Окислительный стресс и действие разобщителей. Ультраструктурное исследование на клетках Saccharomyces cerevisiae и Podospora anserina тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Ожован, Сильвия Михайловна

• Ожован, Сильвия Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ожован, Сильвия Михайловна

ОПЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Окислительный стресс и АФК.

АФК, старение и ПКС.

Изучение ПКС в клетках ЗассЬаготусез селет/'ае.

Индуцированный апоптоз в клетках БассИаготусвз сегечмае.

Антиоксидантные системы защиты клетки.

Антиоксиданты направленного действия.

Роль разобщителей в борьбе с АФК.

Особенности ультраструктуры митохондрий дрожжей.

Функционально-зависимые параметры ультраструктуры митохондрий.

РсхЗозрога апзеппа-модельный организм.

Особенности Робозрога апБвппа.

Старение Робозрога апзеппа.

Особенности ультраструктуры Робозрога апзеппа при старении.

Митохондриальные АФК.

Митохондриальная ДНК: нестабильность и реорганизация.

Долгоживущие штаммы Р. апзеппа.

Значение изучения старения Робозрога ап5вппа для других организмов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Культура клеток.

2. Обработка клеток веществами, влияющими на уровень АФК.

3. Флюорисцентная микроскопия.

4. Фиксация клеток для электронно-микроскопического исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Часть I. Исследование структуры БассЬаготусез сегеу'я'юе дикого типа и мутанта Дуэр2 в условиях действия индукторов апоптоза и митохондриально-направленных антиоксидантов и разобщителей.

1.1. Ультраструктура клеток 5асс|1аготусе5 сегеуЫае дикого типа и мутанта Ду5р2 при действии индуктора апоптоза -амиодарона.

Исследование действия амиодарона: флуоресцентная микроскопия.

Исследование действия амиодарона: электронная микроскопия.

1.2. Исследование ультраструктуры клеток дрожжей Б. сегеуЫае при фосфолипидозе, вызванного амиодароном.

1.3. Исследование эффектов РССР и С12ТРР и изменений ультраструктуры клеток Б. сегеуЫае при одновременной инкубации с амиодароном.

1.4. Защитное действие митохондриально-направленного антиоксиданта БкЦ3 при апоптозе, вызванном амиодароном.

1.5. Влияние высоких концентраций митохондриально-направленного катиона С12ТРР на ультраструктуру клеток БассИаготусез сегеуыае.

1.6. Действие мягких разобщителей С12РВ и С12Ш9, на ультраструктуру клеток Б. сегеуыае.

Часть II. Исследование ультраструктуры Рос/строга апБеппа.

2.1. Увеличение продолжительности жизни нитчатого гриба с помощью митохондриально-направленного катиона БкС^.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Ультраструктурные исследования на клетках БассЬаготусез сегечыае. а. Исследование септирования митохондрий клеток БассИаготусез сегечыае при обработке амиодароном. б. Амиодарон и липидные включения. в. Влияние проникающих катионов и АФК на ультраструктуру митохондрий.

2. Ультраструктурные исследования на клетках Р. апзвг'та.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК- активные формы кислорода

ЛВ-липидное включение мтДНК- митохондриальная ДНК

МТП- митохондриальная транзиционная пора

СОД- супероксиддисмутаза

ПКС- программируемая клеточная смерть ппДНК- плазмидоподобная ДНК стДНК- стареющая ДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Окислительный стресс и действие разобщителей. Ультраструктурное исследование на клетках Saccharomyces cerevisiae и Podospora anserina»

Невозможно точно определить, кто впервые открыл митохондрии как самостоятельные клеточные структуры цитоплазмы. Однако, уже в конце 19 века в литературе появились сообщения, что можно наблюдать «в цитоплазме клеток гранулярные элементы и включения, которым приписывались различные функции» (Ленинджер, 1966). Упоминания митохондрий можно встретить в работах Кольцова (Кольцов, 1903), а также Максимова (Максимов, 1914).

Кёлликер впервые выделил митохондрий из клеточных структур. В 1888 году он выделил эти гранулы из мышцы насекомых и показал, что они обладают мембраной и набухают в воде. На протяжении ста с лишним лет велись кропотливые морфологические и цитологические исследования, которые постепенно подготавливали почву для всестороннего изучения природы митохондрий.

Окислительное фосфорилирование было открыто в 1930 году советским биохимиком В.А. Энгельгардтом при работе с эритроцитами птиц. В 1939 году В.А. Белицер и Е.Т. Цыбакова показали, что окислительное фосфорилирование сопряжено с переносом электронов по цепи дыхательных ферментов, встроенных (как было установлено позднее) во внутреннюю мембрану митохондрий. В короткий срок были открыты осмотическая, сократительная, регуляторная и генетическая функции митохондрий и найдены многие из тех молекулярных структур, которые служат первичным субстратом этих функций. Было показано также, что митохондрии обеспечивают интеграцию многочисленных процессов клеточного обмена, кроме того активно участвуя в процессе программированной клеточной смерти (ПКС).

ПКС широко изучается в многоклеточных организмах, в настоящее время показано, что одноклеточный организм Saccharomyces cerevisiae также имеет программу апоптоза. На сегодняшний день известно, что ключевую роль в процессе апоптоза дрожжей Saccharomyces cerevisiae, как и у животных, играют митохондрии (Gordeeva et al., 2004; Madeo et al., 2004). Динамика морфологии и ультраструктуры митохондрий у животных отражает процесс апоптоза (Cheng et al., 2006).

Помимо этого, на сегодняшний день доказана корреляция между избытком выработки митохондриальных активных форм кислорода (АФК) и процессом старения. В основе некоторых теорий старения лежит гипотеза о том, что окислительный стресс и нарушения, вызванные генерацией АФК, в конечном итоге приводят к накоплению молекулярных дефектов и к гибели организма (Osiewacz , 2002). Нарушения в работе митохондрий, вызванные окислительным стрессом, считаются причиной сверхпродукции АФК.

В настоящее время показано, что митохондриально-направленные антиоксиданты (в т.ч. и SkQ) являются эффективными протекторами клеток и их органелл в условиях окислительного стресса и старения (Anisimov, 2008). Протекторный эффект отчасти зависит от разобщающего действия.

Ультраструктурные изменения митохондрий при стрессе и старении изучены в меньшей степени, чем функциональные. Для изучения таких изменений мы применили метод электронной микроскопии. Кроме того, с помощью метода электронной микроскопии мы охарактеризовали действие целого ряда митохондриально-направленных веществ, обладающих свойствами разобщения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Окислительный стресс и АФК

Окислительный стресс - процесс повреждения клетки в результате повышенной генерации АФК и последующего перекисного окисления молекулярных компонентов клетки. Окислительный стресс - один из самых широко изучаемых процессов в современной биологической науке в настоящее время.

АФК - чрезвычайно реакционно-способные неустойчивые молекулы (02", Н2Ог, *ОН, НО2*, 'Ог, НО2-) промежуточных продуктов обмена. Они образуются как в нормальных метаболических реакциях, так и спонтанно под действием различных стрессов (УФ-лучи, радиация и т.д.), при окислительном стрессе и различных патологиях.

Митохондрии, как уже отмечалось, являются основным эндогенным источником активных форм кислорода в клетке в результате работы электронно-транспортной цепи (Richter, 1988; Rodriguez-Menocal, Urso, 2004). В митохондриальной мембране электронно-транспортная цепь организована сложным образом. В составе основной цепи, общей для животных, растений и грибов, имеется четыре белковых трансмембранных комплекса (НАДН-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, бокомплекс, цитохромоксидаза) и АТФ-синтаза. Связь между комплексами осуществляют подвижные переносчики: убихинон и цитохром с. У растений и грибов в электрон-транспортной цепи имеются также четыре дополнительные НАДН-дегидрогеназы и альтернативная оксидаза. Генерация АФК происходит на НАДН-дегидрогеназе, сукцинатдегидрогеназе, ¿^-комплексе.

Так, свободные радикалы повреждают молекулы ДНК, белков, липидов, образуя перекисные соединения (James, Murphy, 2002). Радикалы, образуя пероксиды липидов, которые изменяют проницаемость мембран и их жесткость, вызывают значительные повреждения мембран: плазматической и мембран органоидов (митохондрий, хлоропластов, вакуолей, лизосом и др.). Вследствие этого происходят нарушения транспортных процессов на мембранах, компартментализации продуктов обмена веществ, выход гидролитических ферментов в цитоплазму, что в свою очередь вызывает нарушения обмена веществ.

Гиперпродукция АФК наносит более сильный урон мтДНК, чем ядерной (Rodriguez-Menocal, Urso, 2004). АФК образуют более 20 видов мутагенных модификаций оснований в ДНК (Jaruga, Dizdaroglu, 1996). Такие повреждения ДНК могут приводить к мутациям в мтДНК, которые способны привести к нарушению митохондриальных функций (Rassmussen, Singh, 1998). Возникает порочный круг повреждений ДНК молекул. Эти данные говорят о том, что митохондриальная ДНК чрезвычайно чувствительна к мутациям, индуцированным АФК.

Общий анализ данных об участии АФК в процессах старения и сопровождающих старение заболеваний позволяет ряду авторов утверждать, что повреждение под действием АФК макромолекул приводит к мутациям, нестабильности генома в целом и развитию ряда возрастных патологий: онкологические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, возрастная иммунодепрессия, дисфункция мозга, катаракта и др. (Голубев, 1996; Кольтовер, 1998; Cutler, 1991; Dogru-Abbasoglu et al., 1997; Shigenaga et al., 1994).

АФК, старение и ПКС

Чрезмерная продукция АФК в клетке, в частности, митохондриями, может являться также причиной старения, злокачественного перерождения и дегенеративных процессов (Cerutti et al., 1994; Kregel, Zhang., 2007, Valko et al., 2007; Carpi et al., 2009, Du, Yan, 2010). На сегодняшний день делящиеся дрожжи широко используются в качестве модели клеточного старения (Jazwinski, 1993; Bitterman et al., 2003; Rodriguez-Menocal, Urso, 2004).

В исследовании было замечено, что накопление окисленных белков в материнской клетке дрожжей вносит значительный вклад в процесс старения (Aguilaniu et al., 2003). С этими данными согласуются наблюдения о том, что генетические воздействия или воздействия окружающей среды, приводящие к возрастанию АФК, приводят к преждевременному старению в дрожжах (Nestelbacher et al., 2000).

Таким образом, существует прямая зависимость от накопления АФК и продолжительностью жизни клетки и организма в целом. Это согласуется с экспериментами, также проведенными и на Caenorhabditis elegans, которые указывают на уменьшение продолжительности жизни с введением мутаций, увеличивающих продукцию АФК (Gems, 1999; Taub et al., 1999).

Следует подчеркнуть, что по> мере старения дрожжевые клетки проявляют многие черты апоптоза, а именно: увеличение образования АФК, фрагментация ДНК, презентация фосфатидилсерина на митохондриальной мембране (Laun et al., 2001). Большинство исследователей убеждено, что старение напрямую связано с ПКС в дрожжах.

Изучение ПКС в клетках Saccharomyces cerevisiae

Изучение апоптоза и механизмов, которые ведут к клеточной смерти, в ответ на повреждение ДНК и другие стимулы удобно проводить с использованием модельных организмов, применяемых в генетических исследованиях - таких, как дрожжи. Проявления ПКС у грибов широко изучается на примере почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Madeo et al., 2002; Madeo et al., 2004; Longo et al., 2005).

Некоторые признаки апоптоза можно наблюдать в клетках дрожжей, подвергнутых «естественным» стрессам, например, высокая температура, высокое содержание солей, гипертонический шок, агенты, повреждающие ДНК, консервирующие агенты и перекись водорода. Голодание и старение также, по-видимому, индуцируют апоптоз в некоторых клетках умирающих популяций (Longo et al., 2005).

Индуцированный апоптоз в клетках Saccharomyces cerevisiae

Одним из индукторов апоптоза дрожжей является амиодарон. Амиодарон является эффективным противоаритмическим агентом (Heger et al., 1981). Данное вещество используется при лечении желудочковой и субжелудочковой аритмий, внезапной остановки сердца, а также способствует предотвращению гибели миокарда после инфаркта (Singh, 1996; Bolt et al., 2001). Однако амиодарон имеет побочные, опасные для жизни и здоровья эффекты: токсичный фиброз, легочную токсичность, поражение печени при длительном лечении (Kannan et al., 1989; Bolt et al., 2001).

Показано, что амиодарон вызывает структурные и функциональные изменения клеток различных тканей (De la Iglesia et al., 1975; Dake et al., 1985; Somani et al., 1987; Pirovino et al., 1988; Fromenty et al., 1990; Campbell et al., 1994; Yasuda et al., 1996; Boit et al., 2001). Наиболее характерное морфологическое изменение ткани — появление большого количества лизосом в гепатоцитах, купферовских клетках и эпителии желчного протока (De la Iglesia et al., 1975; Pirovino et al., 1988). Менее выражен этот эффект в клетках эндотелия, гладких мышцах и соединительной ткани. В тканях пациентов, принимавших амиодарон, показано наличие обширных миелиноподобных образований в макрофагах, пневмоцитах, тканях легкого, кардиомиоцитах и в соединительных тканях (Dake et al., 1985; Gross, Somani, 1986; Somani et al., 1987).

Показано, что в результате применения амиодарона или его производных (дезэтиламиодарона или диэтиламиноэтоксигексестрола) в различных тканях животных - альвеолярных макрофагах, легких и печени — происходит накопление фосфолипидов (De la Iglesia et al., 1975; Kannan et al., 1989). В экспериментах на клетках бычьего эндотелия легочной артерии показано, что амиодарон вызывает значительное повышение уровня фосфолипидов (фосфатидилинозитола, фосфатидной. кислоты и бис(моноацилглицерол)фосфата), специфически частично ингибируя их деградацию. Предполагается, что амиодарон является потенциальным ингибитором лизосомных фосфолипаз А] и А2 (Martin et al., 1989).

Вообще липидное включение (JIB) — одна из ключевых органелл липидного обмена клетки. ЛВ состоят из сильно гидрофобного ядра, содержащего нейтральные липиды (триацилглицерин и сложные эфиры), и поверхностного слоя полярных молекул (Leber et al., 1994). JIB дрожжей S. cerevisiae содержат два фермента, которые поэтапно ацилируют глицерол-3-фосфат до фосфатидной кислоты, ключевого интермедиата в биосинтезе липидов (Athenstaedt, Daum, 1997). При возрастании количества триацилглицерина в клетке происходит увеличение количества и размеров JIB, их скопление и затем агрегирование в общие кластеры (Brasaemle, 2007). Как известно, контакты между различными органеллами клетки являются важным компонентом внутриклеточных процессов (Bolt et al., 2001; Perktold et al., 2007). По литературным данным, наибольшее число взаимодействий наблюдается в парах ЛВ - ядро, ЛВ - вакуоль, ЭР - плазматическая мембрана и вакуоль - ядро. Предполагается, что липидный состав мембран — естественный регулятор контактирования между органеллами (Gaigg et al., 1995; Achleitner et al., 1999; Perktold et al., 2007).

Для исследования механизма амиодароновой токсичности используются дрожжи S.cerevisiae (Gupta et al., 2003; Zhang, Rao, 2007); показано, что амиодарон запускает в клетках программу самоубийства, сопровождаемую появлением маркеров программируемой клеточной смерти (Pozniakovsky et al., 2005). Под действием этого препарата наблюдаются события, напрямую связанные с митохондриями: увеличение скорости дыхания, резкий'подъем трансмембранного потенциала, генерация активных форм кислорода комплексом III дыхательной цепи и выход цитохрома с в. цитоплазму. Было обнаружено, что клетки S. cerevisiae, мутантные по гену ysp2, являются более устойчивыми к амиодарону (Knorre et al., 2008).

Антиоксидантные системы защиты клетки

Интересны данные получены при параллельном изучении продукции АФК тканями молодых и старых животных (Анисимов и др., 1999). Показано, что в головном мозгу старых животных почти в 2 раза снижается активность супероксиддисмутазы (СОД); это, однако, не приводило ни к повышению показателей перекисного окисления белков или общей антиокислительной активности. В литературе отмечены данные о существенном снижении в сыворотке крови пожилых и старых лиц (60-97 лет) уровня глутатиона и повышение продуктов перекисного окисления липидов (Ыийа1 & а1., 1998).

В клетке, как упоминалось выше, существуют антиоксидантные системы, снижающие уровень АФК. Механизм действия наиболее распространённых антиоксидантов (ароматические амины, фенолы, нафтолы и др.) состоит в том, что молекулы антиоксиданта нейтрализуют активные радикалы.

Антирадикальную защиту в клетке осуществляет ряд биохимических систем. Наиболее изучены ферменты супероксиддисмутаза, пероксидаза и каталаза, а также низкомолекулярные вещества: витамин Е, глутатион, аскорбиновая кислота и др. В защите от АФК в организме участвуют и многие другие молекулы и ферментные системы (Осипов и др., 1990). Природные антиоксиданты - витамин Е, витамин А и каротиноиды, активны почти ко всем АФК. В стареющих тканях всех организмов наблюдается снижение активности компонентов антирадикальной защиты, что может способствовать накоплению повреждений биополимеров и уменьшению продолжительности жизни (Скулачев, 2001).

Данные, полученные на трансгенных дрозофилах с дополнительными копиями гена СОД и каталазы показали увеличение средней и максимальной продолжительности жизни (Огг, 8оЬа1, 1994); трансгенные мыши с избыточной экспрессией СОД, каталазы и глутатион-пероксидазы обладают повышенной резистентностью к окислительному стрессу, при снижении же активности этих генов мыши имели признаки преждевременного старения (Ноега!., 1998).

Антиоксиданты направленного действия

Важно упомянуть, что АФК выполняют и многие необходимые для организма функции: являются интермедиатом сигнальных клеточных каскадов, стимулятором дифференцировки клеток, частью воспалительного процесса при защите от инфекций и т. п. (Skulachev, 2003; Jezek, Hlavata, 2005; Brooks, 2006; Terada, 2006; Severin, Skulachev 2009). Такие сигнальные АФК генерируются, в основном, цитоплазматическими ферментами. Таким образом, считается, что практический смысл имеет снижение митохондриальных АФК (Skulachev, 2003; Jezek, Hlavata, 2005; Brooks, 2006; Terada, 2006; Severin, Skulachev 2009).

Так, теория о свободных радикалах трансформировалась в митохондриальную теорию старения. Развитие идей о свободно-радикальном окислении, а также запрограммированной клеточной гибели привели к созданию В. П. Скулачевым гипотезы феноптоза (Skulachev, 1999; Manskikh, 2007). Согласно этой теории, образование токсичных АФК в клетке запускает постепенную деградацию всего организма, что носит адаптивный характер на популяционном уровне. Основной практический результат и в то же время верификация концепции феноптоза является идея использования антиоксидантов для «отключения» программы старения.

Так в 1970-х гг. были созданы липофильные катионы, способные аккумулироваться в митохондриях. Эти молекулы были названы «ионы

Скулачева» (Sk+ и Sk-) (Liberman et al., 1969; Liberman, Skulachev, 1970). В той же серии работ было высказано предположение, что проникающие катионы могут использоваться как «молекулы-электровозы» для адресной доставки в митохондрии других соединений, не проникающих через мембраны.В конце 90-х гг. британский биохимик М.П. Мерфи использовал этот подход, попытавшись создать митоходриально-адресованный антиоксидант. Он присоединил к липофильному иону

14 трифенилалкилфосфония витамин Е. Однако, это вещество, равно как и его несколько более удачный вариант, в котором использован убихинон вместо витамина Е, до сих пор не нашли применения на практике.

Однако, в 2003 г. группа академика В.П. Скулачева начала разработку нового митоходриально-адресованного антиоксиданта. Чтобы принципиально повысить его эффективность был использован пластохинон — вещество из самого насыщенного кислородом места в живой природе — хлоропластов растений. Было сконструировано и синтезировано вещество БкС^ (и его аналоги), эффективность которого оказалась выше предыдущих аналогов в сотни раз (Рис. 1).

ЭкСИ

Рис. 1. Синтезированные митохондриально-направленные антиоксиданты, и SkQз.

Было показано, что такие соединения быстрее и селективнее накапливаются в митохондриях, осуществляя целенаправленный транспорт.

При этом антиоксиданты направленного действия лучше защищают клетки от окислительного стресса, чем природные антиоксиданты.

Таким образом, задача снижения избыточного уровня АФК внутри митохондрий, не затрагивая другие АФК клетки, может быть решена как минимум двумя способами, а именно: направленными в митохондрии антиоксидантами или разобщителями-протонофорами. В то время как митохондриально-направленные антиоксиданты убирают АФК, уже образованные при обратном переносе электронов, разобщители могут изначально предотвращать перенос электронов и с ним — генерацию митохондриальных АФК (Severin et al., 2010).

Роль разобщителей в борьбе с АФК

В животных и растительных клетках имеется система так называемых разобщающих белков (UCP - uncoupling proteins), которые путем разобщения и переключения дыхания на альтернативный путь, снижают вероятность генерации АФК. Разобщение дыхания с помощью UGP является одним из механизмов терморегуляции у теплокровных организмов (Nedergaard et al., 2001).

Матрикс митохондрий богат пероксидами жирных кислот, которые представляют собой агрессивные оксиданты, способные повреждать митохондриальную ДНК и белки матрикса. Транслокация этих пероксидов жирных кислот из матрикса через внешнюю митохондриальную мембрану с помощью белков UCP осуществляет антиоксидантную защиту матрикса. Перенесенные пероксиды жирных кислот не могут транслоцироваться обратно в матрикс с помощью UCP из за существования разности потенциалов в митохондриальной мембране (Goglia, Skulachev, 2003).

Как недавно было показано группой авторов И. И. Севериной, Ю. Н. Антоненко, М. Ю. Высоких и сотр. (Skulachev et al., 2009), SkQ и его аналог, не содержащий пластохинона (С12ТРР), могут служить переносчиками анионов жирных кислот в искусственных и митохондриальных мембранах. Эта дополнительная активность Бк(3 позволяет рассматривать его как разобщитель, адресованный в митохондрии. Примечательно, что 8кС>, в отличие от классических протонофоров типа динитрофенола, должен действовать как «мягкий» разобщитель. Именно такое «мягкое» разобщение является оптимальным механизмом, предотвращающим генерацию АФК митохондриями: небольшое снижение Ац/ резко тормозит образование АФК, но не препятствует синтезу АТФ (КогзЬипоу е1 а1., 1997).

По мнению Ф.Ф. Северина и соавт., производные 8кС>, липофильные катионы типа С12ТРР (Рис. 2), вызывая мягкое разобщение, могут быть перспективными в лечении ожирения, старения и некоторых видов рака, в которых задействована митохондриальная гиперполяризация (8ки1асЬеу, 2009). Таким образом, проникающие ионы, взаимодействуя с жирными кислотами, выступают в роли митохондриально-направленных разобщителей (БкиксЬеу, 2009).

Рис. 2. 5к()3 и С12ТРР («хвост» без хиноновой части).

Основные экспериментальные данные о причинах, протекании и механизмах окислительного стресса и ПКС, борьбе с сверхпродукцией АФК митохондриями исследуются не только на клетках млекопитающих. Показано, что одноклеточный организм Засскаготусея сегеу181ае также имеет программу апоптоза (Маёео е1 а1., 1997). Кроме того, изучение последствий изменения ультраструктуры митохондрий дрожжей играет важную роль в понимании базовых механизмов стрессового ответа клетки и ее гибели.

Поэтому одноклеточные Басскаготусез сегетхгае стали удобной моделью для изучения процессов окислительного стресса и программируемой гибели клетки, а также изменений, связанных с использованием митохондриально-направленных антиоксидантов и разобщителей, на ультраструктурном уровне.

Особенности ультраструктуры митохондрий дрожжей

Как известно, митохондрии присутствуют во всех эукариотических клетках. Ультраструктура митохондрий зависит от метаболизма клетки. Известно, что большое значение в формировании' клетки имеют различные отклонения в условиях культивирования исследуемых одноклеточных организмов. Митохондрии дрожжей подвержены серьезным структурным изменениям под действием самых различных факторов: условий культивирования, физиологического состояния, температуры, воздействия УФ-лучей и т.д. (Котельникова, Звягильская, 1973).

В БасскаготусеБ сегеугзгае размер, количество и форма митохондрии, как правило, определяется физиологическим состоянием клетки, составом среды роста. Морфология хондриома дрожжей исследована с применением различных электронно-микроскопических методов (трехмерной

18 реконструкцией, на основе ультратонких срезов, исследованием в высоковольтном просвечивающем электронном микроскопе, методом замораживания-скалывания), однако, единого мнения о строении митохондриального ретикулума в дрожжах нет.

Так, в анаэробных условиях митохондрии представляют собой маленькие органеллы, называемые «промитохондрии» (Linnane et al., 1962; Wallace et al., 1968; Criddle, Schatz, 1969; Plattner Schatz, 1969, Mc Clary, 1964). Эти «предшественники» митохондрий не содержат функциональной дыхательной цепи. Промитохондрии располагаются под цитоплазматической мембраной (Рис. 3). Предполагается, что такие структуры нужны для построения клеточной стенки и плазмалеммы (Mc Clary, 1964).

Рис. 3. Схема расположения и морфологии митохондрий и промитохондрии в дрожжевой клетке по Mc Clary, 1964.

Так, в частности было показано, что при анаэробных условиях в клетках Saccharomyces cerevisiae выявлялись лишь множественные мембраны (Linnane et al., 1962; Wallace et al., 1968; Luzikov et al., 1971). Эти мембраны были двух типов: напоминающие миелиновые структуры и\или эндоплазматический ретикулум высших эукариот (Linnane et al., 1962). Часто данные мембраны были ассоциированы, по-видимому, с липидными включениями. Стоит отметить, что данные наблюдения изменений в ультраструктуре клетки наблюдались при выращивании клеток на различных средах и добавках.

Полностью развитые классические митохондрии, как по ферментативному составу, так и на ультраструктурном уровне обнаруживаются только при оптимальных аэробных условиях роста клеток дрожжей (Linnane, Still, 1955; Agar, Douglas, 1957; Vitols, Linnane, 1961). Типичные дрожжевые митохондрии на электронно-микроскопических фотографиях клеток, выращенных в оптимальных аэробных условиях, выглядят как круглые или эллиптические тела размером 0.5*0.25 мк (Мс Clary, 1964). Лучше всего развиты и видны митохондрии клеток дрожжей в стационарной фазе,- выращенные в аэробный условиях: удлиненные, увеличенные и разветвленные органеллы, расположенные на периферии клетки (Stevens, 1977). Такое расположение позволяет быстро получать кислород с одной стороны, а с другой, удлиненная разветвленная сеть органеллы доставляет энергию вдоль всей клетки.

Во время мейоза и споруляции митохондрии сливаются и образуют разветвленную митохондриальную сеть, которая окружает делящееся ядро (Zickler, Olsen, 1975; Miyakawa et al., 1984).

Однако, не только размер и форма варьируются в дрожжах

Saccharomyces cerevisiae. Вопрос о количестве митохондрий в дрожжевой клетке всегда широко обсуждался. Так как на различных электронного микроскопических срезах всегда присутствовало разное количество сечений митохондрий. И ответить на вопрос о точном количестве митохондрий на клетку было сложно. Однако, Хоффман и Эверс показали с помощью метода последовательных ультратонких срезов наличие в Saccharomyces cerevisiae одной гигантской разветвленной трубчатой митохондрии (Hoffman, Avers, 1973).

Противоположные данные приведены в других исследованиях (Grimes et al., 1974). На основе анализа электронно-микроскопических фотографий и количества митохондриальной ДНК на клетку, авторы подсчитали, что в диплоидных клетках Saccharomyces cerevisiae присутствуют 22 митохондрии и 11 в гаплоидных, соответственно. Считается, что митохондрии Saccharomyces cerevisiae очень динамичны: часто претерпевают процесс слияния и разделения (Bereiter-Hahn, Voth, 1994). И поэтому сложно подсчитать абсолютное число митохондрий на клетку.

Методом серийных ультратонких срезов было исследовано 35 клеток в 4-х стандартных условиях роста (Stevens, 1977). С помощью трехмерных реконструкций было показано, что число митохондрий связано с фазой* роста культуры клеток. В период быстрого роста в среде, содержащей глюкозу, клетки Saccharomyces cerevisiae имели лишь несколько митохондрии (менее 10). В стационарной фазе роста хондриом дрожжей состоял из 30-50 индивидуальных митохондрий. Только в двух случаях клетки имели одну гигантскую разветвленную митохондрию. Объем хондриома также зависит и от уровня дыхательной активности: при подавлении дыхания он снижается от 10% до 3% от объема клетки.

С помощью исследования последовательных ультратонких срезов целых клеток в электронном микроскопе также показано, что в клетках

Candida utilis присутствует одна гигантская митохондрия. Хондриом

Schizosaccharomyces ротЪе насчитывает две протяженные ветвящиеся и две

21 шаровидные митохондрии (Davison, Garland, 1977). С помощью метода замораживания-скалывания также было подтверждено существование обширного митохондриального ретикулума в виде одной гигантской разветвленной митохондрии в клетке Candida utilis (Keyhani, 1980). Считается, что такие гигантские митохондрии присутствуют как в молодых дрожжевых клетках, так и в больших клетках с почкой. В почкующихся клетках одна гигантская митохондрия переходит из материнской клетки в дочернюю. Ее появление предшествует появлению ядра последней.

Танака с соавт. исследовали поведение гигантских митохондрий во время клеточного деления у Candida albicaus (Tanaka et al., 1985). Оказалось, что гигантские митохондрии на различных стадиях клеточного цикла подвергаются значительным изменениям: они могут делиться и сливаться. Перед входом в почку митохондрии материнской клетки сливаются в одну гигантскую, которая затем фрагментируется в течение митоза и опять сливается в одну гигантскую перед цитокинезом. Далее делится на две равные части для дочерних клеток.

1 Морфологические перестройки хондриома, вызванные изменениями в функциональном состоянии митохондрий, продемонстрированы в исследовании функциональной морфологии митохондриального1 аппарата f дрожжей (Мейсель и др., 1964). При параллельном исследовании с помощью фазового контраста, световой микроскопии витально окрашенных аурофосфином клеток, а также электронной микроскопии показано, что митохондрии дрожжей Indomyces Magnusii, Torulopsis trilis в аэрируемых условиях являются мелкими, шаровидными, индивидуально раздельными органеллами. При переходе к спиртовому брожению митохондрии преобразуются в длинные нити. На электронно-микроскопических фотографиях таких клеток выявляются протяженные гигантские извитые митохондрии.

Так, представления о митохондриальном аппарате дрожжей, как едином хондриоме, претерпевающем значительные морфологические перестройки, обусловленные функциональными изменениями в клетке, а также первые электронно-микроскопические наблюдения гигантских митохондрий в клетках дрожжей были сделаны впервые в 1964 году Мейселем.

Таким образом, форма и объем хондриома тесно связан с физиологическим состоянием клетки. Было выдвинуто интересное объяснение возникновения в клетке гигантских протяженных митохондрий (Неу\УООс1, 1977). По мнению автора, гигантские митохондрии характерны для небольших клеток, если сравнить объемы клеток и число митохондрий у различных организмов.

Таким образом, очевидно, что митохондрии дрожжевых клеток крайне динамичные и изменчивые структуры клетки. В зависимости от условий среды, стадии клеточного цикла, добавок и состава среды культивирования, клеточного окружения и других факторов митохондрии претерпевают различные изменения, которые затрагивают их форму, размер и количество.

Функционально-зависимые параметры ультраструктуры митохондрий

Митохондрии — чрезвычайно функционально-зависимые органеллы. В зависимости от условий и воздействия меняется и их ультраструктура. Наблюдаемые в клетках изменения состояния хондриома и возможные механизмы перестройки ультраструктуры, с помощью которых осуществляются эти перестройки, широко обсуждаются в литературе.

Так, в некоторых исследованиях приводятся данные о наличии в митохондриях перегородок - септ. Септы образованы внутренней мембраной митохондрий и подразделяют пространство ее матрикса на отдельные замкнутые отсеки. В норме септы можно наблюдать в митохондриях печени, почек крыс, мышей, в жировой ткани насекомых (Larsen, 1970; Wakabayashi et al., 1974). В литературе нет единого мнения относительно функционального значения септ в митохондриях. Отсутствуют и экспериментальные данные, проливающие свет на причины возникновения данных структур в митохондриях.

Некоторые авторы предполагают, что появление таких перегородок — доказательство слияния нескольких мелких митохондрий и процесса образования одной гигантской органеллы (Mantón, 1961; Tandler al., 1969; Kimberg, Loeb, 1972; Tandler, Hoppel, 1973; Publicover et al., 1977; Asano et al., 1978; Wakabayashi et al., 1978). Существует и противоположная точка зрения: септированные митохондрии отражают картину фрагментации. Некоторые авторы считают, что септы появляются лишь при экспериментальных воздействиях in vivo (Озернюк, 1978) или in vitro (Duncan et al., 1980). В то же время исследователи, занимающиеся проблемами биогенеза митохондрий, рассматривают эти структуры в качестве доказательства саморепликации митохондрий (Larsen, 1970; Hanzely, Schjeide, 1971; Wakabayashi et al., 1974).

Предполагают, что часто наблюдаемая перестройка хондриома клетки (объединение, стыковка, разъединение митохондрий) происходит с помощью специальных структур. Известны наблюдения за объединением митохондрий в кластеры посредством структур, соединяющих наружные мембраны соседних митохондрий. Во всех исследованных случаях (растительные ткани или ткани млекопитающих), эти межмитохондриальные соединения имеют одинаковые параметры и морфологию: щель между митохондриями 15-20 нм, размер частиц, образующих поперечные соединения между митохондриями,

6-8,5 нм, расстояние между частицами 13-18 нм. В литературе есть несколько терминов для данных структур: «intermitochondrial junctions» (Duvert et al., 1985), «межмитохондриальные септированные контакты» (Машанский и др., 1984), «митохондриальные контакты» (Быков, Клицунова, 1987).

Подобные структуры, объединяющие митохондрии, описаны также в фоторецепторных клетках взрослой лягушки Rana pipiens (Kelly, Smith, 1964), в мышце глазного яблока месячных крыс Вистар (Davidowitz et al., 1984), в культивируемых лимфобластах человека, инфицированных вирусом СПИД (Быков, Клицунова, 1987). В нейронах различных отделов переднего мозга ящерицы Ophisaurus apodus обнаружены группы митохондрий, объединенные межмитохондриальными поперечными соединениями, названными межмитохондриальными септированными контактами. (Машанский и др., 1984).

В основном многие авторы полагают, что данные структуры не являются артефактом. Такое мнение основано на данных о морфологии межмитохондриальных поперечных соединений, полученных методом замораживания-скалывания (Duvert et al., 1985).

Аналогичные поперечные межмембранные соединения иногда возникают не только между наружными мембранами прилежащих митохондрий , но и в межмембранном пространстве одиночных, не связанных с другими органеллами митохондрий. В литературе их называют intracrystal junctions» или «membrane junctions». Многие исследователи наблюдают эти структуры внутри митохондрий (Tandler et al., 1969;

Wakabayashi et al., 1974; Publicover et al., 1977 и др.). чаще всего membrane junctions можно наблюдать внутри митохондрий при различных экспериментальных воздействиях и патологических состояниях: в условиях автолиза клеток почки крысы (Latta et al., 1965), при посмертных изменениях в тканях крысы и быка (Saito et al., 1974), во время развития некроза в

25 мышцах крысы (Кроленко, Рижамадзе, 1979). В некоторых работах есть данные о присутствии данных структур в суспензии изолированных митохондрий. Считается, что появление межмембранных соединений в изолированных митохондриях указывает на старение митохондрий (Saito et al., 1974).

Важным параметром в определении функционального состояния митохондрий являются условия их энергообеспечения (Hackenbrock , 1966; Green, 1968, 1970). Классифицируя морфологические изменения изолированных митохондрий на основании соотношения объемов матрикса и межмембранного пространства митохондрий были выделены следующие основные морфологические состояния митохондрий.

1. Деэнергизованные - наименьший общий объем наиболее сжатый матрикс, самый большой объем межмембранного пространства (анаэробиоз, наличие ингибиторов дыхания или разобщителей окислительного фосфорилирования, отсутствие АТФ, наличие олигомицина).

2. Энергизованные - некоторое увеличение объема матрикса, волнистая форма гребней (присутствие субстратов окисления в аэробной суспензии или АТФ).

3. Энергизованное в присутствии в суспензии фосфата изменение конфигурации внутренней митохондриальной мембраны. Гребни становятся трубчатыми, ветвящимися, извитыми. Наблюдается незначительное увеличение объема матрикса (по сравнению с энергизованными). Сходное морфологическое состояние может быть вызвано заменой фосфата в среде инкубации другими проникающими анионами слабых кислот (сукцинат, пиру ват).

4. Максимально набухшие митохондрии в результате энергозависимого транспорта как природных (Са2+, Н4", в присутствии валиномицина пальмитоилкарнитина), так и синтетических (ДДА+) проникающих катионов. Матрикс при этом максимально набухает. Гребни внутренней митохондриальной мембраны расправляются, внутренняя мембрана плотно прилегает к внешней, в результате чего межмембранное пространство занимает наименьший объем.

Существует и другое состояние митохондрий, которое попадает под классификацию, описанную выше. Морфологические состояния в условиях стационарного дефосфорилирования на начальных фазах транспорта катионов рассматриваются как энергизованные, однако, выработка энергии в этом случае находится в равновесии с ее затратами на осуществление указанных эндэргонических функций. С точки зрения морфологии, в данном состоянии митохондрии близки к деэнергизованному состоянию. Рассмотренные выше функционально-зависимые структурные перестройки митохондрий, по-видимому, во многом обусловлены энергозависимыми перераспределениями осмотически активных ионов между средой инкубации и матриксом.

Ройозрога атегта-модельный организм

Механизм старения, как уже упоминалось, в клетке контролируется целым комплексом процессов, приводя к старению органов, тканей и клеток. Использование организмов, культивирование которых возможно в лабораторных условиях, может пролить свет на некоторые из этих механизмов. В 1980-е гг. почкующиеся дрожжи Засскаготусея сеге^гае были признаны приемлемой моделью для изучения процессов старения.

Однако, первой моделью, с помощью которой была изучена роль митохондрий в процессе старения, стал нитчатый гриб Podospora anserina. Мицелиальный аскомицет Podospora anserina уже несколько десятилетий активно изучается в качестве экспериментальной модельной системы: для выявления и объяснения молекулярных механизмов старения (Rizet, 1953; Marcou, 1961; Griffiths, 1992; Scheckhuber et al., 2007). Изучение старения на этом организме началось еще в 1950-е гг., когда Ризэ (Rizet) показал, что для всех культур этого аскомицета характерна остановка вегетативного роста. Этот процесс был им назван старением (senescence) (Rizet, 1953; Lorine et al., 2006). Однако, до сих пор мало изучена цитологическая сторона вопроса старения мицелия,/*, anserina. Поэтому целью настоящей работы явилось исследование старения мицелия P. anserina на электронно-микроскопическом уровне.

Особенности Podospora anserina

Виды Podospora относятся к экологической группе облигатных копротрофных пиреномицетов, некоторые могут развиваться, на .гниющих растительных остатках. Podospora anserina (или Podospora pauciseta) обитает на навозе травоядных животных. Podospora anserina — нитчатый аскомицет, который; занимает промежуточное положение между одноклеточными и многоклеточными организмами. P. anserina представляет собой организм, состоящий из ветвящихся и септированных нитей (филаменты), так называемых гиф. Септы — это перегородки между клетками, перфорированные порами так, что сохраняется непрерывность и целостность соседних клеток. Эти поры достаточно широки, чтобы пропустить любые органеллы из одной клетки в другую. Таким образом, мицелий P. anserina представляет собой гигантскую многоядерную клетку, именуемую ценоцит

Osiewacz, Borghouts, 2000). Мицелий P. anserina растет со скоростью 7

28 мм/день при температуре 27°С. Аскоспоры одноядерные, двуядерные, эллипсоидные, черные с апикальной порой. Из них развивается гетерокариотический мицелий. Реже споры дают начало гомокариотичному мицелию.

Старение Podospora anserina

Старение является характерной особенностью всех организмов, как одноклеточных, так и многоклеточных. Вследствие старения организм становится менее приспособленным к условиям окружающей среды, уменьшает и теряет свою способность бороться с негативными факторами внешней среды, а также противостоять болезням и травмам.

В отличии от других нитчатых грибов,, мицелий Р. anserina имеет ограниченный срок жизни. Молодой мицелий развивается из аскоспоры (Рис. 4 из статьи Osiewacz, Borghouts, 2000). Этот мицелий растет кончиками гиф. Гриб растет равномерно до того момента, как наступают начальные этапы старения организма. Продолжительность жизни Р. anserina в' природе (от прорастания споры до отмирания мицелия) составляет в среднем 25 дней. Затем наступает старение (Рис. 2 из статьи Osiewacz, Borghouts, 2000) (Rizet, 1953; Lorine et al., 2006).

После нескольких делений апикальные клетки мицелия перестают расти и отмирают (репликативное старение). Отмирание мицелия Р. anserina необратимо, признаки старения быстро распространяются по всему мицелию, и прекращается вегетативный рост (Levine et al., 1996).

Данный синдром наблюдался у всех изученных штаммов, а также у штаммов вида Podospora comata и Podospora curvicolla (Böckelmann, Esser,

1986; Silar et al., 2001). Старые культуры характеризуются несколькими фенотипическими изменениями. К таким изменениям относятся: уменьшение

29 темпов роста, прекращение размножения и увеличение пигментации стареющего мицелия (Esser, Tudzynski, 1980; Osiewacz, Scheckhuber, 2006).

Рис. 4. Жизненный цикл Ройозрога атегта. Прорастание аскоспор, образующихся в качестве продуктов полового размножения в спорангии, приводит к образованию молодого мицелия. Мицелий состоит из разветвленных филаментов и растет кончиками гиф. После определенного периода времени, темпы роста мицелия уменьшается, гифы становятся волнистыми и тонкими. В итоге, мицелий перестает расти и умирает («синдром старения»). В процессе старения дикого типа культуры Р. атегта, популяция нормально функционирующих митохондрий, в конечном счете, превращается в нефункционирующие органеллы. Функционирующие митохондрии производят большое количество АТФ и немного АФК. А в неправильно функционирующих митохондриях стареющих клеток, наоборот, высокий уровень АФК и низкий уровень АТФ. Замена поврежденных митохондрий на более поздних этапах жизни не представляется itscospore nnccliuin

ATP

ATP

ATP возможным, поскольку в этот период некоторые митохондриальные гены, кодирующие различные субъединицы дыхательной цепи, удалены из мтДНК.

Как было обнаружено, по данным электронной микроскопии, периферические гифы стареющих штаммов разветвляются неправильно, становятся опухшими и часто разрушаются (Delay, 1963; Osiewacz, Scheckhuber, 2006). Кроме того, старение P. anserina сопровождается повышением уровня белка PaDnml в митохондриях, ответственного за деление митохондрий (Osiewacz et al., 2002, Scheckhuber et al., 2007).

Особенности ультраструктуры Podospora anserina при старении

Ультраструктурные исследования выявили целый комплекс изменений внутриклеточной системы мембран (Delay, 1963; Silar et al., 2001). Одни из первых изменений происходят в митохондриях, но старение также серьезно отражается на строении ядерной мембраны и эндоплазматического ретикулума. Предполагается, что в последней стадии старения клетки также накапливают свободные рибосомы (Delay, 1963; Silar et al., 2001).

Согласно литературным данным, характерными признаками старения Р. anserina являются остановка апикального роста гиф и размножения, редукция воздушного мицелия, а также повышение пигментации (Griffiths, 1992, Scheckhuber et al., 2007). К концу жизни периферические гифы становятся неконкурентоспособными и отмирают (Havel, Durzan, 1996). Известно также, что старение мицелия сопровождается вакуолизацией цитоплазмы (Havel, Durzan, 1996, Levine et al., 1996, Pinan-Lucarre et al., 2007). В клетках грибов, как и в клетках растений, разрастающиеся вакуоли захватывают все больший клеточный объем, сливаются друг с другом и в конечном итоге приводят к лизису клетки (Pinan-Lucarre et al., 2007).

Зачастую клеточная гибель Р. anserina сопровождается изменениями в положении септ, накоплением липидных капель (Pinan-Lucarre et al., 2007). Помимо этого, было показано наличие аутофагосом и аутофагических тел в цитоплазме в период гибели клеток мицелия Р. anserina (Pinan-Lucarre et al., 2007). Клетки в гифах мицелия Р. anserina отделены друг от друга септами, имеющими поры. Стоит отметить, что когда одна клетка погибает, поры закрываются специальными образованиями — телами Воронина — для предотвращения распространения повреждения и гибели по всему мицелию (Jacobson et al., 1998, Pinan-Lucarre et al., 2007).

Первые биохимические исследования, связанные со старением, проводились Манкресом (Munkres, Rana, 1978; Silar et al., 2001). Он показал, что стареющие клетки накапливают липофусцин (Рис. 5 из статьи Silar et al.,

2001). Эти пигменты накапливаются в стареющих клетках многих организмов, начиная с грибов и заканчиваячеловеком (Terman, Brunk; 1998; Silar et al., 2001). Их назначение в клеточной перестройке в процессе старения в настоящее время неизвестно.

Также было обнаружено, что мтДНК и АФК играют важную роль в старении Р. anserina. Предполагается, что одна из причин гибели клеток мицелия Р. anserina при старении - повышение уровня активных форм кислорода в результате функциональных нарушений митохондрий (Osiewacz,

2002).

Рис. 5. Слева: культура молодого мицелия Р. атегта. Справа: мицелиальная культура стареющего штамма. Стоит отметить более темный цвет стареющей колонии, возникающий за счет накопления липофусцина.

Митохондриальные АФК

Согласно теорий старения, как упоминалось выше, митохондрии — основной источник генерации АФК (Нагшап, 1956; Нагтап, 1958; Оз1е\уас2,

2002). В митохондриях молодых организмов образуется лишь небольшая

часть АФК. Однако, с течением времени митохондрии все больше и больше повреждаются, и поврежденные органеллы продуцируют большие дозы

АФК. Такой «порочный круг» в конечном счете, приводит к нефункциональным митохондриям. Также известно, что во время роста накапливаются поврежденные (за счет АФК) белки дыхательной цепи митохондрий в клетках периферических гиф (Рис. 2 из статьи Оз1е\уас2,

Вог^оШз, 2000) (Оз1ешасг, 2002). Последствия этого летальны: и клетки погибают из-за дефицита энергии (081ешасг, Вог^оъИз, 2000). По-видимому, зз в культуре P. anserina помимо этого происходят также события, связанные с перестройкой мтДНК во время старения (Osiewacz, Borghouts, 2000).

Митохондриальная ДНК: нестабильность и реорганизация

Механизм старения мицелия четко прослежен в отношении мтДНК: происходит реорганизация митохондриального генома, а также появление новых кольцевых ДНК элементов (Jamet-Vierny et al., 1980, Griffiths, 1992, Begel et al., 1999). Новая ДНК влияет на респираторную функцию митохондрий. Известно, что добавление ингибиторов синтеза митохондриальных белков удлиняет жизнь P. anserina (Koll et al., 1984, Griffiths, 1992).

Митохондрии молодых культур P. anserina содержат мтДНК, представляющие собой большие кольцевые молекулы длиной около 100 т. п. н. каждая, которые содержат гены, кодирующие митохондриальные рРНК, тРНК и несколько белков дыхательной цепи (Рис. 4 из статьи Silar et al., 2001). Когда культура начинает стареть, мтДНК исчезает и заменяется плазмидоподобной молекулой, которая называется «стареющей» ДНК (стДНК или senDNA). Она образуется из конкретного участка мтДНК (Рис. 6 из статьи Silar et al., 2001). Все исследователи приходят к выводу, что исчезновение молекулы в 100 т. п. н. фактически является причиной гибели клеток, так как P. anserina облигатный аэроб. Было найдено три класса «стареющих» ДНК, исходя из региона их происхождения: а-стДНК (также называется плазмидоподобная - ппДНК), Р-стДНК и у-стДНК (Рис. 4 из статьи Silar et al., 2001). Сейчас известно, что а-стрДНК и (3-стрДНК (и вероятно, у-стрДНК) амплифицируются во время старения путем различных механизмов (Jamet-Vierny et al., 1997; Silar et al., 2001).Возможно, у штаммов дикого типа ярко-выраженная перестройка мтДНК является главной причиной старения (СЫе-ууасг, Во^Ьог^, 2000). li-senOMA

Амплифицируюшэяся в процессе старения РаМОМЮ-1

Сое! ойо оио о-ьепОПА

Рис. 6. Схематическое изображение мтДНК в процессе ее реорганизации при старении Ройозрога атеппа.

Долгоживущие штаммы Р. anserina

Ранние исследования с использованием различных метаболических ингибиторов, добавленных в субстрат, на котором выращивался гриб, предполагают, что изменения в работе митохондрий влияют на продолжительность жизни культур (Tudzynski, Esser, 1977; Osiewacz, 2002). При использовании концентраций, которые не влияют или мало влияют на

35 скорость роста мицелия P. anserina, было обнаружено, что ее срок жизни продлевается. Ингибиторы митохондриальных рибосом, такие как канамицин, неомицин, стрептомицин, пуромицин и тиамулин оказались вполне эффективными (Esser, Tudzynski, 1977; Osiewacz, 2002). Кроме того, выяснилось, что добавление таких веществ, как акридин и акрифлавин, которые у эукариот преимущественно действуют на мтДНК, и ингибиторов митохондриальной дыхательной цепи таких, как муцидин и цианистый калий, увеличивает продолжительность жизни (Tudzynski, Esser, 1979; Osiewacz, 2002).

Обработка этидиум бромидом также оказывает омолаживающее действие (Koll et al., 1984; Griffiths, 1992). В таких клетках мтДНК исчезает, аэробный метаболизм сменяется гликолизом, но стДНК не появляется и гриб, хотя и существенно медленнее растущий, живет значительно дольше. Определенные концентрации углеродных соединений, а также использование хлорамфеникола уменьшают вероятность старения и продлевают жизнь мицелия (Griffiths, 1992, Belcour and Begel, 1980).

Как было показано, стабилизация мтДНК приводит к увеличению продолжительности жизни (Osiewacz, Borghouts, 2000). Известно несколько таких долгоживущих мутантов P. anserina, которые живут в отличие от дикого типа от 39 дней до 10 лет (Osiewacz, Borghouts, 2000). Например, в долгоживущих мутантах AL2-1 амплификация ппДНК происходит благодаря наличию митохондриальных плазмид (Osiewacz et al., 1989; Hermanns, Osiewacz, 1992; Hermanns et al., 1994; Osiewacz, Borghouts, 2000).

Существуют специфические мутанты P. anserina, которые с возрастом, несмотря на старение митохондрий, не содержат амплифицированных ппДНК, т.е. эти генетические элементы не являются необходимым условием старения (Табл. 1). В других мутантах (ех и тех мутантах), стабилизация мтДНК происходит из-за делеции определенного участка (Сох I,

36 кодирующего большую субъединицу комплекса IV), включающего весь пп-интрон или его часть (Vierny et al., 1982; Kück et al., 1985; Belcour, Vierny, 1986; Schulte et al., 1988). В результате у этих мутантов происходит увеличение продолжительности жизни. Симптомы старения у ех мутанта не проявляются даже после десяти лет выращивания.

В долгоживущих штаммах grísea мутация в ядерном гене, кодирующем белок, контролирующий связывание с медью, приводит к снижению поглощения из среды меди (Рис. 7 из статьи Osiewacz, 2002). Также в этих мутантах происходит амплификация ппДНК и реорганизация мтДНК, специфичная для дикого типа. Рост мутантных штаммов на среде с добавлением меди приводит к преобразованию мутантного фенотипа в штамм, похожий на дикий тип (Marbach et al., 1994; Osiewacz, Nuber, 1996; Borghouts et al., 1997; Osiewacz, Borghouts, 2000). Таким образом, медь является одним из важных факторов, приводящих к делеции мтДНК и амплификации ппДНК.

Несмотря на стабилизацию мтДНК, перечисленные мутанты существенно различаются по продолжительности жизни. Такие, как grísea, характеризуются довольно умеренным увеличением продолжительности жизни (39 дней), по сравнению с такими мутантами, как ех, которые, по-видимому, являются бессмертным. Таким образом, несмотря на то, что нестабильность мтДНК ускоряет старение, это не единственный процесс, влияющий на продолжительность жизни, но скорее всего, часть сложного молекулярного механизма, контролирующего старение.

Табл. 1. Ядерные гены, связанные с увеличением продолжительности жизни Р. атегта. (Оз геи^ш^1997).

Ген Увеличение продолжительности жизни, % Другие характеристики г 56 Точечная мутация, делеция, изменение мрфологии, частичная стерильность

68 Альтернативная морфология, частичная стерильность

У/У 164 Альтернативная морфология, частичная стерильность gr у/у Бессмертный Освобождение митохондриальных плазмид \ (ппДНК) затруднено у/у Бессмертный Амплификация митохондриальных плазмид (ппДНК) затруднена

АБ4 52 Трансляция элонгационного фактора ЕР-1а

Рис. 7 Долгоживущие мутанты grísea характеризуются пигментацией фенотипа (А). Культуры дикого типа (слева) и мутант grísea (справа), выращенные на агаре (В и С): спорангии с аскоспорами дикого типа (черные аскоспоры) и мутанта grísea (серые аскоспоры). Так как мутации в grísea является рецессивными, аскоспоры с легкой пигментацией развиваются только, если двуядерные аскоспоры гомозиготные. В микроскопических снимках можно увидеть спорангий с пятью аскоспорами: одной светлой (grísea) и четырьмя темными (дикого типа).

Значение изучения старения Ро(1о8рога атегта для других организмов

Несмотря на то, что процесс старения у грибов и у человека отличаются, данные, полученные при изучении грибов, могут осветить механизмы старения других организмов. Механизмы старения на примере Р. атегта очень удобно изучать.

Многие геронтологи считают, что существует различие между «основным» или «общим» механизмом старения, который затрагивает большинство видов, и «минорным» или «частным» механизмом старения, который влияет на отдельный вид или род (Kirkwood, 1977, Jazwinski, 1995; Maerin et al., 1996). Изучение старения P. anserina прекрасно иллюстрирует это предположение. Скорее всего, синдром старения и определяющий фактор старения являются уникальными для этого гриба и близких ему видов. Таким образом, это частный механизм. Тем не менее, изменения в содержании цитоплазмы и митохондриального метаболизма влияют на продолжительность жизни P. anserina. Как известно, эти два процесса также влияют на старение животных (Rattan, 1991; Gadaleta et al., 1998; Silar et al., 2001). Таким образом, они могут рассматриваться в качестве «общих» факторов.

Еще одним характерным примером является нарушение процесса роста. Эта клеточная дегенерация проявляется лишь в отдельных мутантных штаммах. Таким образом, этот механизм присущ только подмножеству лабораторных штаммов. Интересно, что эти штаммы могут проявлять или не проявлять признаки повреждения роста, но все в конечном итоге приходят к старению. Это подчеркивает тот факт, что в одних и тех же организмах могут происходить различные процессы дегенерации.

Кроме того, существует несколько цитоплазматических и инфекционных эпигенетических элементов, т. е. прионоподобных белков у дрожжей и у P. anserina, которые участвует как в процессах старения, так и в замедлении роста. (Silar, Daboussi, 1999; Wickner et al., 1999; Silar et al., 2001). На данный момент, точный характер этих элементов неизвестен. Они влияют на различные аспекты клеточной биологии (поглощение азота, остановку трансляции, клеточную дифференцировку и т.д.). Предполагается, что такие элементы могут иметь широкое распространение во всех организмах и что они могут участвовать в процессе старения (БНаг е1 а1., 1999; БПаг е1 а1., 2001). Другими словами, может существовать эпигенетический фактор старения (в дополнение к генетическим и экологическим факторам). Очевидно, что нитевидные грибы с их мицелиальной структурой являются очень хорошим модельным организмом для изучения этого фактора.

Таким образом, мы решили проверить гипотезу о действии «мягких разобщителей» и митохондриально-направленных антиоксидантов на генерацию АФК, а также функциональные изменения, связанные с окислительным стрессом, которые, как было показано выше, затрагивают митохондриальную морфологию и ультраструктуру.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить влияние окислительного стресса и разобщителей на ультраструктуру митохондрий в клетках Засс/гаготусея сегеу/'ы'ае и

РойоБрога апяегта

Задачи исследования:

• Исследовать особенности ультраструктуры митохондрий 8асскаготусе8 сегеугзгае при действии амиодарона.

• Изучить действие разобщителей РССР и С12ТРР (додецилтрифенилфосфоний) на ультраструктуру митохондрий Басскаготусез сегеу1$1ае при одновременной инкубации с амиодароном.

• Изучить защитный эффект митохондриально-направленного антиоксиданта 8кСЬ (метилпластохинон додецилтрифенилфосфоний) на клетки 8асскаготусея сггеуЫае при действии амиодарона.

• Изучить влияние больших концентраций проникающего катиона С12ТРР, а также его производных С121119 (додецил родамин 19), С12КВ (додецил родамин В) на ультраструктуру Засскаготусез сегет$1ае.

• Изучение ультраструктуры митохондрий Рос1о8рога атегта при действии митохондриально-направленного антиоксиданта 8кС>1 (пластохинон додецилтрифенилфосфоний) при старении.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культура клеток.

В работе мы использовали следующие штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: W303 (mat а, дикий тип) и изогенный ему штамм ysp2A (ysp2::TRPl). Клетки выращивали до логарифмической фазы роста

- о

-2*10 клеток/мл), или до стационарной фазы роста (—10 клеток/мл ) в богатой среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу (2%) или раффинозу (2%) согласно протоколу (Sherman F., 2002.).

Культивирование мицелия P. anserina осуществляли в поверхностной культуре на чашках Петри на среде М2 при температуре 26°С в 10-ти повторах. Посевы проводили молодым (4 дня роста) мицелием P. anserina, полученным из одной гаплоидной споры. Культивировали мицелий в течение 3 дней, затем пересеивали мицелий на новую чашку Петри. Имплантант брали с края колонии, как показано на схеме рисунка 1 (Рис. 8).

Рис. 8. Схема пересеивания дикого типа P. anserina (WT).

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Ожован, Сильвия Михайловна

выводы

1. Амиодарон вызывает набухание митохондрий и септирование их матрикса в клетках 5". сегеушяе. Степень септирования коррелирует с устойчивостью клеток к амиодарону.

2. Амиодарон вызывает взаимодействие липидных включений с ядром и митохондриями в клетках сегеу'шае.

3. Мягкий разобщитель С12ТРР эффективнее обычного (БССР) в предотвращении патологических изменений ультраструктуры митохондрий, вызванных амиодароном в клетках 5". сегеушае.

4. Антиоксидант БкСЬ предотвращает изменения как общей организации клеток, так и ультраструктуры митохондрий, вызываемые амиодароном, в клетках 5. сегеушае.

5. Высокие концентрации проникающего катиона С12ТРР вызывают драматическое набухание митохондрий в клетках Б. сегечгзгае. Это набухание предотвращается разобщением митохондрий.

6. Перманентно заряженный проникающий катион С121Ш в высоких концентрациях вызывает необычные изменения ультраструктуры митохондрий в клетках & сегетз1ае. Близкий по формуле депротонируемый проникающий катион С12Я19 таких изменений не вызывает.

7. Обнаружена значительная, перестройка ультраструктуры клеток Р. атегта при старении мицелия. 8кСЬ более чем в 2,4 раза увеличивает продолжительность жизни Р. апзеппа, при этом сохраняя нативность ультраструктуры клеток.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ожован, Сильвия Михайловна, 2011 год

1. Анисимов В.Н., Арутюнян A.B., Опарина Т.И. и др. (1999) Возрастные изменения активности свободнорадикальных процессов в тканях и сыворотке крови крыс. Росс, физиол. журн., т. 85 (4), с. 502-507.

2. Быков A.M., Клицунова Н.В. (1987) Ультраструктура митохондриальных контактов в лимфоцитах человека, инфицированных вирусом, ассоциированым с лимфоаленопатией. 4-я всесоюзная конференция по патологии клетки. Тезисы докладов. М: с. 7.

3. Голубев А.Г. (1996) Изнанка метаболизма. Биохимия, т. 61., с. 20182039.

4. Гордеева A.B., Лабас Ю.А., Звягильская P.A. (2004) Апоптоз. одноклеточных организмов: механизмы и эволюция. Биохимия, т. 69, с. 1301-1313.

5. Кольтовер В.К. (1998) Свободнорадикальная теория старения: современное состояние и перспективы. Успехи геронтологии, т. 2. с. 37-42.

6. Кольцов Н.К. (1936) Организация клетки. Сборник экспериментальных исследований, статей и речей. 1903-1935 гг. М.-Л.: гос. из-во биологической и медицинской литературы.

7. Котельникова А.В., Звягильская Р.А. (1973) Биохимия дрожжевых митохондрий (монография). М.: Наука, с. 239.

8. Кроленко С.А., Рижамадзе Н.А. (1979) Разрушение миофибрилл во время распространяющегося повреждения. III. Изолированные мышцы крысы. Цитология, т. 21, с. 1016-1020.

9. Ю.Ленинджер A.JI. (1966) Митохондрия: молекулярные основы структуры и функций. М: Мир, с. 203.

10. П.Максимов А. (1914) Основы гистологии. Ч. 1. Учение о клетке. С.Петербург: Издание K.JI. Риккера, с. 402.

11. Машанский В.Ф., Озирская Е.В., Туманова Н.Л., Дроздов A.JL (1984) Межмитохондриальные контакты в нейронах переднего мозга ящерицы Ophisaurus apodus. Цитология, т. 26 (6), с. 740-743.

12. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.В. (1990) Активные формы кислорода и их роль в организме. Успехи, биол. химии, т. 31, с. 180-208.

13. Скулачев В.П. (2001) Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода. Соросовский образовательный журнал, т. 7 (6), с. 1-10.

14. Agar H.D., Douglas H.C. (1975) Studies on the cytological structure of yeast: electron microscopy of thin sections. J Bacteriol., vol. 73 (3), p. 365-375.

15. Aguilaniu H., Gustafsson L., Rigoulet M., Nystrom T. (2003) Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science, vol. 299 (5613), p.1751-1753.

16. Anisimov V.N. (2008) Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 5. SkQl prolongs lifespan and prevents development of traits of senescence. Biochemistry (Mosc)., vol: 73 (12), p. 1329-1342.

17. Athenstaedt K., Daum G. (1997) Biosynthesis of phosphatidic acid in lipid particles and endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol., vol. 179, p. 7611-7616.

18. Begel O., Boulay J., Albert B., Dufour E., Sainsard-Chanet A. (1999) Mitochondrial group II introns, cytochrome c oxidase and senescence in Podospora anserina. Mol. Cell. Biol., vol. 19 (6), p. 4093-4100.

19. Belcour L., Begel O. (1980) Life-span and senescence in Podospora anserina: effect of mitochondrial genes and functions. J. Gen. Microbiol., vol. 119, p. 505-515.

20. Belcour L., Begel O., Mosse M.O. and Vierny C. (1981) Mitochondrial DNA amplification in senescent cultures of Podospora anserina. Curr. Genet, vol. 3, p. 13-21.

21. Belcour L. and Vierny C. (1986) Variable DNA splicing sites of a mitochondrialintron: relationship to the senescence process in Podospora anserina. EMBO J, vol. 5, p. 609-614.

22. Bereiter-Hahn J, Voth M. (1994) Dynamics of mitochondria in living cells: shape changes, dislocations, fusion, and fission of mitochondria. Microsc Res Tech., vol. 27 (3), p. 198-219.

23. Bitterman K.J., Medvedik O., Sinclair D.A. (2003) Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 67 (3), p. 376-399.

24. Bockelmann B. and Esser K. (1986) Plasmids of mitochondrial origin in senescent mycelium of Podospora curvicolla. Curr Genet, vol. 10, p. 803810.

25. Borghouts C., Kimpel E. and Osiewacz. H.D. (1997) Mitochondrial DNA rearrangements of Podospora anserina are under the control of the nuclear gene grisea. Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), vol. 94, p. 10768-10773.

26. Brasaemle D.L. (2007) Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res., vol. 48, p. 2547-2559.

27. Breckenridge D.G., Germain M., Mathai J.P., Nguyen M., and Shore G.C. (2003) Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways. Oncogene, vol. 22 (53), p. 8608-8618.

28. Brookes P.S. (2006) Mitochondrial production of oxidants and their role in the regulation of cellular processes. In: Handbook Neurochem. Mol. Neurobiol. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, p. 3-21.

29. Campbell C.L., Tanaka N., White K.H., Thorsness P.E. (1994) Mitochondrial morphological and functional defects in yeast caused by ymel are suppressed by mutation of a 26S protease subunit homologue. Mol Biol Cell., vol. 5, p. 899-905.

30. Cerutti P., Ghosh R., Oya Y., Amstad P. (1994) The role of the cellular antioxidant defense in oxidant carcinogenesis. Environ Health Perspect., vol. 102(10), p. 123-129.

31. Cheng W.C., Berman S.B., Ivanovska I., Jonas E.A., Lee S.J., Chen Y., Kaczmarek L.K., Pineda F., Hardwick J.M. (2006) Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene, vol. 25, p. 4697-4705.

32. Criddle R.S., Schatz G. (1969) Promitochondria of anaerobically grown yeast. I. Isolation and biochemical properties. Biochemistry., vol. 8 (1), p. 322-334.

33. Cutler R. (1991) Human longevity and aging: possible role of reactive oxygen species. Annu. N.Y. Acad, Sci, vol. 621, p.1-28.

34. Mc Clary Dan 0. (1964) The Cytology Of Yeast, the botanical review, vol. 30(2), p. 167-225.

35. Daiber A. (2010) Redox signaling (cross-talk) from and to mitochondria involves mitochondrial pores and reactive oxygen species. Biochim Biophys Acta, vol. 1797 (6-7), p. 897-906.

36. Davison M.T., Garland P.B. (1977) Structure of mitochondria and vacuoles of Candida utilis and Schizosaccharomyces pombe studied by electron microscopy of serial thin sections and model building. J Gen Microbiol., vol. 98 (l),p. 147-153.

37. Davidowitz J., Philips G., Chiarandini D.J., Breinin G.M. (1984) Distribution of mitochondrial and lipidic alterations in abnormal extraocular muscle of rat. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol., vol. 221 (4), p. 153-156.

38. De la Iglesia F.A., Feuer G., McGuire E.J., Takada A. (1975) Morphological and biochemical changes in the liver of various species in experimental phospholipidosis after diethylaminoethoxyhexestrol treatment. Toxicol Appl Pharmacol., vol. 34, p. 28-44.

39. Delay C. (1963) Observations inframicroscopiques sur le mycelium 'senescent' du Podospora anserina. C R Acad Sci., (Paris), vol. 256, p. 4721-4724.

40. Dogru-Abbasoglu S., Tamer-Toptani S., Ugurnal B., Kosak-Toker N., Ayka9-Toker G., Uysal M. (1997) Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in livers and brains of aged rats. Mech. Ageing. Devel., vol. 98 (2), p. 177-180.

41. Du H., Yan S.S. (2010) Mitochondrial permeability transition pore in Alzheimer's disease: Cyclophilin D and amyloid beta, Biochim. Biophys. Acta, vol. 1802, p. 198-204.

42. Duncan C.J., Greenaway H.C., Publicover S.J., Rudge M.F., Smith J.L. (1980) Experimental production of "septa" and apparent subdivision of muscle mitochondria. JBioenergBiomembrvol. 12(1-2), p. 13-33.

43. Duvert M., Mazat J.P., Barets A.L. (1985) Intermitochondrial junctions in the heart of the frog, Rana esculenta. A thin-section and freeze-fracture study. Cell Tissue Res., vol. 241 (1), p. 129-137.

44. Esser K. and Tudzynski P. (1977) Genes inhibiting senescence in the ascomycete Podospora anserina by the antibiotic tiamulin. Nature, vol. 265, p. 454-456.

45. Esser K. and Tudzynski P. (1980) Senescence in fungi. In: Thimann K.V., editor. Senescence in plants. Boca Raton: CRC Press, p. 67—83.

46. Fannjiang Y., Cheng W.C., Lee S.J., Qi B., Pevsner J., Mc Caffery J.M., Hill R.B., Basanez G., and Hardwick J.M. (2004) Mitochondrial fission proteins regulate programmed cell death in yeast. Genes Dev., vol. 18 (22), p. 27852797.

47. Finch C.E. (1990) Longevity, Senescence and the Genome. The University of Chicago Press, (Chicago).

48. Forman H.J., Torres M., and Fukuto J. (2002) Redox signaling. Mol. Cell Biochem., vol. 234-235 (1-2), p. 49-62.

49. Frank S., Gaume B., Bergmann-Leitner E.S., Leitner W.W., Robert E.G., Catez F., Smith C.L. and Youle R.J. (2001) The role of dynamin-relatedprotein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev. Cell, vol. 1 (4), p. 515-525.

50. Gadaleta M.N., Cormio A., Pesce V., Lezza A.M.S. and Cantalore P. (1998) Aging and mitochondria. Biochimie, vol. 80, p. 863-870.

51. Gems D. (1999) Nematode ageing: Putting metabolic theories to the test. Curr. Biol., vol. 9 (16), p. 614-616.

52. Goglia F., Skulachev V.P. (2003) A function for novel uncoupling proteins: antioxidant defense of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the outer membrane leaflet. FASEB J., vol. 17 (12), p. 1585-1591.

53. Gordeeva A.V., Labas Y.A., Zvyagilskaya R.A. (2004) Apoptosis in unicellular organisms: mechanisms and evolution. Biochemistry (Mosc.), vol. 69, p. 1055-1066.

54. Green D.E. and H. Baum. (1970) Energy and the mitochondrion. Acad. Press, New-York, London, p.205.

55. Griffiths A.J. (1992) Fungal senescence. Annu Rev Genet., vol. 26., p. 351372.

56. Grimes G.W., Mahler H.R., Perlman R.S. (1974) Nuclear gene dosage effects on mitochondrial mass and DNA. J Cell Biol., vol. 61 (3), p. 565-574.

57. Gross S.A., Somani P. (1986) Amiodarone-induced ultrastructural changes in canine myocardial fibers. Am. Heart J., vol. 112, p. 771-779.

58. Gupta S.S., Ton V.K., Beaudry V., Rulli S., Cunningham K., Rao R. (2003) Antifungal activity of amiodarone is mediated by disruption of calcium homeostasis. J Biol Chem., vol. 278, p. 28831-28839.

59. Hackenbrock C.R. (1966) Ultrastructural bases for metaboliccally linked mechanical activity in mitochondria I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. J. Cell Biol., vol. 30, p. 269-297.

60. Hanzely L., Schjeide O.A. (1971) Fine structural observations of mitochondria undergoing division in Allium sativum root tip cells. Cytobiology, vol. 4, p. 207-215.

61. Harman D. (1956) A theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol., vol. 11, p. 298-300.

62. Harman D. (1958) Aging and oxidative stress. J. Int. Fed. Clin. Chem., vol. 10, p. 24-27.

63. Havel L., Durzan D.J. (1996) Apoptoses in plants. Bot. Acta., vol. 109, p. 268-277.

64. Heger J.J., Prystowsky E.N., Jackman W.M., Naccarelli G.V., Warfel K.A.,

65. Rinkenberger R.L., Zipes D.P. (1981) Clinical efficacy andelectrophysiology during long-term therapy for recurrent ventriculartachycardia or ventricular fibrillation. N Engl J Med., vol. 305, p. 539-545.115

66. Hermanns J. and Osiewacz H.D. (1992) The mitochondrial plasmid pAL2-l of a longlived Podospora anserina mutant is an invertron encoding a DNA and RNA polymerase. Curr. Genet, vol. 22, p. 491-500.

67. Hermanns J., Asseburg A. and Osiewacz H.D. (1994) Evidence for a life span-prolonging effect of a linear plasmid in a longevity mutant of Podospora anserina. Mol. Gen. Genet., vol. 243, p. 297-307.

68. Hey wood P. (1977) Evidence from serial sections that some cells contain large numbers of mitochondria. J. Cell Sci., vol. 26, p. 1-8.

69. H0 Y.-S., Magnenat J.-L., Gargano M. etc. (1998) The nature of antioxidant defense mechanisms: a lesson from transgenic studies. Environ. Health Perspect., vol.106., p. 1219-1228.

70. Hoffman H.P., Avers C. (1973) Mitochondrion of yeast: ultrastructural evidence for one giant, branched organelle per cell. Science, vol. 181, p. 749-750.

71. Holliday R. (1995) Understanding Ageing. Cambridge University Press, (Cambridge).

72. Jacobson D.J., Beurkens K., Klomparens K.L. (1998) Microscopic and ultrastructural examination of vegetative in compatibility in partial diploids heterozygous at het loci in Neurospora crassa. Fungal Genet. Biol., vol. 23 (1), p. 45-56.

73. James A.M., Murphy M.P. (2002) How mitochondrial damage affects cell function. JBiomed Sci., vol. 9 (6 Pt 1), p. 475-487. Review.

74. Jamet-Vierny C., Begel O., Belcour L. (1980) Senescence in Podospora anserina: amplification of a mitochondrial DNA sequence. Cell., vol. 21 (1), p. 189-194.

75. Jamet-Vierny C., Boulay J., Begel O. and Silar P. (1997) Contribution of various classes of defective mitochonrial DNA molecules to senescence in Podospora anserina. Curr Genet, vol. 31, p. 171-178.

76. Jaruga P., Dizdaroglu M. (1996) Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acid Res., vol. 24, p. 1389-1394.

77. Jazwinski S.M. (1993) The genetics of aging in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetica, vol. 91 (1-3), p. 35-51.

78. Jazwinski S.M. (1995) Nuclear genes in aging. In: Esser K. and Martin G.M. (eds) Molecular Aspect of Aging. Wiley Chichester, p. 15-28.

79. Jezek P., Hlavata L. (2005) Mitochondria in homeostasis of reactive oxygen species in cell, tissues, and organism. Int. J. Biochem. Cell Biol, vol. 37, p. 2478-2503.

80. Kaasik A., Safiulina D., Zharkovsky A., and Veksler V. (2007) Regulation of mitochondrial matrix volume. Am. J. Physiol. Cell Physiol., vol. 292, p. 157-163.

81. Kannan R., Sarma J.S., Guha M., Venkataraman K. (1989) Tissue drug accumulation and ultrastructural changes during amiodarone administration in rats. Fundam Appl Toxicol., vol. 13, p. 793-803.

82. Kelly D.E., Smith S.W. (1964) Fine structure of the pineal organs of the adult frog, Rana Pipiens. J. Cell Biol, vol. 22, p. 653-674.

83. Keyhani E. (1980) Observations on the mitochondrial reticulum in the yeast Candida utilis as revealed by freeze-fracture electron microscopy. J Cell Sci., vol. 46, p. 289-297.

84. Kimberg D.V, Loeb J.N. (1972) Effects of cortisone administration on rat liver mitochondria. Support for the concept of mitochondrial fusion. J Cell Biol, vol. 55 (3), p. 635-643.

85. Kirkwood T.B.L. (1977) Evolution of ageing. Nature, vol. 270, p. 301-304.

86. Knorre D.A., Ojovan S.M., Saprunova V.B., Sokolov S.S., Bakeeva L.E., Severin F.F. (2008) Mitochondrial matrix fragmentation as a protection mechanism of yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry (Mose.), vol. 73, p. 1254-1259.

87. Koll F., Begel O., Keller A.M., Vierney C., Belcour L. (1984) Ethidium bromide rejuvenation of senescent cultures of Podospora anserina: Loss of senescence-specific DNA and recovery of normal mitochondria. Curr. Genet. vol. 8, p.127-134.

88. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. (1997) High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett., vol. 416 (1), p. 15-18.

89. Kregel K.C., Zhang H.J. (2007) An integrated view of oxidative stress in aging: basic mechanisms, functional effects, and pathological considerations. Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol., vol. 292, p. R18-R36.

90. Kück U., Esser K. and Stahl U. (1981) Plasmid-like DNA is part of mitochondrial DNA in Podospora anserina. Curr. Genet, vol. 9, p. 373-382.

91. Kück U., Osiewacz H.D., Schmidt U., Kappelhoff B., Schulte E., Stahl U., Esser K. (1985) The onset of senescence is affected by DNA rearrangements of a discontinuous mitochondrial gene in Podospora anserina. Curr. Genet, vol. 9, p. 373-382.

92. Larsen W.J. (1970) Genesis of mitochondria in insect fat body. J Cell Biol., vol 47 (2), p. 373-383.

93. Latta H., Osvaldo L., Jackson J.D., Cook M.L. (1965) Changes in renal cortical tubules during autolisis: electron microscopic observations. Lab Invest., vol. 14, p. 635-657.

94. Laun P., Pichova A., Madeo F., Fuchs J., Ellinger A., Kohlwein S., Dawes I., Fröhlich K.U., Breitenbach M. (2001) Aged mother cells of

95. Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Mol. Microbiol, vol. 39 (5), p. 1166-1173.

96. Lee H.C., Wei Y.H. (2000) Mitochondrial role in life and death of the cell. JBiomedSci, vol. 7, p. 2-15.

97. Leber R., Zinser E., Zellnig G., Paltauf F., Daum G. (1994) Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast, vol. 10, p. 1421-1428.

98. Lewandowska A., Gierszewska M., Marszalek J., Liberek K. (2006) Hsp78 chaperone functions in restoration of mitochondrial network following heat stress. Biochim Biophys Acta., vol. 1763 (2), p. 141-151.

99. Levine A., Pennell R.I., Alvarez M.E., Palmer R., Lamb C. (1996) Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistance response. Curr Biol., vol. 6 (4), p. 427-437.

100. Linnane A.W., Vitols E., Nowland P.G. (1962) Studies on the origin of yeast mitochondria. J Cell Biol., vol. 13, p. 345-350.

101. Linnane A.W., Sill J.L. (1955) The isolation of respiring mitochondria from Baker's yeast. Arch Biochem Biophys., vol. 59 (2), p. 383-392.

102. Liu, Z. and Butow, R.A. (2006). Annu Rev Genet 40,159-185.

103. Liberman E.A. and Skulachev V.P. (1970) Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion. Biochim Biophys Acta, vol. 216, p. 30-42.

104. Liberman, E.A., V.P. Topaly, L.M. Tsofina, A.A. Jasaitis, and V.P. Skulachev. (1969) Mechanism of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria. Nature, vol. 222, p. 1076-1078.

105. Longo V. D., Mitteldorf J., Skulachev V. P. (2005) Programmed and altruistic ageing. Nat. Rev. Genet., vol. 6, p. 866-872.

106. Lorine S., Dufour E. and Sainsard-Chanet A. (2006) Mitochondrial metabolism and aging in the filamentous fungus Podospora anserina. Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1757, p. 604-610.

107. Luzikov V.N., Zubatov A.S., Rainina E.I., Bakeeva L.E. (1971) Degradation and restoration of mitochondria upon deaeration and subsequent aeration of aerobically grown Saccharomyces cerevisiae cells. Biochim Biophys Acta., vol. 245 (2), p. 321-34.

108. Madeo F., Engelhardt S., Herker E., Lehmann N., Maldener C., Proksch A., Wissing S., Fröhlich K.U. (2002) Apoptosis in yeast: a new model system with applications in cell biology and medicine. Curr. Genet., vol.41, p. 208-216.

109. Madeo F., Herker E., Wissing S., Jungwirth H., Eisenberg T., Fröhlich K.U. (2004). Apoptosis in yeast. Curr. Opin. Microbiol., vol. 7, p. 655-660.

110. Manskikh, V. N. (2007) Pathways of cell death and their biological importance. Tsitologiya, vol. 49, p. 909-915.

111. Mantón J. (1961) Some problems of mitochondrial growth. J. Exp. Botany, vol. 12 (35), p. 421-429.

112. Marbach K., Fernandez-Larrea J. and Stahl U. (1994) Reversion of a long-living undifferentiated mutant of Podospora anserina by copper. Curr. Genet, vol. 26, p. 184-186.

113. Marcou D. (1961) Notion de longévité et nature cytoplasmique du déterminant de la sénescence chez quelques champignons. Ann. Sei. Natur. Bot., vol. 11, p. 653-764.

114. Martin W.J., Kachel D.L., Vilen T., Natarajan V. (1989) Mechanism of phospholipidosis in amiodarone pulmonary toxicity. J Pharmacol Exp Ther., vol. 251, p. 272-278.

115. Martin G.M., Austad S.N. and Johnson T.E. (1996) Genetic analysis of ageing: Role of oxidative damage and environmental stresses. Nat Genet, vol. 13, p. 25-34.

116. Mc Clary (1964) The Cytology of Yeasts. Botanical Review, vol. 30 (2), p. 167-225.

117. Munkres K.D. and Rana R.J. (1978) Antioxidants prolong life span and inhibit the senescence-dependent accumulation of fluorescent pigment (lipofuscin) in clones of Podospora anserina. Mech Age Dev, vol. 7, p. 407— 415.

118. Nedergaard J., Golozoubova V., Matthias A., Asadi A., Jacobsson A., Cannon B. (2001) UCP1: the only protein able to mediate adaptive non-shivering thermogenesis and metabolic inefficiency. Biochim Biophys Acta., vol. 1504(1), p. 82-106.

119. Nestelbacher R. Laun P., Vondräkovä D., Pichova A., Schüller C., Breitenbach M. (2000) The influence of oxygen toxicity on yeast mother cell specific aging. Exp. Gerontol., vol. 35 (1), p. 63—70.

120. Nuttal S.L., Martin U., Hutchin T. Nayak L, Kendall MJ, Sinclair AJ. (1998) Increased oxidative stress in ageing and age-related diseases. Age&Ageing, vol. 27 (1), p. 34.

121. Ojovan S.M., Knorre D.A., Markova O.V., Smirnova E.A., Bakeeva L.E., Severin F.F. (2011) Dodecyl triphenylphosphonium induces ROS-dependent swelling of yeast mitochondria in vivo. Jornal of Bioenergetics and Biomembranes, published.

122. Orr W.C., Sohal R.S. (1994) Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster. Science, vol. 18, p 127-137.

123. Osiewacz H.D., Hermanns J., Marcou D., Triffi M., Esser K. (1989) Mitochondrial DNA rearrangements are correlated with a delayed amplification of the mobile intron (plDNA) in a long-lived mutant of Podospora anserina. Mutat. Res., vol. 219, p. 9-15.

124. Osiewacz H.D. and Nuber. U. (1996). Grisea, a putative copper activated transcription factor from Podospora anserina involved in differentiation and senescence. Mol. Gen. Genet., vol. 252, p. 115-124.

125. Osiewacz H.D, Borghouts C. (2000) Mitochondrial oxidative stress and aging in the filamentous fungus Podospora anserina. Ann N Y Acad Sci., vol. 908, p. 31-39.

126. Osiewacz H.D. (2002) Genes, mitochondria and aging in filamentous < fungi. Ageing Res. Rev., vol. 1 (3), p. 425-442.

127. Osiewacz H.D. (2002) Mitochondrial functions and aging. Gene, vol. 286, p. 65-71.

128. Osiewacz H.D. and Scheckhuber C.Q. (2006). Impact of ROS on ageing of two fungal model systems: Saccharomyces cerevisiae and Podospora anserine. Free Radical Research, vol. 40 (12), p. 1350-1358.

129. Ott M., Gogvadze V., Orrenius S., Zhivotovsky B. (2007) Mitochondria, oxidative stress and cell death. Apoptosis, vol. 12, p. 913-922.

130. Ozhovan S.M., Knorre D.A., Severin F.F., Bakeeva L.E. (2009). Yeast cell ultrastructure after amiodarone treatment. Tsitologiia, vol. 51 (11), p. 911-916.

131. Perktold A., Zechmann B., Daum G., Zellnig G. (2007) Organelle association visualized by three-dimensional ultrastructural imaging of the yeast cell. FEMS Yeast Res., vol. 7, p. 629-638.

132. Pinan-Lucarre B., Paoletti M., Clave C. (2007) Cell death by incompatibility in the fungus Podospora. Sem. Cane. Biol., vol. 17 (2), p. 101-111.

133. Pirovino M., Muller O., Zysset T., Honegger U. (1988) Amiodarone-induced hepatic phospholipidosis: correlation of morphological and biochemical findings in an animal model. Hepatology, vol. 8, p. 591-598.

134. Plattner H., Schatz G. (1969) Promitochondria of anaerobically grown yeast. 3. Morphology. Biochemistry, vol. 8 (1), p. 339-343.

135. Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V., Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F. (2005) Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. J Cell Biol, vol. 168, p. 257-269.

136. Rassmussen L., Singh K.K. (1998) Genetic integrity of mitochondrial genome. In: Mitochondrial DNA Mutations in Aging, Disease, and Cancer. Springer, New York, NY.

137. Rattan S.I.S. (1991). Protein synthesis and the component of protein synthetic machinery during cellular ageing. Muta Res, vol. 256, p. 115-125.

138. Reynolds E.S. (1963). The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., vol. 17, p. 208213.

139. Richter C. (1988) Do mitochondrial DNA fragments promote cancer and aging? FEBSLett., vol. 241, p. 1-5.

140. Rizet G. (1953) Sur l'impossibilité d'obtenir la multiplication végétative ininterrompue et illimitée de l'Ascomycète Podospora anserina. C.R.Hebd.Seances Acad.Sci, vol. 137 (15), p. 838-840.

141. Rizet G. (1953). Sur la longévité des souches de Podospora anserina. C. R. Acad. Sci., (Paris), vol. 237, p. 1106-1109.

142. Rodriguez-Menocal L., Urso G.D. (2004) Programmed cell death in fission yeast. FEMS Yeast Research, vol. 5, p. 111-117.

143. Saito A., Smigel M., Fleischer S. (1974) Membrane junctions in the intermembrane space of mitochondria from mammalian tissues. J. Cell Biol., vol. 60 (3), p. 653-663.

144. Sainsard-Chanet A., Begel O. and Belcour L. (1994) DNA doublestrand break in vivo at the 30 extremity of exons located upstream of group II introns. Senescence and circular DNA introns in Podospora mitochondria. J Mol Biol, vol. 242, p. 630-643.

145. Scheckhuber C.Q., Erjavec N., Tinazli A., Hamann A., Nystrôm T., Osiewacz H.D. (2007) Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol., vol. 9(1). p. 99-105.

146. Schulte E., Kiick U., Esser K. (1988) Extrachromosomal mutations from Podospora anserina: permanent vegetative growth in spite of multiple recombination events in the mitochondrial genome. Mol. Gen. Genet, vol. 211, p. 342-349.

147. Severin F.F., Skulachev V.P. (2009) Programmed cell death as a target to interrupt the aging program. Adv Gerontol., vol. 22 (1), p. 37-48.

148. Sherman F. (2002) Getting started with yeast. Methods Enzymol., vol. 350, p. 3-41.

149. Shigenaga M.K., Hogen T.M., Ames B.N. (1994) Oxidative damage and mitochondrial decay in aging. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol.91 (23), p.10771-10778.

150. Silar P., Haedens V., Rossignol M. and Lalucque H. (1999) Propagation of a novel cytoplasmic, infectious and deleterious determinant is controlled by translational accuracy in Podospora anserina. Genetics, vol. 151, p. 87-95.

151. Silar P. and Daboussi M.J. (1999) Non-conventional infectious elements in filamentous fungi. Trends Genet, vol. 15, p. 141-145.

152. Silar P., Lalucque H. and Vierny C. (2001) Cell degeneration in the model system Podospora anserine. Biogerontology, vol. 2, p. 1-17!

153. Singh B.N. (1996) Antiarrhythmic actions of amiodarone: a profile of a paradoxical agent. Am J Cardiol., vol. 78, p. 41-53.

154. Skulachev V.P. (1999) Phenoptosis: programmed death of an organism. Biochemistry (Moscow), vol. 64, p. 1418-1426.

155. Skulachev V.P. (2002) Programmed death phenomena: from organelle to organism. Ann. N.Y. Acad. Sci., vol. 959, p. 214-237.

156. Skulachev V.P. (2003) Aging and the programmed death phenomena. In: Topics in Current Genetics. (T. Nystrom and H.D. Osiewacz, Eds.) Model systems in aging. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, vol. 3, p. 191— 238.

157. Skulachev V.P. (2009) New data on biochemical mechanism of programmed senescence of organisms and antioxidant defense of mitochondria. Biochemistry (Mose.), vol. 74 (12), p. 1400-1403.

158. Sokolov S., Knorre D., Smirnova E., Markova O., Pozniakovsky A., Skulachev V., and Severin F. (2006) Ysp2 mediates death of yeast induced by amiodarone or intracellular acidification. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1757, p. 1366-1370.

159. Somani P., Bandyopadhyay S., Gross S.A., Morady F., Dicarlo L.A. (1987) Amiodarone and multilamellar inclusion bodies. Br J Clin Pharmacol., vol. 24, p.237-239.

160. Starkov A.A. (2008) The role of mitochondria in reactive oxygen species metabolism and signaling. Ann N Y Acad Sci., vol. 1147, p. 37-52. Review.

161. Stevens B. (1977) Variation in number and volume of mitochondria in yeast according to growth conditions. A study based on serial sectioning and computer graphics reconstruction. Biol. Cell., vol. 28 (1), p. 37-56.

162. Tanaka K., Kanbe T., Kuroiwa T. (1985) Three-dimensional behaviour of mitochondria during cell division and germ tube formation in the dimorphic yeast Candida albicans. J. Cell Sci., vol. 73, p. 207-220.

163. Tandler B., Erlandson R.A., Smith A.L., Wynder E.L. (1969) Riboflavin and mouse hepatic cell structure and function. II. Division of mitochondria during recovery from simple deficiency. J Cell Biol., vol. 41 (2), p. 477-493.

164. Tandler B., Hoppel C.L. (1973) Division of giant mitochondria during recovery from cuprizone intoxication. J Cell Biol., vol. 56 (1), p. 266-272.

165. Taub J., Lau J.F., Ma C., Hahn J.H., Hoque R., Rothblatt J:, Chalfie M. (1999) A cytosolic catalase is needed to extend adult lifespan in C. elegans daf-C and clk-1 mutants. Nature, vol. 399 (6732), p. 162-166.

166. Terada L. S. (2006) Specificity in reactive oxidant signaling: think globally, act locally. J. Cell Biol., vol. 174, p. 615-623.

167. Terman A., Brunk U.T. (1998) Lipofuscin: mechanisms of formation and increase with age. APMIS, vol. 106, p. 265-276.

168. Tudzynski P., Esser K. (1977) Inhibitors of mitochondrial functions prevent senescence in the ascomycete Podospora anserina. Mol. Gen. Genet, vol. 173, p. 111-113.

169. Tudzynski P., Esser K. (1979) Chromosomal and extrachromosomal control of senescence in the ascomycete Podospora anserina. Mol. Gen. Genet, vol 173, p. 71-84.

170. Valko M.,. Leibfritz D, Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J. (2007) Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol., vol. 39, p. 44-84.

171. Vieira H.L., Boya P., Cohen I., El Hamel C., Haouzi D., Druillenec S., Belzacq A.S., Brenner C., Roques B., and Kroemer G. (2002) Cell permeable BH3-peptides overcome the cytoprotective effect of Bcl-2 and Bcl-XL. Oncogene, vol. 21, p. 1963-1977.

172. Vierny C., Keller A.M., Begel O. and Belcour L. (1982) A sequence of mitochondrial DNA is associated with the onset of senescence in a fungus. Nature, vol. 297, p. 157-159.

173. Wakabayashi T. (2002) Megamitochondria formation physiology and pathology. J Cell Mol Med., vol. 6 (4), p. 497-538.

174. Wakabayashi T., Asano M., Ishikawa K., Kishimoto H. (1978) Mechanism of the formation of megamitochondria by copper-chelating agents. V. Further studies on isolated megamitochondria. Acta Pathol Jpn., vol. 28 (2), p. 215-223.

175. Wakabayashi T.5 Asano M., Kurono C. (1974) Some aspects of mitochondria having a "septum". J Electron Microsc (Tokyo), vol. 23 (4), p. 247-254.

176. Wallace P.G., Huang M., Linnane A.W. (1968) The biogenesis of mitochondria. II. The influence of medium composition on the cytology of anaerobically grown Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol., vol. 37 (2), p. 207-220.

177. Westermann B., Neupert W. (2000) Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, vol. 16, p. 1421—1427.

178. Wickner R.B., Taylor K.L., Edskes H.K., Maddelein M.L., Moriyama H. and Roberts B.T. (1999) Prions in Saccharomyces and Podospora spp.: Protein-based inheritance. Microbiol Mol Biol Rev, vol. 63, p. 844-861.

179. Yang H., Ren Q., and Zhang Z. (2006) Chromosome or chromatin condensation leads to meiosis or apoptosis in stationary yeast {Saccharomyces cerevisiae) cells. FEMS Yeast Res., vol. 6, p. 1254-1263.

180. Yasuda S.U., Sausville E.A., Hutchins J.B., Kennedy T., Woosley R.L. (1996) Amiodarone-induced lymphocyte toxicity and mitochondrial function. JCardiovasc Pharmacol., vol. 28, p. 94—100.

181. Zhang Y.Q., Rao R. (2007) Global disruption of cell cycle progression and nutrient response by the antifungal agent amiodarone. J Biol Chem., vol. 282, p. 37844-37853.

182. Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова

183. Факультет биоинженерии и биоинформатикиои.(И 1 5537 7

184. Окислительный стресс и действие разобщителей. Ультраструктурное исследование на клетках Басскаготусея сегеч1$1ае и Ройоярога атеппа1. Ожован Сильвия Михайловна1. Том 2 (Иллюстрации)

185. Руководители: к.б.н. Ф.Ф. Северин, д.б.н., проф. Л.Е. Бакеева1. Москва, 201105 мкм

186. Фот. 1. Контроль. Клетка Басскаготусез сегеУ1з1ае. Дикий тип.

187. Фот. 2. Контроль. Клетки Басскаготусез сегеу1з1ае, дикий тип. Общий вид суспензии клеток. На вклейке справа большое увеличение клетки, имеющей типичную ультраструктуру.

188. Фот. 4. Контроль. Клетки Засскаготусея сегеггзгае. Дикий тип.

189. Фот. 5. Контроль. Клетки Засскаготусея сегеУ1Я1ае. Дикий тип. Стрелкой показана протяженная митохондрия.02 мкм

190. Фот. 6. Клетка Saccharomyces cerevisiae. Мутант по гену ysp2.мтх

191. Фот. 9. Клетка Засскаготусеь сегет$1ае при большем увеличении. Мутант по гену узр2. Клетка содержит митохондрию необычной ультраструктуры.1. ГО

192. Фот. 10. Клетка Засскаготусез cerevisiae. Дикий тип. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ).И

193. Фот. 11. Ультратонкие серийные последовательные срезы (а-е) через одну клетку Saccharomyces cerevisiae. Дикий тип. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ). Видны необычные мотки мембран, скопления JIB.

194. Фот. 12. Ультратонкие серийные последовательные срезы (А-У) через одну клетку Saccharomyces cerevisiae. Дикий тип. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ). Видны скопления JIB, а также отпочковывание ядра.

195. Фот. 14. Клетка Засскаготусез сегеУ1ьчае. Дикий тип. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ). Открытое ядро контактирует с ЛВ.

196. Фот. 15. Клетка Saccharomyces cerevisiae. Дикий тип. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ). Открытое ядро контактирует с JIB.

197. Фот. 16. Ультратонкие серийные последовательные срезы (А-Г) через одну клетку Засскаготусез сегеу1ь1ае. Мутант по гену уяр2. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ).

198. Фот. 17. Клетка ЗасскаготусеБ сегеу1$1ае. Мутант по гену уяр2. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ).

199. Фот. 18. Ультратонкие серийные последовательные срезы (А-И) через одну клетку Засскаготусеъ сегеч'тае. Мутант по гену уьр2. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ).

200. Фот. 20. Клетка Saccharomyces cerevisiae. Мутант по гену ysp2. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ). В ядре отчетливо видны стопки мембран, ядерная мембрана открыта и контактирует с JIB, связанным с митохондрией.

201. Фот. 21. Контрольные клетки Басскаготусеь сегеу1$1ае. Дикий тип. Инкубация 10 мин. с амиодароном (50 мкМ). Мембраны, образующие необычную структуру, имеют содержащие несколько замкнутых отсеков (показано стрелкой).

202. Фот. 22. Ультратонкие серийные последовательные срезы (а-е) через одну клетку Saccharomyces cerevisiae. Мутант по гену ysp2. Инкубация 10 мин. с амиодароном (50 мкМ). На рис. б видна митохондрия с фрагментированной внутренней мембраной.

203. Фот. 23. Клетка Засскаготусеъ сегеУ151ае. Дикий тип. Длительная инкубация (20 мин.) с амиодароном (50 мкМ). Внешняя митохондриальная мембрана незамкнута, под ней располагаются митопласты (показаны стрелками), которые располагаются по всей цитоплазме.

204. Фот. 25. Ультраструктурная картина фрагментации митохондрии & сегеУ1Я1ае, дикий тип, при голодании.1. А мкм

205. Фот. 26. Ультратонкие серийные последовательные срезы (А-Ф) через одну клетку Басскаготусез сегеУ1я1ае. Дикий тип. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ).

206. Фот. 29. Ультратонкие серийные последовательные срезы (А-Р) через одну клетку Засскаготусеь сеге\'1$1ае. Дикий тип. Кратковременная (1-2 мин) инкубация с амиодароном (40 мкМ).

207. Фот. 37. Клетки дикого типа Басскаготусез сегеггягае. Инкубация с БССР (50 нМ). Общий вид.1. Щв0ШЙ1 мкм

208. Фот. 38. Клетки дикого типа Засскаготусез сеге^гае. Инкубация с БССР (50 нМ). Общий вид.

209. Фот. 39. Клетки дикого типа Басскаготусез сегеу1я1ае. Инкубация с РССР (50 нМ). Ультраструктура митохондрий изменена: произошло незначительное набухание, появление внутри митохондрий замкнутых мембранных структур.

210. Фот. 40. Ультраструктурные последовательные срезы через одну клетку ЗасскаготусеБ сеге\>'151ае, дикий тип. Инкубация с С12ТРР (50 нМ).

211. Фот. 41. Ультраструктурные последовательные срезы через одну клетку БасскаготусеБ сегеу1$1ае, дикий тип. Инкубация с С12ТРР (50 нМ). Видны локальные вздутия митохондрий.05 мкм

212. Фот. 42. Ультраструктурные последовательные срезы через одну клетку Засскаготусез сегеУ1$1ае, дикий тип. Инкубация с С12ТРР (50 нМ). Выраженное обводнение митохондрий.

213. Фот. 43. Клетка Засскаготусез сегеУ1Я1ае, дикий тип. Инкубация с С12ТРР (50 нМ). Выраженное обводнение митохондрии.

214. Фот. 44. Клетка Засскаготусеь сегеу1я1ае, дикий тип. Инкубация с С12ТРР (50 нМ). Видно локальное вздутие матрикса митохондрии.4Г

215. Фот. 45. Ультраструктурные последовательные срезы (а-в) через одну клетку Засскаготусез сегеугэгае, дикий тип. Инкубация с С12ТРР (50 нМ). Выраженное обводнение митохондрий. Стрелками показаны септы в митохондриях.

216. Фот. 46. Клетка дикого типа Засскаготусеь cerevisiae. Инкубация с РССР (50 нМ) и амиодароном (40 мкМ). Стрелкой показаны митохондрии необычной ультраструктуры.

217. Фот. 47. Клетка дикого типа БассЬаготусеБ сегеУ1$1ае. Инкубация с БССР (50 нМ) и амиодароном (40 мкМ).

218. Фот. 48. Клетка дикого типа Засскаготусез сегеУ1я1ае. Инкубация с РССР (50 нМ) и амиодароном (40 мкМ). Видны митохондрии гантелевидной формы.

219. Фот. 49. Клетка дикого типа Засскаготусея сегеу'м'ше. Инкубация с БССР (50 нМ) и амиодароном (40 мкМ). Митохондрии собраны в кластеры, образованные плотно прилегающими митохондриями.

220. Фот. 50. Клетка дикого типа Басскаготусез сегеу1ь1ае. Инкубация с РССР (50 нМ) и амиодароном (40 мкМ). Видна митохондрия гантелевидной формы.1. V;