Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Торопыгин, Илья Юрьевич

• Торопыгин, Илья Юрьевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Торопыгин, Илья Юрьевич

СОДЕРЖАНИЕ..............................................................................................2

1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................4

1.1. Актуальность проблемы............................................................................4

1.2. Цель и задачи исследования.......................................................................6

1.3. Научная новизна работы............................................................................7

1.4 Практическая значимость работы................................................................8

1.5. Положения, выносимые на зашдту.............................................................9

1.6. Публикации и апробация работы...............................................................9

1.7. Объем и структура работы........................................................................11

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................12

2.1. Использование масс-спектрометрии при изучении бежов.........................12

2.2. Основы МА1£)1-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов. 14

2.2.1. Устройство масс-спектрометра..............................................................14

2.2.2. Образование свободных ионов в МАЬШ................................................16

2.2.3. Измерение масс ионов...........................................................................22

2.2.4. Влияние изотопии.................................................................................23

2.2.5. Времяпролетный масс-анализатор.........................................................24

2.2.6 Принцип действия времяпролетнош масс-анализатора..........................25

2.2.7. Основные параметры масс-анализаторов................................................26

2.2.9. Фрагментация пептидов в МАЬБ1.........................................................28

2.2.10. Измерение т/г фрагментов..................................................................32

2.2.11. Детектор времяпролетнош анализатора...............................................33

2.3. Масс-спектрометрия в биологии и медицине.............................................34

2.3.1. Протеомное профилирование образцов..................................................36

2.3.2. Про филирование для медициской диагностики......................................37

2.4. Ингибиторы протеаз в плазме крови..........................................................41

2.4.1. Механизмы действия ингибиторов протеиназ.........................................42

2.4.2. Стандартный механизм действия ингибиторов сериновых протеиназ....43

2.4.3. Отклонения от стандартной модели действия ингибитора.......................44

2.4.4. Альфа 2-Макроглобулин.......................................................................45

2.5. Ренин-ангиотензиновая система...............................................................47

2.5.1. Ангиотеюинпревращаюший фермент....................................................50

2.6. Амилоцц-бета и болезнь Альцгеймера.......................................................52

2.6.1. Аншотензинпревращающий фермент в метаболизме амилоида-бега......58

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................61

3.1. Клинический материал.............................................................................61

3.2. Пептиды и белки......................................................................................61

3.4. Гидролиз пептидов амилоида бета отдельными доменами АПФ..............63

3.5. Количественные измерения продуктов гидролиза пептидов амилоида-бега.64

3.6. Получение фрагмента Ab( 1 -5), меченного О..........................................64

3.7. Гидролиз сывороток трипсином...............................................................65

3.8. Гидролиз сывороток в присутствиирекомбинантнош SAA (rSAA)..........65

3.9. Количественные MALDI-TOF анализы SAA............................................65

4.РЕЗУЛБТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................69

4.1. Гидролиз пептида АЬ (1-16)......................................................................69

4.1.1. Гидролиз пептида Ab (1 -16) ангиотензинпревращающим ферментом и влияние изомеризации Asp7 на скорость гидролиза........................................69

4.1.2. Сравнение скоростей гидролиза изомеров пептидов АЬ АПФ с использованием количественной масс-спектрометрии с меченными О внутренними стандартами..............................................................................74

4.2. Измерение активности протеаз в плазме и сыворотке крови.....................79

4.2.1. Исследование особенностей ингибирования сывороткой экзогенного трипсина при различных количествах вводимого фермента с исследованием путем масс-спектрометрии MALDI-TOF полученных пептидных продуктов .80

4.2.1. Избирательный протеолиз в сыворотке крови трипсином......................83

4.2.2. Трипеинолизрекомбинангного SAA(rSAA) в сыворотке больной аденокарциномой (№411) и миомой (№417)..................................................89

4.2.3. Сравнение степеней необратимого ингибирования трипсина в сыворотках больных аденокарциномой яичника (№411 и №431) и миомой матки (№417)..................................................................................................94

4.2.4. Диагностическая классификация образцов ракаяичникаи нераковых образцов.........................................................................................................97

5. ВЫВОДЫ...................................................................................................99

БЛАГОДАРНОСТЬ.....................................................................................100

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................101

Сокращения.................................................................................................111

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови»

1. ВВЕДЕНИЕ 1.1. Актуальность проблемы

Протеазы, или протеолитические ферменты катализируют гидролиз белков по пептидным связям. Биоинформационный анализ генома человека, показал, что к протеазам и гомологичным им белкам относится 566 генов, или 1,7% генома.

До недавнего времени протеазы рассматривались как ферменты, конвертирующие неактивных предшественников физиологически активных белков и пептидов, включая ферменты и гормоны, в активное состояние. Однако в настоящее время стало очевидным, что перечень физиологических функций протеаз значительно шире. Протеазы выполняют важную роль во многих процессах и задействованы не только в метаболических, но и в сигнальных молекулярных сетях. В силу физиологической значимости протеазы играют важную роль и в патогенезе различных заболеваний, а значит, являются привлекательным диагностическими и лекарственными мишенями.

Чтобы наиболее полно понимать функциональное значение протеаз в тех или иных процессах, необходимо определить специфичность фермента, идентифицировать эндогенные субстраты и продукты гидролиза, а также активаторы и ингибиторы фермента. Для описания и моделирования молекулярных сетей, в которых задействованы протеазы, также необходимы количественные оценки концентраций и активностей ферментов, в том числе in vitro, ex vivo и in vivo.

В настоящей работе в качестве экспериментального подхода для изучения протеаз использованы методы, основанные на масс-спектрометрии MALDI-TOF - лазерной десорбции/ионизации из объема специального вещества - матрицы, с времяпролетным детектором. Этот способ анализа образцов обеспечивает определение молекулярной массы исследуемого образца или молекулярных масс компонентов сложных смесей.

В случае исследования белков видов с известным геномом несложная предварительная обработка образца, как правило, позволяет идентифицировать один или несколько белков в смеси. Кроме того, благодаря конструктивным особенностям ионного источника MALDI, имеется возможность работы с биологическим материалом без предварительной очистки или фракционирования образца, например, цельной сывороткой крови.

Возможность одновременного измерения молекулярных масс нескольких компонентов смеси позволяет наблюдать гидролиз природного субстрата или нескольких субстратов, например, по накоплению продуктов реакции. Однако в условиях ионного источника MALDI, как и практически любого другого типа масс-спектрометра, ионы в газовой фазе различных пептидов образуются с неодинаковой эффективностью, поэтому MALDI нельзя отнести к количественным методам, и для сколь-нибудь точных количественных оценок требуется использование специальных методов анализа, например введения изотопных меток.

В данной работе при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF были исследованы взаимодействие выделенных ферментов и субстратов и ингибирование экзогенного фермента ингибиторами протеаз сыворотки крови.

В первой части работы исследован гидролиз пептида АЬ (1-16) белка амилоида бета, связываемого с болезнью Альцгеймера (БА), ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ). То что белок амилоид бета гидролизуется АПФ, было известно ранее, однако сайт гидролиза и влияние на гидролиз изомеризации аспарагиновой кислоты (связываемое с БА возрастное изменение) не были установлены.

Во второй части работы изучался гидролиз цельной сыворотки трипсином. В условиях in vitro в системе из протеазы и субстрата содержащийся в низкой концентрации фермент способен гидролизовать количество белка, многократно превышающее его собственное содержание.

Однако в крови этого не происходит благодаря сбалансированной системе ингибиторов. Иными словами, гидролиз сыворотки трипсином происходите присутствии ингибиторов, при этом ингибиторы могут быть разделены на два типа. Ингибиторы первого типа, например альфа-1 ингибитор протеиназ, (а1ИП) известный как антитрипсин, полностью блокируют активность фермента, необратимо связываясь с ним. Другой важный белок крови, альфа 2-макроглобулин (а2М), образует с протеазами комплекс, в котором активный центр фермента остается свободен, но пространственная структура образованного комплекса ограничивает взаимодействие с частью субстратов и ингибиторов, изменяя специфичность фермента. В зависимости от соотношений трипсина и ингибиторов в реакционной смеси должны наблюдаться различные продукты гидролиза. Так, если ингибиторы связаны с патологическим процессом, то изменения регистрируемых продуктов не только указывает на наличие и относительную концентрацию ингибиторов, но и на развитие или состояние патологического процесса.

Масс-спектрометрия MALDI-TOF использована в настоящей работе как подходящий инструмент для исследования сайтов и скорости гидролиза беков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови.

1.2. Цель и задачи исследования Целью работы является разработка метода прямого MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа образцов сывороток крови с применением разных концентраций вводимого искусственно трипсина..

Основные задачи исследования.

1. Используя модельную систему в составе пептида амилоида-бета АЬ(1-16) в качестве субстрата и ангиотензинпревращающего фермента, определить сайты гидролиза пептида амилоида-бета АЬ(1-16), определить

каталитически активный домен и влияние природной модификации изомеризации остатка Азр-7 на эффективность гидролиза.

2. Осуществить масс-спектрометрический анализ МА1Л31-ТОР продуктов гидролиза плазмы крови различными концентрациями экзогенного трипсина (титрование трипсином).

3. Исследовать динамику накопления продуктов гидролиза трипсином сыворотки крови путем количественного анализа посредством МА1ЛЭ1-ТОР-масс-спектрометрии и установить условия, необходимые гидролиза высококопийных (мажорных) сывороточных белков.

4. Сравнить профили МАЬ01-ТОР-масс-спектрометр ии плазмы крови при гидролизе экзогенным трипсином в норме и при раке яичника.

1.3. Научная новизна работы

1. В работе впервые показано, что в ^концевой домен АПФ специфично гидролизуетпептид АЬ (1-16) с образованием пептидов АЬ(1-5) и АЬ(6-16), при этом С-домен АПФ не гидролизует пептид АЬ(1-16).

2. Кроме того, методом количественной масс-спектрометрии определено, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АЬ(1-16) по сравнению с пептидом с нормальным остатком аспарагиновой кислоты.

3. В работе впервые показано, что при гидролизе сыворотки трипсином состав продуктов гидролиза меняется в зависимости от количества вносимого трипсина. При этом, при введении трипсина в концентрации меньше 2 мг/мл сыворотки, удается регистрировать масс-спектры, свободные от продуктов гидролиза так называемых мажорных белков, целенаправленно удаляемых при проведении прямых масс-спектрометрических исследований.

4. В работе впервые показано, что с использованием методов прямой масс-спектрометрии возможно регистрировать изменения в составе ингибиторов протеаз крови, концентрация которых повышается, в том числе

при развитии онкологических заболеваний. Масс-спектрометрическая регистрация таких изменений проводилась по изменению состава продуктов триптического гидролиза.

5. Впервые методом количественной масс-спектрометрии в условиях прямого масс-спектрометрического исследования была исследована динамика накопления отдельных продуктов гидролиза. Изменения скорости накопления продуктов отражают изменение активности ингибиторов, модифицирующих активность трипсина. Таким образом, используя эти свойства при прямом масс-спектрометрическом исследовании, было определено изменение в концентрации белков содержащихся в крови в концентрации порядка 10~6 М, ранее недоступных для регистрации методом прямого масс-спектрометрического исследования, и таким образом продемонстрирована возможность использования молекулярных зондов при прямом масс-спектрометрическом профилировании (ПМСП).

1.4 Практическая значимость работы

1. Практическая значимость работы заключается в разработке методических подходов к анализу и измерению активности протеаз методом масс-спектрометрии MALDI-TOF с использованием нативных субстратов в сыворотке крови и in vitro. В работе также показана возможность использования функциональных свойств протеолитических ферментов и ингибиторов сыворотки крови для прямого профилирования образцов.

2. Выявленная способность АПФ гидролизовать форму пептида бета-амилоида АЬ(1-16) с изомеризованным остатком аспарагиновой кислоты в четыре раза более эффективно по сравнению с интактной формой может указывать на потенциальную биологическую роль АПФ как фермента, связанного с развитием болезни Альцгеймера. Это находит подтверждение в работах других авторов. Так, выявлены два полиморфных варианта гена АПФ связанных с увеличением накопления АЬ [1][2], со ссылкой на представленную работу. Проводятся исследования влияния

ингибиторов АПФ на развитие БА, также со ссылкой на представленную работу.

3. Использование функциональных свойств протеаз и ингибиторов позволяет по изменениям в их активности при проведении прямого масс-спектрометрического профилирования (ПМСП) оценивать содержание белков, присутствующих в концентрациях порядка 10"6 М, недоступных для непосредственной масс-спектрометрической регистрации.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. №концевой домен ангиотензинпревращающего фермента специфично гидролизует пептид амилоида-бета АЬ(1-16) с образованием двух пептидов АЬ(1-5) и АЬ(6-16), причем изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в 7 положении этого пептида приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АПФ. С-концевой домен не гидролизует пептид амилоида-бета АЬ(1-16).

2. Состав продуктов гидролиза сыворотки трипсином зависит от количества вводимого фермента. При концентрациях трипсина около 8,5 мМ в спектрах представлены продукты, отличные от пептидов альбумина.

3. Скорость накопления продуктов гидролиза трипсином и минимальное количество трипсина, необходимое для начала гидролиза альбумина для образцов сывороток больных аденокарциномой яичника выше, чем для образцов сыворотки крови здоровых доноров.

4. С использованием гидролиза сывороток концентрациями трипсина около 10 мкМ возможно получение МАЬШ-ТОР-профилей, позволяющих различать образцы сыворотки больных аденокарциномой яичника и здоровых доноров.

1.6. Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 10 статей в научных

журналах, рекомендованных ВАК Мннобрнаукн России, и 16 публикации в трудах конференций, один патент. Индекс Хирша автора равен 7.

Результаты работы доложены на 3-м Всемирном Конгрессе НЦРО (Пекин Китай, октябрь 2003), конференции «Фундаментальные науки в медицине», (Москва, июль-август 2006), конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении», (Москва, май 2006), III конференции «Мужское здоровье» (Москва, октябрь 2006), VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2007), 3-ей Международной школе семинаре «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, апрель 2007), на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2007), 3-ем Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, январь 2007), 6-ой Парнасовской конференции «Молекулярные механизмы клеточных сигнальных систем» (Краков, Польша, май-июнь 2007), 6-м Всемирном Конгрессе НПРО (Сеул, Корея, октябрь 2007), конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки", (Минск, октябрь 2007), конференции «Фундаментальны науки в медицине», (Москва декабрь 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск май 2008), 4-й конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанобиотехнологии в медицине» (Москва-Нижний Новгород, июнь 2008), 10-м Европейском симпозиуме по кальций-связывающим бежам в нормальных и трансформированных клетках (Левен, Бельгия, сентябрь 2008), Школе молодыхученых «Методы культивирования клеток», (Москва, октябрь 2008), 37 европейской Конференции по физиологии и фукционированию мышц (Оксфорд, Великобритания сентябрь 2008),7-м Всемирном Конгрессе НЦРО (Амстердам, Голландия, сентябрь 2008), конференции «Фундаментальные науки в медицине» (Москва, декабрь 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, июнь 2009), конференции «Совершенствование медицинской

помощи при онкологических заболеваниях» VII съезда онкологов России (Москва, октябрь 2009), 5-й конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанобиотехнологии в медицине» (Санкт Петербург, июнь 2010), 1-ой международной научно-практической конференции молодых ученых «Постгеномные методы анализ а в биологии, лабораторной и клинической медицине», (Москва ноябрь 2010), конференции «От скальпеля до генома, протеома и липидома» (Казань, апрель 2011), II Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, ноябрь 2011), 38-ом Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ, FEBS (Санкт Петербург, июль 2013).

1.7. Объем и структура работы Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 136 источников, приложения. Работа включает 24 иллюстрации.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Использование масс-спектрометрии при изучении белков

Масс-спектрометрия представляет собой метод исследования веществ, основанный на измерении отношений масс и заряда ионов. В основе всех существующих масс-спектрометров лежит принцип измерения параметров движения заряженных частиц в электрических и магнитных полях. Фактически это единственно возможный подход для определения молекулярных масс веществ, так как определение массы незаряженных молекул с современной физической точки зрения невозможно. В зависимости отрешаемой задачи или предназначения прибора используется подходящий метод ионизации, по существу тип ионного источника, а это определяет выбор масс-анализатора(системы разделения ионов по массам). Конструкционно любой масс-спектрометр состоит из трех основных частей - ионного источника, системы разделения ионов и системы регистрации.

История масс-спектрометрии тесно связано с развитием ядерной физики и начиналась с опытов по исследованию катодных и анодных (или канальных) лучей. Исследования, сделанные Дж. Томсоном в Кавендишской лаборатории Кембриджского университета по изучению отклонения катодных лучей в электрических и магнитных полях привели к открытию в 1895 году электрона и определению отношения его массы к заряду. Рождением масс-спектроскопии можно считать 1898 год, когда Вильгельм Вин, изучая анодные лучи, определил массу атома водорода и, по сути, наблюдал протон. В. Вин пытался определить массы более тяжелых элементов, но недостаточно высокий вакуум, доступный в те времена, приводил к слишком сильному рассеянию. Продолжая изучать отклонение ионных лучей, Дж. Томпсон к 1907 году разработал метод парабол и, продолжая вместе с Ф. Астоном эксперименты по точному измерению отношения массы ионов к заряду ионов, обнаружил существование двух разновидностей неона, массой 20 и 22 единицы. Работы Ф. Астона и в США А. Демпстера (некоторое время работавшего в группе В. Вина) в 1918-1920

годах привели к значительному улучшению точности и воспроизводимости масс-спектров. Для исключения терминологической неоднозначности необходимо внести определенные уточнения. Для регистрации разделенных ионов Вин и Томпсон наблюдали сцинтилляцию и фосфоресценцию в вакуумной трубке, Астон стал использовать фотопластинку, а в установке А. Демпстера измерялся ток, индуцируемый ионами в детекторе. Таким образом, исходя из метода регистрации, используют термин масс-спектроскопия, масс-спектрография и масс-спектрометрия. Во всех современных приборах, в том числе, использованном в представленной работе, осуществляется измерение электрических токов в детекторе, поэтому общеупотребимым и обобщающим стал термин «масс-спектрометрия».

На протяжении первой половины XX века развитие масс-спектрометрии состояло в совершенствовании и изобретении новых методов разделения ионов и их детекции. Заметными вехами стали магнитно-секторный (А. Нир, 1940) и времяпролетный (У. Стивене, 1946) анализаторы. В середине 1950-х годов В. Пол разработал квадрупольный масс-анализатор, а позднее квадрупольную ионную ловушку, специально предназначенную для захвата и измерения масс ионов. Были разработаны масс-спектрометры ионно-циклотронного резонанса (Дж. Хиппл, 1949). В начале 1970-х была разработана новая техника проведения измерений, использующая преобразование Фурье, что на несколько порядков сократило время измерения (М. Комисароу, А. Маршалл, 1974), появились

о

квадрупольные тандемные масс-спектрометры (Р. Иоуст, К. Энке, 1978). В 2000 году был построен прибор с электростатической орбитальной ионной ловушкой (А. Макаров, 2000) [3].

Долгое время единственным методом получения ионов в вакууме являлся метод электронного удара, предложенный А. Демпстером в 1918 году. Этот способ до сих пор широко применяется при исследовании соединений, находящихся в газообразном состоянии или переходящих в

него при нагревании в вакууме. Остальные методы ионизации стали появляться лишь во второй половине XX века. Их примерами служат химическая ионизация (B.JI. Тальрозе, Ф. Филд, М. Мансон, 1966), ионизация при электрораспылении (М. Доул, 1968), полевая десорбция/ионизация (Г. Беки, 1969), ионизация бомбардировкой быстрыми атомами (М. Барбер, 1981), ионизация в индуктивно-связанной плазме (В. Фассел, Мак-Фарлайн, 1974) [4,5].

Однако при использовании этих способов ионизации молекулам сообщается слишком высокая энергия, приводящая к их разрушению в случае биополимеров. Потому такие способы практически непригодны для изучения пептидов, белков или нуклеиновых кислот.

В конце 1980-х годов для получения в вакууме свободных ионов достаточно больших лабильных соединений, например, белков, пептидов, полисахаридов или нуклеиновых кислот, было предложено два метода. Первый из них, метод электрораспыления, был предложен в JI. Галь в СССР и Д. Фенном в США (получив название ЭРИАД и ESI) [6-8]. В основе второго метода лежит открытие группы соединений, большинство из которых представляют собой фенилсодержащие кислоты, которые не только ионизуются лазерной десорбцией в вакууме при низких энергиях, но и способствуют эффективной ионизации примесных атомов МАЫЭ1(метод MALDI) [9,10]. Таким образом, появилась возможность точного измерения молекулярных масс белков и пептидов.

2.2. Основы MALDI-времяпролетноймасс-спектрометрии белков

и пептидов

2.2.1. Устройство масс-спектрометра

Масс-спектрометры могут использоваться и используются для исследования огромного числа разнообразных по природе молекул и соединений. Однако в рамках данного обзора представляется

целесообразным ограничиться рассмотрением анализа только одного вида анализируемых веществ - бежов и пептидов.

Любой масс-спектрометр состоит из (1) устройства ввода образца, (2) ионного источника, (3) масс-анализатора, (4) детектора, (5) вакуумной системы и (6) системы управления и обработки данных. Выбор типа каждого элемента системы определяется назначением прибора.

Суть масс-спектрометрического измерения заключается в преобразовании анализируемого вещества в ионы в газовой фазе и измерение отношения массы к заряду (m/z) образованных ионов. Изучение анализируемого вещества в виде газофазного иона определяет две используемые в масс-спектрометре особенности. Первая - движением свободных ионов в вакууме можно управлять с помощью электромагнитных полей, в которых эти ионы находятся, и по характеру этого движения и изменений в движении ионов определять их свойства. Параметры движения зависят от отношения m/z и, в конечном итоге, от молекулярной массы анализируемого вещества.

Вторая особенность заключается в том, что использование газофазных ионов обеспечивает высокую чувствительность масс-спектрометра. С помощью электромагнитных полей можно пространственно локализовать и фокусировать ионы, что позволяет с высокой эффективностью передавать ионы на детектор частиц. Сам детектор работает с высокой чувствительностью, в нем реализованы схемы, аналогичные фотоэлектронному умножителю. На сегодняшний день не существует других технологий столь точного и эффективного манипулирования незаряженными частицами.

Однако необходимость использования газофазных ионов является одновременно основной сложностью в масс-спектрметрии. Именно перевод исследуемых веществ в форму свободных ионов в вакууме без разрушения молекулы есть одна из основных сложностей в масс-спектрометрии, и именно поэтому потребовалось почти сто лет для разработки методов

ионизации биополимеров. Для получения ионов при масс-спектрометрических измерениях в данной работе использовался метод MALDI (англ. Matrix Assisted Laser Desorbtion and Ionisation) [4,5]. При использовании этого метода исследуемое вещество сокристаллизуют в примесных количествах со специально подобранным веществом (англ. matrix), десорбция и ионизация которого происходит при относительно низких энергиях лазерного излучения, так что совместно с основным веществом десорбируется и ионизуется примесное исследуемое соединение, лазерная десорбция которого в чистом виде может происходить только при заметно больших энергиях излучения. Уменьшающие энергию десорбции вещества по аналогии с английским matrix, в значении «вмещающее или содержащее вещество», принято называть матрицами MALDI.

В русскоязычной литературе можно встретить несколько вариантов перевода названия метода, фонетически сходных с английским, но не передающих исходного смысла, в результате чего представляется целесообразным использовать только общеупотребительный акроним «MALDI».

Представленная работа была выполнена с использованием именно метода MALDI, и его подробное рассмотрение представляется целесообразным.

2.2.2. Образование свободных ионов в MALDI

MALDI является широко используемым аналитическим методом, который появился и развивался главным образом эмпирическим путем. Общепринятого понимания процесса до сих пор не существует, несмотря на достаточно активные исследования в этой области.

Существует большое число предложенных возможных моделей механизмов ионизации MALDI. Практически ни у кого не вызывает сомнений, что процесс ионизации состоит из двух этапов: первый — образование первичных свободных ионов из молекул матрицы, и второй -формирование ионов анализируемого вещества в газовой фазе в результате

взаимодействия высоко реакционноспособиых ионов матрицы и нейтральных молекул анализируемого вещества. Продолжительность первого этапа составляет порядка 4-5 не и примерно соответствует продолжительности импульса N2 или YAG лазера, совпадая со временем жизни возбужденных состояний матрицы. Только в этот промежуток времени могут существовать плотности и потоки энергий, достаточные для формирования газофазных ионов [11-14]. Второй этап, продолжительностью порядка 10 мке, соответствует периоду адиабатического расширения образовавшихся после лазерного импульса продуктов. В это время происходят ион-молекулярные процессы, ведущие к образованию ионов анализируемых веществ.

Наиболее спорны, или наименее понятны, процессы первого этапа MALDI. Прежде всего, нет общепринятого понимания того, что происходит раньше - переход матрицы в газовую фазу или образование ионов. Неясно также, ионизируется матрица в момент лазерного воздействия или служит лишь для обеспечения механического выноса с поверхности под действием лазера вещества в виде свободных молекул, атомов или ионов. Этот процесс принято называть лазерной абляцией, если образуется светящаяся плазма, и десорбцией в случае темной плазмы.

Так, существуют модели, предполагающие поведение паров матрицы аналогично полярной жидкости, рассматривая дальнейшие процессы так, как это принято в химии растворов. Большинство матриц представляют собой органические кислоты и действительно будут протонировать молекулы аналита. При этом, если простая диссоциация недостаточна для образования ионов, то рК, в случае когда электроны находятся в возбужденном состоянии, может значительно, до 10 раз отличаться от рК, когда электроны находятся в стационарном состоянии. В нижние возбужденные состояния электроны могут переходить, поглощая фотоны [14,15].

В большинстве случаев образцы для МА1ЛЭ1 приготавливают в водных растворах, часто с добавлением ТФУ или муравьиной кислоты. В этих условиях аналиты, по крайней мере, белки и пептиды, оказываются протонированными. Такое состояние может сохраняться после высыхания образца. Известно, что индикаторы (бромфенол, метилоранж и др.) не меняют цвет при высыхании в матрице, что указывает на сохранение электронного состояния [16].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Торопыгин, Илья Юрьевич, 2013 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kehoe P.G.,Miners S.,Love S. Angiotensins in Alzheimer's disease-friend or foe? // Trends Neurosci. Elsevier, 2009. Vol. 32, № 12. P. 619-628.

2. Miners J.S. et al. ACE variants and association with brain Aß levels in Alzheimer's disease. // Am. J. Transl. Res. 2010. Vol. 3, № 1. P. 73-80.

3. Makarov A. Electrostatic Axially Harmonic Orbital Trapping: A HighPerformance Technique of Mass Analysis // Anal. Chem. American Chemical Society, 2000. Vol. 72, № 6. P. 1156-1162.

4. Münzenberg G. Development of mass spectrometers from Thomson and Aston to present // Int. J. Mass Spectrom. Elsevier B.V., 2013.

5. Audi G. The history of nuclidic masses and of their evaluation // Int. J. Mass Spectrom. 2006. Vol. 251, № 2-3. P. 85-94.

6. Александров М.Л. etal. Экстракция ионов нз растворов при атмосферном давлении—новый метод масс-спектрометрического анализа// ДАН СССР. 1984. Vol. 277, № 2. Р. 379-383.

7. Yamashita М., Fenn J.B. Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme // J. Phys. Chem. American Chemical Society, 1984. Vol. 88, № 20. P. 4451-4459.

8. Fenn J.B. et al. Electrospray ionization-principles and practice // Mass Spectrom. Rev. Wiley Online Library, 1990. Vol. 9,№ 1. P. 37-70.

9. Karas M., Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons // AnaL Chem. ACS Publications, 1988. Vol. 60, № 20. P. 2299-2301.

10. Tanaka K. et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time? of? flight mass spectrometry//Rapid Commun. Mass Spectrom. Heyden & Son Limited, 1988. Vol. 2, № 8. P. 151-153.

11. Dreisewerd K. The desorption process in MALDI // Chem. Rev. ACS Publications, 2003. Vol. 103, № 2. P. 395-426.

12. Karas M., Krüger R. Ion formation in MALDI: the cluster ionization mechanism // Chem. Rev. ACS Publications, 2003. Vol. 103, № 2. P. 427-440.

13. Setz P.D., Knochenmuss R. Exciton mobility and trapping in a MALDI matrix //J. Phys. Chem. A. ACS Publications, 2005. Vol. 109, № 18. P. 40304037.

14. Zenobi R., Knochenmuss R. Ion formation in MALDI mass spectrometry // Mass Spectrom. Rev. 1998. VoL 17, № 5. P. 337-366.

15. Chen X., Carroll J.A., Beavis R.C. Near-ultraviolet-induced matrixassisted laser desorption/ionization as a function of wavelength // J. Am. Soc. Mass Spectrom. Springer, 1998. Vol. 9, № 9. P. 885-891.

16. Krüger R. et aL Analyte Incorporation and Ionization in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Visualized by pH Indicator Molecular Probes // Anal. Chem. American Chemical Society, 2001. Vol. 73, № 24. P. 5812-5821.

17. Karas M., Glückmann M., Schäfer J. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors. // J. Mass Spectrom. 2000. Vol. 35, № 1. P. 1-12.

18. Talroze V.L. et al. Advanced in Mass Spectrometry // Adv. Mass Spectrom. / ed. Gelpi E. NY: Wiley, 2001. P. 481-491.

19. Talrose V.L. et al. Insight into absorption of radiation/energy transfer in infrared matrix-assisted laser desorption/ionization: the roles of matrices, water and metal substrates. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999. Vol. 13, № 21. P. 2191-2198.

20. Kinsel G.R. et al. Ionization energy reductions in small 2,5-dihydroxybenzoic acid-proline clusters. // J. Mass Spectrom. 2002. Vol. 37, № 11. P. 1131-1140.

21. Setz P.D., Knochenmuss R. Exciton mobility and trapping in a MALDI matrix. // J. Phys. Chem. A. 2005. Vol. 109, № 18. P. 4030-4037.

22. Electrospray and MALDI Mass Spectrometry / ed. Cole R.B. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2010.

23. Brown R.S., Lennon J.J. Mass Resolution Improvement by Incorporation of Pulsed Ion Extraction in a Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Linear Time-of-Flight Mass Spectrometer//Anal. Chem. American Chemical Society, 1995. Vol. 67, № 13. P. 1998-2003.

24. Guilhaus M. Special feature: Tutorial. Principles and instrumentation in time-of-flight mass spectrometry. Physical and instrumental concepts // J. Mass Spectrom. 1995. Vol. 30, № 11. P. 1519-1532.

25. Каратаев В.И., Мамырин Б.А., Шмикк Д.В. Новый принцип фокусировки ионных пакетов во времяпролетных масс-спектрометрах. //ЖтФ, 1971. Т. 41. Вып. 7. С. 1498—1501

26. Мамырин Б. А. et al. Массрефлектрон, новый безмагнитный времяпролётный масспектрометр с высоким разрешением.// ЖТФ, 1973. Т. 64. Вып. 1. С. 82—89.

27. Paizs В., Suhai S. Fragmentation pathways of protonatedpeptides. // Mass Spectrom. Rev. Vol. 24, № 4. P. 508-548.

28. Eckersall P.D. et al. Mass spectrometry and animal science: Protein identification strategies and particularities of farm animal species // J. Proteomics. 2012. Vol. 75, № 14. P. 4190-4206..

29. Roepstorff P., Fohlman J. Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of pep tides.// Biomed. Mass Spectrom. 1984. Vol. 11, №11. P. 601.

30. JohnsonR.S. et al. Novel fragmentation process ofpeptides by collision-induced decomposition in a tandem mass spectrometer: differentiation of leucine and isoleucine // Anal. Chem. American Chemical Society, 1987. Vol. 59, №21. P. 2621-2625.

31. Suckau D. et al. A novel MALDI LIFT-TOF/TOFmass spectrometer for proteomics. // Anal. Bioanal. Chem. 2003. Vol. 376, №7. P. 952-965.

32. Sleno L., Volmer D.A. Ion activation methods for tandem mass spectrometry. // J. Mass Spectrom. 2004. Vol. 39, № 10. P. 1091-1112.

33. Domingues M.R. et al. Do charge-remote fragmentations occur under matrix-assisted laser desorption ionization post-source decompositions and matrix-assisted laser desorption ionization collisionally activated decompositions?// J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999. Vol. 10, № 3. P. 217223.

34. Nikolaev E.N. et al. Implementation of low-energy surface-induced dissociation (eV SID) and high-energy collision-induced dissociation (keV CID) in a linear sector-TOF hybrid tandem mass spectrometer// Int. J. Mass Spectrom. 2001. Vol. 212, № 1. P. 535-551.

35. Wysocki V.H. et al. Mobile and localized protons: a framework for understanding peptide dissociation. // J. Mass Spectrom. 2000. Vol. 35, № 12. P. 1399-1406.

36. Medzihradszky K.F. et al. The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer. // Anal. Chem. 2000. Vol. 72, № 3. P. 552-558.

37. Mann M., Hojrup P., RoepstorffP. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases.// Biol. Mass Spectrom. 1993. Vol. 22, № 6. P. 338-345.

38. Pappin D.J., Hojrup P., Bleasby A.J. Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. // Curr. Biol. 1993. Vol. 3, № 6. P. 327-332.

39. Shevchenko A. et al. Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. //Proc.Natl Acad. Sci. U. S. A. 1996. Vol. 93, №25. P. 14440-14445.

40. Perkins D.N. et al. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. // Electrophoresis. 1999. Vol 20, № 18. P. 3551-3567.

41. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. //J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250, № 10. P. 4007-4021.

42. Jensen O.N. et al. Sample preparation methods for mass spectrometric peptide mapping directly from 2-DE gels. // Methods Mol. Biol. 1999. Vol. 112. P. 513-530.

43. Davies S.O.K. and D.R.W.H.N. and G.J. et al. Mass spectrometry for proteomics // Curr. Opin. Chem. Biol. 2008. Vol. 12, № 5. P. 483-490.

44. Snyder A.P. Interpreting protein mass spectra: a comprehensive resource. 2000.

45. Hillenkamp F. et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers // Anal. Chem. American Chemical Society, 1991. Vol. 63, № 24. P. 1193A-1203A.

46. Siuzdak G. Mass Spectrometry for Biotechnology. Academic Press, 1996. P. 161.

47. Ilina E.N. et al. Direct Bacterial Profiling by Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry for Identification of Pathogenic Neisseria //J. Mol. Diagnostics. 2009. Vol. 11, № 1. P. 75-86.

48. Mokrousov I. et al. Mass spectrometry based methods for the discrimination and typing of mycobacteria// Infect. Genet. Evol. 2012. Vol. 12, №4. P. 838-845.

49. Koomen J.M. et al. Plasma protein profiling for diagnosis of pancreatic cancerreveals the presence of host response proteins. // Clin. Cancer Res. 2005. Vol. 11, №3. P. 1110-1118.

50. Archakov A.I. et al. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics. // Proteomics. 2007. Vol. 7, № 1. P. 4-9.

51. Moshkovskii S.A. et al. Ovarian cancer marker of 11.7 kDa detected by proteomics is a serum amyloid Al. // Proteomics. 2005. Vol. 5, № 14. P. 37903797.

52. Edgell T. et al. Phase II biomarker trial of a multimarker diagnostic for ovarian cancer. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2010. Vol. 136, № 7. P. 10791088.

53. Menon U., Jacobs I. Screening for ovarian cancer. // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 2002. Vol. 16, № 4. P. 469-482.

54. De Angelis G. et al. Twenty Years of PSA: From Prostate Antigen to Tumor Marker. // Rev. Urol. 2007. Vol. 9, № 3. P. 113-123.

55. Rawlings N.D. Peptidase inhibitors in the MEROPS database. // Biochimie. 2010. Vol. 92, № 11. P. 1463-1483.

56. Laskowski M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases. // Annu. Rev. Biochem. 1980. Vol. 49. P. 593-626.

57. Otlewski J. et al. Structure-function relationship of serine protease-protein inhibitor interaction. // Acta Biochim. Pol. 2001. Vol. 48, № 2. P. 419-428.

58. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. / М. Академия, 2005, 480с

59. Jiang L. et al. The Binding Mechanism of a Peptidic Cyclic Serine Protease Inhibitor //J. Mol. Biol. 2011. Vol. 412, №2. P. 235-250.

60. Krowarsch D. et al. Canonical protein inhibitors of serine proteases. // Cell. Mol. Life Sci. 2003. Vol. 60, № 11. P. 2427-2444.

61. Haverback B.J. et al. Protein binding of pancreatic proteolytic enzymes. // J. Clin. Invest. 1962. Vol. 41. P. 972-980.

62. Sottrup-Jensen L. et al. Primary structure of human alpha 2-macroglobulin. V. The complete structure. // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259, № 13. P. 8318-8327.

63. Feldman S.R., Gonias S.L., Pizzo S. V. Model of alpha 2-macroglobulin structure and function. //Proc.NatL Acad. Sci. U. S. A. 1985. Vol. 82, № 17. P. 5700-5704.

64. Mehl J.W., O'Connell W., Degroot J. Macroglobulin from human plasma which forms an enzymatically active compound with trypsin. // Science. 1964. Vol. 145, №3634. P. 821-822.

65. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors. // Annu. Rev. Biochem. 1983. Vol. 52. P. 655-709.

66. Веремеенко K.H., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии / К. Здоровья. 1988. 198с.

67. Fyhrquist F., Saijonmaa О. Renin-angiotensin system revisited.//J. Intern. Med. 2008. Vol. 264, № 3. P. 224-236.

68. Hubert C. et al. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. Two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene. //J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, №23. P. 15377-15383.

69. Paul M., Poyan Mehr A., Kreutz R. Physiology of local renin-angiotensin systems. // Physiol. Rev. 2006. Vol. 86, № 3. P. 747-803.

70. Fleming I., Kohlstedt K., Busse R. The tissue renin-angiotensin system and intracellular signalling. // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2006. Vol. 15, № 1. P. 8-13.

71. Engeli S., Negrel R., Sharma A.M. Physiology and Pathophysiology of the Adipose Tissue Renin-Angiotensin System//Hypertension. 2000. Vol. 35, № 6. P. 1270-1277.

72. Furuhashi M. et al. Blockade of the renin-angiotensin system decreases adipocyte size with improvement in insulin sensitivity. // J. Hypertens. 2004. Vol. 22, № 10. P. 1977-1982.

73. Shesely E.G. et al. Elevated blood pressures in mice lacking endothelial nitric oxide synthase. //Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. Vol. 93, № 23. P. 13176-13181.

74. Esther C.R. et al. Mice lacking angiotensin-converting enzyme have low blood pressure, renal pathology, and reduced male fertility. // Lab. Invest. 1996. Vol. 74, № 5. P. 953-965.

75. Lattion A.L. et al. The testicular transcript of the angiotensin I-converting enzyme encodes for the ancestral, non-duplicated form of the enzyme. // FEBS Lett. 1989. VoL 252, № 1-2. P. 99-104.

76. Van Esch J.H.M. et al. Selective angiotensin-converting enzyme C-domain inhibition is sufficient to prevent angiotensin I-induced vasoconstriction.//Hypertension. 2005. Vol. 45, № 1. P. 120-125.

77. Yanai K. et al. Renin-dependent cardiovascular functions and renin-independent blood-brain barrier functions revealed by renin-deficient mice. // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 1. P. 5-8.

78. Ramaraj P. et al. Selective restoration of male fertility in mice lacking angiotensin-converting enzymes by sperm-specific expression of the testicular isozyme. // J. Clin. Invest. 1998. Vol. 102, № 2. P. 371-378.

79. Hemming M.L., Selkoe D.J. Amyloid beta-protein is degraded by cellular angiotensin-converting enzyme (ACE) and elevated by an ACE inhibitor. // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, №45. P. 37644-37650.

80. Iwata N. et al. Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin. // Science. 2001. Vol. 292, №5521. P. 1550-1552.

81. Eckman E.A. et al. Alzheimer's disease beta-amyloid peptide is increased in mice deficient in endothelin-converting enzyme. // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, №4. P. 2081-2084.

82. Hu J. et al. Angiotensin-converting enzyme degrades Alzheimer amyloid beta-peptide (A beta ); retards A beta aggregation, deposition, fibril formation; and inhibits cytotoxicity. //J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 51. P. 4786347868.

83. SavaskanE. etal. Cortical alterations of angiotensin converting enzyme, angiotensin II and ATI receptor in Alzheimer's dementia. //Neurobiol. Aging. Vol. 22, № 4. P. 541-546.

84. Masters C.L. et al Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. //Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985. Vol. 82, № 12. P. 4245-4249.

85. Glenner G.G., Wong C.W.Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. Vol. 120, № 3. P. 885-890.

86. Goedert M. et al. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. // Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. Vol. 85, №11. P. 4051-4055.

87. Grundke-Iqbal I. et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. // Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. Vol. 83, № 13. P. 4913-4917.

88. Ihara Y. et al. Phosphorylated tau protein is integrated into paired helical filaments in Alzheimer's disease. //J. Biochem. 1986. Vol. 99, № 6. P. 18071810.

89. Kosik K.S., Joachim C.L., Selkoe D.J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease.//Proc.Natl. Acad. Sci. U.S. A. 1986. Vol. 83, № 11. P. 4044-4048.

90. Rozemuller J.M., Eikelenboom P., Stam F.C. Role of microglia in plaque formation in senile dementia of the Alzheimer type. An immunohistochemical study. // Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 1986. Vol. 51, № 3. P. 247-254.

91. Wyss-CorayT. Inflammation in Alzheimer disease: driving force, bystander or beneficial response?//Nat. Med. 2006. Vol. 12, № 9. P. 10051015.

92. McGeer P.L., Rogers J., McGeer E.G. Inflammation, anti-inflammatory agents and Alzheimer disease: the last 12 years. // J. Alzheimers. Dis. 2006. Vol. 9, № 3 Suppl. P. 271-276.

93. Fitzjohn S.M. et al. Similar levels of long-term potentiation in amyloid precursor protein -null and wild-type mice in the CAI region ofpicrotoxin treated slices //Neurosci. Lett. 2000. Vol. 288, № 1. P. 9-12.

94. Hirokawa N., Takemura R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. //Nat. Rev. Neurosci. 2005. Vol. 6, № 3. P. 201-214.

95. Reinhard C., Hébert S.S., De StrooperB. The amyloid-beta precursor protein: integrating structure with biological function. // EMBO J. European Molecular Biology Organization, 2005. Vol. 24, № 23. P. 3996-4006.

96. Hoe H.-S. et al. Interaction of reelin with amyloid precursorprotein promotes neurite outgrowth. // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, № 23. P. 7459-7473.

97. Steiner H. et al. PEN-2 is an integral component of the gamma-secretase complex required for coordinated expression ofpresenilin and nicastrin. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, №42. P. 39062-39065.

98. Francis R. et al. aph-1 and pen-2 are required for Notch pathway signaling, gamma-secretase cleavage of betaAPP, and presenilin protein accumulation. //Dev. CelL 2002. Vol. 3, № 1. P. 85-97.

99. Levitan D. et al PS 1N- and C-terminal fragments form a complex that functions in APP processing and Notch signaling. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. Vol. 98, №21. P. 12186-12190.

100. Yu G. et al. Nicastrin modulates presenilin-mediated notch/glp-1 signal transduction and betaAPP processing. // Nature. 2000. Vol. 407, № 6800. P. 48-54.

101. Wolfe M.S. et al. Two transmembrane aspartates in presenilin-1 required forpresenilin endoproteolysis and gamma-secretase activity. //Nature. 1999. Vol. 398, №6727. P. 513-517.

102. Gyure K.A. et al. Intraneuronal abeta-amyloid precedes development of amyloid plaques in Down syndrome. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2001. Vol. 125, №4. P. 489-492.

103. Mori C. et al. Intraneuronal Abeta42 accumulation in Down syndrome brain. // Amyloid. 2002. Vol. 9, № 2. P. 88-102.

104. Crossgrove J.S., Li G.J., Zheng W. The choroid plexus removes beta-amyloid from brain cerebrospinal fluid. //Exp. Biol. Med. (Maywood). 2005. Vol. 230, № 10. P. 771-776.

105. Herz J. LRP: a bright beacon at the blood-brain barrier. // J. Clin. Invest. 2003. Vol. 112, № 10. P. 1483-1485.

106. Shibata M. et al. Clearance of Alzheimer's amyloid-ss(l-40) peptide from brain by LDL receptor-related protein-1 at the blood-brain barrier. // J. Clin. Invest. 2000. Vol. 106, № 12. P. 1489-1499.

107. Kang D.E. et al. Modulation of amyloid beta-protein clearance and Alzheimer's disease susceptibility by the LDL receptor-related protein pathway. //J. Clin. Invest. 2000. Vol. 106, № 9. P. 1159-1166.

108. Deane R. et aL LRP/amyloid beta-peptide interaction mediates differential brain efflux of Abeta isoforms. //Neuron. 2004. Vol. 43, №3. P. 333-344.

109. Yan S.D. et al. Receptor-dependent cell stress and amyloid accumulation in systemic amyloidosis. //Nat. Med. 2000. Vol. 6, № 6. P. 643-651.

110. Zlokovic B. V. Clearing amyloid through the blood-brain barrier. // J. Neurochem. 2004. Vol. 89, №4. P. 807-811.

111. Marr R.A. et al. Neprilysin gene transfer reduces human amyloid pathology in transgenic mice. // J. Neurosci. 2003. Vol. 23, № 6. P. 1992-1996.

112. Newell A.J. et al. Thiorphan-induced neprilysin inhibition raises amyloid beta levels in rabbit cortex and cerebrospinal fluid. // Neurosci. Lett. 2003. Vol. 350, № 3. P. 178-180.

113. Caccamo A. et al. Age- and region-dependent alterations in Abeta-degrading enzymes: implications for Abeta-induced disorders.//Neurobiol. Aging. 2005. Vol. 26, № 5. P. 645-654.

114. Carpentier M. et al. Declining expression of neprilysin in Alzheimer disease vasculature: possible involvement in cerebral amyloid angiopathy. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2002. Vol. 61, № 10. P. 849-856.

115. Farris W. et al. Partial loss-of-function mutations in insulin-degrading enzyme that induce diabetes also impair degradation of amyloid beta-protein. // Am. J. Pathol. 2004. Vol. 164, № 4. P. 1425-1434.

116. Roher A.E. et al. Structural alterations in the peptide backbone of beta-amyloid core protein may account for its deposition and stability in Alzheimer's disease. //J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, № 5. P. 3072-3083.

117. Roher A.E. etal. beta-Amyloid-(l-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: implications for the pathology of Alzheimer disease. // Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. Vol. 90, № 22. P. 1083610840.

118. Wyss-CorayT. et al. Prominent neurodegeneration and increased plaque formation in complement-inhibited Alzheimer's mice. //Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, № 16. P. 10837-10842.

119. Shimizu T.,Matsuoka Y., Shirasawa T. Biological significance of isoaspartate and its repair system. // Biol. Pharm. Bull. 2005. Vol. 28, № 9. P. 1590-1596.

120. Leissring M.A. et al. Enhanced proteolysis of beta-amyloid in APP transgenic mice prevents plaque formation, secondaiypathology, and premature death. //Neuron. 2003. Vol. 40, №6. P. 1087-1093.

121. Iwata N., Higuchi M., Saido T.C. Metabolism of amyloid-beta peptide and Alzheimer's disease. // Pharmacol. Ther. 2005. Vol. 108, № 2. P. 129-148.

122. ObaR. et al. The N-terminal active centre of human angiotensin-converting enzyme degrades Alzheimer amyloid beta-peptide. // Eur. J. Neurosci. 2005. Vol. 21, № 3. P. 733-740.

123. Luhrs T. et al. 3D structure of Alzheimer's amyloid-beta(l-42) fibrils. // Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. VoL 102, №48. P. 17342-17347.

124. Guilloreau L. et al. Structural and thermodynamical properties of Cull amyloid-betal6/28 complexes associated with Alzheimer's disease. // J. Biol. Inorg. Chem. 2006. Vol. 11, № 8. P. 1024-1038.

125. Kozin S.A. et al. Zinc binding to Alzheimer's Abeta(l-16) peptide results in stable soluble complex. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 285, №4. P. 959-964.

126. Zirah S. et al. Zinc binding agonist effect on the recognition of the beta-amyloid (4-10) epitope by anti-beta-amyloid antibodies.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. Vol. 321, №2. P. 324-328.

127. Zirah S. et al. Structural changes of region 1-16 of the Alzheimer disease amyloid beta-peptide upon zinc binding and in vitro aging. // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 4. P. 2151-2161.

128. Elisseeva Y.E. et al. Evidence for the presence of dipeptidyl carboxypeptidaseand its inhibitors in inflammatory synovial fluids. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. Vol. 658, № 1. P. 165-168.

129. Mirgorodskaya O.A. et al. Absolute quantitation of proteins by a combination of acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. //Anal. Chem. 2004. Vol. 76, № 13. P. 3569-3575.

130. Wei L. et al. The two homologous domains of human angiotensin I-converting enzyme are both catalytically active. // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, № 14. P. 9002-9008.

131. Heller M. et al. Trypsin catalyzed 160-to-180 exchange for comparative proteomics: tandem mass spectrometry comparison using MALDI-TOF, ESI-QTOF, and ESI-ion trap mass spectrometers. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003. Vol. 14, № 7. P. 704-718.

132. Fenselau C., Yao X. Proteolytic labeling with 180 for comparative proteomics studies: preparation of 180-labeled peptides and the 180/160 peptide mixture. // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 359. P. 135-142.

133. Eckman E.A. et al. Regulation of steady-state beta-amyloid levels in the brain by neprilysin and endothelin-converting enzyme but not arigiotensin-converting enzyme. //J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 41. P. 30471-30478.

134. Frackenpohl J. et al. The outstanding biological stability of beta- and gamma-peptides toward proteolytic enzymes: an in vitro investigation with fifteen peptidases. // Chembiochem. 2001. Vol. 2, № 6. P. 445-455.

135. Acharya K.R. et al. Ace revisited: a new target for structure-based drug design. //Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, № 11. P. 891-902.

136. Власова M.A., Мошковский C.A. Молекулярные взаимодействия сывороточного амилоида А острой фазы: возможное участие в патогенезе злокачественных опухолей (обзор)//Биохимия. Академиздатцентр" Наука" РАН, 2006. Vol. 71, № ю. Р. 1301-1311.

Сокращения

MALDI

TOF alPffl a2M Ab

Nd:YAG-na3ep

а.е.м.

m/z

м.д. CID

HE CID

ВЭЖХ

ПСА

С Al 25

АПФ

БА

АРР

НССА ТФУ

лазерная десорбции/ионизации из объема специального вещества - матрицы (Matrix Assisted Laser Desorbtion and Ionisation англ.)

времяпролетный анализатор (Time ofFlight, англ) альфа-1 ингибитор протеиназ альфа 2-макроглобулин

пептида амилоида-бета, в скобкахуказан точный фрагмент, полная последовательность пептида АЬ (1-42) DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV LA

твердотельный лазер, в качестве активной среды используется алюмо-иттриевый гранат («YAG», Y3AI5O12) легированный ионами неодима атомные единицы массы

безразмерная величина, отношение массы и заряда иона. Заряд принято выражают в единицах элементарного заряда, е, то есть в зарядах протона или, с обратным знаком, электрона. Иногда используется внесистемная единица - Томсон, 1 Th=l а.е.м./1 е. миллионные доли

диссоциация при столкновениях (collision induced dissociation, англ)

High Energy CID, hCID или keVCID, диссоциация при высоких энергиях столкновений Высокоэффективная жидкостная хроматография простатоспецифичный антиген раковый антиген, белок муцин-16 ангиотензинпревращающий фермент болезнь Альцгеймера

белок-предшественник амилоида, (Amyloid precursor protein, англ)

а-циано-4-гидроксикоричная кислота трифторуксусная кислота