;14(1):100899. doi: 10.1016/j.tranon.2020.100899. Epub 2020 Oct 17. PMID: 33080522; PMCID: PMC7573380.

80.Prieto-García E, Díaz-García CV, García-Ruiz I, Agulló-Ortuño MT. Epithelial -to-mesenchymal transition in tumor progression. Med Oncol. 2017 Jul;34(7):122. doi: 10.1007/s12032-017-0980-8. Epub 2017 May 30. PMID: 28560682

81.Kim DH, Xing T, Yang Z, Dudek R, Lu Q, Chen YH. Epithelial Mesenchymal Transition in Embryonic Development, Tissue Repair and Cancer: A Comprehensive Overview. J Clin Med. 2017 Dec 22;7(1):1. doi: 10.3390/jcm7010001. PMID: 29271928; PMCID: PMC5791009

82.Dalla Pozza E. et al. Secreted molecules inducing epithelial-to-mesenchymal transition in cancer development //Seminars in cell & developmental biology. -Academic Press, 2018. - T. 78. - C. 62-72.

83.Marconi GD, Fonticoli L, Rajan TS, Pierdomenico SD, Trubiani O, Pizzicannella J, Diomede F. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT): The Type-2 EMT in Wound Healing, Tissue Regeneration and Organ Fibrosis. Cells. 2021 Jun 23;10(7):1587. doi: 10.3390/cells10071587. PMID: 34201858; PMCID: PMC8307661.

84.Liao TT, Yang MH. Revisiting epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis: the connection between epithelial plasticity and stemness. Mol Oncol. 2017 Jul;11(7):792-804. doi: 10.1002/1878-0261.12096. Epub 2017 Jun 26. PMID: 28649800; PMCID: PMC5496497.

85.Bakir B, Chiarella AM, Pitarresi JR, Rustgi AK. EMT, MET, Plasticity, and Tumor Metastasis. Trends Cell Biol. 2020 Oct;30(10):764-776. doi:

10.1016/j.tcb.2020.07.003. Epub 2020 Aug 13. PMID: 32800658; PMCID: PMC7647095.

86.Hornsby PJ. Cellular aging and cancer. Crit Rev Oncol Hematol. 2011 Aug;79(2):189-95. doi: 10.1016/j.critrevonc.2010.07.011. Epub 2010 Aug 11. PMID: 20705476; PMCID: PMC3033987.

87.Ryu N. E., Lee S. H., Park H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells //Cells. - 2019. - T. 8. - №. 12. - C. 1620.

88.Stadler M. et al. Exclusion from spheroid formation identifies loss of essential cell-cell adhesion molecules in colon cancer cells //Scientific reports. - 2018. -T. 8. - №. 1. - C. 1151

89.Grigora§ ML, Arghirescu TS, Folescu R, Talpoç IC, Gîndac CM, Zamfir CL, Cornianu M, Anghel MD, Levai CM. Expression of E-cadherin in lung carcinoma, other than those with small cells (NSCLC). Rom J Morphol Embryol. 2017;58(4):1317-1325. PMID: 29556623

90.Dongre A, Weinberg RA. New insights into the mechanisms of epithelialmesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:69-84

91.Francart ME, Vanwynsberghe AM, Lambert J, Bourcy M, Genna A, Ancel J, et al. Vimentin prevents a miR-dependent negative regulation of tissue factor mRNA during epithelial-mesenchymal transitions and facilitates early metastasis. Oncogene. 2020;39:3680-92

92.Meng J, Chen S, Han JX, Qian B, Wang XR, Zhong WL, et al. Twist1 Regulates Vimentin through Cul2 Circular RNA to Promote EMT in Hepatocellular Carcinoma. Cancer Res. 2018;78:4150-62

93.Berr, A.L., Wiese, K., dos Santos, G. et al. Vimentin is required for tumor progression and metastasis in a mouse model of non-small cell lung cancer. Oncogene 42, 2074-2087 (2023). https://doi.org/10.1038/s41388-023-02703-9

94.Liu F., Zhang Y., Lu M., Wang C., Li Q., Gao Y., Mu D., Cao Y., Li M., Meng X. Nestin servers as a promising prognostic biomarker in non-small cell lung cancer. Am. J. Transl. Res. 2017;9:1392-1401

95.Minn AJ, Gupta GP, Siegel PM, Bos PD, Shu W, Giri DD, Viale A, Olshen AB, Gerald WL, Massague J. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 2005 Jul 28;436(7050):518-24. doi: 10.1038/nature03799. PMID: 16049480; PMCID: PMC1283098.

96.Lowy CM, Oskarsson T. Tenascin C in metastasis: A view from the invasive front. Cell Adh Migr. 2015;9(1-2):112-24. doi: 10.1080/19336918.2015.1008331. PMID: 25738825; PMCID: PMC4422797.

97.Li M, Zhang X, Hu K, Shi M, Dong G, Li D, Zhang P. Prognostic role of snail in lung cancer: Protocol for a systematic review. Medicine (Baltimore). 2018 Jul;97(28):e11539. doi: 10.1097/MD.0000000000011539. PMID: 29995827; PMCID: PMC6076196.

98.Lim WC, Kim H, Kim Y-J. Dioscin suppresses TGF-b1-induced epithelialmesenchymal transition and suppresses A549 lung cancer migration and invasion. Bioorg Med Chem Lett 2017;27:3342-8

99.Luo F. et al. HIF-1a inhibition promotes the efficacy of immune checkpoint blockade in the treatment of non-small cell lung cancer //Cancer Letters. - 2022. - T. 531. - C. 39-56.

100. Gebb SA, Jones PL. Hypoxia and lung branching morphogenesis. Adv Exp Med Biol. 2003;543:117-25. doi: 10.1007/978-1-4419-8997-0_8. PMID: 14713117.

101. McKendrick J, Coutsouvelis J: Capecitabine: effective oral fluoropyrimidine chemotherapy. Expert Opin Pharmacother. 2005 Jun;6(7):1231-9. doi: 10.1517/14656566.6.7.1231. (PubMed ID 15957975)

102. Longley DB, Harkin DP, Johnston PG: 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 2003 May;3(5):330-8. (PubMed ID 12724731

103. Dean L, Kane M: Capecitabine Therapy and DPYD Genotype. . (PubMed ID 28520372)

104. Shimma N, Umeda I, Arasaki M, Murasaki C, Masubuchi K, Kohchi Y, Miwa M, Ura M, Sawada N, Tahara H, Kuruma I, Horii I, Ishitsuka H: The design

and synthesis of a new tumor-selective fluoropyrimidine carbamate, capecitabine. Bioorg Med Chem. 2000 Jul;8(7):1697-706. doi: 10.1016/s0968-0896(00)00087-0. (PubMed ID 10976516)

105. Scagliotti, G. V., Ceppi, P., Capelletto, E. & Novello, S. Updated clinical information on multitargeted antifolates in lung cancer. Clin. Lung Cancer 10, S35-S40 (2009)]. B [Thymidylate synthase drives the phenotypes of epithelial-to-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer

106. Haeger, A., Wolf, K., Zegers, M. M., and Friedl, P. (2015). Collective cell migration: guidance principles and hierarchies. Trends Cell Biol. 25, 556-566. doi: 10.1016/j.tcb.2015.06.003

107. Lu P., Lu Y. Born to run? Diverse modes of epithelial migration //Frontiers in Cell and Developmental Biology. - 2021. - T. 9. - C. 704939

108. Shabalina EY, Skorova EY, Chudakova DA, Anikin VB, Reshetov IV, Mynbaev OA, Petersen EV. The matrix-dependent 3D spheroid model of the migration of non-small cell lung cancer: a step towards a rapid automated screening. Front Mol Biosci. 2021 Mar 25;8:610407. doi: 10.3389/fmolb.2021.610407. PMID: 34422897; PMCID: PMC8378843.

109. Chiou WC, Huang C, Lin ZJ, Hong LS, Lai YH, Chen JC, Huang HC. a-Viniferin and e-Viniferin Inhibited TGF-ß1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition, Migration and Invasion in Lung Cancer Cells through Downregulation of Vimentin Expression. Nutrients. 2022 May 30;14(11):2294. doi: 10.3390/nu14112294. PMID: 35684095; PMCID: PMC9182810.

110. Loh, C.-Y.; Chai, J.Y.; Tang, T.F.; Wong, W.F.; Sethi, G.; Shanmugam, M.K.; Chong, P.P.; Looi, C.Y. The E-Cadherin and N-Cadherin Switch in Epithelial-to-Mesenchymal Transition: Signaling, Therapeutic Implications, and Challenges. Cells 2019, 8, 1118. https://doi.org/10.3390/cells8101118

111. Chen Z, Wang J, Cai L, Zhong B, Luo H, et al. (2014) Role of the Stem Cell-Associated Intermediate Filament Nestin in Malignant Proliferation of Non-Small Cell Lung Cancer. PLOS ONE 9(2): e85584. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085584

112. Nagaharu K, Zhang X, Yoshida T, Katoh D, Hanamura N, Kozuka Y, Ogawa T, Shiraishi T, Imanaka-Yoshida K. Tenascin C induces epithelialmesenchymal transition-like change accompanied by SRC activation and focal adhesion kinase phosphorylation in human breast cancer cells. Am J Pathol. 2011 Feb;178(2):754-63. doi: 10.1016/j.ajpath.2010.10.015. PMID: 21281808; PMCID: PMC3069868.

113. Edmondson R. et al. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors //Assay and drug development technologies. - 2014. - Т . 12. - №. 4. - С . 207-218.

114. Kalluri R. et al. The basics of epithelial-mesenchymal transition //The Journal of clinical investigation. - 2009. - Т. 119. - №. 6. - С. 1420-1428.

115. Шамбазова Д. Н. и др. АКТИВНОСТЬ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПРОИЗВОДНОГО ПИРИДИНА ТХ-14 НА КЛЕТКИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ КРАТКОСРОЧНОЙ И НЕПРЕРЫВНОЙ ИНКУБАЦИИ

116. Lee C. S. et al. In vivo and in vitro anticancer activity of doxorubicinloaded DNA-AuNP nanocarrier for the ovarian cancer treatment //Cancers. - 2020. - Т. 12. - №. 3. - С. 634.

117. Константинов А. С., Шелехова К. В. Прогнозирование биологического поведения опухолей (на примере колоректального рака): ретроспектива и взгляд в будущее //Journal of Siberian Medical Sciences. -2021. - №. 4. - С. 80-96.

118. Kozak J. et al. Inhibition or reversal of the epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer: pharmacological approaches //International journal of molecular sciences. - 2020. - Т. 22. - №. 1. - С. 277.

119. Guo LY, Zhu P, Jin XP. Association between the expression of HIF-1alpha and VEGF and prognostic implications in primary liver cancer. Genet Mol Res (2016) 15(2):gmr8107. 10.4238/gmr.15028107

120. Drzal A. et al. Increasing oxygen tension in tumor tissue using ultrasound sensitive O2 microbubbles //Free Radical Biology and Medicine. - 2022. - Т. 193. - С. 567-578.

121. Xie S. et al. The metastasizing mechanisms of lung cancer: Recent advances and therapeutic challenges //Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2021. - Т. 138. - С. 111450.

122. Liu K. H. et al. Hypoxia stimulates the epithelial-to-mesenchymal transition in lung cancer cells through accumulation of nuclear в-catenin //Anticancer Research. - 2018. - Т. 38. - №. 11. - С. 6299-6308.

123. Тарасенко А. И. и др. ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ И ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА-в ПРИ РАКЕ ПОЧКИ //Research'n Practical Medicine Journal. - 2022. - Т. 9. - №. 2. - С. 96-106.

124. Клишо Е. В., Кондакова И. В., Чойнзонов Е. Л. Матриксные металлопротеиназы в онкогенезе //Сибирский онкологический журнал. -2003. - №. 2. - С. 62-70.

125. Jaiswal D. et al. Stiffness analysis of 3D spheroids using microtweezers //PloS one. - 2017. - Т. 12. - №. 11. - С. e0188346.

126. Sawabata N. et al. Lung cancer biopsy dislodges tumor cells into circulating blood //J Cancer Metastasis Treat. - 2017. - Т. 3. - С. 16-20.

127. Reddy R. M. et al. Pulmonary venous blood sampling significantly increases the yield of circulating tumor cells in early-stage lung cancer //The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. - 2016. - Т. 151. - №. 3. - С. 852-858.

128. Hamilton G., Rath B. Role of circulating tumor cell spheroids in drug resistance //Cancer Drug Resistance. - 2019. - Т. 2. - №. 3. - С. 762.

129. Alix-Panabieres C., Pantel K. Challenges in circulating tumour cell research //Nature Reviews Cancer. - 2014. - Т. 14. - №. 9. - С. 623-631.

130. Gallo M. et al. Clinical utility of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer //Translational lung cancer research. - 2017. - T. 6. -№. 4. - C. 486.

110

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает огромную признательность принимавшим участие в работе сотрудникам МФТИ. В частности, автор благодарит за помощь с экспериментами и плодотворные дискуссии Е.В Петерсен и коллег лаборатории молекулярно-биологических и нейробиологических проблем и биоскрининга МФТИ.