Молекулярно-генетическая структура гиперфенилаланинемий в Российской Федерации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Кузнецова Ирина Александровна

• Кузнецова Ирина Александровна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Кузнецова Ирина Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История изучения ГФА

1.2 Молекулярные основы ГФА

1.2.1 Фенилаланингидроксилаза

1.2.2 Тетрагидробиоптерин

1.2.3 Белок, содержащий J-домен

1.3 Классификация ГФА

1.3.1 Клиническая классификация

1.3.2 Молекулярно-генетическая классификация

1.4 Характеристика различных форм гиперфенилаланинемии

1.5 Эпидемиология

1.6 Диагностика гиперфенилаланинемии

1.7 Лечение различных форм гиперфенилаланинемии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Выделение геномной ДНК

2.2.2 Метод мультиплексной амплификации лигированных проб

2.2.3 Массовое параллельное секвенирование

2.2.4 Поиск крупных делеций и дупликаций в гене РАН

2.2.5 Электрофорез в полиакриламидном геле

2.2.6 Прямое автоматическое секвенирование по Сэнгеру

2.2.7 Кастомная система MLPA

2.2.8 Статистическая обработка данных

2.2.9 Биоинформатический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Установление спектра вариантов генов, вовлеченных в развитие ГФА в РФ

3.1.1. Поиск 25 частых вариантов гена РАН

3.1.2 Поиск вариантов методом МПС

3.1.3 Поиск крупных перестроек методом количественной MLPA

3.1.4. Редкие варианты гена РАН

3.1.5. Новые варианты гена РАН

3.2 Тетрагидробиоптерин-дефицитные формы ГФА

3.3. Особенности спектра вариантов в различных субъектах РФ

3.4. Доли потенциально сапротерин-зависимых и сапроптерин-чувствительных пациентов

3.5. Усовершенствование протокола ДНК-диагностики у пациентов с ГФА в РФ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Практические рекомендации

Список публикаций по теме диссертации

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

ГМ - головной мозг

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ГФА - гиперфенилаланинемия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОФА - L-Диоксифенилаланин

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

МГК - медико-генетическая консультация

МПС- массовое параллельное секвенирование

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТГ - тирозингидроксилаза

ТПГ - триптофангидроксилаза

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ФА - фенилаланин

ФАГ - фенилаланингидроксилаза

ФКУ - фенилкетонурия

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

BH4 - тетрагидробиоптерин (tetrahydrobiopterin)

cAMP - циклический аденозинмонофосфат

сАРК - цАМФ-зависимая протеинкиназа (cAMP-dependent protein kinase) DHPR - дигидроптеридин редуктаза (dihydropteridine reductase) GTPCH - ГТФ-циклогидролаза I (GTP cyclohydrolase I)

5HIAA - 5-гидроксииндолуксусная кислота (5-hydroxyindoleacetic acid)

HVA - гомованиловая кислота (homovanillic acid)

JDP1 - белок, содержащий J-домен (J domain-containing protein 1)

LNAA - крупные нейтральные аминокислоты (large neutral amino acids)

MLPA - мультиплексная лигазозависимая амплификация (multiplex ligation-

dependent probe amplification)

NEF - фактор обмена нуклеотидов (nucleotide exchange factor) NGS - массовое параллельное секвенирование (next generation sequencing) OMIM - база данных наследственных болезней человека (Online Mendelian Inheritance in Man)

PCBD1 - птерин-4а-карбиноламиндегидратаза (pterin-4a-carbinolamine dehydratase) Phe - фенилаланин (phenylalanine)

PTS - 6-пировоил-тетрагидробиоптерин синтетаза (6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase)

SPR - сепиаптеринредуктаза (sepiapterin reductase) Xaa - неуточненная аминокислота

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая структура гиперфенилаланинемий в Российской Федерации»

Актуальность работы

Гиперфенилаланинемия - группа наследственных заболеваний, характеризующихся повышением уровня фенилаланина (ФА) в крови, наследующихся по аутосомно-рецессивному типу. Клинически гиперфенилаланинемии проявляются задержкой умственного развития, моторным дефицитом и поведенческими расстройствами в течение первых лет жизни при отсутствии лечения. Генетической причиной заболевания может являться наличие патогенных вариантов в гене фермента фениаланингидроксилазы (ФАГ), а также в генах, отвечающих за синтез и регенерацию тетрагидробиоптерина (ВН4), являющегося шапероном ФАГ. Это позволяет выделить среди ГФА фенилкетонурию (ФКУ) и ВН4-дефицитные ГФА. При прямом, а также при ВН4-опосредованном нарушении работы ФАГ активируются побочные пути обмена ФА и происходит накопление токсичных веществ, приводящее к поражению ЦНС и задержке умственного развития. Клинические проявления ГФА возникают в раннем возрасте и носят необратимый характер. Для минимизации патологического воздействия необходимо начинать лечение пациентов как можно раньше. Однако, разные формы ГФА требуют разных подходов к терапии. Методом лечения ФКУ является диетотерапия, исключающая поступление ФА. Лечение при ВН4-дефицитных формах ГФА осуществляется фармакологическим аналогом тетрагидробиоптерина - сапроптерином, в сочетании с препаратами леводопы [Blau N. et al. 2014]. Помимо этого, отмечено, что у некоторых пациентов с ГФА, обусловленной патогенными вариантами в гене РАН, успешна терапия препаратами ВН4. Состояние таких пациентов называется «ВН4-чувствительная ФКУ» [Баранов А.А. и др. 2012; Burton et al. 2007]. Подбор необходимой дозы сапроптерина, а также определение чувствительности к препарату осуществляется проведением нагрузочных тестов [van Wegberg et al. 2017], которые в настоящее время не являются рутинной процедурой в РФ. Помимо нагрузочных тестов приведены данные, согласно которым потенциальный ответ на терапию препаратами ВН4

можно предсказать на основании данных о генотипе пациента [Blau et al. 2016]. В сложившихся условиях определение генотипов позволит выявить потенциально чувствительных к лечению сапроптерином российских пациентов с ФКУ и своевременно назначить эффективную патогенетическую терапию.

Диагностика ГФА основана на определении уровня фенилаланина в крови новорожденных. Молекулярно-генетическая диагностика в мире проводится в рамках семейного консультирования, а также в научных интересах. В России молекулярно-генетическая диагностика проводится для подбора лечения и подтверждения установленного диагноза. Чаще проводится диагностика ФКУ методом поиска 25 частых вариантов в гене PAH. Исследование всей кодирующей последовательности гена РАН проводится гораздо реже. Полный спектр вариантов в гене РАН на территории РФ остается неизвестным. Важным аспектом в диагностике является дифференциальная диагностика ВН4-дефицитных ГФА. Это обусловлено тем, что клинически ВН4-дефицитные ГФА сложно дифференцировать от ФКУ, но при этих формах требуется иное лечение. Тетрагидробиоптерин является шапероном не только для ФАГ, но и для других гидроксилаз, таких как тирозингидроксилаза и триптофангидроксилаза, необходимых для синтеза нейротрансмиттеров. При отсутствии лечения недостаточность ВН4 ведет к умственной отсталости и тяжелым неврологическим нарушениям. Для предотвращения тяжелых последствий необходимо своевременно определить форму ГФА и назначить эффективную терапию. В настоящее время, для дифференциальной диагностики редких форм ГФА, в некоторых странах мира, используется метод тандемной масс-спектрометрии. Однако, в России этот метод не входит в рутинную практику, и на сегодняшний день остро стоит проблема раннего выявления редких форм ГФА. По мировым данным доля ФКУ составляет около 98%, на долю ВН4-дефицитных форм ГФА приходится 1-2% от всех ГФА [Opladen et al. 2011]. По данным неонатального скрининга, проводимого на территории России частота ФКУ в России составляет 1:1000 новорожденных [Новиков П.В. и др. 2012]. Доля ВН4-дефицитных форм ГФА в России в настоящий момент неизвестна. Ввиду отсутствия в рутинной практике

дифференциальной диагностики различных форм ГФА, в настоящее время нет возможности определить долю редких форм ГФА на территории Российской Федерации. В связи с этим необходимо определить полный спектр вариантов, приводящих к развитию ГФА в РФ, что позволит усовершенствовать существующий протокол диагностики ГФА и определить долю редких форм ГФА.

Степень разработанности темы исследования

Гиперфенилаланинемия широко и подробно изучена зарубежными исследователями. Открыто и изучено семь форм гиперфенилаланинемии, последняя из которых открыта в 2017 году. Оценена распространенность различных форм в некоторых популяциях мира. Активно изучаются и совершенствуются методы диагностики и лечения ГФА. Большинство исследований посвящено изучению фенилкетонурии и изучению новых вариантов в гене РАН, молекулярно-генетическая диагностика ВН4-дефицитных форм производится гораздо реже. В России масштабных исследований по изучению вклада вариантов в генах, вовлеченных в развитие гиперфенилаланинемий, до настоящего времени не проводилось. Затруднена дифференциальная диагностика ВН4-дефицитных форм ГФА, распространенность данных форм в России не определена.

Цель исследования: изучить генетическую гетерогенность гиперфенилаланинемий в Российской Федерации для усовершенствования протокола молекулярно-генетической диагностики и определения перспектив лечения больных фенилкетонурией и гиперфенилаланинемиями.

Задачи исследования:

1) Описать спектр и частоту патогенных вариантов в гене РАН, а также установить вклад вариантов в генах, кодирующих белки метаболизма тетрагидробиоптерина, в развитие гиперфенилаланинемий в Российской Федерации.

2) Установить доли и спектры вариантов в генах, вовлеченных в развитие ВН4-дефицитных форм гиперфенилаланинемий.

3) Оценить эффективность применения системы анализа частых вариантов в гене РАН в различных субъектах Российской Федерации.

4) Определить доли потенциально сапроптерин-зависимых и сапроптерин-чувствительных пациентов среди больных фенилкетонурией и гиперфенилаланинемиями.

5) Усовершенствовать алгоритм ДНК-диагностики у пациентов с гиперфенилаланинемиями в Российской Федерации.

Методология и методы исследования

Методологической и теоретической основной диссертационного исследования явились научные работы отечественных и зарубежных исследователей в области изучения различных форм гиперфенилаланинемии и молекулярно-генетических подходов к ее диагностике.

В работе использованы следующие методы: выделение геномной ДНК, мультиплексная амплификация лигированных проб, массовое параллельное секвенирование панели генов, метод полимеразной цепной реакции, метод прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру, электрофорез в полиакриламидном геле, методы статистической обработки данных и биоинформатического анализа данных МПС.

Положения, выносимые на защиту

1) Определен вклад и спектр вариантов генов, вовлеченных в развитие гиперфенилаланинемий в Российской Федерации в выборке больных с гиперфенилаланинемией. РАН-дефицитная ГФА является наиболее частой нозологической формой, ее доля составляет 99,6% среди всех ГФА, за ней следует гиперфенилаланинемия с дефицитом тетрагидробиоптерина типа А с долей 0,4%. Других форм ГФА в исследуемой выборке не обнаружено.

2) Данные спектра генетических вариантов, полученные в ходе анализа образцов из 51 субъекта России, определили частоты выявленных вариантов в каждом субъекте, а также особенности их распределения. Общим для всех субъектов является вариант р.А^408Тгр в гене РАН, аллельная частота которого

составляет 52,1% среди всех проанализированных хромосом пациентов.

3) Согласно данным об остаточной активности фермента ФАГ рассчитаны доли потенциально сапроптерин-зависимых и сапроптерин-чувствительных пациентов в исследуемой выборке. Доля пациентов, потенциально не отвечающих на терапию сапроптерином, составляет 64%. Доля потенциальных «ответчиков» составила 27%. Предложен возможный алгоритм нагрузочного тестирования для пациентов.

4) Усовершенствован существующий алгоритм молекулярно-генетической диагностики гиперфенилаланинемий. На первом этапе рекомендуется поиск 25 наиболее частых вариантов в гене PAH. При обнаружении одного частого варианта в гене PAH, предлагается поиск второго варианта методом прямого автоматического секвенирования гена PAH. При отсутствии частых вариантов, предлагается второй этап - генотипирование методом МПС панели генов, варианты в которых приводят к развитию гиперфенилаланинемии. Если диагноз не подтвержден, на третьем этапе рекомендуется проведение поиска протяженных перестроек методом MLPA.

Научная новизна результатов исследования

Впервые проведено молекулярно-генетическое исследование всего спектра генов, вовлеченных в развитие ГФА на территории Российской Федерации. Исследование проведено с использованием всех доступных методов молекулярно-генетической диагностики. Для проведения исследования разработана панель для массового параллельного секвенирования, включающая в себя все известные гены, патогенные варианты в которых приводят к развитию ГФА. На основе анализа крупной выборки пациентов, с диагнозами фенилкетонурия и гиперфенилаланинемия, выявлены редкие варианты в гене РАН, приводящие к фенилкетонурии, в том числе ранее не описанные в литературе. Определена доля крупных перестроек в гене РАН среди всех вариантов, которая составила 1,3%. Выявлены варианты в гене PTS, приводящие к развитию тетрагидробиоптерин-дефицитной гиперфенилаланинемии типа А, определена доля ВН4-дефицитных

форм ГФА в РФ. В ходе работы установлен размах вариации доли варианта р.А^408Тгр в субъектах РФ.

Теоретическая и практическая значимость

Разработана и введена в рутинную практику панель массового параллельного секвенирования, включающая в себя 7 генов, варианты в которых приводят к развитию ГФА. В ходе работы определен вклад и спектр вариантов в исследуемых генах, в связи с этим предложен усовершенствованный алгоритм молекулярно-генетической диагностики. На основании полученных данных определена потенциальная чувствительность пациентов к препаратам сапроптерина. Показано, что пациентам, не имеющим в генотипе частых вариантов в гене РАН, необходимо проведение нагрузочного тестирования. Определен спектр вариантов, специфичных для исследуемой популяции.

Степень достоверности результатов

Работа проведена на выборке больных гиперфенилаланинемией на территории РФ, в которую вошло 1263 неродственных пробанда с клиническими диагнозами «фенилкетонурия» и «гиперфенилаланинемия», зарегистрированных в аудите неонатального скрининга и лечения фенилкетонурии. Исследование проведено с использованием современных молекулярно-генетических методов диагностики и статистических методов обработки данных. В качестве теоретической основы исследования использованы многочисленные источники литературы, в число которых вошли как отечественные, так и зарубежные работы. Полученные результаты наглядно представлены в виде рисунков и таблиц. Выводы подкреплены экспериментальными данными и соответствуют поставленным задачам.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с областями исследования специальности 1.5.7. (03.02.07) -Генетика (медицинские науки) - «Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни. Молекулярные основы наследственности. Мутационная

изменчивость.». Работа включает в себя обсуждение проблем генетики человека, медицинской генетики, наследственных болезней.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на XXV межрегиональной научно-практической конференции «Современные молекулярно-биологические и генетические технологии в медицинской практике», Новосибирск, 19-20 апреля 2018 год; European Human Genetics Conference 2017, May 27-30, 2017, Copenhagen, Denmark, Х Конференции и конкурсе работ молодых ученых ФГБНУ «МГНЦ», Москва, ноябрь 2018 год; Четвёртой международной научно-практической конференции «NGS в медицинской генетике 2019», Суздаль, 24-26 апреля 2019 год; European Society of Human Genetics Conference, 2019 June 15 - 17, Gothenburg, Sweden.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 (Д 001.016.01) при ФБГНУ «МГНЦ».

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор работы непосредственно участвовал в разработке схемы и последовательности проведенных исследований, формулировании цели и задач, выборе методов исследования, статистической обработке полученных данных. Автор принимал участие в подборе условий и введении метода поиска 25 частых вариантов гена РАН в диагностическую практику. Автором проведено молекулярно-генетическое обследование 294 пробандов с использованием метода массового параллельного секвенирования, молекулярный анализ хромосом с протяженными делециями в гене РАН. Автором изучена и проработана зарубежная и отечественная литература по теме диссертации, проведен анализ полученных данных, сформулированы результаты и выводы. Результаты проведенного исследования опубликованы автором в рецензируемых журналах, а также представлены на российских и зарубежных научных конференциях.

Публикации

Материалы диссертации представлены в 6 печатных работах соискателя, в том числе 5 статей в журналах (SCOPUS и WoS), рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Работа представлена на 117 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 15 рисунков. Библиографический указатель включает 129 наименований, из них 6 отечественных и 123 иностранных источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 История изучения ГФА

Первым хорошо изученным наследственным метаболическим заболеванием является фенилкетонурия. Заболевание описано в 1934 году норвежским врачом Асбьёрном Фёллингом [Fölling et al. 1934]. Он описал биохимическую патологию, лежащую в основе развития ФКУ, обнаружив фенилпировиноградную кислоту в моче двух детей и назвал заболевание фенилпировиноградная олигофрения. Позже заболевание переименовано в фенилкетонурию Лайонелом Пенроузом, который установил, что болезнь носит аутосомно-рецессивный характер наследования [Penrose et al. 1935]. В 1937 году Джордж Джервис установил, что причиной развития гиперфенилаланинемии при ФКУ является нарушение работы фермента фенилаланингидроксилазы. В дальнейшем это подтвердили тестами, проведенными на клетках печени больных фенилкетонурией in vitro [Jervis et al. 1953]. В 1950х годах впервые успешно применено лечение пациентов с ФКУ На основании предыдущих работ, посвященных исследованию ФКУ, доктор Бикель с коллегами приготовил первый аминокислотный заменитель животного белка без содержания фенилаланина и успешно применил его на практике. В качестве заменителя использовался гидролизат казеина, очищенный от фенилаланина [Bickel et al. 1953]. Таким образом, ФКУ - это первое наследственное заболевание, для которого найдено эффективное лечение путем модификации внешних факторов. Данный метод лечения остается наиболее эффективным и в настоящее время.

Благодаря работе доктора Роберта Гатри стало возможным проведение неонатального скрининга ГФА [Guthrie et al. 1963]. В основе метода лежит явление торможения роста Bacillus subtilis при посеве на питательную среду, содержащую специфические ингибиторы роста микроорганизмов. При содержании ФА в крови, превышающем нормальные значения (2-6 мг/дл), тормозящее влияние химического ингибитора снимается и бактерии начинают активно расти. Содержание фенилаланина в крови оценивается по диаметру образовавшейся колонии. Позже,

на смену микробиологическому методу пришел иммуноферментный анализ и флуориметрия. В настоящее время клиническая диагностика почти повсеместно проводится методом тандемной масс-спектрометрии из-за скорости получения результата [Lukacs et al. 2006]. Неизменным остается только метод забора биоматериала для проведения скрининга, так как сухие пятна крови на фильтре просты в использовании и не требуют особых условий при транспортировке.

В 1970-х годах описано, что гидроксилазная система печени, отвечающая за превращение ФА в тирозин, состоит из двух апоферментов -фенилаланингидроксилазы и дигидроптеридинредуктазы, а также необходимого кофактора L-эритро-5,6,7,8-тетрагидробиоптерина (BH4) [Massey V. et al. 1975]. C 1974 года описано несколько пациентов с атипичной ФКУ, клиническая картинка которых схожа с таковой при классической ФКУ, однако основным отличием являлось отсутствие улучшений при ограничении поступления ФА, а также несколько случаев смерти таких пациентов в течение первых лет жизни [Bartholome et al. 1974; Danks et al. 1975; Kaufman et al. 1978; Danks et al. 1978]. Исследование биопсии печени и биохимический анализ крови таких пациентов показали нормальную активность ФАГ, но низкую концентрацию биоптеринподобных соединений в сыворотке крови и печени [Leeming et al. 1976; Kaufman et al. 1978]. Очевидно, что гиперфенилаланинемия у таких пациентов вызвана дефицитом ВН4. В связи с этим заболевание получило название «злокачественная гиперфенилаланинемия», а позже переименовано в «дефицит ВН4» [Danks et al. 1978; Curtius et al. 1979]. В настоящее время насчитывают 5 генетических форм гиперфенилаланинемии с дефицитом ВН4 и одну форму без дефицита ВН4. Для дифференциальной диагностики дефицита ВН4 Данкс предложил тестировать всех пациентов, у которых отмечена гиперфенилаланинемия, введением ВН4 [Danks et al. 1978]. При введении ВН4 у таких пациентов высокая концентрация ФА в сыворотке снижалась. Впервые это продемонстрировано у 17-ти месячного пациента с дефицитом ВН4. При введении ВН4, фенилаланин сыворотки снизился с 7,2 до 5,6 мг/дл через два часа после введения 10 мг BH4. В течение следующих двух дней пациенту однократно ввели 50 мг в первый и 100 мг во второй день, после

чего фенилаланин сыворотки снизился до 1,5 мг/дл [Danks et al. 1975]. В связи с этим проводились исследования, направленные на изучение ВН4 и его синтетических аналогов для лечения ГФА. По настоящее время для лечения ГФА с дефицитом ВН4 во всем мире используется синтетический аналог сапроптерин дигидрохлорид - Куван (Kuvan®, BioMarin Pharmaceutical Inc, США). Позднее обнаружено, что некоторые пациенты с вариантами в гене РАН также отвечают на введение ВН4 [Kure et al. 1999], данный феномен получил название «ВН4-чувствительная ФКУ». Замечено, что у пациентов с такой формой ГФА отмечается высокая остаточная активность фермента ФАГ, что повлекло за собой предположение о связи типа вариантов с ответом на лечение тетрагидробиоптерином [Spaapen et al. 2003]. Кроме того, стало известно, что фенилкетонурия - конформационное заболевание, вызванное мисфолдингом белка ФАГ [Gersting et al. 2008]. Введение тетрагидробиоптерина пациентам с определенными вариантами в гене РАН приводило к восстановлению рабочей конформации ФАГ [Pey et al. 2004]. В таком случае, тетрагидробиоптерин, считавшийся до этого кофактором ФАГ, на самом деле является шапероном, что доказано позднее in vivo на модели мышей [Gersting et al. 2010]. Данное открытие в дальнейшем помогло в лечении других конформационных заболеваний.

К 1990-м годам установлено, что ген PAH человека локализован на 12 хромосоме (12q22-12q24.2) и окончательно определена молекулярная структура гена [DiLella et al. 1986; Lidksy et al. 1984].

1.2 Молекулярные основы ГФА

Причиной развития ГФА служит нарушение метаболизма ФА. Поступающий извне ФА в организме претерпевает ряд изменений. Фенилаланин метаболизируется путем образования тирозина, необходимого для синтеза меланина, гормонов коры надпочечников и поджелудочной железы. Однако, при нарушении работы фенилаланингидроксилазы, в организме накапливается большое количество токсичных метаболитов ФА, таких как фенилпировиноградная, фенилмолочная и фенилуксусная кислоты. Данные

метаболиты оказывают токсичное действие на головной мозг. Нарушение работы ФАГ происходит несколькими путями. Первый путь обусловлен нарушениями в гене, кодирующем ФАГ (PAH), то есть нарушение непосредственно синтеза фермента. Второй путь возникает при нарушении работы шаперонов, обеспечивающих фолдинг и активацию фермента. К данным шаперонам относятся тетрагидробиоптерин и белок, содержащий J-домен (J domain-containing protein 1, JDP1). Принцип работы указанных белков рассматривается ниже.

1.2.1 Фенилаланингидроксилаза

Фенилаланингидроксилаза представляет собой негемовый железозависимый фермент, который катализирует гидроксилирование ФА до триптофана в присутствии тетрагидробиоптерина с использованием молекулярного диоксида кислорода в качестве дополнительного субстрата. У человека этот процесс происходит преимущественно в клетках печени [Scriver et al. 1995]. Фермент фенилаланингидроксилаза кодируется геном РАН, расположенном на коротком плече 12 хромосомы в регионе 12q22-12q24.2 [Lidksy et al. 1984]. ФАГ представляет собой гомотетрамерный белок с протомером, организованным в три функциональных домена (рис.1): регуляторный N-концевой домен (остатки 1-117), содержащий сайт фосфорилирования (Ser16) и ауторегуляторную последовательность (autoregulation sequence; ARS, остатки 1-33); каталитический домен (остатки 118-411); и C-концевая область (остатки 412-452), включающая мотивы димеризации и тетрамеризации [Flatmark et al. 1999; Stokka et al. 2003].

Тетрамер представляет собой димер двух конформационно разных димеров, связанных двойной некристаллографической осью симметрии [Fusetti et al. 1998]. В клетке ФАГ существует в стабильной и нестабильной конформационных формах. Стабильная форма представлена неактивным свернутым ферментом, в котором регуляторные домены каждого тетрамера находятся во взаимодействии с каталитическим доменом, при этом активный сайт каталитического домена оказывается заблокированным для субстрата. Таким образом стабильная форма является неактивной.

Регуляторный домен

Рисунок 1. Трехмерная структура протомера фенилаланингидроксилазы человека с указанием доменной структуры, красным обозначен атом железа в области сайта связывания [Flatmark et al. 1999].

Переход в активную, нестабильную, форму опосредуется связыванием ФА с регуляторными доменами, что приводит к их гомодимеризации и открытию активного сайта каталитического домена (рис. 2). Таким образом, ФА активизируется под действием субстрата [Patel et al. 2016]. Дополнительным механизмом посттранскрипционной регуляции ФАГ является фосфорилирование Ser16 в N-концевом домене цАМФ-зависимой протеинкиназой (cAMP-dependent protein kinase, сАРК). Свободный ФА повышает скорость фосфорилирования с помощью сАРК, что способствует активации ФАГ [Fitzpatrick et al. 2012].

При возникновении аминокислотных замен в концевых доменах белка, нарушается процесс образования активного тетрамера. Происходит неправильное сворачивание белка и быстрая деградация фермента [Gregersen et al. 2006]. Это приводит к развитию РАН-зависимой гиперфенилаланинемии, которая также носит название Фенилкетонурия.

Рисунок 2. Механизм активации фенилаланингидроксилазы. Желтым цветом обозначены К-концевые регуляторные домены; зеленым - каталитические домены. Фиолетовым цветом обозначен активный сайт. Переход ФАГ из стабильной формы в активную форму происходит при наличии ФА в среде (стрелка вправо). Обратный переход осуществляется благодаря шаперону ВН4 (стрелка влево) [Ра1е1 е1 а1. 2016].

1.2.2 Тетрагидробиоптерин

В организме человека тетрагидробиоптерин выступает как кофактор многих ферментов. К ним относятся гидроксилазы фенилаланина, тирозина и триптофана, NO-синтаза и глицерил-эфир-монооксигеназа. Тетрагидробиоптерин также играет роль кофермента в реакциях превращения тирозина в ДОФА и серотонин под действием тирозингидроксилазы (ТГ). В реакции гидроксилирования фенилаланина ВН4 выступает как ко-субстрат, который принимает один из атомов кислорода от О2 и в процессе реакции гидроксилируется, образуя птерин 4а-карбиноламин (4-ОН-ВН4). Кроме роли субстрата кофактор ВН4 также функционирует в качестве отрицательного эффектора. Он конкурентно связывается с ФАГ и снижает скорость фосфорилирования по Ser16, образуя стабилизирующий комплекс ФАГ-ВН4 при низких концентрациях свободного ФА [Реу et а1. 2004]. При этом ВН4 действует как естественный шаперон, способствуя сворачиванию и стабилизации молекулы ФАГ [и^еЛа^ et а1. 2012].

1.2.2.1 Синтез тетрагидробиоптерина

Тетрагидробиоптерин образуется в результате синтеза de novo, а также в процессе регенерации. Биосинтез de novo тетрагидробиоптерина протекает в организме в три этапа (рис.3).

Рисунок 3. Метаболизм тетрагидробиоптерина в организме человека. Цифрами обозначены этапы протекания метаболизма. Описание этапов приведено в тексте. Курсивом обозначены гены, кодирующие ферменты. Зеленым цветом указаны пути метаболизма тетрагидробиоптерина, не относящиеся к

фенилаланингидроксилазной системе [Blau et al. 2001].

На первом этапе (1) из гуанозинтрифосфата (guanosine triphosphate, GTP; ГТФ) под действием фермента ГТФ циклогидролазы I (GTP cyclohydrolase I, GTPCH) образуется дигидронеоптеринтрифосфат. Далее, из дигидронеоптеринтрифосфата образуется 6-пирувоил-тетрагидробиоптерин (2) при помощи 6-пирувоилтетрагидроптерин синтазы (6-pyrovoyl tetrahydropterin synthase, PTPS). На третьем этапе (3) образуется тетрагидробиоптерин под действием сепиаптеринредуктазы (sepiapterin reductase, SR) [Werner et al. 2011]. Ферменты, участвующие в этих реакциях рассмотрены ниже.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кузнецова Ирина Александровна, 2021 год

Тип Использованные Ссылка

варианта предикторы

Миссенс Ми1а1юпТа81ег http://www.mutationtaster.org/

Ргоуеап/ЗШТ http://provean.jcvi.org/index.php

иМБ-Рге&^ог http://umd-predictor.eu/

БАТИММ http://fathmm.biocompute.org.uk/

Ро1уРИеп-2 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

Ми1а11опА88е88ог http://mutationassessor.org/r3/

М-САР http://bejerano.stanford.edu/mcap/

Ми1а1юпТа81ег http://www.mutationtaster.org/

№Юепе2 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/

Тип варианта Использованные предикторы Ссылка

Вариант сайта сплайсинга FSPLICE http://www.softberry.com/berry.phtml?topic =fsplice&group=programs&subgroup=gfind

Human Splicing Finder 3.1 http://www.umd.be/HSF/

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Установление спектра вариантов генов, вовлеченных в развитие

ГФА в РФ

Впервые в России проведено масштабное молекулярно-генетическое исследование генов, варианты в которых приводят к развитию гиперфенилаланинемий. Работа проведена с использованием современных методов ДНК анализа. С целью установления спектра вариантов генов, вовлеченных в развитие ГФА проанализированы данные 1263 неродственных пробандов (2526 хромосом) с диагнозами «фенилкетонурия» и «гиперфенилаланинемия». Материал пробандов поступал в лабораторию в рамках программы генотипирования из различных субъектов России. В программе участвовали пациенты с гиперфенилаланинемией, выявленной в ходе неонатального скрининга. Обязательным условием для участия в программе генотипирования является наблюдение пациента у врача-генетика и наличие информации о пациенте в «Аудите неонатального скрининга и лечения фенилкетонурии». В рамках программы для каждого пациента проведен поиск 25 частых вариантов в гене РАН. Однако, гиперфенилаланинемия возникает не только из-за изменений в гене РАН, и спектр вариантов, в такой большой и многонациональной стране как Россия, не может ограничиваться только 25 вариантами. В связи с этим, для тех пациентов, у которых не удалось обнаружить два частых варианта в гене РАН проведен поиск редких вариантов в генах, варианты в которых связаны с развитием ГФА, с использованием метода массового параллельного секвенирования, произведен поиск протяженных делеций и дупликаций в гене РАН. Таким образом, в настоящей работе использованы все доступные методы молекулярно-генетической диагностики.

3.1.1. Поиск 25 частых вариантов гена РАН

Согласно мировым данным самой распространенной формой ГФА является фенилкетонурия. В связи с этим, на первом этапе исследования для 1263 неродственных пробандов проведен поиск 25 частых вариантов гена PAH.

Исследование проводилось в рамках программы генотипирования с использованием диагностических систем РКи-9, РКи-10 и РКи-6, разработанных в лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ МГНЦ. К частым вариантам, входящим в эти системы, относятся: р^ег16* (с.47_48delCT), p.Leu48Ser, IVS2+5G>A, IVS2+5G>C, p.ArgШ*, IVS4+5G>T, EX5del4154ins268, p.Arg158Gln, p.Asp222* (c.664_665delGA), p.Arg243Gln, p.Arg243*, p.Arg252Trp, p.Arg261Gln, p.Arg261*, p.Glu280Lys, p.Pro281Leu, p.Ala300Ser, p.Ile306Val, p.Ser349Pro, ГГОтт^, p.Glu390Gly, p.Ala403Val, p.Arg408Trp, p.Tyr414Cys, ГУЗП+Ш^. Диагностика осуществлялась методом мультиплексной амплификации лигированных проб. Исследовано 2526 хромосом пациентов. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 18.

Таблица 18

Результаты программы генотипирования

Выявлено два варианта в гене РАН Выявлен один вариант в гене РАН Частых вариантов не обнаружено Всего

Число пациентов 969 260 34 1263

Число хромосом 1938 260 328 2526

По итогам анализа у 969 пробандов (76,7%) обнаружено два патогенных варианта в гене РАН, на основании чего диагноз «фенилкетонурия» для этих пробандов подтвержден на молекулярно-генетическом уровне. У 260 пробандов (20,6%) удалось выявить только один частый вариант, еще у 34 пробандов (2,7%) частых вариантов не обнаружено. Хотя бы один вариант обнаружен у 97,3% пациентов. С помощью метода мультиплексной амплификации лигированных проб патогенные варианты выявлены на 2198 (87,0%) хромосомах.

Проанализированы аллельные частоты искомых вариантов. Результаты анализа представлены в таблице 19. Наиболее распространенным патогенным вариантом является р.Arg408Trp. Данный вариант является самым частым среди российских больных [Gundorova et а1. 2019]. Также, высокая частота варианта зарегистрирована в странах Балтики ^^оске et а1. 2003]. В исследуемой выборке

вариант р.А^408Тф встречается на 52,3% аллелей. Пациенты с генотипом р.[А^408Тф];[А^408Тф] составляют 27,9% выборки (353 человека).

Таблица 19

Частоты 25 частых вариантов гена РАН, зарегистрированные в выборке из 1263 пациентов.

Позиция в кДНК Позиция в белке Число хромосом Аллельная частота (N=2526), % Остаточная активность ФАГ, %

с.47 48delCT р^ег16* 9 0,4 0

с.143Т>С p.Leu48Ser 28 1,1 39

c.168+5G>A IVS2+5G>A 10 0,4 0

c.168+5G>С IVS2+5G>C 12 0,5 0

с.331С>Т p.ArgШ* 20 0,8 0

c.441+5G>T IVS4+5G>T 31 1,2 0

с.442-2913 509+ 1173del4154ins268 EX5del4154ins268 20 0,8 0

p.Arg158Gln p.Arg158Gln 74 2,9 10

с.664 665delGA p.Asp222* 43 1,7 0

с.727С>Т p.Arg243* 23 0,9 0

c.728G>A p.Arg243Gln 11 0,4 14

с.754С>Т p.Arg252Trp 41 1,6 0

с.781С>Т p.Arg261* 27 1,1 0

c.782G>A р.А^26Ш1п 147 5,8 44

c.838G>A p.Glu280Lys 38 1,5 2

с.842С>Т p.Pro281Leu 72 2,9 2

c.898G>T p.Ala300Ser 12 0,5 31

с.916А^ p.ne306Val 12 0,5 39

с.1045Т>С Р^Г349РГО 5 0,2 1

c.1066-11G>A IVS10-11G>A 63 2,5 5

c.1169A>G p.Glu390Gly 19 0,8 62

с.1208С>Т p.Ala403Val 23 0,9 66

с.1222С>Т p.Arg408Trp 1321 52,3 2

c.1241A>G p.Tyr414Cys 52 2,1 57

c.1315+1G>A IVS12+1G>A 85 3,4 0

Всего 2198 87,0 -

Вторым по распространенности вариантом является р.А^29Ш1п. Это

«мягкий» вариант, распространенный в Европе, а также на ближнем востоке. В данной работе он встречается с частотой 5,8%. За ним следует «тяжелый» вариант !УБ12+Ш>А, приводящий к возникновению альтернативного акцепторного сайта

сплайсинга. Данный вариант встречается преимущественно в Северной Европе [Bayat et al. 2016]. С одинаковой частотой встречаются варианты p.Arg158Gln и p.Pro281Leu. Оба этих варианта относятся к «тяжелым» вариантам и характерны для стран Европы и Среднего Востока [Zschocke et al. 2003]. Далее следует «тяжелый» вариант IVS10-11G>A, приводящий к образованию альтернативного донорного сайта сплайсинга. Вариант характерен для Турции [Dobrowolski et al. 2011]. Вариант p.Tyr414Cys относится к «мягким вариантам», так же как и вариант IVS12+1G>A встречается в Северной Европе [Bayat et al. 2016]. В исследуемой выборке вариант p.Tyr414Cys встретился с частотой 2,1%. Примерно с одинаковой частотой выявлены «тяжелые» варианты p.Asp222* и p.Arg252Trp. Оба этих варианта распространены в Европейских странах [Guldberg et al. 1993; Couce et al. 2013]. С частотой менее двух процентов встретились варианты p.Glu280Lys, IVS4+5G>T, p.Leu48Ser и p.Arg243*. Из них только вариант p.Leu48Ser относится к «мягким» вариантам. Остальные варианты встречаются в выборке с частотой менее 1%. Из них стоит выделить вариант EX5del4154ins268. Это протяженная делеция 5 экзона гена РАН. Данный вариант встречается в Словакии, однако, данные о его распространенности неполные, в связи с ограничениями детекции крупных перестроек [Polak et al. 2013].

Искомые варианты являются высоко специфичными для стран Европы, однако, их распространенность в каждом субъекте отличается. На территории России частота этих вариантов также варьирует в зависимости от субъектов. Используемый метод позволил выявить патогенные варианты на 87% хромосом, но этого недостаточно, чтобы оценить спектр вариантов, характерных для Российской Федерации, а также определить доли других форм ГФА.

3.1.2 Поиск вариантов методом МПС

Особый интерес представляли пациенты, у которых не удалось обнаружить

двух частых вариантов в гене РАН. Данные пациенты разбиты на две выборки для проведения дальнейшей работы. Первая выборка состоит из 260 пациентов с одним обнаруженным вариантом по результатам поиска 25 наиболее частых вариантов гена PAH. Вторая выборка состоит из 34 пациентов без выявленных вариантов.

Дальнейшие исследования проводились на образцах ДНК 294 неродственных пробандов - 328 хромосом без выявленных вариантов.

На следующем этапе проводился поиск редких вариантов, ответственных за развитие гиперфенилаланинемии. Однако, процесс поиска вариантов усложняется отсутствием в рутинной практике дифференциальной диагностики различных форм ГФА. По этой причине, заранее не известно какая генетическая форма ГФА у каждого из исследуемых пациентов. Клиническая картина для различных видов ГФА схожа, а молекулярные причины каждой формы обусловлены нарушениями работы разных белков. Исследование каждого гена по-отдельности, для большой выборки пациентов, экономически не выгодно и требует больших временных затрат на постановку эксперимента и анализ полученных данных. Для ускорения процесса поиска вариантов спроектирована панель для массового параллельного секвенирования (МПС; next-generation sequencing NGS), которая покрывает кодирующую последовательность, экзон-интронные соединения и частично покрывает нетранслируемые области генов, варианты в которых отвечают за развитие ГФА. Основным преимуществом данного метода является возможность анализа протяженных последовательностей на больших выборках пациентов в одно и то же время. Настоящим методом исследованы образцы ДНК 294 неродственных пробандов без двух выявленных частых вариантов гена РАН. Среди них у 260 пробандов ранее выявлен один частый вариант гена РАН в ходе поиска 25 частых вариантов, и у 34 пробандов частых вариантов не выявлено (рис.10). Таким образом, методом массового параллельного секвенирования проведен поиск вариантов на 328 хромосомах без выявленных вариантов.

Методом МПС обнаружено 110 редких вариантов, из них 104 обнаружено в гене РАН и 6 вариантов - в гене PTS. Среди вариантов, обнаруженных в гене РАН 72 варианта классифицируются как патогенные, 29 как вероятно патогенные и 3 как варианты неопределенного значения [Рыжкова О.П. и др. 2019].

При анализе 260 образцов ДНК пробандов, имевших один ранее выявленный частый вариант в гене РАН, у 224 пробандов (17,7% всех пробандов) обнаружен второй вариант и подтвержден первый. У 36 пациентов (2,9%) подтвержден первый

вариант, второй вариант не выявлен. Наибольший интерес представляли пациенты, у которых по результатам поиска 25 частых вариантов в гене РАН вариантов не обнаружено, так как высока вероятность выявить варианты в генах, ответственных за развитие ВН4-дефицитных форм ГФА. Проанализированы образцы ДНК 34 пробандов, не имевших частых вариантов гена РАН. Варианты обнаружены у 28 пробандов (рис. 10), среди них у 23 обнаружены варианты в гене РАН, у 5 пробандов - два варианта в гене PTS. У 6 пробандов варианты в исследуемых генах не обнаружены. Из 23 пробандов, у которых найдены варианты в гене РАН, два варианта обнаружены у 15 пробандов, один вариант - у 8 пробандов. Из 328 обследованных хромосом без вариантов на 262 обнаружены варианты в гене РАН, на 10 - варианты в гене PTS, на 56 хромосомах вариантов не выявлено. В генах в€Н1, PCBD1, ООРЯ, SPR и DNAJC12 вариантов не обнаружено.

6

Рисунок 10. Результат анализа методом массового параллельного секвенирования для двух выборок

3.1.3 Поиск крупных перестроек методом количественной MLPA

Согласно данным базы HGMD, в генах PAH, PTS, GCH1 и DNAJC12 описаны протяженные делеции, приводящие к гиперфенилаланинемии. Метод панельного высокопроизводительного секвенирования AmpliSeq не позволяет детектировать крупные делеции и перестройки более 10 п.н. В качестве дополнительного метода для поиска крупных делеций использован метод MRC-Holland MLPA. Однако, производитель предоставляет тестовую систему только для количественного анализа гена РАН. Для других генов, представляющих интерес, готовых наборов для поиска крупных перестроек нет. Поиск крупных делеций проводился в гене РАН для пробандов, у которых не установлен диагноз и материал позволял проведение анализа. В ходе проведенной работы у 50 пробандов диагноз не установлен, у 44 из них обнаружен только один вариант в гене РАН, у 6 пробандов вариантов не обнаружено. У 6 пробандов материал оказался непригоден для проведения анализа MRC-Holland MLPA. Таким образом, анализ проведен для 44 образцов ДНК. Из них, протяженные делеции выявлены у 10 пробандов. У этих пробандов имеется одна точковая мутация. Выявлены делеции экзонов 1, 3 и 5, которые встретились 1 раз, 4 раза и 5 раз, соответственно. Аллельные частоты делеций указаны в таблице 19. Стоит отметить, что в систему детекции 25 частых вариантов гена РАН входит делеция пятого экзона (EX5del4154ins268) и, очевидно, имеет границы отличные от вариантов делеции экзона 5, зарегистрированных методом MRC-Holland MLPA. В литературе описаны протяженные делеции экзонов 1, 3 и 5 гена РАН [Yan et al. 2016; Desviat et al. 2006; Kozak et al. 2006; Chen et al. 2002; Lu et al. 2011].

Для определения границ выявленных протяженных делеций синтезированы праймеры, покрывающие границы описанных в литературе делеций. Последовательности используемых праймеров приведены в таблице 11. Определение границ проводилось с помощью секвенирования полученных в результате амплификации фрагментов с известными праймерами. Также, проведен поиск выявленных крупных делеций с помощью амплификации исследуемых

фрагментов для 6 пробандов, материал которых не позволил провести поиск крупных делеций методом MRC-Holland MLPA.

Делеция первого экзона выявлена у одного пробанда, в компаунд-гетерозиготном состоянии с частым вариантом p.Tyr414Cys. Для определения границ выявленной делеции экзона 1 использованы праймеры с дизайном на основе исследований Yan Y.S. - Ex1del5329ins56 [Yan et al. 2016] и Lu C.X. - с.-1932_+3402del [Lu et al. 2011]. Границы выявленной в работе делеции не совпадают ни с одной из описанных ранее.

Для установления границ делеции третьего экзона использовались данные Desviat L.R. - c.169-4951del6604ins8 [Desviat et al. 2006], Yan Y.S. - del6599ins8 [Yan et al. 2016] и Kozak L. - EX3del4765 [Kozak et al. 2006]. Делеция встретилась у 4 пробандов в компаунде с частым вариантом p.Arg408Trp дважды, частым вариантом p.Arg261Gln и редким вариантом p.Ser350Tyr. Однако, установить границы по итогам проведенной работы не удалось, так как границы выявленных делеций не совпали ни с одним из описанных ранее вариантов.

Делеция пятого экзона выявлена у 5 пробандов, у которых ранее выявлены точечные мутации. У троих пробандов имеется частый вариант p.Arg408Trp, у одного пробанда - частый вариант IVS12+1G>A и еще у одного - редкий вариант p.Val388Met. Определение границ делеции 5 экзона проводилось по данным Trujillano D. - g.103259491_103264844del [Trujillano et al. 2014], Desviat L.R. - c.442-1556del1881 [Desviat et al. 2006] и Kozak L. - EX5del4232ins268 и EX5del955 [Kozak et al. 2006]. Делеция 5 экзона, обнаруженная в данной работе, совпадает с делецией Kozak L. - EX5del955 у всех пяти пробандов и имеет границы - с.442-102_509+781 del.

Дополнительно проведен поиск крупных делеций промоторной области гена РАН. Для поиска использовались праймеры на делеции Chen K.J. - с.-4173_-407del3767 [Chen et al. 2002] и Yan Y.S. - с.-4163_-406del3758 [Yan et al. 2016]. Последовательности праймеров приведены в таблице 11. У одного пробанда обнаружена делеция с.-4161_-404del3758. В генотипе пробанда также имеется частый вариант p.Arg408Trp. Выявленная делеция отличается от описанной Yan

Y.S. делеции с.-4163_-406del3758 на 2 нуклеотида, однако, это может быть связано с изменением правил номенклатуры наименований крупных делеций.

По итогам проведенной работы крупные перестройки гена РАН выявлены у 11 пробандов. Все эти пробанды имели в генотипе 1 ранее выявленный вариант, таким образом, 11 пациентам диагноз ФКУ подтвержден молекулярно-генетическими методами. У 39 пациентов, включая 6 пациентов материал которых не позволил провести анализ МКС-НоПа^ МЬРА, крупные делеции не обнаружены.

3.1.4. Редкие варианты гена РАН

В настоящей работе с использованием всех доступных методов выявлено 108 редких вариантов гена РАН в выборке российских больных. Среди этих вариантов 10 ранее не описаны в литературе. Все выявленные варианты приведены в таблице 20 с указанием аллельных частот. Аллельные частоты вариантов рассчитывались на выборке из 2516 хромосом, без учета хромосом с установленными вариантами в гене PTS.

Среди редких вариантов обнаружены варианты, встречающиеся в выборке чаще, чем вариант р^ег349Рго, входящий в систему детекции 25 частых вариантов. Обнаружено 10 редких вариантов гена РАН, которые встретились на 7 и более хромосомах (таб. 24). В связи с этим возможно редактирование существующей системы детекции частых вариантов для повышения ее эффективности. Данный вопрос рассмотрен ниже.

Редкие варианты, выявленные в гене РАН

Таблица 20

№ Позиция в кДНК Позиция в белке Число хромосом Аллельная частота (N=2516), % Патогенность варианта1 Остаточная активность ФАГ, %2

1 с.58С>Т р^1п20* 2 0,08 П -

2 c.60+5G>A IVS1+5G>A 1 0,04 П -

3 c.60+5G>T IVS1+5G>T 8 0,32 П -

4 с.116 1Ше1 p.Phe39del 2 0,08 П -

5 c.158G>A p.Arg53His 1 0,04 П 79

6 с.165Т^ p.Phe55Leu 1 0,04 П -

7 c.165del p.Phe55Leufs*6 10 0,4 П -

8 c.169-13T>G IVS2-13T>G 6 0,24 П -

9 с.194Т>С p.Пe65Thг 2 0,08 П 33

10 с.204А>Т p.Arg68Ser 2 0,08 П 25

11 с.205С>А p.Pro69Thr 1 0,04 ВП -

12 c.248del рХеи83Т^*9 5 0,2 П -

13 c.266dup p.Ala90Cysfs*12 1 0,04 П -

14 с.275С>Т p.Thг92Иe 2 0,08 П 76

15 с.311С>А p.Ala104Asp 10 0,4 П 27

16 с.355С>Т p.Pro119Ser 1 0,04 ВП -

17 с.395С>Т p.Ala132Val 1 0,04 ВП -

18 с.398 401del p.Asn133Argfs*61 2 0,08 П -

19 с.428А>Т p.Asp143Val 1 0,04 ВП -

20 с.434А>Т p.Asp145Val 2 0,08 П -

21 с.436С>Т p.His146Tyr 1 0,04 ВП -

22 c.442-1G>A IVS4-1G>A 3 0,12 П -

-о 0

Число хромосом Аллельная Патогенность варианта1 Остаточная

№ Позиция в кДНК Позиция в белке частота (N=2516), % активность ФАГ, %2

23 с.461А>Т p.Tyr154Phe 1 0,04 ВП -

24 с.472С>Т р.А^158Тгр 3 0,12 П 2

25 с.5^>А p.Gly171Glu 1 0,04 ВП -

26 с.526С>Т p.Arg176* 3 0,12 П -

27 c.529G>C p.Val177Leu 1 0,04 П -

28 с.533А^ p.Glu178Gly 2 0,08 П 39

29 с.559Т>С р.Тгр187А^ 5 0,2 П -

30 c.563G>A p.Gly188Asp 4 0,16 П -

31 с.569Т>С p.Val190Ala 1 0,04 П 40

32 с.592 6Ше1 p.Tyr198Serfs*136 2 0,08 П -

33 c.611A>G p.Tyr204Cys 3 0,12 П -

34 c.620A>G p.Asn207Ser 1 0,04 ВП -

35 с.631С>А р.Рго211Ткг 3 0,12 П 72

36 с.638Т>С p.Leu213Pro 1 0,04 П -

37 с.648С^ Р.ТУГ216* 3 0,12 П -

38 c.665A>G p.Asp222Gly 2 0,08 ВП -

39 с.665А>Т p.Asp222Val 1 0,04 ВП -

40 с.671Т>С p.Иe224Thr 1 0,04 П -

41 с.673С>А р.Рго225Ткг 9 0,36 П -

42 с.674С>Т p.Pro225Leu 1 0,04 ВП -

43 c.688G>A p.Val230Иe 7 0,28 П 63

44 с.695А>С р^1п232Рго 1 0,04 НЗ -

45 c.710G>T p.Cys237Phe 1 0,04 НЗ -

46 с.712А>С p.Thr238Pro 3 0,12 ВП -

47 с.721С>Т p.Arg241Cys 8 0,32 П 57

-о

Число хромосом Аллельная Патогенность варианта1 Остаточная

№ Позиция в кДНК Позиция в белке частота (N=2516), % активность ФАГ, %2

48 c.722G>A p.Arg241His 5 0,2 П 23

49 с.730С>Т p.Pro244Ser 1 0,04 ВП -

50 с.734Т>С p.Val245Ala 2 0,08 П 50

51 c.755G>A p.Arg252Gln 1 0,04 П 3

52 с.773Т^ p.Leu258Arg 1 0,04 ВП -

53 c.809G>A p.Arg270Lys 1 0,04 П 11

54 с.826А^ p.Met276Val 1 0,04 ВП -

55 c.837del p.Glu280Asnfs*61 1 0,04 П -

56 c.842+1G>A IVS7+1G>A 7 0,28 П -

57 c.842+5G>A IVS7+5G>A 2 0,08 П -

58 с.869А>Т p.His290Leu 1 0,04 ВП -

59 с.874С>Т p.Pro292Ser 1 0,04 ВП -

60 с.889С>Т p.Arg297Cys 1 0,04 ВП -

61 c.890G>A p.Arg297His 1 0,04 П 39

62 c.896T>G p.Phe299Cys 3 0,12 П 3

63 с.899С>А p.Ala300Asp 1 0,04 ВП -

64 c.912+1G>C IVS8+1G>C 1 0,04 П -

65 c.913-7A>G 2 0,08 П -

66 c.913-1G>A IVS8-1G>A 1 0,04 П -

67 с.932Т>С p.Leu311Pro 8 0,32 П 10

68 c.934G>A p.Glu312Ser 1 0,04 ВП -

69 c.960G>C p.Lys320Asn 4 0,16 П -

70 с.970-1G>C Г^9-Ш>С 1 0,04 П -

71 с.982А>С p.Thr328Pro 1 0,04 ВП -

72 с.992Т>С p.Phe331Ser 2 0,08 П -

-о 2

Число хромосом Аллельная Патогенность варианта1 Остаточная

№ Позиция в кДНК Позиция в белке частота (N=2516), % активность ФАГ, %2

73 c.1024del p.Ala342Hisfs*58 1 0,04 П -

74 с.1028А^ p.Tyr343Cys 1 0,04 ВП -

75 c.1036G>A р^1у346Л^ 1 0,04 ВП -

76 с.1042С^ p.Leu348Val 4 0,16 П 25

77 с.1049С>А p.Ser350Tyr 7 0,28 П -

78 c.1055del p.Gly352Valfs*48 1 0,04 П -

79 c.1065+1G>A IVS10+1G>A 4 0,16 П -

80 c.1066-14C>G ^10-14С^ 2 0,08 П -

81 с.1066-3С>Т IVS10-3C>T 5 0,2 П -

82 с.1068С>А р.Туг356* 1 0,04 П -

83 c.1089del p.Lys363Asnfs 2 0,08 П -

84 с.1114А>Т p.Thг372Ser 3 0,12 ВП -

85 с.1150С>Т p.Pro384Ser 1 0,04 П 76

86 c.1157A>G p.Tyr386Cys 11 0,44 П -

87 с.1159Т>С p.Tyr387His 3 0,12 П -

88 c.1162G>A p.Val388Met 2 0,08 П 28

89 c.1183G>C p.Ala395Pro 1 0,04 П 16

90 с.1196Т>С p.Val399Ala 1 0,04 ВП -

91 с.1197А>Т p.Val399Val 3 0,12 П -

92 c.1199+1G>C IVS11+1G>C 5 0,2 П -

93 с.1217Т>С p.Иe406Thr 1 0,04 ВП -

94 c.1223G>A p.Arg408Gln 4 0,16 П 41

95 c.1238G>C р.А^413Рго 3 0,12 П 11

96 c.1243G>A p.Asp415Asn 1 0,04 П 72

97 с.1246С>А р.Pro416Thг 1 0,04 ВП -

-о 3

№ Позиция в кДНК Позиция в белке Число хромосом Аллельная частота (N=2516), % Патогенность варианта1 Остаточная активность ФАГ, %2

98 c.1249T>A p.Tyr417Asn 1 0,04 ВП -

99 c.1251C>A p.Tyr417* 1 0,04 П -

100 c.1262T>C p.Ile421Thr 1 0,04 П -

101 c.1289T>C p.Leu430Pro 2 0,08 П -

102 c.1301C>A p.Ala434Asp 1 0,04 П 9

103 c.1304A>T p.Asp435Val 2 0,08 НЗ -

104 c.1357 1359+2del p.*453Proext*33 1 0,04 ВП -

105 c.-4161 -404del del Promotor 1 0,04 П -

106 с.(? -1) (60+1 61-1)del Ex1del 1 0,04 П -

107 c.(168+1 1691) (352+1 353-1)del Ex3del 4 0,16 П -

108 c.442-102 509+781deldel Ex5del 5 0,2 П -

Всего 273 10,9

Примечание: !П - патогенный вариант, ВП - вероятно патогенный вариант, НЗ - вариант неопределенного значения;

2По данным базы BioPKU.org; Полужирным шрифтом выделены ранее не описанные варианты. «-»- остаточная активность не определена.

3.1.4.1. Спектр вариантов гена РАН

Всего в ходе работы в гене РАН обнаружено 133 варианта, включая 25 частых вариантов, 94 редких варианта, 4 крупные перестройки и 10 ранее не описанных вариантов. Варианты гена РАН обнаружены на 2471 хромосоме (97,8% от всех хромосом). Основная часть выявленных вариантов представлена миссенс-вариантами (82,2%). Варианты сплайсинга составляют 10,1%, небольшие делеции и дупликации 3,2%, нонсенс варианты 3,2%. Крупные перестройки встречаются с частотой 1,3% (рис. 11).

Рисунок 11. Спектр вариантов гена РАН. На диаграмме представлен спектр вариантов гена РАН, разбитый по типу встретившихся вариантов. Голубым цветом представлены миссенс-варианты, оранжевым - варианты, влияющие на сплайсинг, серым- небольшие делеции и дупликации, желтым - нонсенс варианты, и темно -синим показаны крупные перестройки.

Варианты выявлены во всех экзонах, а также один вариант в промоторной зоне (рис.12). В ходе обработки полученных данных, обнаружено два «горячих» экзона - двенадцатый и седьмой. Суммарная аллельная частота вариантов в этих экзонах превышает 10% от аллелей с вариантами в гене РАН. Доля вариантов, встречающихся в двенадцатом экзоне составляет 60,7% аллелей. Столь высокая доля объясняется частотой варианта р.Л^408Тгр, расположенного в данном экзоне.

Варианты гена РАН

Крупные перестройки

1,3%

Небольшие делеции и дупликации

3,2% Нонсенс варианты

3,2%

S16* Q20* EX 1 del IVS1-5G>A IVS1+5G>T

Del

Promotor

F39del L48S R53H F55L F55Lfs*6 IVS2+5G>A IVS2+5G>C

IVS2-13T>G I65T R68S P69T L83Wfs*9 A90Cfs*12 T92I A104D Rlll* EX3del

IVS4-1 G> A Y154F R158W R158Q EX5 del4154ins268 EX5del

0,9%

2,6%

2.1%

P119S A132V N133Rfs*61 D143V D145V H146Y IVS4+5G>F

1,6%

G171E R176* V177L E178G W187R E188D VI90 A Y198Sfs*136 Y204C N207S P211T L213P Y216* D222E D222V D222* I224T P225L P225T V230I Q232P

4,3%

3,8%

C237F Т238Р R241C R241H R243* R243Q P244S V245A R252Q R252W L258R R261* R261Q R270K M276V E280K E280Nfs*61

P281L IVS7+1G>A IVS7+5G>A

IVS8-7A>G IVS8-1G>A I306V L311P E312S K320N

H290L R297C; R297H P292S F299C A300D A300S IVS8+1G>C

L i

15,9%

0,9%

IVS9-1G>C T328P F331S A342Hfs*58 Y343C G346R L348V S349P S350Y G352Vfs*48 IVS10+1 G>A

IVS10-140G IVS10-11G>A IVS10-30F Y356* K363Nfs T372S P384S Y386C Y387H V388M E390G A395P V399V V399A IVS11 + 1G>C

1,1%

1,1%

A403V I406T R408W R408Q R413P Y414C D415N P416T Y417N Y417* 142 IT L430P A434D D435V

o 6

*453Pext*33

IVS12+1G>A

4,9%

60,7%

0,04%

7

Экзоны

10

11

12

13

Рисунок 12. Распределение выявленных вариантов в гене РАН по экзонам. Процентами показана доля вариантов в данном экзоне от общего числа мутантных хромосом.

Доля вариантов, выявленных в седьмом экзоне составляет 15,9%, что связано с расположением большинства частых вариантов в данном экзоне. В шестом экзоне обнаружено больше всего вариантов, их число составляет 21. Однако, почти все эти варианты редкие и их суммарная аллельная частота составляет 3,8% от аллелей с вариантами в гене РАН. Реже всего варианты встречались в первом и тринадцатом экзонах, их доля не превышает одного процента. Это объясняется тем, что в этих экзонах расположены нетранслируемые области.

3.1.5. Новые варианты гена РАН

На сегодняшний день в базах данных HGMD и ВюРКи описано 1280 вариантов в гене РАН (данные от 4 апреля 2021г.). В ходе исследования выявлено 10 ранее не описанных в литературе вариантов в гене РАН: р.Рш69Ткт, p.Leu83Trpfs*9, р^1п232Рго, p.Cys237Phe, p.Ala300Asp, р^1у3Шег, р.ТЪг328Рго, р.Туг417*, p.Asp435Val и IVS9-1G>C. Клиническая значимость (патогенность) выявленных вариантов оценивалась на основе руководства по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования [Рыжкова О.П. и др. 2019]. Варианты p.Leu83Trpfs*9, р.Туг417* и IVS9-1G>C являются патогенными. Три варианта р^1п232Рго, p.Cys237Phe и p.Asp435Val классифицированы как варианты неопределенного значения. Остальные варианты классифицируются как вероятно патогенные. Патогенность данных вариантов и критерии патогенности приведены в таблице 21. В настоящее время варианты описаны и внесены в базы данных HGMD и ВюРКи [Kuznetcova et б1. 2019].

Вариант р.Рш69ТЬг расположен в С-концевом АСТ домене, связывающим регуляторные белки. Встретился в гетерозиготном состоянии у одного пациента, имевшего в генотипе частый вариант р.А^408Тгр. Уровень ФА у данного пациента составлял 19,6 мг/дл, что соответствует классической ФКУ Такой уровень соответствует среднетяжелому или классическому фенотипу, из чего можно сделать вывод, что редкий вариант р.Рш69Ткг возможно относится к «тяжелым» вариантам. Подтверждение данной теории возможно только проведением функционального

анализа рассматриваемого варианта. Для уточнения патогенности варианта р.Рго69ТЫ" необходимо провести анализ положения вариантов, однако материал родителей пациента в настоящее время недоступен.

Таблица 21

Новые варианты гена РАН

Вариант Число хромосом Критерии патогенности1 Патогенность варианта2

p.Pro69Thr 1 PS3, PM2, PP2, PP3 ВП

p.Leu83Trpfs*9 5 PVS1, PM2, PP3 П

p.Gln232Pro 1 PM2, PP2, PP3, PP4 НЗ

p.Cys237Phe 1 PM2, PP2, PP3 НЗ

p.Ala300Asp 1 PM2, PM5, PP2, PP3, PP4 ВП

IVS9-1G>C 1 PVS1, PM2, PP3 П

p.Glu312Ser 1 PM2, PM5, PP2, PP3, PP4 ВП

p.Thr328Pro 1 PS3, PM2, PP2, PP3, PP4 ВП

p.Tyr417* 1 PS3, PM2, PM4, PP3, PP4 П

p.Asp435Val 2 PM2, PP2, PP3 НЗ

Примечание:1Клиническая значимость (патогенность) вариантов оценивалась на основе руководства по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) [Рыжкова О.П. и др. 2019]; 2 П - патогенный вариант, ВП - вероятно патогенный вариант, НЗ - вариант неопределенного значения.

Вариант p.Leu83Trpfs*9 обнаружен у 5 пациентов в гетерозиготном

состоянии. У одного из этих пациентов второго варианта не обнаружено. Другие 4 пациента имели в генотипе один частый вариант в гетерозиготном состоянии. Два пациента - «тяжелый» вариант p.Pro281Leu, один пациент - «тяжелый» вариант IVS2+5G>A, еще один - «тяжелый» вариант IVS10-11G>A. У всех пациентов отмечается уровень ФА в крови до лечения, соответствующий классической ФКУ У пациента, в генотипе которого встретился только вариант p.Leu83Trpfs*9 в гетерозиготном состоянии отмечается уровень ФА, соответствующий 23,6 мг/дл. Также, данный вариант приводит к укорочению белка за счет образования

преждевременного стоп-кодона, что в последующем приводит к быстрой деградации белка. Исходя из представленных данных, вариант p.Leu83Trpfs*9 наиболее вероятно относится к «тяжелым».

Вариант р^1п232Рго классифицирован как вариант неопределенного значения. В проведенной работе вариант р^1п232Рго обнаружен у одного пробанда, в генотипе которого ранее выявлен частый вариант р.А^408Тгр. Уровень ФА составляет 28,86 мг/дл и соответствует классической ФКУ

Вариант p.Cys237Phe классифицирован как вариант неопределенного значения, так как исходя из полученных данных его нельзя отнести ни к патогенным, ни к доброкачественным вариантам. Вариант обнаружен в гетерозиготном состоянии у одного пробанда. Второй вариант у пробанда выявить не удалось. Уровень ФА соответствует мягкой ГФА и составляет 5,46 мг/дл.

Вариант p.Ala300Asp выявлен в том же положении, что и описанный как патогенный вариант p.Ala300Ser, который входит в систему поиска 25 частых вариантов. Обнаружен у одного пациента в генотипе которого присутствует частый патогенный вариант р.А^408Тгр. Уровень ФА до лечения составляет 30,3 мг/дл, что соответствует классической ФКУ. Возможно, данный вариант является «тяжелым», при этом, частый вариант p.Ala300Ser классифицируется как «мягкий».

Патогенный вариант IVS9-1G>C обнаружен у одного пациента в компаунд-гетерозиготном состоянии с частым патогенным вариантом IVS10-11G>A. Уровень ФА до лечения у данного пациента составляет 34,2 мг/дл, что соответствует классической ФКУ. Данный вариант относится к вариантам сайта-сплайсинга. Такие варианты чаще всего являются «тяжелыми», таким образом рассматриваемый вариант возможно относится к «тяжелым».

Вариант p.Glu312Ser встретился в гетерозиготном состоянии у одного пациента, имевшего в генотипе частый вариант р.А^408Тгр. Клиническая картина соответствует классической ФКУ, уровень ФА у пациента равен 23 мг/дл. Вариант р.ТЪг328Рго встретился в гетерозиготном состоянии у одного пациента, имевшего в генотипе частый вариант р.А^408Тгр. Уровень ФА в крови составляет 31 мг/дл, что соответствует тяжелой ФКУ. Возможно, данный вариант можно

отнести к «тяжелым» вариантам.

Патогенный нонсенс-вариант р.Туг417* встретился в гетерозиготном состоянии у одного пациента, имевшего в генотипе частый вариант р.А^408Тгр. Уровень ФА в крови составляет 27 мг/дл, что соответствует тяжелой ФКУ

Вариант неопределенного значения p.Asp435Val обнаружен у двух пациентов в гетерозиготном состоянии в компаунде с редким патогенным вариантом IVS2-13Т^ у одного пациента и патогенным вариантом IVS12+1G>A у другого. У обоих пациентов отмечается уровень ФА, соответствующий мягкой ГФА и составляет 5,83 и 3,3 мг/дл. Из полученных данных можно сделать вывод, что вариант р^р435Уа! возможно относится к «мягким» вариантам.

Пациенты, у которых в результате работы выявлены варианты р.Рш69Ткг, p.Cys237Phe и p.Asp435Val, возможно являются потенциальными ответчиками на лечение сапроптерином. Для определения потенциального ответа данным пациентам необходимо провести нагрузочное тестирование. У остальных пациентов варианты возможно относятся к «тяжелым», но без информации об остаточной активности фермента при рассматриваемых вариантах нельзя сделать точный вывод. Однако, данные пациенты скорее всего относятся к потенциальным неответчикам. Для пациентов, в генотипе которых обнаружены вероятно патогенные варианты, а также варианты неопределенного значения, необходимо проведение семейного анализа для уточнения патогенности выявленных вариантов. В настоящее время материал родителей пациентов недоступен.

3.2 Тетрагидробиоптерин-дефицитные формы ГФА

Наибольший интерес в работе представляли редкие формы ГФА. В России пока не существует системы, направленной на молекулярно-генетическую диагностику редких форм ГФА. Клиническая диагностика редких форм ГФА проводится в качестве дифференциальной диагностики с фенилектонурией и осуществляется методом тандемной масс-спектрометрии. До этого крупных исследований, посвященных определению доли ВН4-дефицитных ГФА на выборке Российских больных, не проводилось. В настоящей работе исследованы все гены,

для вариантов в которых, на сегодняшний день, установлена связь с развитием ГФА. Среди исследованных генов, обнаружены варианты в гене PTS, которые приводят к развитию ВН4-дефицитной ГФА типа А. В других генах вариантов не обнаружено. У пяти пациентов из исследуемой выборки обнаружено 6 миссенс вариантов, что составило 0,4% от всех пробандов.

Трое из пяти пациентов, с выявленными вариантами в гене PTS, поступили на исследование с диагнозом «фенилкетонурия», что подтверждает необходимость проведения дифференциальной диагностики до проведения молекулярно-генетического анализа. Все варианты, обнаруженные в гене PTS, представлены в таблице 22 с указанием частот.

Таблица 22

Варианты, выявленные в гене РТ8

Позиция в Позиция в Число Аллельная частота, % Патогенность

кДНК белке хромосом N=10 N = 2526 варианта1

c.26G>A p.Arg9His 2 20 0,08 НЗ

с.94А^ p.Ser32Gly 1 10 0,04 НЗ

с.108С^ p.Asn36Lys 1 10 0,04 НЗ

с.146А^ p.His49Arg 1 10 0,04 ВП

с.216Т>А p.Asn72Lys 2 20 0,08 П

с.317С>Т p.Thr106Met 2 20 0,08 П

с.(? 26) (216 ?Ме1 - 1 10 0,04 П

Всего 10 0,4%

Примечание:1П - патогенный вариант, ВП - вероятно патогенный вариант, НЗ -вариант неопределенного значения

На рисунке 13 указаны все обнаруженные варианты с расположением в гене PTS. Среди 7 вариантов, обнаруженных в гене PTS, 3 варианта являются патогенными, один - вероятно патогенный и 3 варианта неопределенного значения. К вариантам неопределенного значения относятся p.Arg9His, p.Ser32Gly, p.Asn36Lys. В настоящей работе в гене PTS неоднократно встретился вариант p.Arg9His. Данный вариант встречается в популяции Восточной Азии [СЫи et а1. 2012]. Вариант обнаружен у двух пробандов, у одного из них вариант обнаружен в гомо-/гемизиготном состоянии. Данному пробанду проведен анализ птеринов в моче,

подтвердивший нарушение синтеза пирувоилтетрагидробиоптерин синтетазы.

Рисунок 13. Варианты гена PTS, распределенные по экзонам

Из полученных данных можно сделать вывод, что вариант p.Arg9His является возможной причиной заболевания. Для подтверждения выдвинутой гипотезы, проведен семейный анализ для пробанда, имеющего в генотипе вариант p.Arg9His в гомо-/гемизиготном положении. В ходе исследования у матери пробанда вариант p.Arg9His обнаружен в гетерозиготном состоянии, у отца вариант не выявлен. Дополнительно проведено подтверждение родства пробанда и отца, по итогам которого выдвинуто предположение, что в генотипе отца расположена крупная делеция гена PTS, и, таким образом, исследуемый вариант у пробанда может находиться в гемизиготном состоянии. Для подтверждения выдвинутой гипотезы необходимо проведение метода MRC-Holland MLPA для детекции протяженных делеций. Однако, у производителя отсутствует коммерческий набор для детекции делеций в гене PTS. В связи с этим, проведена модернизация мультиплексной амплификации лигированных проб. Для проведения количественного анализа в амплификационную смесь добавлены меченые праймеры. С помощью модифицированной системы изучены экзоны 1, 2, 4 и 6 гена PTS. В ходе исследования у пробана и отца обнаружена делеция исследуемых экзонов в гетерозиготном состоянии. Границы делеции установить не удалось, так как делеция затрагивает весь ген, в связи с чем для номенклатуры использованы координаты крайних олигопраймеров - a(?_26)_(216_?)del. Вероятно, выявленная делеция затрагивает весь ген PTS. Делеция всего гена PTS неоднократно описана ранее [Blau et al. 2000; Ellingford et al. 2017].

Вариант p.Ser32Gly, как и патогенные варианты p.Asn72Lys и p.Thr106Met, описан в статье Степановой А.А., где он обнаружен в ходе рутинной диагностики, проводившейся с 2005 по 2006 годы в лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ» [Степанова А.А. и др. 2006]. Однако, данный вариант больше нигде не описан. В настоящей работе, как и в работе Степановой А.А. вариант встретился у пациентов, имеющих известный патогенный вариант в гене PTS, что говорит о том, что он может являться возможной причиной заболевания. Для одного пациента, имеющего в генотипе варианты p.Ser32Gly и p.Thr106Met, проведен семейный анализ, подтвердивший, что данные варианты находятся в транс-положении. Вариант p.Asn36Lys описан только в работе Zekanowski у двух сибсов, и относится к вариантам неопределенного значения [Zekanowski et al. 1998]. Вероятно патогенный вариант p.His49Arg описан в работе Leuzzi V., в выборке больных ГФА в России ранее не встречался. В данной работе вариант встретился у пациента с патогенным вариантом p.Asn72Lys. Для данного пациента проведен семейный анализ, подтвердивший, что выявленные варианты находятся в транс-положении. Патогенный вариант p.Thr106Met обнаружен при исследовании областей гена PTS, которые не удалось покрыть с помощью пользовательской панели МПС. Для исследования непокрытых участков использовался метод прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру. Использованные праймеры приведены в таблице 13.

В ходе работы, у пациентов, в исследуемой выборке обнаружены варианты, приводящие к развитию ВН4-дефицитной ГФА типа А. Других форм ГФА не обнаружено. Всего у пяти пробандов обнаружены варианты. Суммарная аллельная частота данных вариантов составляет 0,4%. Данный показатель гораздо ниже ожидаемого, так как, согласно литературным данным, ВН4-дефицитные формы составляют 1-2% от всех ГФА в странах Европы [Opladen et al. 2011]. Таким образом, доля ВН4-дефицитных ГФА на территории Российской Федерации составляет всего 0,4% и представлена ВН4-дефицитной ГФА типа А. Причиной такой низкой частоты может являться отсутствие накопления ВН4-дефицитных форм в популяции, а также стертые клинические проявления у некоторых форм, не позволяющие заподозрить у пациента диагноз «гиперфенилаланинемия».

3.3. Особенности спектра вариантов в различных субъектах РФ

В лабораторию ДНК-диагностики для исследования направлялись пациенты из различных субъектов России. В данной работе проанализированы данные 1263 неродственных пробандов, направленных на обследование из 51 субъекта. В связи с тем, что субъекты могут отличаться национальным составом населения, проведен анализ особенностей спектра вариантов для каждого субъекта. Возможные особенности можно использовать для создания субъект-специфичных систем диагностики. В настоящее время в некоторых субъектах проводится молекулярно-генетическая диагностика пациентов с ФКУ методом поиска 8 частых вариантов гена РАН (р.Arg158Gln, IVS4+5G>T, р.А^252Тф, р.А^26Ш1п, р.Рго28^еи, IVS10-11G>A, р.А^408Тф, IVS12+1G>A) или методом поиска патогенного варианта р.А^408Тф. На анализ направлялись только те пациенты, у которых не удалось выявить двух частых вариантов в гене РАН на уровне субъектов. Информация о пациентах с установленным генотипом не поступала, в связи с чем, полученные данные возможно смещены. Для сравнительного анализа частот вариантов и генотипов выбраны субъекты, количество пациентов из которых превышает 15. Данные из 25 субъектов не удалось статистически достоверно проанализировать в связи с недостаточным количеством пациентов. Результаты анализа для 26 субъектов приведены в таблице 23.

Больше всего данных получено из Москвы и Московской области, Краснодарского края, Нижегородской, Челябинской, Пермской, Самарской и Свердловской областей. На анализ из каждой из этих областей поступило более 50 пациентов. Суммарно из 7 субъектов, указанных выше, поступило 586 пациентов, что составляет 46% от всей выборки. Меньше всего данных получено из Адыгеи, Алтайского края, Ивановской, Липецкой, Орловской, Томской и Ярославской областей, а также из Ханты-Мансийского Автономного Округа.

Дополнительно проведено сравнительное исследование частоты ФКУ среди новорожденных в субъектах РФ.

Таблица 23

Данные анализа по субъектам РФ.

Субъекты Численность населения1 Тыс.чел. Частота ФКУ1 Всего хромосом Частота вариантов р.А^408Тф (%) Суммарная частота 25 вариантов РАН (%) Редкие варианты РАН (%) Протяженные делеции гена РАН (%) Вариантов не обнаружено (%) Варианты в гене PTS

Архангельская область 1127,1 1:17000 34 58,8 85,3 14,7 - - -

Брянская область 1192,5 1:5000 38 55,3 86,8 13,2 - 2,6 -

Владимирская область 1342,1 1:10000 36 58,3 91,7 8,3 - - -

Волгоградская область 2474,6 1:10000 86 48,8 83,7 16,3 - - -

Вологодская область 1151,8 1:5000 34 64,7 79,4 20,6 2,9 - -

Воронежская область 2305,6 1:10000 58 46,6 81,0 19,0 - - -

Иркутская область 2375,0 1:5000 38 47,4 84,2 15,8 - 7,9 -

Кировская область 1251,2 1:13000 60 71,7 93,3 6,7 - - 4,0

Краснодарский край 5683,9 1:10000 190 45,3 84,2 15,8 - - 2,0

Курганская область 818,6 1:5000 30 73,3 90,0 10,0 - - -

Мордовия 779,0 1:4000 46 47,8 89,1 10,9 - 2,2 -

Москва 20363,5 1:10000 340 52,1 83,5 16,5 - 2,1 -

Мурманская область 732,9 1:10000 42 54,8 88,1 11,9 - - -

Нижегородская область 3176,6 1:5000 164 67,1 90,9 9,1 - - -

Субъекты Численность населения1 Тыс.чел. Частота ФКУ1 Всего хромосом Частота вариантов р.А^408Тгр (%) Суммарная частота 25 вариантов PAH (%) Редкие варианты PAH (%) Протяженные делеции гена РАН (%) Вариантов не обнаружено (%) Варианты в гене PTS

Пермская область 2579,3 1:10000 128 68,8 89,1 10,9 0,8 1,6 2,0

Ростовская область 4181,5 1:10000 40 42,5 80,0 20,0 - 5,0 -

Рязанская область 1098,3 1:5000 48 58,3 95,8 4,2 - - -

Самарская область 3154,2 1:13000 112 46,4 84,8 15,2 - 0,9 -

Санкт-Петербург и ЛО 7277,1 1:15000 94 46,8 75,5 24,5 1,1 4,3 -

Саратовская область 2395,1 1:5000 34 41,2 94,1 5,9 - - -

Свердловская область 4290,1 1:5000 100 43,0 80,0 20,0 1,0 1,0 -

Тамбовская область 994,4 1:5000 84 45,2 82,1 17,9 1,2 1,2 -

Татарстан 3894,1 1:12000 66 27,3 77,3 22,7 1,5 - -

Тульская область 1449,1 1:5000 36 47,2 83,3 16,7 - 2,8 -

Тюменская область 3778,1 1:13000 54 46,3 81,5 18,5 - 5,6 -

Ульяновская область 1218,3 1:10000 38 52,6 97,4 2,6 - - -

Примечание: !По данным Федеральной службы Государственной Статистики (Росстат)

Данные получены из открытого источника - Федеральной Службы Государственной Статистики (Росстат). Наиболее высокая частота ФКУ отмечается в Республике Мордовия (1:4000 новорожденных), реже всего ФКУ встречается в Архангельской области (1:17000 новорожденных). Высокая частота заболеваемости ФКУ отмечается в Центральном федеральном округе (Брянская, Рязанская, Тамбовская и Тульская области), низкая частота - в Северо-Западном федеральном округе (Архангельская, Ленинградская и Мурманская области). Наиболее частым патогенным вариантом в гене РАН в популяции российских больных является вариант р.А^408Тф. Он встречается на 1316 хромосомах (52,1% аллелей с вариантами) из 2526. Субъекты с самой высокой частотой р.Аг§408Тф-Москва, Нижегородская область, Краснодарский край, Пермская область, Санкт-Петербург и Самарская область (рис. 12). Однако, частота данного варианта может быть выше, так как в лабораторию не направлялись данные о пациентах, имевших в генотипе вариант р.А^408Тф в гомозиготном состоянии, или два частых варианта. Данные о частоте этого варианта в некоторых субъектах являются смещенными, так, например, в Республике Дагестан, Томской области и Республике Тыва, частота р.А^408Тф не представлена. Частоты вариантов сильно варьируют в зависимости от субъекта.

Самая высокая доля 25 частых вариантов гена РАН представлена в Ульяновской области - 97,4%. Вариант р.Аг§408Тф в данном субъекте встречается на 52,6% от всех аллелей. Доля редких вариантов гена РАН составляет 2,6% аллелей и является самой низкой среди представленных субъектов. субъектом с самой высокой долей редких вариантов является Свердловская область. Аллельная частота редких вариантов здесь составляет 18,0% от всех аллелей субъекта. Также, высокая доля редких вариантов отмечается в Воронежской области (17,2%), Тульской области (16,7%) и Ростовской области (15,0%). Протяженные делеции чаще всего встретились в Вологодской области, их доля составляет 2,9%. Реже всего протяженные делеции встретились в Москве (0,6%), примерно с одинаковой частотой их удалось выявить в Пермской области (0,8%), Свердловской области (1,0%), Санкт-Петербурге (1,1%), Тамбовской области (1,2%) и Татарстане (1,5%).

Рисунок 12. Распределение варианта р.А^408Тгр по субъектам. Интенсивностью цвета указана доля варианта в каждом отдельном субъекте.

В Ростовской области самая высокая доля аллелей без выявленных вариантов, она составляет 5,0%. Следом за ней идет Тюменская область (3,7%), Санкт-Петербург (2,1%), Пермская область (1,6%) и Москва (1,2%) Варианты в гене PTS в равной степени выявлены у пациентов из Краснодарского края, Кировской, Пермской, Томской и Челябинской областей.

Исходя из полученных данных наиболее эффективной системой диагностики остается поиск 25 частых вариантов гена РАН, однако, в некоторых субъектах отмечается преобладание варианта р.А^408Тф. Так, в Кировской области (частота р.А^408Тгр 74,1%), Курганской области (73,3%), Пермской области (68,8%) и Нижегородской области (67,1%) данный вариант преобладает в генотипе пациентов. Возможно, для этих субъектов наиболее целесообразно проводить сначала поиск варианта р.А^408Тф и последующее секвенирование гена РАН. Помимо этого, в данных субъектах наблюдается низкая частота редких вариантов гена РАН, менее 10%. В Саратовской области отмечена самая низкая частота варианта р.А^408Тф (41,2%). В генотипах данного субъекта преобладают частые варианты (52,9% без учета р.А^408Тф).

3.4. Доли потенциально сапротерин-зависимых и сапроптерин-

чувствительных пациентов

Для 1258 пациентов с вариантами в гене РАН проведено определение потенциальной чувствительности к сапроптерину. Потенциальная чувствительность каждого пациента определялась по наличию в генотипе «тяжелых» и «мягких» вариантов. При наличии в генотипе пациента двух «тяжелых» вариантов, пациент считается потенциальным «неответчиком». Это обусловлено тем, что при «тяжелых» вариантах остаточная активность фермента ФАГ отсутствует или сильно снижена (менее 10%). В таком случае, введение синтетического аналога ВН4, являющегося кофактором ФАГ не вызовет терапевтического ответа у пациента. Пациенты, в генотипе которых обнаружено два «мягких» варианта считаются потенциальными «ответчиками». Остаточная активность ФАГ при таких вариантах превышает 10% и введение сапроптерина

может стабилизировать молекулу ФАГ. Потенциальным ответчикам рекомендуется проведение нагрузочных тестов с использованием сапроптерина для оценки терапевтического ответа и подбора дозы препарата для эффективного лечения. Пациенты, в генотипе которых обнаружена хотя бы один мягкий вариант также относятся к потенциальным ответчикам. Данные об остаточной активности фермента ФАГ при разных вариантах гена PAH приведены в базе данных BioPKU.org. Однако, не для всех вариантов известна их остаточная активность.

В России среди мутантных аллелей гена РАН, выявленных в результате поиска 25 наиболее частых вариантов гена РАН 17 являются тяжелыми (р^ег16* (с.47_48delCT), IVS2+5G>A, IVS2+5G>C, р.А^111*, IVS4+5G>T, EX5del4154ins268, р.Arg158Gln, ^Asp222* (c.664_665delGA), р.А^243*, р.А^252Тф, р.А^261*, р.Glu280Lys, р.Рго28^еи, р^ег349Рго, IVS10-11G>A, р.А^408Тф, IVS12+1G>A) и 8 мягкими ^.Leu48Ser, р.Arg243Gln, р.Arg261Gln, р.Ala300Ser, р.Пе306Уа1, р.Glu390Gly, р.Ala403Val, р.Tyr414Cys,) исходя из анализа остаточной активности ФАГ. Суммарные аллельные частоты тяжелых и мягких вариантов составляют 75,2% и 12,2% аллелей соответственно. Основной вклад в суммарную частоту тяжелых вариантов вносит вариант Arg408Trp. Среди 108 редких выявленных вариантов гена РАН встретился 21 мягкий и 17 тяжелых вариантов. Для 66 вариантов (61,11%) данных об остаточной активности фермента ФАГ в базе данных BioPKU.org не приведено. Среди 318 проанализированных хромосом, без 10 хромосом с вариантами в гене PTS, выявлено 62 аллеля с мягкими вариантами и 56 аллелей с тяжелыми вариантами, для 155 аллелей остаточная активность фермента неизвестна, на 45 аллелях вариантов не обнаружено. В результате, в выборке 2516 хромосом, доля тяжелых вариантов составила 77,4%, а доля мягких - 14,6% (Рис.13). После поиска редких вариантов доля пациентов, потенциально отвечающих на терапию ВН4 возросла на 2,47%, а доля пробандов, потенциально не отвечающих на терапию - на 2,23%. Таким образом, уменьшилась доля пациентов, для которых потенциальный ответ на терапию ВН4 был не определен после анализа 25 частых вариантов. По итогам проведенной работы, исходя из установленных генотипов, 807 пробандов относятся к потенциальным

неответчикам, 335 пробандов являются потенциальными ответчиками. Для 110 пробандов рекомендуется проведение дальнейших исследований, так как в их генотипе обнаружены варианты, остаточная активность ФАГ при которых неизвестна.

Рисунок 13. Доли тяжелых и мягких вариантов гена РАН (N=2516 хромосом с вариантами в гене РАН). На левой диаграмме указаны доли тяжелых и мягких вариантов, выявленных в результате поиска 25 наиболее частых вариантов. На правой диаграмме представлены суммарные данные, полученные после проведения поиска 25 наиболее частых вариантов, массового параллельного секвенирования и количественного анализа гена РАН. Красным цветом показаны доли тяжелых вариантов, зеленым цветом - мягких, в оранжевую область входят варианты, для которых остаточная активность фермента неизвестна.

Для 6 пробандов вариантов в гене РАН не обнаружено (рис.14). У 807 пробандов в генотипе встретились 2 тяжелых варианта, у 283 - один тяжелый и один мягкий варианты, два мягких варианта встретились у 32 пробандов. У 20 пробандов в генотипе обнаружен один мягкий вариант, тяжесть второго варианта не установлена, или второй вариант не обнаружен. Из 110 пробандов, для которых рекомендуется проведение дальнейших исследований, у 106 пациентов выявлен один тяжелый вариант в генотипе, у 4 пациентов обнаружены только варианты без установленной остаточной активности.

Проведение анализа методом МПС позволило выявить мягкие варианты дополнительно в 3,7% случаев, однако при этом в 8,0% случаев остаточная активность фермента неизвестна. Это затрудняет определение потенциальной

25 частых вариантов

Исследование полного спектра

чувствительности к ВН4 по генотипу. Для определения чувствительности к препаратам ВН4 для пациентов с данными вариантами необходимо проведение нагрузочного тестирования. Если целью исследования является только определение чувствительности к ВН4, наиболее целесообразно проведение поиска 25 частых вариантов.

Рисунок 14. Доли потенциальных ответчиков и неответчиков на лечение ВН4.

В случае, если чувствительность установить не удалось, предлагается сразу назначать проведение нагрузочных тестов препаратом. Использование массового параллельного секвенирования с целью определения чувствительности не оправдывает временных и материальных затрат, но подходит для определения генотипа пациента в рамках генетических исследований и для семейного консультирования.

3.5. Усовершенствование протокола ДНК-диагностики у пациентов с

Суммарная аллельная частота повторяющихся редких вариантов, встретившихся в данной работе более 6 раз, составляет 3,4% (таблица 24). Выявлено 10 таких повторяющихся редких вариантов гена РАН. Добавление этих

Ответ на ВН4

ГФА в РФ

вариантов в существующую систему детекции частых вариантов не является целесообразным. Создание новой системы не имеет смысла, учитывая низкую частоту встретившихся вариантов и высокие временные и экономические затраты.

Таблица 24

Повторяющиеся редкие варианты гена РАН

Число выявленных Аллельная частота

Вариант вариантов (хромосом) (%) (N=2516 хромосом)

p.Tyr386Cys 11 0,4

p.Phe55Leufs*6 10 0,4

p.Ala104Asp 10 0,4

р.Рш225ТЫ- 9 0,4

p.Arg241Cys 8 0,3

IVS1+5G>T 8 0,3

рХеи311Рго 8 0,3

р^ег350Туг 7 0,3

^7+Ш>А 7 0,3

р^а123011е 7 0,3

Всего 85 3,4

Исходя из результатов, полученных в ходе работы, предложен

усовершенствованный протокол молекулярно-генетической диагностики ГФА (рис.

15).

На первом этапе проводится поиск 25 частых мутаций в гене РАН. Также, поиск частых вариантов можно проводить в «горячих» экзонах (6, 7, 12) гена РАН, в отсутствие специализированных диагностических систем. Если у пациента обнаружена одна мутация в гене РАН, рекомендуется проведение прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру гена РАН. Для пациентов, у которых не найдено частых мутаций в гене РАН, рекомендуется проведение поиска редких вариантов методом массового параллельного секвенирования в генах РАН, PTS, в€Н1, PCBD1, ООРЯ, SPR и DNAJC12. В случае, если, после проведения секвенирования по Сэнгеру или использования метода МПС обнаружена только одна мутация в гене РАН или мутаций не найдено, рекомендуется проведение поиска крупных делеций и дупликаций в гене РАН методом МЬРА. Такой протокол

позволит точно и своевременно устанавливать молекулярно-генетические причины гиперфенилаланинемии у каждого конкретного пациента. А также сократить экономические затраты на проведение необязательных диагностических анализов.

Два варианта

Рисунок 15. Предложенный усовершенствованный протокол диагностики ГФА. Цветом обозначено нововведение в существующий алгоритм.

В случае, если у пациента не выявлено два частых варианта в гене РАН, существует вероятность, что гиперфенилаланинемия вызвана вариантами в других известных генах, и более целесообразно направить пациента на поиск вариантов методом МПС. Таким образом удастся сократить время, которое ранее затрачивалось на последовательный поиск вариантов в каждом из генов интереса, и позволит проводить дифференциальную диагностику в отсутствии рутинных тест-систем.

Один вариант/ нет вариантов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведена масштабная работа по установлению спектра вариантов, приводящих к возникновению гиперфенилаланинемии на территории Российской Федерации. В ходе работы проанализированы образцы ДНК 1263 неродственных пробандов с входящими диагнозами «фенилкетонурия» и «гиперфенилаланинемия», зарегистрированных в аудите неонатального скрининга и лечения фенилкетонурии. Работа проведена с использованием всех доступных современных методов диагностики. К ним относятся: поиск 25 частых вариантов гена РАН, метод высокопроизводительного секвенирования, MRC-Holland MLPA и метод прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру. По итогам работы с использованием всех доступных методов, из 2526 исследованных хромосом, варианты обнаружены на 2481 хромосоме (98,2%), на 45 хромосомах (1,8%) вариантов обнаружить не удалось. Диагноз при аутосомно-рецессивных заболеваниях считается подтвержденным, если у пациента обнаружено два патогенных варианта, один патогенный и один вероятно патогенный варианты или два вероятно патогенных варианта. В случае, когда у пациента с одним патогенным или вероятно патогенным вариантом встречается вариант неопределенного значения, или два варианта неопределенного значения - диагноз не установлен. Для 1217 пациентов подтвержден диагноз «фенилкетонурия», двум пациентам подтвержден диагноз «гиперфенилаланинемия с дефицитом ВН4 типа А». У 5 пробандов диагноз не подтвержден, так как у них выявлен один патогенный или вероятно патогенный вариант и один вариант неопределенного значения. У 6 пациентов вариантов не обнаружено, у 33 пациентов найден только 1 вариант в гене PAH, что не позволяет ни подтвердить, ни опровергнуть диагноз. Отсутствие второго варианта в гене РАН у 33 пациентов, предположительно, обусловлено наличием вариантов в некодирующих и регуляторных областях гена РАН, которые в настоящей работе не анализировались из-за ограничений используемых методов. Наиболее вероятной причиной, по которой у 6 пробандов не удалось детектировать ни одного варианта является наличие двух вариантов в некодирующих и