Оптимизация методов получения антигенного материала и поликлональных антител для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации эндомикоризных грибов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Козлова, Наталия Валерьевна

• Козлова, Наталия Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козлова, Наталия Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль эвдомикоризных грибов в жизни растений.

1.2. Биоразнообразие и идентификация эндомикоризных грибов. Современные методы исследования

1.2.1. Биологическое разнообразие эндомикоризных грибов.

1.2.2. Изучение биоразнообразия и идентификация эндомикоризных грибов с помощью молекулярно-генетических методов.

1.2.3. Использование иммунохимических методов для изучения биоразнообразия и идентификации эндомикоризных грибов

1.2.3.1. Молекулярные основы иммунохимических методов. Поликлональные и моноклональные антитела.

1.2.3.2. Особенности получения антител к антигенам эндомикоризных грибов.

1.2.3.3. Использование антител для серогруппирования AMГ и их идентификации в почве и корнях.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы грибов и условия культивирования.

2.2. Получение и поддержание культур Ri-трансформированных корней и установление эндомикоризного симбиоза in vitro.

2.3. Определение степени микоризной колонизации корней.

2.4.Получение иммунных сывороток и оценка активности антител.

2.5. Выделение иммуноглобулинов.

2.6. Определение специфичности антител к поверхностным антигенам почвообитающих грибов.

2.7. Анализ антигенных структур AMT

2.7.1. Двумерный иммуноэлектрофорез и прибор для его проведения.

2.7.2. Приготовление буфера, агарозных гелей и белковых растворов. Проведение иммуноэлектрофореза.

2.7.3. Визуализация иммунопреципитатов.

2.7.4. Характеристика антигенных детерминант.

2.7.5. Идентификация изолята AMT по морфологическим признакам. 60 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ:

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО МАТЕРИАЛА

3.1. Оптимизация метода очистки везикул эндомикоризных грибов от корней P. australis.

3.2. Совместное культивирование Glomus intraradices штамма 7 и Ri-трансформированных корней.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

4.1. Подготовка антигена к иммунизации.

4.2. Схема иммунизации.

4.3. Специфичность антител к поверхностным антигенам.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР

5.1. Общая характеристика выявленных антигенов. Динамика активности антител.

5.2. Полиморфизм белковых антигенов эндомикоризных грибов.

5.3. Идентификация изолята Gigaspora margarita с помощью морфологических критериев.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация методов получения антигенного материала и поликлональных антител для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации эндомикоризных грибов»

Актуальность проблемы. Симбиоз с эндомикоризными грибами (арбускулярно-микоризными грибами, AMT) приводит к улучшению минерального питания растений, увеличивает их устойчивость к фитопатогенам и другим стрессовым воздействиям, а также способствует выводу из почвы солей тяжелых металлов и радионуклидов /Marschner and Dell, 1994/. Отсутствие методов надежной идентификации AMГ и сложность их культивирования без растения-хозяина являются серьезными препятствиями для изучения этих микроорганизмов, в том числе, оценки их биоразнообразия. Систематика AMT базируется на морфологических критериях /Trappe, 1982; Walker, 1992/, весьма неоднозначных вследствие модификационной изменчивости морфологических признаков и внутривидовых вариаций /Morton, 1988/.

Иммунохимические методы привлекательны для решения задач идентификации и систематики благодаря специфичности реакции антиген -антитело. Для изучения AMT с помощью иммунохимических методов важными задачами являются получение специфичных антител и выбор метода, адекватного для решения поставленных задач. Получение антител к водорастворимым белкам AMT целесообразно ввиду их видоспецифичности и способности индуцировать строгий иммунный ответ. Использование иммуноэлектрофореза и поликлональных антител перспективно для оценки биоразнообразия AMT и степени их родства, так как позволяет оценить полиморфизм сразу нескольких белковых антигенов. Для получения поликлональных антител и проведения иммуноэлектрофоретического анализа необходимо значительное количество белкового антигена AMT, свободного от растительных примесей. Однако, низкое процентное содержание белка в структурах этих грибов (не более 20 %) и невозможность нарастить существенное количество их биомассы без растения-хозяина /Неррег, 1984; Williams, 1991/ затрудняют получение достаточного количества антигена.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - получить поликлональные антитела к водорастворимым белкам эндомикоризного гриба и использовать их для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации AMГ. Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1. Оптимизировать метод очистки везикул AMT от растительных тканей.

2. Оптимизировать процесс подготовки белкового антигена везикул к иммунизации.

3. Предложить схему иммунизации для получения активных поликлональных сывороток к водорастворимым белкам везикул эндомикоризного гриба.

4. Проанализировать полиморфизм водорастворимых белковых антигенов нескольких видов AMT.

Научная новизна работы. Предложен способ получения политональных антител к водорастворимым белкам везикул эндомикоризного гриба Glomus intraradices. Оптимизирован метод получения белковых антигенов AMГ, свободных от растительных примесей. Предложена совокупность приемов подготовки антигена к иммунизации, позволяющая существенно увеличить концентрацию и иммуногенность белков эндомикоризного гриба. Впервые методом двумерного иммуноэлектрофореза проанализирован полиморфизм белковых антигенов эндомикоризных грибов. Показано наличие семи перекрестно реагирующих антигенов для G. intraradices и G. species и пяти таких антигенов для G. intraradices и G. constrictum. Три антигена были обнаруженных только у G. intraradices. Рассмотренные подходы позволяют изучать биоразнообразие и проводить идентификацию AMT на качественно новом уровне.

Практическая ценность работы. Получены поликлональные антитела, позволяющие изучать поведение и развитие G. intraradices в условиях модельных опытов, приближенных к естественным. Идентификация специфичных антигенов методом иммуноэлектрофореза может быть использована для контроля чистоты биопрепарата на основе G. intraradices штамма 7 и мониторинга при его использовании. Предложенные методы очистки структур эндомикоризных грибов от растительных примесей, подготовки антигенного материала к иммунизации и получения поликлональных антител к G. intraradices штамму 7 открывают перспективы для получения антител к другим видам AMT.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации были изложены на второй международной конференции по микоризе (Упсала, Швеция, 1998), конференции «Проблемы микологии на рубеже веков» (Москва, 2000), Докучаевских молодежных чтениях 2000 «Почвы и биоразнообразие» (Санкт-Петербург), международной конференции «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность» (Санкт-Петербург, 2000). По материалам диссертации опубликовано три работы и две работы принято к публикации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит восемь таблиц, 11 рисунков. Список использованной литературы включает 149 наименований, в том числе 138 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Козлова, Наталия Валерьевна

выводы

1. Оптимизирован метод очистки везикул эндомикоризных грибов от корней P. australis. Содержание примесей в материале очищенных везикул не превышает 5 - 10 %. Очищенные везикулы сохраняют жизнеспособность и нативность структуры, что позволяет использовать их как для выделения белка, так и для инокуляции корней.

2. Показана возможность установления симбиоза G. intraradices штамма 7 с культурами Ri-трансформированных корней гороха, табака и картофеля с образованием характерных эндомикоризных структур внутри коротких участков корней. Оптимизирован метод поверхностной стерилизации везикул, позволяющий использовать их в качестве инокулюма для установления AM симбиоза in vitro.

3. Оптимизирован метод экстракции белков из везикул AMT. Предложен процесс подготовки антигена к иммунизации, направленный на увеличение концентрации белка и иммуногенности материала эндомикоризных грибов.

4. Получены поликлональные антитела к водорастворимым белкам G. intraradices. Предложена схема иммунизации, основанная на введении малых доз антигенного материала и позволяющая получить значительное количество активных антител необходимой специфичности, используя одного кролика-донора.

5. Проведен анализ полиморфизма белковых антигенов трех видов эндомикоризных грибов. Показано наличие пяти перекрестно реагирующих антигенных детерминант для Glomus intraradices и Glomus constrictum и семи таких детерминант для Glomus intraradices и Glomus species. Кроме того, показано наличие трех антигенных детерминант Glomus intraradices, не выявляемых полученными антителами у двух других видов Glomus.

6. На основании анализа иммунохимических и морфологических признаков изолят Gigaspora margarita переопределен как Glomus species.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа осуществлена при поддержке двух грантов для студентов, аспирантов, молодых ученых и специалистов (кандидатский проект) администрации Санкт-Петербурга, Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации и Российской Академии наук, а также при поддержке совместной программы ВНИИСХМ - Soil and Water Research Institute (Иран).

Автор выражает благодарность Струнниковой О. К, Лабутовой Н. М., Востряковой В. И., Лутовой Л. А. Ходжаевой Л. Т., Зеленникову О. В., Богомяко С. А. и Гинзбургу М. М. за неоценимую помощь в выполнении и оформлении работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы были получены поликлональные антитела к водорастворимым белкам Glomus intraradices штамм 7, пригодные как для изучения полиморфизма белковых антигенов, так и для идентификации эндомикоризных грибов.

Проведенное исследование предлагает ряд методик, позволяющих преодолеть трудности работы с эндомикоризными грибами, которые, несомненно, будут полезны для изучения этих облигатных симбионтов. В частности, предложен эффективный метод очистки везикул эндомикоризных грибов от корней P. australis, оптимизирован метод экстракции белков из везикул AMT и процесс подготовки антигена к иммунизации, направленный на увеличение концентрации бежа и иммуногенности материала AMГ.

Предложенная схема иммунизации позволила получить активные антитела, специфичность которых была достаточна для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации AMT. Несомненным достоинством данной схемы является возможность экономного использования антигена эндомикоризных грибов. Кроме того, данная схема иммунизации может служить основой для разработки модифицированных схем. Например, для получения антител с высоким сродством к поверхностным структурам, необходимым для изучения AMT в почве, в схему иммунизации могут быть включены дополнительные инъекции поверхностными структурами AMT.

Специфичность полученных антител к поверхностным антигенам АМГ открывает возможность использования антител для изучения эндомикоризных грибов в естественных условиях в случаях, когда необходимо отличить мицелий АМГ от мицелия немикоризных почвообитающих грибов. Поскольку мицелий АМГ не обладает четкими морфологическими отличиями, изучение ранних стадий формирования эндомикоризного симбиоза, в том числе, механизмов контакта АМГ при взаимодействии с растением затруднено. Проблемы идентификации мицелия АМГ часто возникают при изучении процессов, происходящих при совместной инокуляции растений микоризными и другими почвообитающими (например, фитопатогенными) грибами. Кроме того, стадия развития эндомикоризных грибов в почве исследована крайне мало ввиду тех же объективных трудностей. При правильной организации модельного опыта, исключающей одновременное наличие нескольких видов АМГ, использование полученных антител позволит решить проблему идентификации эндомикоризных грибов и изучать эти микроорганизмы в условиях, приближенных к естественным.

Взаимодействие антител, полученных к фракции водорастворимых белков, с поверхностными антигенами мицелия и спор шести видов АМГ является серьезным аргументом в пользу наличия антигенных детерминант, общих для водорастворимой фракции и поверхностных структур АМГ.

Полученные в работе данные говорят о применимости использования сравнительного иммуноэлектрофоретического анализа белковых антигенных детерминант для оценки биоразнообразия и идентификации эндомикоризных грибов. Однако, проделанная работа является лишь первым шагом в этом направлении. Анализ полиморфизма белковых антигенов с использованием широкого спектра антител к различным таксономическим группам AMT в совокупности с морфологическими и молекулярно-генетическими данными позволит оценить степень родства этих грибов, что весьма важно для развития их систематики. Кроме того, анализ полиморфизма белковых антигенов нескольких изолятов, выделенных из разных мест обитания, может внести существенный вклад в оценку биологического разнообразия AMT, в том числе, и на подвидовом уровне.

Проделанная работа открывает путь для идентификации специфичных антигенов коммерческих штаммов и создания систем контроля чистоты и мониторинга соответствующих биопрепаратов. Одной из систем контроля может быть идентификация коммерческих штаммов на основании наличия специфичных антигенов, выявляемых методом иммуноэлектрофореза. Кроме того, возможно получение антител, специфичных к коммерческим штаммам, за счет выявления штаммоспецифичных антигенов методом сравнительного иммуноэлектрофоретического анализа и использования их в качестве иммуногена. В частности, возможно создание систем идентификации G.intraradices штамм 7, если штаммоспецифичность антигенов А2, В и С2 будет доказана по результатам более обширного анализа изолятов.

Полученные результаты показывают, что сравнительный анализ перекрестно реагирующих антигенных детерминант может быть крайне ценным для определения идентичности коллекционных штаммов эндомикоризных грибов.

Таким образом, результаты проведенного исследования, в частности предложенные подходы, расширяют возможности изучения эндомикоризных грибов с помощью иммунохимических методов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козлова, Наталия Валерьевна, 2000 год

1. Вееке Б. Принципы, оборудование, реактивы и процессы. Общие сведения. В кн.: Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. М.: Мир. 1977а.-с. 11-42.

2. Вееке Б. Перекрестный иммуноэлектрофорез. В кн.: Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. М.: Мир. 19776. с. 58-74.

3. Глотов Н. В., Животовский Л. А., Хованов Н. В., Хромов-Борисов Н. Н. Биометрия. Л.: Издательство ЛГУ, 1982. - 263с.

4. Гусев А. И., Цветков В. С. К технике постановки реакции микропреципитации в агаре // Лабораторное дело. 1961. - т. 2. - с. 43.

5. Зольникова Н. В., Воробьев Н. И. Методы исследования грибов, образующих с растениями микоризу арбускулярно-везикулярного типа / Под ред. Г. С. Муромцева. Санкт-Петербург, 1992. - 44с.

6. Карандашов В. Е. Особенности формирования и развития арбускулярной микоризы в условиях in vitro: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1999. -21с.

7. Муромцев Г. С., Маршунова Г. Н., Павлова В. Ф., Зольникова Н. В. Роль почвенных микроорганизмов в фосфорном питании растений // Успехи микробиологии. 1985. - т. 20. - с. 174-195.

8. Струнникова О. К., Муромцев Г. С. Изучение штаммов Verticillium dahliae и V. albo-atrum методом иммуноэлектрофореза // Микология и фитопатология. 1987. - т. 21. - № 2. - с. 155-160.

9. Хрущева Е. П., Согина И. И. Об участии эндомикоризы в фосфорном питании сельскохозяйственных растений // Микориза и другие формы консортивных связей в природе. Пермь, 1983. - с. 29 - 33.

10. Abbott L. К., Robson A. D., Hall I. R. Introduction of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi into agricultural soils // Australian Journal of Agricultural Research. 1983. - v. 34. - p. 741-749.

11. Abdalla M. E., Abdel-Fattah G. M. Influence of the endomycorrhizal fungus Glomus mosseae on the development of peanut pod rot disease in Egypt // Mycorrhiza. 2000. - v. 10. - p. 29-35.

12. Ahiabor B. D., Hirata H. Characteristic responses of three tropical legumesto the inoculation of two species of VAM fungi in Andosol soils with different fertilities //Mycorrhiza. 1994. - v. 5. - p. 63-70.

13. Aldwell F. E. B., Hall I. R. Monitoring spread of Glomus mosseae through soil infested with Acaulospora laevis using serological and morphological techniques // Trans. Br. Mycol. Soc. 1986. - v. 87. - p. 131-134.

14. Aldwell F. E. B., Hall I. R., Smith J. M. B. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to identify endomycorrhizal fungi // Soil. Biol. Biochem. 1983. - v. 15.-p. 377-378.

15. Aldwell F. E. B., Hall I. R., Smith J. M. B. Enzyme-linked immunosorbent assay as an aid to taxonomy of the Endogonaceae // Trans. Br. Mycol. Soc. 1985. - v. 84.-p. 399-402.

16. Al-Karaki G. N. Growth of mycorrhizal tomato and mineral acquisition under salt stress // Mycorrhiza. 2000. - v. 10. - p. 51-54.

17. Ames R. N., Reid C. P. P., Porter L. K., Cambardella C. Hyphal uptake and transport of nitrogen from two I5N labeled sources by Glomus mosseae, a vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus // New Phytol. 1983. - v. 95. - p. 381396.

18. Azcon R., Gomez M., Tobar R. Physiological and nutritional responses by Lactuca sativa L. to nitrogen sources and mycorrhizal fungi under drought conditions // Biology and Fertility of Soils. 1996. - v. 22. - p. 156-161.

19. Bécard G., Fortín J. A. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots // New Phytol. 1988. - v. 108. - p. 211-218.

20. Bécard G., Pfeffer P. E. Status of nuclear division in arbuscular mycorrhizal fungi during in vitro development // Protoplasma. 1993. - v. 194. - p. 62-68,

21. Bethlenfalvay G. J., Reyes-Solis M. G., Camel S. B., Ferrera-Cerrato R. Nutrient transfer between the root zones of soybean and maize plants connected by a common mycorrhizal mycelium // Physiol. Plant. 1991. - v. 82. - p. 423-432.

22. Bolan N. S., Robson A. D., Barrow N. J. Effects of vesicular-arbuscular mycorrhiza on the availability of iron phosphates to plants // Plant Soil. 1987. -v. 22.-p. 401-410.

23. Bonfante-Fasolo P., Faccio A., Perotto S., Schubert A. Correlation between chitin distribution and cell wall morphology in the mycorrhizal fungus Glomus versiforme II Mycol. Res. 1990. - v. 94. - p. 157-165.

24. Casana M., Bonfante-Fasolo P. Ife intercellulari ed arbuscoli di Glomus fasciculatum (Thaxter) Gerd. et Trappe isolate con digestione enzimatica // Allionia. 1982. - v. 25. - p. 17-25.

25. Chabot S., Bécard G., Piché Y. Life cycle of Glomus intraradices in root organ culture//Mycologia. 1992. - v. 84. - p. 315-321

26. Chelius M. K., Triplett E. W. Rapid detection of arbuscular mycorrhizae in roots and soil of an intensively managed turfgrass system by PCR amplification of small subunit rDNA // Mycorrhiza. 1999. - v. 9. - p. 61-64.

27. Clapp J. P., Young J. P. W., Merryweather J. W., Fitter A. H. Diversity of fungal symbionts in arbuscular mycorrhizas from a natural community // New Phytol. 1995. v. 130.-p. 259-265.

28. Cooke J. C., Gemma J. N., Koske R. E. Observations of nuclei in vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi // Mycologia. 1987. - v. 79. - p. 331-333.

29. Cordier C., Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Immunodetection de champignons endomycorhiziens a arbuscules in planta // Acta Bot Gallica. -1994.-v. 141,-p.465-468.

30. Dewey M., Evans D., Coleman J., Priestley R., Hull R., Horsley D., Hawes C. Antibodies in plant science // Acta Bot Neerl. 1991. - v.40. - p. 1-27.

31. Diop T. A., Plenchette C., Strullu D. G. Dual axenic culture of sheared-root inocula of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with tomato roots // Mycorrhiza. 1994. - v. 5. - p. 17-22.

32. Franken P., Gianinazzi-Pearson V. Construction of genomic phage libraries of the arbuscular mycorrhizal fungi Glomus mosseae and Scutellospora castanea and isolation of ribosomal RNA genes // Mycorrhiza. 1996. - v. 6. - p. 167-173.

33. Friese C. F., Allen M. F. Tracking the fates of exotic and local VA mycorrhizal fungi: methods and patterns // Agric. Ecosys. Environ. 1991. - v. 34. - p. 8796.

34. Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Enzymatic studies on the metabolism of vesicular-arbuscular mycorrhiza. II soluble alkaline phosphatase specific to the mycorrhizal infection in onion roots // Physiol. Plant Pathol. 1978. - v. 12. - p. 45-53.

35. Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Protein and protein activities in endomycorrhizal symbioses. In: Mycorrhiza: function, molecular biology and biotechnology. / ed. B. Hock, A. K. Varma. Springer-Verlag. - Heidelberg, 1994.

36. Gibbons A. Systematics goes molecular // Science. -1991. v. 251. - p. 872-874.

37. Giersch T., Hock B. Production of monoclonal antibodies for the determination of s-triazines with enzyme immunoassays // Food Agrie. Immunol. 1990. - v. 2. -p. 85-97.

38. Giovanetti M., Gianinazzi-Pearson V. Biodiversity in arbuscular mycorrhizal fungi // Mycol. Res. 1994. - v. 98. - p. 705-715.

39. GÓbel C., Hahn A., Hock B. Production of polyclonal and monoclonal antibodies against hyphae from arbuscular mycorrhizal fungi // Critical Reviews in Biotechnology. 1995. - v. 15. - p. 293-304.

40. Gupta R., Krishnamurthy K. V. Response of mycorrhizal and nonmycorrhizal Arachis hypogaea to NaCl and acid stress // Mycorrhiza. 1996. - v. 6. - p. 145149.

41. Haas J. H., Krikun J. Efficacy of endomycorrhizal fungus isolates and inoculum quantities required for growth response // New Phytologist. 1985. - v. 100. - p. 613-621.

42. Hahn A., Bonfante P., Horn K., Pausch F., Hock B. Production of monoclonal antibodies against surface antigens of spores from arbuscular mycorrhizal fungi by an improved immunization and screening procedure // Mycorrhiza. 1993. -v.4. - p. 69-78.

43. Hahn A., Horn K., Hock B. Serological properties of mycorrhizae. In: Mycorrhiza: function, molecular biology and biotechnology. / ed. B. Hock, A. K. Varma. Springer-Verlag. - Heidelberg, 1994b

44. Hall I. R., Field trials assessing the effect in inoculating agricultural soils with endomycorrhizal fungi // Journal of Agricultural Science. 1984. - v. 102. - p. 725-731.

45. Harboe N. M. G., Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins and antibody titre determination // Scand. J. Immunol. 1983. - v. 17. - p. 345-351.

46. Hardham A. R., Suzaki E., Perkin J. L. Monoclonal antibodies to isolate-, species-, and genus-specific components on the surface of zoospores and cysts of the fungus Phytophthora cimmamomi I I Can. J. Bot. 1986. - v. 64. - p. 311321.

47. Harley J. L., Smith S. E. Mycorrhizal symbiosis. London: Academic Press, 1983.-483 pp.

48. Harley J. L. The significance of Mycorrhiza // Mycological research. 1989. - v. 92, part 2.-p. 129-139.

49. Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

50. Haselwandter K., Berreck M. Accumulation of radionuclides in fungi. In: Metal ions in fungi. / ed. G. Winkelmann, D. R. Winge. Marcel Dekker. - New York, 1994.-p. 259-277.

51. Hassouna N., Michot B., Bachellerie J. P. The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene. Implication for the process of size increase of the large rRNA in higher eucaryotes // Nucleic Acid Res. 1984. - v. 12. - p. 3563-3583.

52. Hayashi K., Yandell D. W. How sensitive is PCR-SSCP? // Hum. Mutat. 1993. - v.2. - p. 338-346.

53. Hepper C. M. Isolation and culture of VA mycorrhizal (VAM) fungi. In: VA Mycorrhiza. / ed. C. L. I. Powell, D. J. Bagyaraj. CRC Press. - Boca Raton, Fla, 1984.-p. 95-112.

54. Hepper C. M., Mosse B. Techniques used to study the interaction between Endogone and plant roots. In: Endomycorrhizas. / ed. F. E. Sanders, B. Mosse, P. B. Tinker. Academic Press. - London, 1975. - p. 65-75.

55. Hepper C. M., Sen R., Azcon-Aguilar C., Grace C. Variation in certain isozymes amongst different geographical isolates of the vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi Glomus monosporum and Glomus mosseae // Soil Biol. Bioch. 1988a. - v. 20.-p. 51-59.

56. Hepper C. M., Azcon-Aguilar C., Rosendahl S., Sen R. Competition between three species of Glomus used as spatially separated introduced and indigenousmycorrhizal inocula for leek {Allium porrum L.) // New Phytol. 1988b. - v. 110. -p. 207-215.

57. Horn K., Hahn A., Pausch F., Hock B. Isolation of pure spore and hyphal fractions from vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi // J. Plant Physiol. 1992. -v. 141.-p. 28-32.

58. Jabaji-Hare S., Sridhara S. J., Kendrick B. A technique for the isolation of intramatrical vesicles from vesicular-arbuscular mycorrhizae // Can. J. Bot. -1984.-v. 62.-p. 1466-1468.

59. Jackson N. E., Miller R. H., Franklin R. E. The influence of vesicular-arbuscular mycorrhizae on uptake of 90 Sr from soil by soybeans // Soil Biol. Biochem. -1973.-v. 5.-p. 205.

60. Jakobsen I., Rosendahl L. Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants // New Phytol. 1990. - v. 115. - p. 77-83.

61. Jakobsen I., Abbot L. K., Robson A. D. External hyphae of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with Trifolium subterraneum L. Spread of hyphae and phosphorus inflow into roots // New Phytol. 1992. - v. 120. - p. 371-380.

62. Karandashov V., Kuzovkina I., Hawkins H-J., George E. Growth and sporulation of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus caledonium in dual culture with transformed carrot roots // Mycorrhiza. 2000. - v. 10. - p. 23-28.

63. Kawai Y., Yamamoto Y. Increase in the formation and nitrogen fixation of soybean nodules by vesicular-arbuscular mycorrhiza // Plant Cell Physiol. -1986.-v. 27.-p. 399-405.

64. Khaliq A., Sanders F. E. Effects of phosphorus application and vesicular arbuscular mycorrhizal inoculation on the growth and phosphorus nutrition of maize // Journal of Plant Nutrition. 1997. - v. 20. - p. 1607-1616.

65. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity //Nature. 1975. - v. 256. - p. 495-497.

66. Kohn I. Developing new characters for fungal systematics: an experimental approach for determining the rank of resolution // Mycologia. 1992. - v. 84. -p. 139-153.

67. Kothari S. K. Marschner H., Römheld V. Contribution of VA mycorrhizal hyphae in acquisition of phosphorus and zinc by maize grown in a calcareous soil //Plant soil.-1991.-v. 131.-p. 177-185.

68. Kough J., Malajczuk N., Linderman R.G. Use of the indirect immunofluorescent technique to study the vesicular-arbuscular fungus Glomus epigaeum and other Glomus species // New Phytol. 1983. - v. 94. - p. 57-62.

69. Li X-L., George E., Marschner H. Extension of the phosphorus depletion zone in VA-mycorrhizal white clover in a calcareous soil // Plant Soil. 1991a. - v. 136. -p. 41-48.

70. Li X-L., Marschner H., George E. Acquisition of phosphorus and cooper by VA-mycorrhizal hyphae and root-to-shoot transport in white clover // Plant Soil. -1991b.-v. 136.-p. 49-57.

71. Liu A., Hamel C., Hamilton R.I., Ma B.L., Smith D.L. Acquisition of Cu, Zn, Mn, and Fe by mycoirhizal maize (Zea mays L.) grown in soil at different P and micronutrient levels // Mycorrhiza. 2000. - v.9. - p. 331-336.

72. Marschner H., Dell B. Nutrient uptake in mycorrhizal symbiosis // Plant and Soil. -1994.-v. 159.-p. 89-102.

73. McGraw A. C., Gamble J. F., Schenck N. C., Vesicular-arbuscular mycorrhizal uptake of cesium-134 in two tropical pasture grass species // Phytopathology. -1979.-v. 69.-p. 1038.

74. Micales J. A., Bonde M. R., Peterson G. L. The use of isozyme analysis in fungal taxonomy and genetics // Mycotaxon. 1986. - v. 27.- p. 405-449.

75. Michot B., Bachellerie J. P. Secondary structure of mouse 28S rRNA and general models for the folding of the large RNA in eucaryotes // Nucleic Acid Res. -1984.-v. 12.-p. 4259-4279.

76. Miller R. M., Jastrow J. D. The role of mycorrhizal fungi in soil conservation. In: Mycorrhiza in sustainable agriculture / ed. G. J. Bethlenfalvay, R. G. Linderman. ASA Spec. Publ. - Madison, 1992. - p. 29-44.

77. Miller-Wideman M. A., Watrud L. S. Sporulation of Gigaspora margarita on root cultures of tomato // Canad. J. Microbiol. 1984. - v. 30. - p. 642-646.

78. Morton J. B. Variation in mycorrhizal and spore morphology of Glomus occultum and Glomus diaphanum as influenced by plant and soil environment // Mycologia. 1985a. - v. 77. - p. 192-204.

79. Morton J. B. Underestimation of most probable numbers of vesicular-arbuscular endophytes because of nonstaining mycorrhizae // Soil Biol. Biochem. 1985b. -v. 17.-p. 383-384.

80. Morton J. B. Taxonomy of VA mycorrhizal fungi: classification, nomenclature, and identification // Mycotaxon. 1988. - v. 32. - p. 267-324.

81. Morton J. B. Evolutionary relationships among arbuscular mycorrhizal fungi in the Endogonaceae // Mycologia. 1990. - v. 82. - p. 192-207.

82. Mosse B., Hepper C. Vesicular-arbuscular mycorrhizal infections in root organ cultures // Physiol. Plant Pathol. 1975. - v. 5. - p. 215-223.

83. Mugnier J., Mosse B. Vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in transformed root-inducing t-DNA roots grown axenically // Phytopathology. 1987. - v. 77. -p. 1045-1050.

84. Mullis K., Faloona F., Schaarf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. // Quant. Biol. 1986. - v. 51. - 263-273.

85. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. - v. 15. - p. 473-497.

86. Pacovsky R. S., Fuller G., Stafford A. E., Paul E. A. Nutrient and growth interactions in soybeans colonized with Glomus fasciculatum and Rhizobium japonicum II Plant Soil. 1986. - v. 92. - p. 37-45.

87. Perrin R. Interactions between mycorrhizae and diseases caused by soil-borne fungi II Soil Use Manag. 1990. - v. 6. -p. 189-195.

88. Raju P. S., Clark R. B., Ellis J. R., Maranville J. W. Mineral uptake and growth of sorghum colonized with VA mycorrhiza at varied soil phosphorus levels // J. Plant Nutr. 1990. - v. 13. - p. 843-859.

89. Remy W., Tailor T. N., Hass H., Kerp H. Four hundred-million-years-old vesicular arbuscular mycorrhizae // Proceedings of the National Academy of Sciences USA.- 1994,-v. 91.-p. 11841-11843.

90. Rosendahl S., Sen R. Isosyme analysis of mycorrhizal fungi and their mycorrhiza. In: Methods in microbiology. Techniques for mycorrhizal research /ed. J. R. Norris, D. J. Read, A. K. Varma. Academic Press. - London, 1994. - p. 629-654.

91. Ruiz-Lozano J. M., Azcon R., Gomez M. Effects of arbuscular-mycorrhizal Glomus species on drought tolerance: Physiological and nutritional plant responses //Appl. Environ. Microbiol. 1995. - v. 61. - p. 456-460.

92. Ruiz-Lozano J. M., Azcon R., Gomez M. Alleviation of salt stress by arbuscular-mycorrhizal Glomus species in Lactuca sativa plants // Physiol. Plant. 1996. -v. 98. - p. 767-772.

93. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S„ Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B., Erich H. A. Primer-directed enzyme amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. - v. 239. - p. 487-491.

94. Schenck N. C., Pérez Y. Manual for the identification of VA mycorrhizal fungi. -Gainesville: INVAM, University of Florida, 1988.-241 pp.

95. Sen R., Hepper C. M. Characterization of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi {Glomus spp) by selective enzyme staining following polyacrylamide gel electrophoresis // Soil Biol. Biochem. 1986. - v. 18. - p. 29-34.

96. Sharma M. P., Gaur A., Bhatia N. P., Adholeya A. Growth responses and dependence of Acacia nilotica var. cupriciformis on the indigenous arbuscular mycorrhizal consortium of a marginal wasteland soil // Mycorrhiza. 1996. - v. 6.-p. 441-446.

97. Simon L., Lalonde M., Bruns T.D. Specific amplification of 18S fungal ribosomal genes from vesicular-arbuscular endomycorrhizal fungi colonizing roots // Appl Environ Microbiol. 1992a. - v. 58. - p. 291-295.

98. Simon L., Levesque R. C., Lalonde M. Rapid quantification by PCR of endomycorrhizal fungi colonizing roots // PCR Methods and Application. -1992b.-v. 2.-p. 76-80.

99. Simon L., Bousquet J., Levesque R. C., Lalonde M. Origin and diversification of endomycorrhizal fungi and coincidence with vascular land plants // Nature. -1993a.-v. 363.-p. 67-69.

100. Simon L., Levesque R. C., Lalonde M. Identification of endomycorrhizal fungi colonizing roots by fluorescent single-strand conformation polymorphism -polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. — 1993b. v. 59. - p. 4211-4215.

101. Singleton L. L., Mihail J. D., Rush C. M. (eds) Methods for research on soilborne phytopathogenic fungi. St. Paul: APS Press, 1992. -p 243.

102. Smith S. E., Gianinazzi-Pearson V. Physiological interactions between symbionts in vesicular-arbuscular mycorrhizal plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bioi. 1988. - v. 39. - p. 221-244.

103. Smith S. E., Gianinazzi-Pearson V., Koide R., Cairney J. W. G. Nutrient transport in mycorrhizas: structure, physiology and consequences for efficiency of the symbiosis // Plant and Soil. 1994. - v. 159. - p. 103-113.

104. Straker C. J., Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S., Cleyet-Marel J. C., Bousquet N. Electrophoretic and immunological studies on acid phosphatase from a mycorrhizal fungus of Erica hispidula // New Phytol. 1989. - v. 111. — p. 215221.

105. Subramanian K. S., Charest C. Nutritional, growth and reproductive responses of maize (Zea mays L.) to arbuscular mycorrhizal inoculation during and after drought stress at tasselling // Mycorrhiza. 1997. - v.7 - p. 25-32.

106. Sward R. J. The structure of the spores of Gigaspora margarita. II. Changes accompanying germination//New Phytol. -1981. v. 88. - p. 661-666.

107. Sylvia D. Activity of external hyphae of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi // Soil Biol. Biochem. 1988. - v. 20. - p. 39-43.

108. Tommerup I. C. The vesicular-arbuscular mycorrhizas // Adv. Plant Pathol. -1988.-v. 6.-p. 81-91.

109. Walker C Systematics and taxonomy of the Glomales: a possible way forward // Agronomie. 1992. - v. 12. - p. 887-897

110. Walker C., Trappe J. M. Names and epithets in the Glomales and Endogonales // Mycol. Res. 1993. - v. 97. - p. 339-344.

111. Wang G., Whittam T. S., Berg M., Berg D. E. RAPD (arbitrary primer) PCR is more sensitive than multilocus enzyme electrophoresis for distinguishing related bacterial strains //Nucleic Acid Res. 1993. - v. 21. - p. 5930-5935.

112. Weinbaum B. S., Allen M. F., Friese C. F. Tracking the fate of Acaulospora and Scutellospora using fluorescent antibodies // Newsletter of the MSA. 1992. - v. 43.-p. 54

113. Weller T. H., Coons A. H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagates in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. - v. 86, n. 4.-p. 789-794.

114. Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tinguey S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acid Res. 1990. - v. 18. - p. 6531-6535.

115. Williams P.G. Axenic culture of arbuscular mycorrhizal fungi // Methods Microbiol. 1991. - v. 24. - p. 203-220.

116. Wilson I. M., Trinick M. J., Parker C. A. The identification of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi using immunofluorescence // Soil Biol. Biochem. -1983.-v. 15.-p. 439-445.

117. Wright S. F., Franke-Snyder M., Morton J. B., Upadhyaya A. Time-course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi during active colonization of roots // Plant Soil. 1996. - v. 181. - p. 193203.

118. Wright S. F., Morton J. B. Detection of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus colonization of roots by using a dot-immunoblot assay // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - v. 55. -p. 761-763.

119. Wright S. F., Morton J. B., Sworobuk J. E. Identification of a. vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus by using monoclonal antibodies in an enzyme-linked immunosorbent assay // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - v. 53. - p. 2222-2225.

120. Wright S. F., Starr J. L., Paltineanu I. C. Changes in aggregate stability and concentration of glomalin during tillage management transition // soil Sci. -1999.-v. 63.-p. 1825-1829.

121. Wright S. F., Upadhyaya A. Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi // Soil Sci. 1996. - v. 161. - p. 575-586.

122. Wright S. F., Upadhyaya A. A survey of soils for aggregate stability and glomalin, a glycoprotein produced by hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi // Plant Soil. 1998. - v. 198. - p. 97-107.

123. Wright S. F., Upadhyaya A. Buyer J. S. Comparison of N-linked oligosaccharides of glomalin from arbuscular mycorrhizal fungi and soils by capillary electrophoresis // Soil Biol. Biochem. 1998. - v. 30. - p. 1853-1857.

124. Wyss P., Bonfante P. Amplification of genomic DNA of arbuscular-mycorrhizal (AM) fungi by PCR using short arbitrary primers // My col Res. 1993. - v. 97. -p. 1351-1357.

125. Zézé A., Dulieu H., Gianinazzi-Pearson V. DNA cloning and screening of a partial genomic library from an arbuscular mycorrhizal fungus, Scutellospora castanea I I My corrhiza. 1994. - v. 4. - p. 251-254.