Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Васильева, Инна Анатольевна

• Васильева, Инна Анатольевна
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Васильева, Инна Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Реакция аминоацилирования тРНК.

1.2. Два класса аминоацил-тРНК-синтетаз.

1.3. Структура тРНК.

1.4. Общие закономерности и особенности высокоспецифичного взаимодействия аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК: методы выявления элементов идентичности в тРНК и исследования их функциональной роли.

1.4.1. In vivo и in vitro методы определения элементов специфичности.

1.4.2. Распределение элементов узнавания в тРНК.

1.4.3. Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования.

1.4.4. Аминоацилирование мини-тРНК субстратов (mini- и microhelices).

1.4.5. Функциональная роль элементов узнавания в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия.

1.4.6. Природа контактов, обеспечивающих специфичность взаимодействия.

1.4.7. Динамика взаимодействия с тРНК.

1.4.8. Механизмы контроля продуктивного связывания З'-конца тРНК.

1.5. Фенилаланил-тРНК-синтетаза: структурно-функциональные особенности фермента и его взаимодействия с субстратами.

1.5.1. Общая характеристика структуры фермента.

1.5.2. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНКРЬе.

1.5.3. Структурные основы каталитической функции фермента.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение плазмидных ДНК.

2.2.2. Гидролиз плазмидных ДНК эндонуклеазой рестрикции.

2.2.3. Синтез и выделение тРНК-транскриптов.

2.2.4.32Р-Мечение тРНК по 5'-концу.

2.2.5. Ступенчатая деградация тРНК с З'-конца.

2.2.6. УФ-индуцируемая модификация мутантных тРНКРЬе.

2.2.7. Частичный нуклеазный и щелочной гидролиз тРНК.

2.2.8. Получение транскриптов тРНК , содержащих остаток s4U(s6G) на З'-конце, с использованием концевой СТР(АТР):тРНК-нуклеотидилтрансферазы.

2.2.9. Получение диальдегидных производных тРНКРЬе.

2.2.10. Получение з4и-замещенных аналогов тРНКр|1е с использованием Т4 РНК-лигазы.

2.2.11. Аминоацилирование тРНКРЬе, тРНКРЬе-транскрипта и его фотоактивных аналогов и неспецифичных тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой.

2.2.12. Мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы фотореакционноспособными аналогами тРНКРЬе и разделение продуктов модификации.

2.2.13. Аффинное мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы диальдегидными производными тРНКРЬе.

2.2.14. Нуклеазный гидролиз продуктов модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы.

2.2.15. Определение констант диссоциации комплексов фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНК.

2.2.16. Гель-электофорез нуклеиновых кислот и белков.

Глава 3. (РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ) Функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия с фенилаланил-тРНК-синтетазой.

3.1. Эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus на стадии связывания.

3.1.1. тРНКРЬе Е. coli - эффективный субстрат фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus в связывании.

3.1.2. Исследование стабильности третичной структуры мутантных тРНКРЬе с нуклеотидными заменами в 19-ом и 56-ом положениях.

3.1.3. Сравнение параметров связывания и аминоацилирования мутантных тРНКРЬе.

3.1.4. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с неспецифичными тРНК.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия»

Точность воспроизведения генетически заданной структуры белков зависит от способности аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS) узнавать и эффективно аминоацилировать соответствующую тРНК. Правильный отбор и аминоацилирование тРНК достигается благодаря взаимодействиям aaRS с определенным набором нуклеотидных остатков тРНК, называемых "элементами идентичности" ("identity elements") или "элементами узнавания" ("recognition elements"). В настоящее время известны элементы идентичности для всех 20 систем тРНК-aaRS из Е. coli и для нескольких систем из дрожжей, Thermus thermophilus и высших эукариот, включая человека [1]. Аминоацилирование тРНК - это многостадийный процесс, который включает первоначальное связывание субстратов, конформационную перестройку фермент-субстратного комплекса, химическую реакцию в активном центре и освобождение продуктов. Несмотря на многочисленные исследования по проблеме "узнавания" тРНК, выполненные преимущественно с использованием генетических методов in vivo и кинетических экспериментов in vitro с мутантными тРНК [1,2], данные об уровне распознавания тРНК на стадии связывания и последующих этапах каталитического превращения получены для ограниченного числа систем. Взаимодействия аспартил-тРНК-синтетазы (AspRS) дрожжей и гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS) Е. coli с антикодоном специфичных тРНК вносят основной вклад в прочность соответствующих комплексов и обеспечивают специфичность отбора на стадии связывания [3, 4]. Многочисленные биохимические и структурные исследования дрожжевой AspRS и ее взаимодействия с субстратами позволили установить, что связывание tPHKAsp инициируется узнаванием антикодоновой петли, и что все элементы ее узнавания участвуют в формировании каталитически активного комплекса [5]. Селективность отбора tPHKHis на стадии связывания усиливается взаимодействием HisRS с устойчивым аналогом гистидиладенилата [4]. В то же время идентичность тРНКТгр определяет преимущественно скорость переноса на нее активированной аминокислоты [6]. Нарушения взаимодействий глутаминил-тРНК-синтетазы Е. coli с элементами идентичности тРНК01" влияют на эффективность узнавания глутамина [7]. Способность тРНК оптимизировать взаимодействие фермента со специфичной аминокислотой обнаружена и для тРНК-независимых триптофанил- и серил-тРНК-синтетаз (катализирующих реакцию активации в отсутствие тРНК) [6, 8]. Уменьшение каталитической эффективности аминоацилирования тРНКРЬе дрожжевой фенилаланил-тРНК-синтетазой в результате мутаций нуклеотидов, стабилизирующих третичную структуру, обусловлено в значительной мере ингибированием диссоциации пирофосфата

9]. Таким образом, индивидуальность систем проявляется не только в наборе элементов узнавания, но и выполняемых ими функциях.

Основной целью данной работы было изучение функциональной роли элементов узнавания тРНК на разных этапах взаимодействия: на стадии первоначального связывания тРНК синтетазой и последующих перестройках комплекса в каталитически активную форму, в том числе индуцируемых низкомолекулярными субстратами. В качестве объекта исследования была выбрана фенилаланин-специфичная система из Thermus thermophilus.

Фенилаланил-тРНК-синтетаза (PheRS) - один из наиболее сложноорганизованных ферментов семейства аминоацил-тРНК-синтетаз: субъединичная структура цитоплазматического фермента (аР)2-типа эволюционно консервативна [10]. Согласно своим структурным характеристикам PheRS принадлежит к так называемому классу II синтетаз, но использует 2'-гидроксил концевой рибозы тРНК для переноса аминокислоты, подобно ферментам класса I [11-13]. Трехмерная структура PheRS Т. thermophilus и ее комплексов с отдельными субстратами (фенилаланином, тРНКРЬе) и фенилаланиладенилатом (Phe-AMP) установлена с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [10, 14-16]. Взаимодействие PheRS Т. thermophilus с тРНКРЬе изучено с помощью биохимических методов [17, 18]. Идентифицированы элементы узнавания тРНК№е в эволюционно различных организмах [19-26]. Структурные исследования ряда комплексов aaRS с тРНК на атомном уровне позволили понять молекулярную основу специфичности их взаимодействия, но для большинства систем не решена проблема продуктивного связывания акцепторного конца тРНК. Данные РСА комплексов с правильной ориентацией ССА-конца получены пока для глутаминил-, глутамил- и аргинил-тРНК-синтетаз (GlnRS, GluRS и ArgRS) класса I, аспартил-, треонил- и серил-тРНК-синтетаз (AspRS, ThrRS и SerRS) класса II [5,27-33]. Присутствие малых субстратов в активном центре является необходимым условием функционального связывания 3'-конца тРНК не только для тРНК-зависимых aaRS (GlnRS, GluRS и ArgRS, не синтезирующих аминоациладенилат в отсутствие тРНК). Для Asp- и Ser-специфичных ферментов класса II показано, что правильная ориентация акцепторного конца тРНК, необходимая для катализа, достигается только в присутствии АТР и аминокислоты [30, 31, 33]. Необходимость существования аналогичного механизма контроля для PheRS следует из анализа структуры комплексов фермента с отдельными субстратами (низкомолекулярными или TPHKPhe): перекрывание участков связывания концевого аденозина и фенилаланина создает серьезные препятствия для продуктивного взаимодействия [16]. Получение комплексов aaRS со всеми субстратами является большой удачей из-за ограничений, накладываемых условиями кристаллизации и возможного протекания второй стадии реакции аминоацилирования в кристаллах [29]. С другой стороны, использование негидролизуемых аналогов аденилатов не всегда способствует связыванию и функциональной ориентации акцепторного конца тРНК. Так, в комплексах лизил- и пролил-тРНК-синтетаз, сокристаллизованных со специфичными тРНК в присутствии устойчивых аналогов аминоациладенилата, ССА-конец остается неупорядоченным [34, 35]. Альтернативным подходом к изучению структурной динамики взаимодействия с тРНК представляется метод аффинной модификации, применявшийся в основном в ранних исследованиях aaRS [36, 37].

Первой задачей данной работы было изучение эффективности распознавания специфичной и отбраковки неспецифичных тРНК PheRS Т. thermophilus на стадии связывания. Для её решения были определены константы диссоциации комплексов фермента с тРНКР11е различного происхождения, рядом мутантных тРНКР1к Е. coli и неспецифичными тРНК и сопоставлены с известными кинетическими параметрами аминоацилирования.

Второй задачей было изучение функциональной роли фенилаланина и АТР в продуктивном связывании акцепторного конца тРНКРЬе с помощью аффинного мечения PheRS аналогами тРНКРЬе, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды на З'-конце.

Третьей задачей являлась оценка роли структурных элементов тРНКРЬе, определяющих специфичность системы, в функциональном связывании акцепторного конца, контролируемом низкомолекулярными субстратами. Для ее решения был проведен сравнительный анализ продуктов мечения субъединиц PheRS Т. thermophilus s4U76-замещенными аналогами тРНКРЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие либо в присутствии малых субстратов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Васильева, Инна Анатольевна

выводы

1. Для выявления структурных элементов, ответственных за специфичность связывания и эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus, измерены константы диссоциации комплексов фермента с тРНКРЬе, содержащими замены различных нуклеотидов, и неспецифичными тРНК. Показано, что

- специфичность комплексообразования определяется в первую очередь идентичностью антикодона;

- нуклеотиды, образующие третичные взаимодействия G19-C56 и U45-G10-C25, вносят основной вклад в стабилизацию правильной трехмерной структуры тРНК, необходимой для оптимального связывания;

- U20 и нуклеотиды, образующие третичное взаимодействие A26-G44, важны для конформационной подстройки комплекса;

- неспецифические взаимодействия фермента с антикодоновым и акцепторным стеблями и с А73 не важны для распознавания тРНКРЬе в процессе комплексообразования;

- уменьшение эффективности комплексообразования с неспецифичными тРНК в 100-3000 раз по сравнению с тРНКРЬе обеспечивает их преимущественную отбраковку на уровне связывания.

2. Впервые с помощью аффинной модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus аналогами тРНК№е, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды в определенных позициях З'-концевой последовательности (окисленные периодатом натрия по концевой рибозе или фотоактивируемые), изучена конформационная динамика взаимодействия фермента с акцепторным концом тРНКРЬе.

- Показано, что взаимодействия фермента с фенилаланином и АТР влияют на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе; индуцируемые нуклеотидным субстратом эффекты выражены значительно сильнее и зависят от структурных различий бактериальной и эукариотической тРНКРЬе в районах, не контактирующих с активным центром.

- На основе анализа полученных результатов и известных рентгеноструктурных данных высказано предположение, что взаимодействия с аминокислотным субстратом контролируют связывание З'-концевого аденозина тРНКРЬе в активном центре, а индуцируемые АТР более глубокие перестройки в структуре комплекса модулируют конформацию акцепторной ветви в целом.

3. Исследована роль различных элементов узнавания тРНКРЬе в обеспечении продуктивного связывания акцепторного конца с помощью фотоаффинного мечения фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus з4и-содержащими аналогами тРНКРЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие и в присутствии фенилаланина и АТР. Показано, что

- взаимодействие фермента с тРНКРЬе на этапе, предшествующем каталитической стадии, требует тонкой конформационной подстройки комплекса: любые мутации оказывают более существенное влияние на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе в присутствии фенилаланина и АТР, чем в их отсутствие;

- нарушение специфических взаимодействий с антикодоном наиболее критично для функциональной ориентации акцепторного конца, контролируемой малыми субстратами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Васильева, Инна Анатольевна, 2005 год

1. Giege R., Sissler M., Florentz C. Universal rules and idiosyncratic features in tRNA identity //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5017-5035.

2. Beuning P. J., Musier-Forsyth K. Transfer RNA recognition by aminoacyl-tRNA synthetases // Biopolymers. 1999. V. 52. P. 1-28.

3. Bovee M. L., Yan W., Sproat B. S., Francklyn C. S. tRNA discrimination at the binding step by a class II aminoacyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 13725-13735.

4. Ibba M., Sever S., Praetorius-Ibba M., Söll D. Transfer RNA identity contributes to transition state stabilization during aminoacyl-tRNA synthesis // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 3631-3637.

5. Gruic-Sovulj I., Landeka I., Söll D., Weygand-Durasevic I. tRNA-dependent amino acid discrimination by yeast seryl-tRNA synthetase // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 52715279.

6. Khvorova A., Motorin Y., Wolfson A. Pyrophosphate mediates the effect of certain tRNA mutations on aminoacylation of yeast tRNA // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4451-4456.

7. Mosyak L., Safro M. Phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus has four antiparallel folds of which only two are catalytically functional // Biochimie. 1993. V. 75. P. 1091-1098.

8. Fräser T. H., Rich A. Amino acids are not all initially attached to the same position on transfer RNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1975. V. 72. P. 3044-3048.

9. Sprinzl M., Cramer F. Site of aminoacylation of tRNAs from E. coli with respect to the 2'- or 3'-hydroxyl group of the terminal adenosine // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1975. V. 72. P. 3049-3053.