Особенности белково-протеиназного комплекса пивоваренного ячменя, выращенного на различных агрофонах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Диаби Ибраима Калил

• Диаби Ибраима Калил
• кандидат биологических наук
• 1994

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Диаби Ибраима Калил

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТ ЕР АТ У Р Ы

1.1. Обпря характеристика протеолитических ферментов.

1. 2. Протеолитические ферменты растений.

1.3. Протеолитические ферменты семян растений.,.

1.4. Протеолитические (ферменты ячменя.

1. 5. Белковые ингибиторы протезе растений..

1.5. Белковые ингибиторы протеиназ ячменя.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

И С С Л Е Д О В А Н И Я.

2.1. Агрохимическая характеристика почв.

2.2. Материалы..

2.3. Подготовка образцов к исследованию..

2.4. Определение белка по методу Лоури.

2.5. Выбор субстрата для нейтральных протеаз.

2.6. Определение активности протеаз по методу Ансона.

2. 7. Определение начальной скорости реакции.

2.8. Гель-хроматография.

2. 9. Определение молекулярной массы водорастворимых белков ячменя гель-хроматографией на сефадексе 0-75.

2.10. Выделение белковых ингибиторов протеаз.

2.11. Выделение ферментного препарата нейтральных протеаз ячменя.,.

2.12. Определение активности ингибиторов протеаз.7.

2.12.1. Определение активности ингибиторов трипсина.— .7..

2.12.2. Определение активности ингибиторов нейтральных протеаз ячменя.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Характеристика исследуемого зерна ячменя.

3. 2. Активность нейтральных протеаз, ингибиторы нейтральных протеаз и трипсина зерна ячменя, выращенного на различных агрофонах..

3. 3. Активность кислых протеаз зерна ячменя, выращенного на различных агрофонах.

3. 4. Влияние условий выращивания на содержание водорастворимого белка в исследуемых образцах ячменя.

3.5. Фракционирование водорастворимых белков исследуемых образцов ячменя на сефадексе 0-75.

3.6. Изменение активности кислых протеаз при прорастании исследуемых образцов ячменя.

3.7. Изменение активности нейтральных протеаз при прорастаний исследуемых образцов ячменя..

3. 8. Изменение активности белковых ингибиторов протеаз при прорастании зерна ячменя.

3.9. Характеристика солода из исследуемых образцов ячменя по активности кислых и нейтральных протеаз.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК Л И Т Е РА ТУ Р Ы.

В ВЕДЕ Н МЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности белково-протеиназного комплекса пивоваренного ячменя, выращенного на различных агрофонах»

Одним из факторов, во многом определяющим химический состав зерна, его биохимические особенности и технологические показатели качества, является внешняя среда - состояние почвы, степень ее окультуренноети, дозы вносимых удобрений.

Известно, что внесение минеральных удобрений влияет на плодородие почвы, увеличивая урожайность зерновых культур, Увеличение урожайности, как правило, сопроволщается биохимическими изменениями. Направленность биохимических изменений может носить разный характер: в одних случаях эти изменения приводят к улучшению технологических достоинств., в других - г возможно их ухудшение.

Программирование урожайности зерновых культур, направленное формирование биохимических показателей и технологических достоинств зерна особо важное значение приобретают в зонах рискованного земледелия, к числу которых относится и Московская область. К культуру занимающим важное место в зерновом хозяйстве, относится ячмень, являющийся основным сырьем пивоваренной промышленности. Изучение влияния степени окультуренноети почвы, доз вносимых удобрений, их взаимосвязь с физическими показателями качества выращиваемого ячменя, исследование активности протеолитических ферментов зерна и их ингибиторов имеет большое значение для решения вопросов, связанных с получением зерна ячменя, отвечающего качественным требованиям пивоваренной промышленности.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение влияния степени окультуренноети почвы, доз вносимых удобрений на качество сортового зерна пивоваренного ячменя, его биохимические свойства и технологические показатели.

В соответствии с темой исследования были поставлены следующие задачи:

- изучение физических показателей качества пивоваренного ячменя сорта "Зазерский 85", выращенного на различных агрофонах;

-характеристика биохимических - и технологических показателей качества исследуемых образцов зерна ячменя;

- характеристика нейтральных и кислых протеаз и ингибиторов протеаз, выделенных из образцов ячменя, выращенных на различных агрофонах;

- исследование белкового комплекса образцов ячменя с использованием гель-хроматографии;

- исследование белково-протеиназного комплекса в процессе прорастания исследуемого ячменя и его солодоращения;

- характеристика солода, полученного из исследуемого зерна ячменя, по активности кислых и нейтральных протеаз.

Научная новизна. Проведено исследование качества зерна, в том числе физических показателей качества пивоваренного ячменя сорта "Зазерский 85", выращиваемого на почвах, различающихся степенью окультуренности и на фоне различных доз вносимых удобрений в течение 2 лет.

Исследована активность нейтральных и кислых протеаз, а также активность белковых ингибиторов, выделенных из зерна пивоваренного ячменя сорта "Зазерский 85", выращенного на почвах с различной степенью окультуренности и применением разных доз удобрений

Изучено взаимодействие нейтральных протеаз исследуемого , зерна ячменя и трипсина с белковыми ингибиторами, выделенными из этого зерна.

С помощью корреляционного анализа установлено, что определяющим фактором в формировании системы "протеазы-ингибиторы" является степень окультуренности почвы.

Показано влияние агрофона на содержание водорастворимого белка в зерне ячменя. фракционирование водорастворимых белков на колонке с се-фадексом 6-75 исследуемых образцов ячменя выявило, что улучшение степени окультуренности почвы приводит к увеличению их молекулярной массы. Установлено влияние на молекулярную массу водорастворимых белков ячменя степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений.

Установлена зависимость изменения активности кислых и нейтральных протеаз ячменя, а, также белковых ингибиторов протеаз при прорастании зерна от используемого при возделывании агрофона.

Выявлена взаимосвязь между активностью кислых и нейтральных протеаз- солода и степенью окультуренноети почвы и доз вносимых удобрений.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе проведенных экспериментов данные расширяют представление о влиянии степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений на физические свойства, биохимические показатели качества и технологические достоинства пивоваренного ячменя,

Результаты исследований создают предпосылки для получения зерна пивоваренного ячменя с оптимальными технологическими достоинствами.

Результаты работы могут быть использованы в сельском хозяйстве при выращивании пивоваренного ячменя. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на расширенном заседании кафедры биохимии и зерноведения МГАПП (Шс-1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

I. ОЕЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общря характеристика протеолитических ферментов

Протеолитические ферменты по современной классификации относятся к классу гидролаз, в составе -которого образуют особый подкласс пептидгидролаз / а Ф. 3. 4. /. Пептидгидрола-зы катализируют реакции расщепления пептидных связей в белках и пептидах. Многие ферменты этой группы, наряду с реакциями гидролиза пептидных связей, катализируют реакции расщепления эфирных связей, а также реакции переноса аминокислотных остатков на другие акцепторы, так называемые реакции трансэстерификации и транспептидации (Мосолов, 1971; Антонов, 1983).

В соотвествии с классификацией Бергмана протеазы делятся на пептидазы (экзопептидазы), действующие на концах полипептидной цепи и протеиназы (эндопептидазы), действующие на центральных участках. В основу их деления на подклассы положена специфичность и особенности механизма катализа (Ден, 1981).

Экзопептидазы, включающие подподкласеы 3. 4.11. - 3. 4.17, подразделяются на основании положения расщепляемой связи в пептидной цепи. Эндопептидазы разделены на четыре подкласса /3. 4. 21-3. 4. 24/, в первую очередь на .основании особенностей строения их каталитических центров. В подкласс 3. 4. 99 включены протеиназы с неизвестным механизмом каталитического действия. Протеиназы - наиболее изученные и легко поддающиеся кинетическим и структурным исследованиям ферменты. Механизмы каталитического действия некоторых протеиназ изучены достаточно полно, другие исследованы в общих чертах (Фёршт, 1980; Клёсов, Еерезин, 1980, 1984).

СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ (а Ф. 3.4. 21) - наиболее изученная группа ферментов. К ней относятся ферменты животных и челове-ка(трипсин, химотрипсин, зластаза, тромбин, плазмин и другие), некоторых растений и микроорганизмов (субтилизин). Ферменты этой группы обладают, как правило, максимальной активностью при нейтральных значениях рН. В состав их активного центра входит остаток серина.

Для этих ферментов характерно наличие цепи переноса заряда, образованной гидрокеильной группой серина, имидазольным кольцом гистидина и карбоксильной группой аспарагиновой кислоты (Фёршт, 1980; Антонов, 1983).

ТЙОЛОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ (ЕФ.З. 4.22) широко распространены в природе. К ним относятся ферменты папаин, бромелаин, фицин и ряд других эндопептидаз, для которых характерен общий тип специфичности, зависящий от аминокислотного остатка, удаленного на один остаток от атакуемой пептидной связи. Активность тиоловых протеиназ повышается в присутствии восстанавливающих веществ, содержащих НБ- группу (цистеин, глютатион, 2-меркантоэтанол и др.) и подавляется веществами, специфически блокирующими Н5- группы в белках (Мосолов, 1971).

КИСЛЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ (Н. Ф. 3. 4. 23) представлены эндопептида-зами, содержащими в каталитическом центре, по крайней мере, две карбоксильные реакционноспособные группы (Фёршт, 1980). Одна из них специфически блокируется ингибиторами с диазо-ацетильной группой, другая, вероятно, избирательно реагирует с апоксисоединениями. Применение этих типов ингибиторов значительно облегчает идентификацию кислых протеиназ (Антонов, 1983). Наиболее изученными ферментами этого подподкласса, проявляющими свою активность в кислой и слабокислой среде, являются пепсин, ренин, катепеин Д, кислые протеиназы лизосом (Мосолов, 1971; Кретович, 1986).

МЕТАЛЮПРОТЕИНАЗЫ (Н. Ф. 3. 4. 24) имеют некоторое сходство с другими протеиназами по механизму действия. Однако, для ферментов этой группы характерна существенная особенность, заключающаяся в том, что все они содержат ион металла, необходимый для каталитической активности (Степанов, 1973; Фёршт, 1980).

Большинство металлопротеиназ представлено ферментами микробного происхождения. Растительные металлопротеиназы были выделены из маиса (Антонов, 1983), из семян фасоли (Витол, Попов, 1986). Цинкосодержапря протеиназа обнаружена в семенах гречихи (Воскобойникова, Дунаевский, Белозерский и др., 1989).

Протеиназы играют важную роль в физиологических процессах. В случае деградации белковых молекул, они определяют скорость распада белков в организме и участвуют в регуляции их кругооборота. Они также осуществляют удаление "ненормальных" белков иа организма, образующихся в результате мутаций, ошибок биосинтеза (Локшина, 1979; Элпидина, Воскобойкикова и др. ,1990).

Протеолитические ферменты выполняют регуляторную роль в процессе активации зимогенов предшественников (Кретович, 1986; Коэн,1986), контролируют концентрацию биорегуляторов, определяющих характер метаболизма (Шсолов, 1971;; Локшина, 1979), участвуют в расщеплении биологически активных белков с удалением сигнальных аминокислот и пептидов (Ленинджер, 1985).

Успехи в изучении протеолитических ферментов особенно значительны в последние годы. Важным стимулом при изучении протеолитических ферментов является большая их физиологическая роль и широкие перспективы их практического применения в различных технологических процессах ÇГрачева, 1987; Taufei, 1990).