Особенности межмолекулярного взаимодействия молекул коллагена в водных растворах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Сергеева, Ирина Александровна

• Сергеева, Ирина Александровна
• кандидат физико-математических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Сергеева, Ирина Александровна

Введение.

Глава 1. Основные свойства белковых молекул.

1.1 Состав и строение белков.

1.2 Физико-химические свойства коллагена.

1.3 Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля

Глава 2. Рассеяние света в растворах биополимеров. Метод статического рассеяния света.

2.1 Основные положения теории рассеяния света.

2.2 Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса и второго вириального коэффициента рассеивающих частиц.

2.3 Теория Скэтчарда.

Глава 3. Рассеяние света в растворах биополимеров. Метод динамического рассеяния света.

3.1 Корреляционная функция интенсивности рассеянного света.

3.2 Вириальное разложение для коэффициента трения в растворах белков.

3.3 Теория Джеймса — Эванса.

Глава 4. Обзор литературных данных по физическим свойствам коллагена.

Глава 5. Экспериментальное исследование водных растворов коллагена методом статического светорассеяния.

5.1 Объекты исследования и подготовка образцов для измерений.

5.2 Описание экспериментальной установки.

5.3 Результаты экспериментального исследования водных растворов коллагена методом статического светорассеяния.

5.4 Обсуждение результатов и выводы.

Глава 6. Экспериментальное исследование водных растворов коллагена методом динамического светорассеяния.

6.1 Принципы работы фотонно-корреляционного спектрометра.

6.2 Динамические свойства молекул коллагена в водных растворах с добавлением солей различных металлов.

6.2.1 Экспериментальные результаты.

6.2.2 Обсуждение результатов.

6.3 Изучение угловых зависимостей интенсивности рассеянного света в водных растворах коллагена с добавлением солей различных металлов.

6.3.1 Экспериментальные данные.

6.3.2 Методы обработки экспериментальных данных (метод асимметрии и метод двойной экстраполяции).

6.3.3 Результаты, полученные с помощью обработки методами асимметрии и двойной экстраполяции.

6.3.4 Обсуждение результатов.

6.4. Исследование температурных зависимостей коэффициента трансляционной диффузии молекул коллагена в водных растворах.

6.4.1 Результаты эксперимента.

6.4.2 Обсуждение результатов и выводы.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности межмолекулярного взаимодействия молекул коллагена в водных растворах»

Белки — высокомолекулярные природные органические вещества, играющие фундаментальную роль в структуре и жизнедеятельности организмов. Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также оценка влияния внешних факторов на белковые системы представляют собой огромный интерес для современной медицинской биофизики, молекулярной физики и экологии.

Макромолекулы белков, биополимеров и их водные растворы являются уникальными для исследования с помощью методов молекулярной физики, поскольку масса белковой макромолекулы строго определена для каждого типа белка, при этом поверхность белковой молекулы имеет определенную величину заряда, которую можно изменять путем изменения показателя рН раствора.

Актуальность темы исследования

Коллаген является одним из наиболее важных и распространённых белков в живых организмах, составляя одну треть всех белков массы человеческого тела. Различают около двух десятков типов коллагенов, самыми распространёнными из них являются первые четыре. Коллаген I типа - главный компонент кожи, сухожилий, связок и костей. Коллаген II типа - главный компонент хрящевой ткани. Коллаген III типа -упрочняющий компонент стенок полых органов, в том числе кровеносных сосудов и кишечника. Коллаген IV типа - упрочняющий компонент базальной пластины эпителия, фильтров в кровеносных капиллярах и других структурах. Коллаген выполняет главную структурную роль в организме. В связи с этим очень важными являются исследования как структурных изменений коллагена в водных растворах, так и процессов, связанных с объединением молекул в коллагеновые цепи - фибриллы, что определяет уникальные свойства костей, кожи и других тканей. [79,85].

• 4 - - 2

Металлы необходимы для нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Более 5% веса человеческого тела составляют натрий, калий, кальций и магний. Кальций - самый распространенный макроэлемент в организме человека, большая его часть содержится в скелете и зубах в виде фосфатов. Ионы кальция участвуют в процессах свертывания крови, мышечных и нейронных реакциях, а так же обеспечивают осмотическое давление крови. Калий и натрий играют важную роль в образовании буферных систем, предотвращающих сдвиги реакции среды и обеспечивающих их постоянство. Для всех тканей характерно определенное соотношение между концентрациями калия и натрия. В организме человека около 98% калия находится внутри клеток тканей, а в транспортных системах, где происходит синтез и транспортировка белка, преимущественно содержится натрий. Калий и натрий, играя важную роль в процессе внутриклеточного и межклеточного обмена, являются основными потенциалобразующими ионами. Вместе они участвуют в возникновении нервного импульса, механизме кратковременной памяти, влияют на состояние мышечной и сердечно -сосудистой систем. Изучение взаимодействия этих металлов с молекулами белков - важная и актуальная проблема современной биофизики и медицины. Другие металлы, такие как железо, кобальт, медь, молибден и 1 цинк присутствуют в организме в связанном состоянии (гемоглобин, ферменты), а их содержание составляет менее 1% веса тела [11,12,20,18].

Тем не менее, превышение допустимой концентрации металлов в окружающей среде создает серьезную угрозу здоровью человека [65]. Особенно опасны тяжелые металлы, имеющие атомный вес больше 40. В значительной мере это связано с биологической активностью многих из них. Многие тяжелые металлы проявляют комплексообразующие свойства. В водных средах ионы этих металлов гидратированы и способны образовывать различные гидроксокомплексы, состав которых зависит от кислотности раствора. Если в растворе присутствуют какие-либо анионы или молекулы органических соединений, то ионы этих металлов образуют разнообразные комплексы различного строения и устойчивости.

В ряду тяжелых металлов одни крайне необходимы для жизнеобеспечения человека, другие вызывают противоположный эффект и, попадая в живой организм, они даже в небольших концентрациях способны серьезно нарушить нормальное течение физиологических процессов. Среди наиболее опасных для здоровья человека и животных выделяют ртуть, свинец и кадмий. Опасность свинца для человека определяется его значительной токсичностью и способностью накапливаться в организме. Проникая внутрь организма, свинец даже в малых количествах задерживается в нем и постепенно замещает кальций, который входит в состав костей. Это приводит к хроническим заболеваниям. Имея большой ионный радиус (Rpb2+=1,20 А), этот металл очень сильно влияет на процесс кластерообразования даже при очень малых концентрациях.

Белки в водных растворах имеют тенденцию к агрегации в зависимости от их физико-химического состояния. Этот процесс часто бывает необратимым и может являться признаком некоторых серьезных заболеваний в организме человека.

Агрегация и другие процессы, происходящие с белковыми макромолекулами в растворах, зависят от природы белков, их концентрации, типа растворителя, солей, ионов металлов, кислот, оснований, показателя рН, температуры и других факторов [92].

Патологические изменения в структуре коллагеновых фибрилл являются причиной ряда заболеваний соединительной ткани (коллагеновые болезни) и характеризуются поражением органов, а именно, суставов, сердца, сосудов, мышечной и кожной ткани.

Основной целью данной работы было исследование молекулярно-динамических процессов, происходящих в растворах молекул коллагена при воздействии различных параметров среды (рН, концентрация белка, ионная сила, температура), в том числе вредное воздействие ионов токсичных металлов методами статического и динамического рассеяния света.

Исходя из общей цели, в диссертации ставился ряд практических задач: исследование растворов макромолекул коллагена при изменении показателя рН среды с помощью метода статического рассеяния света; изучение влияния ионов металлов с различными ионными радиусами на динамические свойства молекул белка в водных растворах методом фотонно - корреляционной спектроскопии; получение и обработка угловых зависимостей интенсивности рассеянного света водных растворов коллагена при добавлении солей различных металлов с помощью метода динамического светорассеяния; исследование температурных зависимостей коэффициента трансляционной диффузии молекул в водных растворах коллагена в интервале температур от 24 50°С.

В данной работе для определения молекулярных параметров коллагена использовались линейные оптические методы: статическое и динамическое рассеяние света. Особое внимание уделялось динамическому светорассеянию, с помощью которого изучались механизмы образования супермолекулярных наноструктур коллагена в водных растворах с ионами металлов, имеющих большие ионные радиусы.

Научная новизна диссертации обусловлена рядом экспериментальных результатов, впервые полученных в данной работе: 1. С помощью метода статического светорассеяния были получены зависимости эффективной массы макромолекул коллагена в водных растворах при различных значениях показателя рН среды. При рН 4.5 значение молекулярной массы коллагена М=297000 г/моль хорошо согласуется с литературными данными.

2. Впервые была определена изоэлектрическая точка белка коллагена -рН 6.0 методом интегрального рассеяния света. Для определения изоэлектрической точки коллагена исследовалась зависимость коэффициента деполяризации от рН раствора. Экстремум этой зависимости наблюдается при значении рН в.0.

3. Получено, что • зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия от рН в водных растворах коллагена нелинейна и имеет параболический характер с минимумом в изоэлектрической точке рНв.0 белка.

4. Впервые с помощью метода фотонно - корреляционной спектроскопии получены значения коэффициента трансляционной диффузии в чистом водном растворе коллагена и в растворах, содержащих соли CaSC^ и NaCl. рН — зависимости коэффициента Dt имеют максимум близи изоэлектрической точки белка.

5. Впервые обнаружено, что размер ионных радиусов металлов сильно влияет на характер электростатического взаимодействия между макромолекулами коллагена. Взаимодействие ионов калия и тяжелого металла свинца, обладающих сравнительно большими ионными радиусами (К+- 1,33А, РЬ2+-1,2А), в растворах с коллагеном приводят к образованию макромолекулярных комплексов - дипольных белковых наноструктур.

6. Было показано, что значения коэффициентов трансляционной диффузии в водных растворах коллагена, содержащих соли КС1 и РЬ(СН3СОО)2, уменьшаются с ростом ионной силы раствора. Это указывает на увеличение массы частиц в растворах с ростом концентрации ионов К иРЬ .

7. С помощью данных по угловому рассеянию света в водных растворах коллагена с солями CaS04> NaCl, КС1 и Pb(CH3COO)2 оказалось возможным определить наиболее вероятную форму и размер наноструктур, образующихся в результате взаимодействия ионов металлов с молекулами белка.

8. Установлено, что коэффициент трансляционной диффузии при нагревании водного раствора коллагена имеет характерную зависимость с минимумом в области оптимальной температуры тела человека (37°С). В области данной температуры наблюдается, вероятно, фазовый переход и дальнейшее нагревание приводит к необратимым изменениям в структуре молекул белка - его денатурации.

9. Получено, что коэффициент трансляционной диффузии Dt при нагревании водных растворах коллагена, содержащих ацетат свинца, резко увеличивается в области температур 37-40°С, что вероятно, связано с разрушением дипольных кластеров.

В качестве основных результатов на защиту выносятся следующие положения:

1. На основании данных по статическому рассеянию света было получено, что коэффициент межмолекулярного взаимодействия имеет минимальное значение при рН 6.0 в водных растворах коллагена; эффективная масса молекул коллагена изменяется при различных значениях рН, причем максимальное значение молекулярной массы белка соответствует рН 6.0. Впервые была определена изоэлектрическая точка коллагена рН 6.0 по зависимости коэффициента деполяризации от показателя раствора рН.

2. Впервые обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров коллагена в водных растворах при взаимодействия молекул белка с ионами калия и свинца.

3. Показано, что массы образующихся наночастиц зависят от ионной силы растворов - увеличиваются с ростом концентрации ионов.

4. Обнаружен фазовый переход в водных растворах коллагена при температуре 37°С. Дальнейшее увеличение температуры приводит к необратимым изменениям в структуре молекул белка.

5. Установлено, что нагревание растворов коллагена, содержащих соль ацетата свинца, приводит к разрушению нанокластеров в области температуры ~ 37°С.

Практическая ценность предлагаемого исследования заключается в том, что полученные в работе результаты способствуют развитию представлений о молекулярно-динамических процессах, происходящих в растворах белковых макромолекул, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.

Изученное в работе поведение макромолекул коллагена в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей, в том числе с ионами тяжелых металлов, позволяет установить возможные патологические процессы в организме человека, происходящие под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды.

Как известно, токсичные и ядовитые вещества могут проникать внутрь организма через кожу и накапливаться в нем. Именно в коже содержится большая часть коллагена первого типа, который и являлся объектом исследования в данной работе. Содержание тяжелых металлов в окружающей нас среде увеличивается быстрыми темпами в результате деятельности человека, в связи с этим, изучение воздействия этих вредных факторов на организм человека, в том числе на слизистые оболочки и кожный покров, имеет важное практическое значение для медицины, экологии и косметологии.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Сергеева, Ирина Александровна

Выводы

1. Из экспериментально полученных рН - зависимостей коэффициента межмолекулярного взаимодействия и коэффициента деполяризации растворов коллагена, имеющих экстремумы при рН 6.0, можно сделать вывод, что изоэлектрическая точка коллагена (I-типа) равна р16.0.

2. Обнаружено, что масса рассеивающих частиц в водных растворах коллагена изменяется при изменении рН и имеет максимальное значение - Mefj=673 ООО при рН 6.0.

3. Поведение коэффициента трансляционной диффузии в водных | растворах коллагена, содержащих ионы К и РЬ , с минимумом в изоэлектрической точке (рН 6.0) свидетельствуют об образовании нанокластеров в растворах. Максимальную величину образующиеся наночастицы имеют вблизи изоэлектрической точки белка.

4. Результаты, полученные с помощью методов угловой зависимости интенсивности рассеянного света, показывают, что при добавлении в

I 2"Ь раствор коллагена ионов К и РЬ возникают крупные наноструктуры, имеющие форму клубка.

5. В области физиологической температуры 37°С в водных растворах коллагена наблюдается минимум молекулярной подвижности. При дальнейшем увеличении температуры коэффициент Д молекул коллагена резко увеличивается.

6. Обнаружено, что нагревание растворов коллагена, содержащих соль ацетата свинца, приводит к разрушению нанокластеров в области температур 37-40°С, а дальнейшее нагревание растворов, вероятно,1 вновь приводит к образованию крупных малоподвижных структур, под воздействием ионов свинца.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Сергеева, Ирина Александровна, 2009 год

1. Scatchard G. J. "The attraction of protein for small molecules and ions "// Ann. N.Y. Acad. Sci., 1949, V.51, P.2315.

2. Zimm ВН., Stockmayer W.H. // Chem. Phys. 1949, 1301.

3. Edsall J.T. et al. "Light Scattering in Solutions of Serum Albumin: effects of charge and ionic strength "// J. of American Chem. Soc., 1950, V. 72, P.4641.

4. Волъкенштейн M.B. "Молекулярная оптика "// ГИТТЛ, M.JI., 1951.

5. P.O. Schmitt, J. Gross and J.H. Highberger, Proc. Natl. Acad. Set., 99, 459 (1953).

6. H. Boedtker and P. J. Doty "The Native and Denatured States of Soluble Collagen"//Phys. Chem. 1954, Vol.78, P.4267-4280.

7. K. Stacey "Light Scattering in Physical Chemistry"// Acad. Press, New York, 1956.

8. Crick F.H.C., Kendrew J.C. "X-ray analysis and protein structure"//, Advan. Protein Chem., 12, 1957, P. 133-214.

9. P. M. Gallop, "The solubility and properties of a purified ichthyocol in salt solutions of neutral pH'7/ Biochem. and Biophys. Citol., 1957, Vol. 3, No. 4, P.545-557.

10. Heiipam Г., Бейли К. "Белки " //Изд. ИЛ, М.Л., 1958.

11. Lyman Т. "Metals handbook" // V. 1. Ohio, 1961

12. Лебедева КВ. "Техника безопасности в металлургии свинца и цинка" //Москва, 1963.

13. Цветков В.Н., Эскин В.Е., Френкель С.Я. "Структура макромолекул в растворах" //Изд. Наука, 1964.

14. Фабелинский И.Л. "Молекулярное рассеяние света " // М. Наука, 1965.

15. Эйнштейн А. "Собрание научных трудов"//М. Наука, 1966.

16. Мартин Р. "Введение в биофизическую химию "// М. Мир, 1966.17