Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Еремеев, Сергей Андреевич

• Еремеев, Сергей Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Еремеев, Сергей Андреевич

Оглавление.

1.Список сокращений.

2. Введение.

2.1 Актуальность работы.

2.3 Задачи исследования.

2.4 Научная новизна работы.

2.5 Практическое значение работы.

3. Обзор литературы.

3.1 Строение и функции митохондрий.

3.2 Структура комплексов дыхательной цепи.

3.2.1 Первый дыхательный комплекс.

3.2.2 Второй дыхательный комплекс.

3.2.3 Третий дыхательный комплекс.

3.2.4 Четвертый дыхательный комплекс.

3.2.5 АТФ-синтетаза.

3.3 Сопряжение процессов дыхания и фосфорилирования.

3.3.1 Химическая схема сопряжения.

3.3.2 Хемиосмотическая гипотеза Митчелла.

3.3.3 Теория Вильямса.

3.3.4 Схема Бойера.

3.3.5. Фракция неравновесно связанных с поверхностью мембран протонов и ее идентификация.

3.3.6 Два режима системы сопряжения.

3.3.7 Трансмембранный градиент протонов, локальный градиент активности ионов водорода на БЛМ.

3.3.8 Разобщители и разобщение.

3.4 Активные формы кислорода.

3.4.1 Общие сведения.

3.4.2 АФК - регуляторные молекулы.

3.5 Хиноны ряда 8кС> и Мко(3.

4. Материалы и методы.

4.1 Реактивы.

4.2 Буферные растворы.

4.2.1 Среды для экспериментов с митохондриями.

4.2.2 Среды для экспериментов на БЛМ.

4.2.3 Среды для спектрофотометрических экспериментов.

4.3 Выделение митохондрий печени.

4.4 Измерение скорости дыхания митохондрий.

4.5 Измерение степени стимуляции дыхания митохондрий низкими концентрациями поверхностно активных протонофоров.

4.6 Активация сукцинатдегидрогеназы.

4.7 Восстановление ТРР+-конъюгированных хинонов и измерение спектральных характеристик восстановленных форм.

4.8 Расчет теоретических значений.

4.9 MALDI спектроскопия.

4.9.1 Механизм ионизации.

4.10 Эксперименты на модели бислойной липидной мембраны (БЛМ).

5. Результаты и обсуждение.

Раздел I. Поверхностно активные и протонофорные свойства ТХФ-С15.

5.1.1 ТХФ-С15 детергент или протонофор (определение условий эксперимента).

5.1.2 Низкие концентрации ТХФ-С15 (1 мкМ) стимулируют дыхание митохондрий в состоянии 2 по Чансу.

5.1.3 Доказательство протонофорных свойств ТХФ-С15 на модели БЛМ.

5.1.4 Избирательность взаимодействия ТХФ-С15 с фракцией R-протонов в митохондриях.

5.1.5 Влияние ТХФ-С15 на величину параметра АДФ/О.

5.1.6 Попытка измерения ТХФ-С15 на величину мембранного потенциала митохондрий.

Раздел II. Эндогенные транспортные системы, контролирующие функционирование ТХФ-С15 (как протонофора) в митохондриях.

5.2.1 Транслокатор нуклеотидов принимает участие в транспорте ТХФ-С15 через мембрану митохондрий.

5.2.2 Переносчик фосфата в митохондриях - эндогенный регулятор объема фракции мембраносвязанных протонов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране»

5.3.2 Механизмы стимуляции дыхания митохондрий индуцированного SkQ3.86

5.3.3 Модель ускорения дыхания митохондрий под действием SkQ3.89

5.3.4 SkQ3, также как ТХФ-С15, избирательно взаимодействует с R-протонами в митохондриях.96

5.3.5. Фосфат (также как и в случае ТХФ-С15) резко снижает ускорение дыхания митохондрий под действием SkQ3.98

5.3.6 Заключение.100

Раздел VI. Дополнительные исследования (сопоставление специфических свойств ТХФ-С15 и SkQ3).101

5.4.1 Изучение эффекта ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций ТХФ-С15.101

5.4.1.1 Введение.101

5.4.1.2 Разобщающее действие ТХФ-С15 в наномолярном диапазоне концентраций 101

5.4.2 Изучение эффекта ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций SkQ3.106

5.4.3 Заключение.110

5.4.4 Доказательство отсутствия стерических запретов для образования внутирмолекулярных циклических цвиттерионов.111

6. Выводы.115

7. Список литературы.116

1.Список сокращений

DNP ЕС

EDTA

FAD FeS

FMN

FCCP

GTP HEPES

I комплекс

II комплекс

III комплекс

IV комплекс MES

MitoQ

NAD

NPA PCP PDB

ДНФ, C6H4N2O5, 2,4-динитрофенол, 2,4-dinitrophenol Enzyme Commission number, код фермента по международной иерархической классификации

ЭДТУ,С 1 оНJ6N208, этилендиаминтетрауксусная кислота, ethylenediaminetetraacetic acid, 2,2',2",2"'-(ethane-l ,2-diyldinitrilo)-tetraacetic acid

ФАД, C27H33N9O15P2, флавинадениндинуклеотид, flavin adenine dinucleotide FeS кластер, Fe2S2, Fe3S4 или Fe4S4, железо Риске, железо-серный кластер, Rieske cluster, iron-sulfur center

ФМН, C17H21N4O9P, флавинмононуклеотид, flavin mononucleotide, riboflavin-5 '-phosphate

C10H5F3N4O, пара-трифторометокисикарбонил-цианидфенилгидразон, carbonyl cyanide-trifluoromethoxy carbonyl cyanide phenyl hydrazone ГТФ, C10H16N5O14P3, гуанозинтрифосфат, guanosine-5'-triphosphate C8H18N2O4S, ^2-гидроксиэтилпиперазин-ГчГ-2-этансульфоновая кислота, 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid EC 1.6.5.3, NADH-дегидрогеназа, NADH убихиноноксидоредуктаза, NADH-dehydrogenase, NADH ubiquinone oxidoreductase EC 1.3.5.1, СДГ, SQR, сукцинатдегидрогеназа, сукцинат убихинон оксидоредуктаза, succinate dehydrogenase, succinate coenzyme Q reductase EC 1.10.2.2, bci-комплеке, убихинол цитохром С оксидоредуктаза, coenzyme Q cytochrome С reductase, cytochrome be 1-complex EC 1.9.3.1, цитохром С оксидаза, cytochrome С oxidase C6H13NO4S, 2-(Тч[-морфолино)-этансульфокислота, 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid

Сз7Н4бС>4Р+, [ 10-(4,5-диметокси-2-метил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1 -ил)децил]трифенилфосфоний бромид

НАД, C21H27N7O14P2, никотинамидадениндинуклеотид, nicotinamide adenine dinucleotide

3-NPA, C3H5NO4, 3-нитропропионат, 3-nitropropionate ПХФ, C6HC150, пентахлорфенол, pentachlorophenol Protein Data Bank, база данных X-Ray структур, www.rcsb.org

Q CoQ, C59H90O4, кофермент Q, убихинон, ubiquinone, coenzyme Q

Q-цикл Q cycle, реакции, осуществляемые комплексом III ЭТЦ

SkQ ряд производные пластохинона, содержащие положительно заряженную ТРР+ группировку

SkQ 1 СзбН440гР+, [ 10-(4,5 -диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1 ил)децил]трифенилфосфоний бромид SkQ3 Сз7Н4б02Р+, [ 10-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1 ил)децил]трифенилфосфоний бромид TCP ТХФ, СбНзСЬО, трихлорфенол, 2,4,6-trichlorophenol

ТХФ-С15 C21H33CI3O, трихлорфенол-С15, 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол, 2,4,6trichloro-3 -pentadecyl-phenol ТРР+ ТФФ+, С18Н15Р+, катион трифенилфосфония, triphenylphosphonium cation

V комплекс ЕС 3.6.3.14, АТФ-синтетаза, FoFi-АТФ-синтетаза, АТФ-synthase С12ТРР катион додецилтрифенилфосфония

БЛМ бислойная липидная мембрана, lipid bilayer

БСА BSA, бычий сывороточный альбумин, bovine serum albnumin

Да Da, Дальтон, а.е.м., атомная единица массы, Dalton дитионит Na2S2C>4, натрия гидросульфит, sodiumdithionite, sodiumhydrosulfite натрия

ДТД ЕС 1.6.5.2, ДТ-диафораза, NADH хинон оксидоредуктаза 1, NQOl, DTdiaphorase, NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 пора пора временной активности, permeability transition pore цикл Кребса Krebs cycle, цикл трикарбоновых кислот, цитратный цикл, цикл лимонной кислоты, tricarboxylic acid cycle, citric acid cycle, TCA cycle ЭТЦ ETC, дыхательная электрон-транспортная цепь, electron transport chain

NEM N-этилмалеимид

АФК активированные формы кислорода

ФИТЦ флуоресцеина изотиоцианат

2. Введение

2.1 Актуальность работы

К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании механизмов функционирования системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Согласно П. Митчеллу (1) эта система способна функционировать в режиме так называемого делокализованного сопряжения, при котором дыхательные протонные помпы и система синтеза АТФ функционируют как независимые структурно-функциональные единицы. В таких условиях протонные помпы трансформируют энергию окислительных реакций в электрохимический потенциал ионов водорода на митохондриальной мембране, а АТФ-синтетаза преобразует энергию потенциала в энергию пирофосфатной связи АТФ. Эта модель в настоящее время является общепринятой. В том же 1961 году Р. Вильяме предложил модель локального сопряжения (2), согласно которой система окислительного фосфорилирования представляет собой единый мембранный комплекс, где перенос энергии (перенос ионов водорода) и система синтеза АТФ жестко объединены в структуру суперкомплекса. Основная особенность этой модели состоит в том, что переносчик энергии (ион водорода) включен в работу протонных помп и АТФ-синтетазы как структурная единица. Вторая модель, таким образом, предполагает не только функциональное, но и структурное сопряжение работы протонных помп, системы транспорта энергии и АТФ-синтетазы. Таким образом, протон, связываясь с поверхностью мембраны, образует электронейтральную кислоту Бренстеда.

В течение последних 30 лет в нашей лаборатории ведутся исследования, направленные на поиск условий, при которых реализуется механизм локального сопряжения. К настоящему времени нами было показано существование двух структурно-функциональных состояний системы окислительного фосфорилирования, одно из которых соответствует критериям механизма локального сопряжения (модели суперкомплекса), другое - модели Митчелла (3), (4). При этом было установлено, что переход между указанными состояниями регулируется системой объемной регуляции, обнаруженной в митохондриях Халестрапом (5). Этот результат показал, что модели Митчелла и Вильямса не являются абсолютно взаимоисключающими, но могут реализовываться в митохондриях при различных внешних условиях, в частности под влиянием факторов, вызывающих значительное изменение объема митохондриального матрикса. Модель Вильямса предполагает существование суперкомплекса, в составе которого транспорт энергии окислительных реакций на АТФ-синтетазный комплекс осуществляется мембраносвязанными ионами водорода, обладающими избытком свободной энергии. В наших исследованиях использовался качественно новый путь идентификации фракции мембраносвязанных ионов водорода, выполняющих роль переносчика энергии на АТФ-синтетазу. Ранее формирование фракции неравновесно связанных кислот Бренстеда на поверхности мембраны митохондрий в условиях работы протонных помп было обнаружено в нашей лаборатории с помощью катализаторов, которые ускоряют диссоциацию этих кислот, усиливая отрыв неравновесно связанных протонов с поверхности мембран функционирующих митохондрий. Катализаторы снижают активность ионов водорода на поверхности мембраны, увеличивая тем самым отрицательный заряд поверхности. Оба параметра регистрировали либо с помощью ковалентно пришитого к мембранам рН-зонда (6), (7), либо по изменению ^-потенциала мембран митопластов (4) и митохондрий (8). В последнем случае эффект образования фракции неравновесно связанных ионов водорода при включении протонных помп удается наблюдать без использования катализатора.

В настоящей работе исследован новый класс поверхностно активных протонофоров, специфически взаимодействующих с фракцией неравновесно связанных с мембраной ионов водорода.

Для исследования было синтезировано производное фенола - 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол (ТХФ-С15) (Рис. 1), обладающее (на 7,5 порядков) большим сродством к мембране, чем его структурный аналог 2,4,6-трихлорфенол (ТХФ) и на 6 порядков больше чем известный классический разобщитель - пентахлорфенол (схему синтеза и доказательство строения можно посмотреть в работе (9)). свойствами потенциально физиологически активного мембранотропного гидрохинона БкС)3, который обладает высоким сродством к мембране.

Из приведенной структуры ТХФ-С15 видно, что эта молекула может двумя принципиально разными способами воздействовать на ионную проницаемость мембран. Во-первых - присутствие фенольной группировки, определяющей протонофорные свойства этого соединения. Во-вторых - высокая поверхностная активность вещества, которая он

Изучение этого соединения проводилось параллельно с изучением классических разобщителей ТХФ и ПХФ. Свойства этого соединения были сопоставлены со классических

Рис. 1. Структура ТХФ-Сц (2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол). определяется сочетанием в структуре молекулы полярной гидроксильной группы и длинного углеводородного гидрофобного фрагмента. Первый этап изучения этого соединения как вещества, стимулирующего дыхание митохондрий, был проведен в лаборатории на высоких концентрациях (10-320 мкМ), при которых может проявляться свойство ТХФ-С15 как детергента. В настоящей работе систематически исследована концентрационная зависимость действия ТХФ-С15. Основное внимание уделено изучению действия низких и очень низких концентраций ТХФ-С15 (1 мкМ - 1 нМ), при которых вероятность проявления детергентных свойств данного соединения сведена к минимуму. Протонофорные свойства ТХФ-С15 были продемонстрированы в экспериментах на модели БЛМ.

2.2 Цель данной работы

Получить строгое экспериментальное обоснование действия ТХФ-С15 - как протонофора, специфически взаимодействующего с фракцией неравновесно связанных с мембраной протонов, которая образуется на поверхности внутренней митохондриальной мембраны в условиях работы дыхательных протонных помп.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Еремеев, Сергей Андреевич

6. Выводы

1. На модели плоской бислойной мембраны (БЛМ) показано, что поверхностно активное соединение 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол (ТХФ-С15) обладает свойствами протонофора.

2. На митохондриях показано, что ТХФ-С15 стимулирует дыхание митохондрий в состоянии два по Чансу.

3. Найдены условия, при которых на митохондриях наблюдается резкое качественное различие между протонофорной активностью классических разобщителей и поверхностно активным ТХФ-С15.

4. Показано, что, в отличие от классических разобщителей, ТХФ-С15 преимущественно взаимодействует с мембраносвязанной неравновесной фракцией ионов водорода, которая образуется в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий на поверхности митохондриальной мембраны при включении дыхательных протонных помп:

Таким образом, получено независимое подтверждение образования фракции мембраносвязанных протонов, обладающих избытком свободной энергии, возникающей при работе протонных помп митохондрий.

5. Показано, что транспорт ТХФ-С15 в митохондриях на 60-75% осуществляет переносчик адениновых нуклеотидов.

6. Обнаружено, что система транспорта фосфата в функционирующих митохондриях является эндогенным регулятором объема фракции неравновесно связанных с мембраной протонов.

7. Проведено сопоставление разобщающих свойств ТХФ-С15 и гидрохинона ряда 8к<3 (БкдЗНг). На митохондриях установлено качественное сходство этих соединений как протонофоров.

5.4.3 Заключение

Также в этой главе мы проверили возможность ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций SkQ3. На проведение этих экспериментов нас натолкнула схожесть эффектов ТХФ-С15 и SkQ3 в микромолярном диапазоне концентраций, вследствие чего можно было ожидати схожести эффектов и в наномолярном диапазоне концентраций. Кроме того, как уже было сказано в пункте 3.5 данной работы SkQl оказывает биологически активное действие в наномолярных концентрациях ( (108), (109), (110), (111), (112), (100)), а в некоторых случаях даже и в пикомолярных (99), (101). Отсюда встал логичный вопрос, может ли в какой-то степени это действие объясняться разобщающей активностью данных соединений, даже в столь низких концентрациях.

Ускорения дыхание митохондрий под действиемБкОЗ удалось зарегистрировать на всем диапазоне наномолярных концентраций. В частности, было показано, что внесение в среду инкубации катализатора HEPES резко снижает эффект SkQ3. Также показано, что, как и в случае с ТХФ-С)5, внесение в среду неорганического фосфата приводит к значительному снижению эффекта ускорения дыхания SkQ3. После сравнения данных экспериментов, проведенных в нано- и микромолярных диапазонах, стало ясно, что механизм разобщающего действия SkQ3 при различных концентрациях один и тот же.

5.4.4 Доказательство отсутствия стерических запретов для образования внутирмолекулярных циклических цвиттерионов

На первых этапах работы нам было необходимо показать отсутствие серьезных стерических запретов, препятствующих превращению анионов гидрохинонов соединений ряда SkQ в циклические цвиттерионы. Для этой цели была проведена MALDI спектрометрия хлоридов гидрохинонов рассматриваемых соединений. Для удобства дальнейшего описания введем ряд обозначений. MitoQ обозначим как соединение I, SiQl - II, SkQ3 - III, гидрохиноны соответственно 1а, Па и Illa. В MALDI спектрах хлоридов гидрохинонов Ia-IIIa (для каждого вещества) были обнаружены четыре группы производных с одинаковым скелетом молекулы, которые представлены в Таблица. 7. Структуры в группах 1 и 4 были определены в рамках принципа минимальности гипотез и предположения, согласно которому в реакцию вступают в первую очередь наименее прочные О-Н связи в группах гидрохинонов, а также Р+ -CF связи. Как видно из таблицы (Таблица. 7), соединения в группах 1 и 4 не содержат массы атома хлора, они имеют положительный заряд. Молекулярные массы соединений в группе 4 соответствуют массам гидрохинонов (Ia-IIIa), а в группе 1 - массам хинонов (I—III), которые, очевидно, образуются при изомеризации бирадикала гидрохинона. Фракции катионов (группы 1 и 4), в которых ион фосфония экранирован ионом хлора, не имеют заряда и не видны в спектрах. С другой стороны, нейтральные моноанион радикалы (Таблица. 7, группа 2) видны на спектрах только в виде хлоридов, которые придают молекулам избыточный отрицательный заряд. Теоретически казалось возможным обнаружить в MALDI спектрах отрицательно заряженные циклические цвиттерионы, образованные дианионами гидрохинонов Ia-IIIa, в которых, в отличие от соединений группы 2, положительный заряд фосфоний катиона экранирован одним из отрицательных зарядов дианиона гидрохинона; в таких молекулах должна отсутствовать масса аниона хлора. 2

Рис. 85. MALDI спектры соединений, которым приписана структура циклических форм цвиттерионов, образовавшихся из гидрохинонов la, Illa. Спектр 1 - производное SkQ3 т=550,7; производное MitoQ, т=582, 7. Пики 1а, 2а массы соответствующих изотопов

Однако нам не удалось достоверно установить образование отрицательно заряженных молекул, массы которых соответствовали бы таким структурам. Это, скорее всего, связано с крайне низкой вероятностью образования дианионов гидрохинонов в условиях MALDI эксперимента. В то же время в эксперименте были обнаружены отрицательно заряженные соединения, которые, как и ожидалось, не содержали массы хлора (Таблица. 7 группа 3 и Рис. 85).

Однако у этих веществ масса молекулы была не на две, а на три единицы меньше масс соответствующих гидрохинонов. Это говорит о том, что предполагаемый циклический цвиттерион должен быть образован не дианионом гидрохинона, а дианионом семихинона (см. группу 3). Плодотворной оказалась схема (Рис. 86), согласно которой наблюдаемый цвиттерион образуется при циклизации таутомерных форм (б и в), возникающих из анион-радикала (а). Такая схема позволила с единой точки зрения объяснить образование и соединений группы 3, и соединений группы 2 (см. Таблица. 7), основываясь на эффекте таутомерии соответствующих семихиноиов (а-г). Согласно этой схеме, образование соединений группы 2 и группы 3 (Таблица. 7) происходит, по-видимому, в процессе конкуренции между анионом хлора и дианионом радикала (Рис. 86, г) за взаимодействие с катионом фосфония. Кроме того, можно видеть, что данная схема основана на реакции таутомеризации семихинонов и поясняет путь образования циклического дианион-радикала (таблица 1, группа 3).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Еремеев, Сергей Андреевич, 2012 год

1. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961, Vol. 191, pp. 144-148.

2. R.J., Williams. Possible functions of chain of catalysists. Journal of theoretical biology. 1961, Vol. 1, l,pp. 1-17.

3. Yaguzhinsky L.S., Boguslavsky L.I., Volkov A.G., Rakhmaninova A.B. Synthesis of ATP coupled with action of membrane protonic pumps at the octane-water interface. Nature. 1976, Vol. 259, 5543, pp. 494-496.

4. Моисеева B.C., Мотовилов K.A., Лобышева H.B., Орлов B.H., Ягужинский JI.C.

5. Образование метастабильной связи ионов водорода с поверхностью митопластов. Доклады академии наук. 2011, Vol. 438, 4, pp. 555-558 .

6. Halestrap А.Р., Quinlan P.T., Whipps D.E., Armst A.E. Regulation of the mitochondrial matrix volume in vivo and in vitro. The role of calcium. Biochem J. 1986, Vol. 236, pp. 779-787.

7. Yurkov V.I., Fadeeva M.S., Yaguzhinsky L.S. Proton transfer through the membrane-water interfaces in uncoupled mitochondria. Biochemistry (Moscow). 2005, Vol. 70, 2, pp. 195-199.

8. Yaguzhinsky L.S., Yurkov V.I., Krasinskaya I.P. On the localized coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria. Biochimica et biophysica acta. 2006, Vol. 1757, (5-6), pp. 408414.

9. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию. Четвертое издание. Москва : ИКЦ «Академкнига», 2005.

10. Геннис, Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Москва : Мир, 1997.

11. Halestrap, А.Р. The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria in vivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism. Biochimica et biophysica acta. 1989, Vol. 973, 3, pp. 355-382.

12. Lehninger, A. Principles of biochemistry. 4th ed. s.l. : Oxford: Freeman, 2004.

13. Кольман Я., Рем К-Г. Наглядная биохимия. Второе издание, s.l. : Москва: Мир, 2004.

14. Bushnell G.W., Louie G.V., Brayer G.D. High-resolution three-dimensional structure of horse heart cytochrome c. Journal of molecular biology. 1990, Vol. 214, 2, pp. 585-595.

15. Sun F., Huo X., Zhai Y., Wang A., Xu J., Su D., Bartlam M., Rao Z. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 2005, Vol. 121, 7, pp. 1043-1057.

16. Belevich I., Wikstrom M. Complexes I and IV of respiratory chain. http://www. biocenter. helsinki.fi/bi/hbg/hbgresearch. html. Online.

17. Lind C., Cadenas E., Hochstein P., Ernster L. DT-diaphorase: Purification, properties, and function. Methods in enzymology. . 1990, Vol. 186, pp. 287-301.

18. Yaguzhinsky L.S., Smirnova E.G., Ratnikova L.A., Kolesova G.M., Krasinskaya I.P.

19. Hydrophobic sites of the mitochondrial electron transfer system. Journal of bioenergetics and biomemebranes. 1973, Vol. 5, 3, pp. 163-174.

20. Asher G., Dym O., Tsvetkov P., Adler J., Shaul Y. The crystal structure of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 in complex with its potent inhibitor dicoumarol. Biochemistry. 2006, Vol. 45, 20, pp. 6372-6378.

21. Chance В., Williams G.R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. . Advances in enzymology and related subjects of biochemistry. 1956, Vol. 17, pp. 65-134.

22. Green D.E., Tzagoloff A. The mitochondrial electron transfer chain. Archives of biochemistry and biophysics. 1966, Vol. 116, pp. 293-304.

23. Walker J.E. The NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) of respiratory chains. Quarterly reviews of biophysics. 1992, Vol. 25, 3, pp. 253-324.

24. Yagi T.,Matsuno-Yagi A. The proton-translocating NADH-quinone oxidoreductase in the respiratory chain: the secret unlocked. Biochemistry. 2003, Vol. 42, pp. 2266-2274.

25. Carroll J., Fearnley I.M., Skehel J.M., Shannon R.J., Hirst J., Walker J.E. . Bovine complex I is a complex of 45 different subunit. The Journal of biological chemistry. 2006, Vol. 281, 43, pp. 32724-32727.

26. Sazanov L.A., Hinchliffe P. Structure of the hydrophilic domain of respiratory complex I from Thermus thermophilus. Science. 2006, Vol. 311, 5766, pp. 1430-1436.

27. Ohnishi T. Iron-sulfur clusters/semiquinones in complex I. Biochimica et biophysica acta. 1998, Vol. 1364, 2, pp. 186-206.

28. Balaban R.S., Nemoto S., Finkel T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 2005, Vol. 120, 4, pp. 483-495.

29. Kudin A.P., Bimpong-Buta N.Y., Vielhaber S., Elger C.E., Kunz W.S. Characterization of superoxide-producing sites in isolated brain mitochondria. The Journal of biological chemistry. 2004, Vol. 279, 6, pp. 4127-4135.

30. Schapira, A.H. Human complex I defects in neurodegenerative diseases. Biochimica et biophysica acta. 1998, Vol. 1364, 2, pp. 261-270.

31. Lancaster C.R., Kroger A. Succinate: quinone oxidoreductases: new insights from X-ray crystal structures. Biochimica et biophysica acta. 2000, Vol. 1459, 2-3, pp. 422-431.

32. Hagerhall, C. Succinate: quinone oxidoreductases. Variations on a conserved theme. Biochimica et biophysica acta. 1997, Vol. 1320, 2, pp. 107-141.

33. Lemire B.D., Oyedotun K.S. . The Saccharomyces cerevisiae mitochondrial succinate:ubiquinone oxidoreductase. Biochim Biophys Acta. 2002, Vol. 1553, pp. 102-116.

34. Oyedotun K.S., Lemire B.D. The Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase anchor subunit, Sdh4p: mutations at the C-terminal lys-132 perturb the hydrophobic domain. Biochim Biophys Acta. 1999, Vol. 1411, pp. 170-179.

35. Yankovskaya V., Sablin S.O., Ramsay R.R., Singer T.P., Ackrell B.A., Cecchini G., Miyoshi H. . Inhibitor probes of the quinone binding sites of mammalian complex II and Escherichia coli fumarate reductase. J Biol Chem . 1996, Vol. 271, pp. 21020-21024.

36. Ohnishi T., Trumpower B.L. . Differential effects of antimycin on ubisemiquinone bound in different environments in isolated succinate . cytochrome c reductase complex. J Biol Chem . 1980, Vol. 255, pp. 3278-3284.

37. Rich, P.R. Electron and proton transfers through quinones and cytochrome be complexes. Biochimica et biophysica acta. 1984, Vol. 768, 1, pp. 53-79.

38. Mitchell, P. The protonmotive Q cycle: a general formulation. FEBS letters. 1975, Vol. 59, 2, pp. 137-139.

39. Robertson D.E., Prince R.C., Bowyer J.R., Matsuura K., Dutton P.L., Ohnishi T.

40. Thermodynamic properties of the semiquinone and its binding site in the ubiquinol-cytochrome с (c2) oxidoreductase of respiratory and photosynthetic systems. J Biol Chem. 1984, Vol. 259, pp. 1758-1763.

41. Covian R., Trumpower B.L. Regulatory interactions in the dimeric cytochrome bc(l) complex: the advantages of being a twin. Biochim Biophys Acta. 2008, Vol. 1777, pp. 1079-1091.

42. Brzezinski P., Adelroth P. Pathways of proton transfer in cytochrome с oxidase. Journal of bioenergetics and biomembranes. 1998, Vol. 30, 1, pp. 99-107.

43. LaNoue K.F., Duszynski J. Kinetic studies of ATP synthase: the case for the positional change mechanism. Journal of bioenergetics and biomembranes. 1992, Vol. 24, 5, pp. 499-506.

44. Rubinstein J.L., Walker J.E., Henderson R. Structure of the mitochondrial ATP synthase by electron cryomicroscopy. The EMBO journal. 2003, Vol. 22, 23, pp. 6182-6192.

45. Северин E.C. Биохимия. Второе издание. Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2004.

46. Rastogi V.K., Girvin М.Е. . Structural changes linked to proton translocation by subunit с of the ATP synthase. Nature. 1999, Vol. 402, 6759, pp. 263-268.

47. Gibbons C., Montgomery M.G., Leslie A.G., Walker J.E. The structure of the central stalk in bovine F(l)-ATPase at 2.4 A resolution. Nature structural biology. 2000, Vol. 7, 11, pp. 10551061.

48. Wilkens S., Borchardt D., Weber J., Senior A.E. . Structural characterization of the interaction of the delta and alpha subunits of the Escherichia coli F1F0-ATP synthase by NMR spectroscopy. Biochemistry. 2005, Vol. 44, 35, pp. 11786-11794.

49. Del Rizzo P.A., Bi Y., Dunn S.D., Shilton B.H. The "second stalk" of Escherichia coli ATP synthase: structure of the isolated dimerization domain. Biochemistry. 2002, Vol. 41, 21, pp. 68756884.

50. Lipmann F. Currents in Biochemical Research, ed. Green D.E. New York : Wiley (Intersciens), 1946. p. 137.

51. Slater, E.C. Mechanism of phosphorylation in the respiratory chain. Nature. 1953, Vol. 172, pp. 975-978.

52. Mitchell P., Moyle J. Group-translocation: a consequence of enzyme-catalysed group-transfer. Nature. 1958, Vol. 182, pp. 372-373.

53. Neumann J., Jagendorf A.T. Light-Induced Ph Changes Related Phosphorylation by Chloroplasts. Arch Biochem Biophys. 1964, Vol. 107, pp. 109-119.

54. Mitchell P, Moyle J. Respiration-driven proton translocation in rat liver mitochondria. The Biochemical journal. 1967, Vol. 105, 3, pp. 1147-1162.

55. Mitchell P., Moyle J. Evidence discriminating between the chemical and the chemiosmotic mechanisms of electron transport phosphorylation. Nature. 1965, Vol. 208, 5016, pp. 1205-1206.

56. Mitchell P., Moyle J. . Stoichiometry of proton translocation through the respiratory chain and adenosine triphosphatase systems of rat liver mitochondria. Nature. 1965, Vol. 208, pp. 147-151.

57. Levitskii D.O., Skulachev V.P. Effects of penetrating synthetic ions on the respiration of mitochondria and submitochondrial particles. Mol Biol. 1972, Vol. 6, pp. 267-272.

58. Mitchell P., Moyle J. Proton translocation coupled to ATP hydrolysis in rat liver mitochondria. Eur J Biochem . 1968, Vol. 4, pp. 530-539.

59. Kagawa Y., Kandrach A., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XXVI. Specificity of phospholipids required for energy transfer reactions. J Biol Chem . 1973, Vol. 248, pp. 676-684.

60. Nicholls D.G. The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-electrochemical gradient across the inner membrane of rat-liver mitochondria as determined by ion distribution. Eur J Biochem. 1974, Vol. 50, pp. 305-315.

61. Jagendorf A.T., Uribe E. . ATP formation caused by acid-base transition of spinach chloroplasts. Proc Natl Acad Sci USA . 1966, Vol. 55, pp. 170-177.

62. Moyle J., Mitchell P. . Active/inactive state transitions of mitochondrial ATPase molecules influenced by Mg2+, anions and aurovertin. FEBS Lett. 1975, Vol. 56, pp. 55-61.

63. Chappell J.B. Systems used for the transport of substrates into mitochondria. Br Med Bull. 1968, Vol. 24, pp. 150-157.

64. Mitchell P.,Moyle J. Translocation of some anions cations and acids in rat liver mitochondria. Eur J Biochem. 1969, Vol. 9, pp. 149-155.

65. Liberman E.A., Skulachev V.P. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion. Biochim Biophys Acta. 1970, Vol. 216, pp. 30-42.

66. Drachev L.A., Jasaitis A.A., Mikelsaar H., Nemecek I.B., Semenov A.Y., Semenova E.G., Severina II, Skulachev V.P. Reconstitution of biological molecular generators of electric current. H+-ATPase. J Biol Chem. 1976, Vol. 251, pp. 7077-7082.

67. Massari S., Azzone G.F. The mechanism of ion translocation in mitochondria. 2. Active transport and proton pump. Eur JBiochem. 1970, Vol. 12, pp. 310-318.

68. Racker E., Kandrach A. Reconstitution of the third site of oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 1971, Vol. 246, pp. 7069-7071.

69. Mitchell, P. Chemiosmotic Coupling in Oxidative and Photosynthetic Phosphorylation. Bodmin : Glynn Research Ltd., 1966.

70. Kell D.B. On the functional proton current pathway of electron transport phosphorylation. An electrodic view. Biochim Biophys Acta. 1979, Vol. 549, pp. 55-99.

71. Rottenberg H. The measurement of transmembrane electrochemical proton gradients. J Bioenerg. 1975, Vol. 7, pp. 61-74.

72. Mitchell, P. A chemiosmotic molecular mechanism for proton-translocating adenosine triphosphatases. FEBS Lett. 1974, Vol. 43, 2, pp. 189-94.

73. Бойер П.Д. Новые гипотезы о механизмах фосфорилирования и передачи энергии в мышцах и митохондриях. Сб. Молекулярная биология. 1964, р. 227.

74. Николе Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. Москва : Мир, 1985.

75. Sokolov V. S., Kuzmin V.G. Measurement of differences in the surface potentials of bilayer membranes according to the second harmonic of a capacitance current. Biofizika. 1980, Vol. 25, 1, pp. 170-172.

76. Antonenko Y.N., Kovbasnjuk O.N., Yaguzhinsky L.S. Evidence in favor of the existence of a kinetic barrier for proton transfer from a surface of bilayer phospholipid membrane to bulk water. Biochimica et biophysica acta. 1993, Vol. 1150, 1, pp. 45-50.

77. Krasinskaya I.P., Lapin M.V., Yaguzhinsky L.S. Detection of the local H+ gradients on the internal mitochondrial membrane. FEBS letters. 1998, Vol. 440, 1-2, pp. 223-225.

78. Solodovnikova I.M., Iurkov V.I., Ton'shin A.A., Iaguzhinskiï L.S. Local coupling of respiration processes and phosphorylation in rat liver mitochondria. Biofizika. 2004, Vol. 49, 1, pp. 47-56.

79. Kovbasnjuk O.N., Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. Proton dissociation from nigerisin at the membrane-water interface, the rate-limiting step of K'/W exchange on the bilayer lipid membrane. FEBS Lett. 1991, Vol. 289, 2, pp. 176-178.

80. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков A.A. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия. 2005, Vol. 70, 2, pp. 246-264.

81. Shimizu К., Wu G.S., Sultana С., Kalra V.K., Rao N.A. Stimulation of macrophages by retinal proteins: production of reactive nitrogen and oxygen metabolites. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1999, Vol. 40, 13, pp. 3215-3223.

82. Skulachev, V.P. A biochemical approach to the problem of aging: "megaproject" on membrane-penetrating ions. The first results and prospects. Biochemistry (Moscow). 2007, Vol. 72, 12, pp.1385-1396.

83. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L., Lesnefsky E.J. Production of reactive oxygen species by mitochondria. J. Biol. Chem. 2003, Vol. 278, 38, pp. 36027-36031.

84. Fluery C., Mignotte В., Vayssiere J.L. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. Biochimie. 2002, Vol. 84, 2-3, pp. 131-141.

85. Forman H.J., Fukuto J.M., Torres M. Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and nitrogen species can act as second messengers. Am. J.Physiol. Cell. Physiol. 2004, Vol. 287, pp. 246-256.

86. Moskovitz J., Berlett B.S., Poston J.M., Stadtman E.R. The yeast peptide-methionine sulfoxide reductase functions as an antioxidant in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, Vol. 94, pp. 9585-9589.

87. C.K., Sen. Redox signaling and the emerging therapeutic potential of thiol antioxidants. Biochem Pharmacol. 1998, Vol. 55, 11, pp. 1747-1758.

88. Быстрова М.Ф., Буданова E.H. Перекись водорода и пероксиредоксины в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации . Биологические мембраны. 207, Vol. 24, 2, pp. 115125.

89. Ohba М., Shibanuma М., Kuroki Т., Nose К. Production of hydrogen peroxide by transforming growth factor-beta 1 and its involvement in induction of egr-1 in mouse osteoblastic cells. J. Cell. Biol. 1994, Vol. 126, 4, pp. 1079-1088.

90. Murphy M.P., Smith R.A. Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations. Annual review of pharmacology and toxicology. 2007, Vol. 47, pp. 629-656.

91. Asin-Cayuela J., Manas A.R., James A.M., Smith R.A., Murphy M.P. Fine-tuning the hydrophobicity of a mitochondria-targeted antioxidant. FEBS letters. 2004, Vol. 571, (1-3), pp. 916.

92. Кравченко Д.В., Усков А.И., Замятнин А.А. . Оптимизация процесса получения оздоровленных микрорастений картофеля из меристематических эксплантов с использованием препарата SkQl. Москва : s.n., 2008. pp. 330-337.

93. Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаника. Москва : Мир, 1990. Vol. 2.

94. Kotlyar А.В., Vinogradov A.D. . Interaction of the membrane-bound succinate dehydrogenase with substrate and competitive inhibitors. Biochim. Biophys. Acta. 1984, Vol. 784, pp. 24-34.

95. Peshenko I.V., Shichi H. Oxidation of active center cysteine of bovine 1-Cys peroxiredoxin to the cysteine sulfenic acid form by peroxide and peroxynitrite. Free. Radic. Biol. Med. . 2001, Vol. 31,3, pp. 292-303.

96. Kramer, R. . Mitochondrial carrier proteins can reversibly change their transport mode: the cases of the aspartate/glutamate and the phosphate carrier. Exp. Physiol. . 1998, Vol. 83, pp. 259265.

97. Еремеев С.А., Мотовилов К.А., Волков E.M., Ягужинский JI.С. Новый представитель класса мембранотропных разобщителей SkQ3. Биологические мембраны. 2011, Vol. 28, 5, pp. 339-345.

98. Каргин В.И., Мотовилов К.А., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Взаимодействие положительно заряженного аналога убихинона (MitoQIO) с ДТ-диафоразой митохондрий печени. . Биологические мембраны. 2008, Vol. 25, pp. 34-40.

99. Skulachev V.P. et. al. . An attempt to prevent senescence: a mitochondrial approach. Biochimica et biophysica acta. 2009, Vol. 1787, (5), pp. 437-461.

100. Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 4. Age-related eye disease. SkQl returns vision to blind animals. Neroev VV. 12, 2008, Biochemistry (Moscow), Vol. 73, pp. 1317-1328.

101. Антоненко Ю.Н. и др. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 1. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro. . Биохимия (Моска). . 2008, Vol. 73, 12, pp. 1589-1606.

102. Murugova T.N., Gordeliy V.I., Islamov A.K., Kovalev Y.S., Kuklin A.I., Vinogradov A.D., Yaguzhinsky L.S. Structure of membrane of submitochondrial particles studied by small angle neutron scattering. Materials structure. 2006, Vol. 2, pp. 68-70.

103. Mulkidjanian A.Y., Heberle J., Cherepanov D.A. . Protons and interfaces: implications for biological energy conversion. Biochimica et biophysica acta. 2006, Vol. 1757, (8), pp. 913-930.

104. Haberer G., Kieber J.J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone. Plant physiology. 2002, Vol. 128, 2, pp. 354-362.

105. Johnson D., Lardy H. Isolation of liver or kidney mitochondria. Methods in enzymology. 1967, Vol. 10, pp. 94-96.

106. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of biological chemistry. 1951, Vol. 193, 1, pp. 265-275.

107. R.W., Estabrook. Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurement of ADP.O ratios. Methods in enzymology. 1967, Vol. 10, pp. 41-47.

108. Ryrie I.J., Jagendorf A.T. Correlation between a conformational change in the coupling factor protein and the high energy state in chloroplasts. J Biol Chem. 1972, Vol. 247, 14, pp. 44539.

109. Moroney J.V., McCarty R.E. Reversible uncoupling of photophosphorylation by a new bifunctional maleimide. J Biol Chem. 1979, Vol. 254, 18, pp. 8951-5.

110. Gasch A.P., Spellman P.T., Kao C.M., Carmel-Harel O., Eisen M.B., Storz G., Botstein D., Brown P.O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 2000, Vol. 11, 12, pp. 4241-4257.

111. Zheng M., Aslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation. Science. 1998, Vol. 279, 5357, pp. 1718-1721.

112. Na H.K., Surh Y.J. Transcriptional regulation via cysteine thiol modification: a novel molecular strategy for chemoprevention and cytoprotection. Mol Carcinog. 2006, Vol. 45, 6, pp. 368-380.

113. Wu R.F., Terada L.S. Oxidative modification of protein tyrosine phosphatases. Sci STKE. 2006, Vol. 2006, 332.

114. Werner E. GTPases and reactive oxygen species: switches for killing and signaling. J. Cell. Sci. 2004, Vol. 117, 2, pp. 143-153.

115. Wood Z.A., Poole L.B., Karplus P.A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 2003, Vol. 300, 5619, pp. 650-653.

116. Butterfield L.H., Merino A., Golub S.H., Shau H. From cytoprotection to tumor suppression: the multifactorial role of peroxiredoxins. Antioxid. Redox. Signal. 1999, Vol. 1, 4, pp. 385-402.

117. Bae Y.S., Kang S.W., Seo M.S., Baines I.C., Tekle E., Chock P.B., Rhee S.G. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem. 1997, Vol. 272, 1, pp. 217-221.

118. Lee S.R., Kwon K.S., Kim S.R., Rhee S.G. Reversible inactivation of protein-tyrosine phosphatase IB in A431 cells stimulated with epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 1998, Vol. 273, 25, pp. 15366-15372.

119. Sattler M., Winkler T., Verma S., Byrne C.H., Shrikhande G., Salgia R., Griffin J.D.

120. Hematopoietic growth factors signal through the formation of reactive oxygen species. Blood. 1999, Vol. 93,9, pp. 2928-2935.

121. Belmonte M.A., Santos M.F., Kihara A.H., Yan C.Y., Hamassaki D.E. Light-Induced photoreceptor degeneration in the mouse involves activation of the small GTPase Racl. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006, Vol. 47, 3, pp. 1193-1200.

122. Deshpande S.S., Qi B., Park Y.C., Irani K. Constitutive activation of racl results in mitochondrial oxidative stress and induces premature endothelial cell senescence. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003, Vol. 23, 1, pp. 1-6.

123. Hordijk, P.L. Regulation of NADPH oxidases: the role of Rac proteins. Circ. Res. 2006, Vol. 98, 4, pp. 453-462.

124. Puceat, M. Role of Rac-GTPase and reactive oxygen species in cardiac differentiation of stem cells. Antioxid. Redox. Signal. 2005, Vol. 7, 11-12, pp. 1435-1439.

125. Kulinsky VI, Kolesnichenko LS. Regulation of metabolic and energetic functions of mitochondria by hormones and signal transduction systems. Biochemestry (Moscow) Supplemental series B: Biomedical chemistry. 2007, Vol. 1, 2, pp. 95-113.

126. Krasinskaya I.P., Marshansky V.N., Dragunova S.F., Yaguzhinsky L.S. Relationships of respiratory chain and ATP-synthetase in energized mitochondria. FEBS Lett. 1984, Vol. 167, 1, pp. 176-180.

127. Yaguzhinsky L.S., Yurkov V.I., Krasinskaya I.P. On the localized coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. 2006, Vol. 1757, pp. 408414.

128. Neroev V.V. Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 4. Age-related eye disease. SkQl returns vision to blind animals. Biochemistry (Moscow). 2008, Vol. 73, 12, pp. 1317-1328.