Масс-спектрометрическое определение фосфонилированных модификаций холинэстераз в крови человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Мурашко Екатерина Александровна

• Мурашко Екатерина Александровна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Мурашко Екатерина Александровна

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Общая характеристика холинэстераз

1.2 Измерение активности холинэстераз

1.3 Фосфорорганические соединения

1.4 Определение модификаций белков методами масс-спектрометрии

1.5 Посттрансляционные модификации

1.6 Выделение холинэстераз из биологических объектов

1.7 Применение аддуктов ХЭ с ФОС как биомаркеров отравления

2 Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2 Получение образцов холинэстераз, модифицированных фосфорорганическими соединениями

2.3 Определение степени ингибирования БХЭ методом Эллмана

2.4 Определение степени ингибирования АХЭ методом Эллмана

2.5 Приготовление сорбентов для селективного выделения холинэстераз

2.5.1 Приготовление прокаинамидного геля для аффинного выделения БХЭ

2.5.2 Приготовление иммуномагнитных микросфер с привитыми антителами для выделения ХЭ

2.6 Селективное выделение холинэстераз из крови человека

2.6.1 Выделение БХЭ методом аффинной хроматографии

2.6.1.1 Выделение БХЭ из 1 л плазмы крови человека

2.6.1.2 Выделение БХЭ из 1 мл плазмы крови человека

2.6.2 Выделение ХЭ методом иммунопреципитации

2.6.2.1 Выделение БХЭ методом иммунопреципитации

2.6.2.2 Выделение АХЭ методом иммунопреципитации

2.6.3 Гель-электрофорез

2.6.3.1 Гель-электрофорез в денатурирующих условиях

2.6.3.2 Гель-электрофорез в нативных условиях

2.6.4 Ферментативный гидролиз ХЭ

2.6.4.1 Ферментативный гидролиз с использованием трипсина

2.6.4.2 Ферментативный гидролиз с использованием трипсина в геле

2.6.4.3 Ферментативный гидролиз с использованием пепсина

2.6.5 Металл-аффинная хроматография

2.6.5.1 Металл-аффинная хроматография на сорбенте, содержащем оксид титана(^), с использованием патронов Titansphere Phos-TiO

2.6.5.2 Металл-аффинная хроматография на сорбенте, содержащем оксид титана(^), с использованием патронов микроколонок Supel-Tip Ti

2.6.5.3 Металл-аффинная хроматография на сорбенте, содержащем стеарат лантана(Ш) (FLa)

2.6.6 Хромато-масс-спектрометрический анализ

2.6.6.1 Хромато-масс-спектрометрический анализ гидролизатов белков в режиме AutoMS(2)

2.6.6.2 Хромато-масс-спектрометрический анализ пептического гидролизата БХЭ лошади

2.6.6.3 Оптимизация условий хроматографического разделения модифицированных нонапептидов

2.6.6.4 Определение пределов обнаружения нонапептидов методом ВЭЖХ-МС/МС

2.6.7 МАЛДИ масс-спектрометрический анализ

2.6.7.1 МАЛДИ масс-спектрометрический анализ на масс-спектрометре Axima Performance

2.6.7.2 МАЛДИ масс-спектрометрический анализ на масс-спектрометре UltrafleXtreme

2.6.7.3 Масс-спектрометрический анализ триптических гидролизатов белков

2.6.7.4 Масс-спектрометрический анализ пептических гидролизатов БХЭ

3 Результаты и обсуждение

3.1 Разработка хромато-масс-спектрометрического метода определения аддуктов холинэстераз с фосфорорганическими соединениями

3.2 Идентификация фосфонилированных модификаций холинэстераз человека

3.2.1 Выделение бутирилхолинэстеразы из плазмы крови методом аффинной хроматографии на прокаинамидном геле

3.2.2 Метод иммунопреципитации для выделения холинэстераз

3.2.2.1 Метод иммунопреципитации для выделения бутирилхолинэстеразы

3.2.2.2 Метод иммунопреципитации для выделения ацетилхолинэстеразы из цельной крови

3.2.3 Идентификация фосфонилированных модификаций холинэстераз человека

3.2.3.1 Определение модификаций холинэстераз зоманом

3.2.3.2 Определение модификаций холинэстераз зарином

3.2.3.3 Определение модификаций холинэстераз нервно-паралитическими V-газами

3.2.3.4 Определение модификаций холинэстераз диизопропилфторфосфатом

3.2.4 Металл-аффинная хроматография на сорбенте, содержащем оксид титана(^)

3.2.5 Определение модификаций холинэстераз методом МАЛДИ масс-спектрометрии

3.2.6 Металл-аффинная хроматография на сорбенте, содержащем стеарат лантана(Ш) (FLa)

3.2.7 Обзорный анализ модификаций холинэстераз с помощью масс-спектрометрии

3.2.8 Хромато-масс-спектрометрическое определение аддуктов БХЭ с ФОС как биомаркеров отравления ФОС при выполнении сличительных профессиональных тестов ОЗХО

3.3 Определение степени ингибирования ХЭ методом ВЭЖХ-МС/МС

3.3.1 Измерение степени ингибирования БХЭ в плазме крови здоровых

доноров

Заключение

Список сокращений

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Масс-спектрометрическое определение фосфонилированных модификаций холинэстераз в крови человека»

Введение

Актуальность темы. Фосфорорганические соединения (ФОС) - наиболее распространенный класс пестицидов различного назначения (инсектицидов, гербицидов, фунгицидов, акарицидов, дефолиантов), широко применяемых в сельском хозяйстве. В промышленности ФОС используются в качестве смазок и пластификаторов. ФОС имеют применение в медицине и быту. Решающим фактором, определяющим неугасающий интерес к изучению ФОС, является их способность ингибировать холинэстеразы. Наиболее токсичные представители ФОС разрабатывались многими странами в ХХ веке в военных целях - группа фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ): О-газы (табун, зарин, зоман, циклозарин) и У-газы (УХ, СУХ, УЯ).

«Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении» (далее Конвенция), предложенная в 1993 г, в настоящее время ратифицирована 192 странами мира [1]. Международная Организация по запрещению химического оружия (ОЗХО) осуществляет контроль за соблюдением Конвенции. Уничтожение химического оружия проводилось в течение нескольких десятилетий в ряде стран и все еще продолжается в США. Угроза применения ФОВ остается актуальной из-за возможности применения ФОВ в военных конфликтах и террористических атаках.

По оценкам Всемирной организации здравоохранения ежегодно в мире более 3 миллионов человек подвергаются воздействию фосфорорганических веществ, что приводит к смерти около 300 000 человек. Актуальной является проблема выявления воздействия малых доз (концентраций) отравляющих веществ, не имеющих характерных клинических проявлений. В настоящее время разработка надежных методов диагностики отравлений ФОС является необходимой в поддержке верификационных процедур ОЗХО и при осуществлении судебно-химических экспертиз.

Идентификация посттрансляционных модификаций белков ксенобиотиками -различными токсичными веществами и лекарственными препаратами, необходима для установления механизма их действия на организм человека. Результатом воздействия ксенобиотиков могут быть модификации внутриклеточных белков, контролирующих ключевые функции клетки.

Фосфонилирование - неприродная модификация белков, являющаяся результатом взаимодействия с фосфорорганическими соединениями, представляющими собой эфиры

фосфорной или метилфосфоновой кислот. Главными мишенями воздействия ФОС являются ацетилхолинэстераза (АХЭ) и бутирилхолинэстераза (БХЭ). Определение фосфонилированных модификаций холинэстераз имеет важное диагностическое значение при установлении причины снижения активности ферментов, которое может быть связано как с отравлениями ФОС, так и с целым рядом заболеваний, например, с хроническими заболеваниями печени и болезнью Альцгеймера.

Степень разработанности темы. За последние десятилетия накоплен огромный опыт идентификации и количественного определения как самих фосфорорганических отравляющих веществ в биопробах, так и их низкомолекулярных метаболитов и аддуктов с высокомолекулярными соединениями, что позволяет достоверно устанавливать факт отравления и контакта с ФОВ в течение нескольких недель и месяцев. Однако, по литературным данным практически все методики определения аддуктов ФОВ с ХЭ основаны на целевой масс-спектрометрической детекции пептического нонапептида активного центра холинэстераз. На данный момент в научной литературе отсутствует процедура обзорного анализа аддуктов холинэстераз с фосфорорганическими соединениями.

Цели и задачи. Цель работы - селективное выделение ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы с помощью различных методов аффинной хроматографии из биопроб для масс-спектрометрического определения аддуктов фосфорорганических соединений с холинэстеразами.

Задачи исследования:

1. Синтез аффинных сорбентов, специфичных к холинэстеразам, на основе моноклональных антител и прокаинамида и их использование при разработке методик специфичного выделения ферментов из биопроб.

2. Разработка методик выделения аддуктов фосфорорганических соединений с холинэстеразами с помощью металл-аффинной хроматографии (МАХ).

3. Разработка методик определения фосфонилированных модификаций холинэстераз методами МАЛДИ-МС/МС и ВЭЖХ-МС/МС.

4. Разработка подхода к определению степени ингибирования холинэстераз с использованием масс-спектрометрии.

Научная новизна. Впервые получен и охарактеризован сорбент для селективного выделения холинэстераз из крови человека на основе магнитных микросфер с

эпоксиактивированными поверхностями, подобраны антитела для иммунопреципитации АХЭ и БХЭ.

Впервые был предложен метод металл-аффинной хроматографии для концентрирования пептидов активного центра холинэстераз, модифицированных фосфорорганическими соединениями.

Впервые предложена методика обзорного химического анализа фосфонилированных модификаций холинэстераз методом МАЛДИ-МС/МС.

Впервые предложена методика определения степени ингибирования холинэстераз по соотношению площадей хроматографических пиков модифицированных пептидов, что позволяет оценить степень ингибирования фермента в отсутствие информации о фоновом уровне активности холинэстеразы.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе результатов работы подготовлены и утверждены методические рекомендации «Методы по обогащению фосфонилированных аддуктов белков крови» МР ФМБА России 4.1.332014; «Определение фосфонилированных модификаций холинэстераз» МР ФМБА России 12.05-2016; «Подтверждение факта воздействия фосфорорганических отравляющих веществ по результатам анализа биопроб» МР ФМБА России 12.038-2016. Разработанные стандартные процедуры могут быть использованы в научно-исследовательских учреждениях, организациях и центрах профпатологии ФМБА России при проведении медицинских и судебно-медицинских мероприятий по выявлению факта воздействия ФОВ на организм человека. Разработанные методики были успешно применены в рамках выполнения квалификационных тестов ОЗХО в 2017-2020 гг.

Работа отмечена Премией губернатора Ленинградской области за лучшую научно-исследовательскую работу в 2019 г.

Методология и методы исследования. В работе для определения фосфонилированных модификаций холинэстераз в крови человека и сопутствующих процедур были использованы современные методы хроматографии, масс-спектрометрии, адекватные поставленным целям и сформулированным задачам. Для селективного выделения белков из плазмы крови применяли методы иммунопреципитации и аффинной хроматографии; аддукты фосфорорганических соединений с холинэстеразами селективно выделяли методом металл-аффинной хроматографии. Для анализа гидролизатов белков и

определения фосфонилированных модификаций использовали хромато-масс-спектрометрию методами МАЛДИ-МС/МС и ВЭЖХ-МС/МС.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аффинная хроматография на прокаинамидном геле и иммуноаффинных магнитных сорбентах позволяет выделять холинэстеразы из биопроб в количестве, достаточном для идентификации фосфонилированных модификаций холинэстераз методом ВЭЖХ-МС/МС в целевом химическом анализе. Предложены методики синтеза сорбентов и выделения холинэстераз.

2. Соотношение площадей хроматографических пиков модифицированных и нативных пептических пептидов активного центра холинэстераз позволяет определить степень ингибирования БХЭ методом ВЭЖХ-МС/МС в отсутствие информации о фоновом уровне активности фермента.

3. Металл-аффинная хроматография на сорбентах, содержащих Т1(1У) и Ьа(Ш), позволяет концентрировать пептиды активного центра холинэстераз, модифицированные ФОВ. Комбинация иммуноаффинного выделения холинэстераз из биопроб с дальнейшей металл-аффинной хроматографией и определением аддуктов ФОВ с холинэстеразами методом МАЛДИ-МС/МС обеспечивает идентификацию ФОВ в биопробах в обзорном анализе.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных в работе результатов определяется проведением комплексных исследований с использованием современных физико-химических методов анализа, использованием стандартизованных методик, воспроизводимостью экспериментальных данных и соответствием результатов современному уровню знаний в исследуемой области науки. Соискатель имеет 17 опубликованных печатных работ, в том числе 6 статей в научных рецензируемых журналах, 1 обзорную статью, 7 тезисов научно-практических конференций, 3 утвержденных методических рекомендации.

Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: 11 Международной конференции по холинэстеразам (Казань, 2012); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); 38 Конгрессе ФЕБС (FEBS) (Санкт-Петербург, 2013); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические аспекты химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2013); 12 Международной

конференции по холинэстеразам (Аликанте, Испания, 2015); III Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические аспекты химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2018); 13 Международной конференции по холинэстеразам (Градец-Кралове, Чехия, 2018).

1 Обзор литературы 1.1 Общая характеристика холинэстераз

Холинэстеразы - семейство ферментов, которые относятся к классу сериновых гидролаз, одному из самых многочисленных и разнообразных классов ферментов эукариот и прокариот. Характерной особенностью сериновых гидролаз является наличие серинового нуклеофила в активном центре. Одним из признаков принадлежности ферментов к семейству холинэстераз считается их ингибирование алкалоидом эзерином в концентрации 10-5-10-8 М.

К холинэстеразам относятся ацетилхолинэстераза (АХЭ, КФ 3.1.1.7), бутирилхолинэстераза (БХЭ, КФ 3.1.1.8) и карбоксилэстераза (КЭ, КФ 3.1.1.1). Данные ферменты принадлежат к типу а/р гидролаз, третичная структура представлена а-спиралью, связанной с Р-слоем, который содержит каталитический домен с 8ег/И18/01и триадой, в отличие от более распространенной для сериновых протеаз комбинации 8ег/И18/Л8р. Серин и гистидин принимают участие в реакции гидролиза в качестве нуклеофильной атакующей группы и элемента кислотно-основного катализа соответственно. Холинэстеразы катализируют гидролиз ацетилхолина до холина и уксусной кислоты, что является важнейшим процессом, необходимым для жизнедеятельности холинэргических нейронов.

Ацетилхолинэстераза

Ацетилхолинэстераза получила свое название от природного субстрата ацетилхолина. Ее также называют ацетилхолин-ацетилгидролаза или истинная холиэстераза. Открытие и изучение ацетилхолина в начале ХХ в. связано с именами О. Лёви и Г. Дейля, которые в 1936г были удостоены Нобелевской премии по медицине за открытия, связанные с химической передачей нервных импульсов. Существование холинэстеразы впервые было показано Лёви и Навратилом в 1926 г. [2, [3]. Ацетилхолин присутствует в центральной и периферической нервных системах. Выделяют два основных типа рецепторов ацетилхолина: мускариновые и никотиновые. Также рецепторы ацетилхолина были найдены в эндотелиальных клетках и клетках иммунной системы [4].

Ацетилхолинэстераза присутствует в сыворотке и плазме крови, эритроцитах, головном мозге, скелетных мышцах, сердце, легких, кишечнике, селезенке и плаценте. Фермент локализован в межнейрональных синапсах, концевых двигательных пластинах скелетных мышц, ганглиях вегетативной нервной системы и мембранах эритроцитов [5].

Аминокислотная последовательность и ген, кодирующий белок, были установлены Сорек с соавт. [6]. АХЭ человека имеет консервативную часть, состоящую из 534 аминокислотных остатков, и вариабельную часть, расположенную ближе к С-концу, длиной 14, 26 и 40 аминокислотных остатков [7]. АХЭ может существовать в 4 различных изоформах: АХЭт (синаптическая изоформа), АХЭн (эритроцитная изоформа), АХЭя (геа&кго^И) и АХЭ4. Мономер АХЭ имеет молекулярный вес 69 кДа.

Структура молекулы АХЭ - предмет многолетних исследований, которые продолжаются и по сей день [8, 9]. Установление точной трехмерной структуры белка важно для разработки и исследования новых лекарственных препаратов, разработке таргетных инсектицидов и антидотов, применяемых при отравлении пестицидами и нервно-паралитическими агентами. В настоящее время большинство авторов используют методы компьютерного моделирования (молекулярного докинга) [10, 11].

Активный центр (эстеразный сайт), содержащий каталитическую триаду 8ег-203, №8-447, О1и-334, расположен на дне узкого ущелья глубиной около 20 А, которое выстлано 14 ароматическими аминокислотами. На входе в канал расположен периферический анионный сайт (ПАС), который отвечает за первичное связывание лигандов и попадание субстрата внутрь канала. ПАС имеет ароматический кластер Тгр-286, Туг-124, РИе-338; фенольные группы Туг-341, Туг-124 и Туг-337 образуют так называемое «бутылочное горлышко» канала с динамически меняющимся просветом, которое перекрывает канал и контролирует движение субстратов и ингибиторов к эстеразному сайту.

Основной физиологической функцией АХЭ является контроль концентрации нейромедиатора ацетилхолина (АХ) при передаче нервно-мышечного импульса. При ингибировании АХЭ передача нервных импульсов нарушается, так как освобождение рецепторов от ацетилхолина происходит очень медленно (только посредством диффузии). Это вызывает серьезные расстройства, такие как головные боли, головокружение, слюноотделение, слезотечение, диарея, тремор, брадикардия, судороги, кома и даже смерть [12, 13].

В настоящее время известны функции АХЭ, не связанные с холинэргической передачей [14]. АХЭ участвует в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и адгезии, а также АХЭ играет роль в механизмах апоптоза [15, 16, 17, 18, 19]. В работе Инестроза и соавт. показана роль АХЭ в ассоциации Ар пептида в амилоидные фибриллы [20].

Кроме нервной и мышечной тканей, АХЭ также обнаружена на эритроцитах, они экспрессируют фермент на внешней поверхности мембраны. Особое внимание привлекает вопрос о функциональной значимости АХЭ мембран эритроцитов.

В эритроцитах млекопитающих АХЭ представлена димерами, связанными с внешней поверхностью мембраны фосфатидилинозитолом (ОР1 якорь) [2]. Известно, что ацетилхолин способствует мобилизации оксида азота (N0) в эритроците, образованию в эритроците метаболитов N0, связанных с гемоглобином, а также принимает участие в переносе кислорода эритроцитом. Комплекс АХЭ-АХ может опосредованно влиять на процессы метаболизма N0 и оксигенации эритроцита [21].

Бутирилхолинэстераза

Бутирилхолинэстераза известна с 1940-х годов [ 22 ]. В ранних работах было установлено, что существует два вида холинэстераз, и что только ацетилхолинэстераза играет важную роль в передаче нервных импульсов [ 23 , 24 ]. Хотя БХЭ широко представлена в теле человека, ее физиологические функции долгое время были не ясны. Также было обнаружено, что у некоторых людей нет активной БХЭ, и что несмотря на полное отсутствие БХЭ, они здоровы [25,26]. Эта информация привела к мысли о том, что БХЭ не имеет физиологической функции, и поэтому не заслуживает изучения. Переломный момент в изучении БХЭ наступает в 1990е годы. Было показано, что БХЭ может эффективно связывать токсичные нервно-паралитические агенты, выступать в качестве терапевтического препарата при отравлении [ 27 ]. В настоящее время БХЭ в центре внимания ученых, работы которых посвящены использованию аддуктов БХЭ как биомаркеров отравления; применению БХЭ в терапевтических целях при отравлениях ФОВ и лечении кокаиновой зависимости; роли БХЭ в развитии и лечении нейродегенеративных заболеваний [11,28,29].

Название «бутирилхолинэстераза» было принято в 1989 г. Комитетом по номенклатуре генов человека. В литературе встречаются названия сывороточная

холинэстераза, плазматическая холинэстераза, неспецифическая холинэстераза, псевдохолинэстераза, бутирилхолинэстераза и ацилхолин-ацилгидролаза.

Бутирилхолинэстераза присутствует в сыворотке и плазме крови, а также практически во всех тканях организма - печени, кишечнике, поджелудочной железе, плаценте, сердце, в центральной и периферической нервной системе и т.д [29]. БХЭ синтезируется в печени и имеет период полужизни в плазме крови 11 дней. Содержание бутирилхолинэстеразы в плазме крови человека около 4 мкг/мл, а общее содержание в организме человека в среднем в 10 раз больше, чем АХЭ.

Аминокислотная последовательность БХЭ человека состоит из 602 аминокислот, включает 28 остатков, принадлежащих сигнальному пептиду, и 574 остатка в зрелом секретируемом белке, к которым присоединены остатки сиаловых кислот и углеводов. Масса мономера составляет около 85 кДа. Холинэстераза в организме присутствует в нескольких молекулярных формах. В основном БХЭ находится в форме тетрамеров, однако встречаются димеры и мономеры. Кристаллографическая структура мономера была получена Николе с соавт. в 2003 [ 30 ], 3Б структура тетрамера установлена российскими учеными в 2018 г [31].

Тетрамер БХЭ имеет массу 340 кДа, состоит из 4х одинаковых субъединиц, организованных как димер димеров. Каждый димер состоит из мономеров, связанных дисульфидными связями. Тетрамер стабилизирован полипролиновым пептидом (3 кДа), который расположен в центре тетрамера [29, 31].

Аминокислотные последовательности АХЭ и БХЭ гомологичны на 53%, однако ферменты различаются по субстратной специфичности и сродству к различным ингибиторам в силу различия в строении каналов, ведущих к активным центрам ферментов. Активный центр БХЭ более объемный, чем у АХЭ, так как 6 из 14 ароматических аминокислот заменены алифатическими. Активный центр представлен триадой Ser-198, №8-438, 01и-197. Для периферического анионного сайта БХЭ характерно отсутствие ароматического кластера, границей ПАС считают аминокислотные остатки А8р-70 и Туг-332, которые играют важную роль в связывании и транспортировке субстратов и ингибиторов к активному сайту [11, 32].

Бутирилхолинэстераза не имеет собственного природного субстрата. Однако, если АХЭ способна гидролизовать только небольшие молекулы, такие как ацетилхолин и ацетилтиохолин, в качестве субстратов для БХЭ могут выступать почти любые

холиновые эфиры, такие как бутирилхолин, бутирилтиохолин и сукцинилхолин [33, 34], а также производные индола и др. [35].

В настоящее время выделяют защитную функцию БХЭ. БХЭ используют в качестве протектора при отравлениях ФОВ, при лечении кокаиновой зависимости. Ведутся активные исследования по терапевтическому применению БХЭ [29], создаются варианты БХЭ [36, 37], способные дольше сохраняться в организме, разрабатываются методы доставки [38, 39]. БХЭ выполняет функцию детоксикации для целого ряда экзогенных соединений: нервно-паралитические агенты, пестициды, кокаин [40], героин [ 41 ], прокаин [ 42 ], физостигмин, аспирин, анатоксин [29]. Отсутствие явной физиологической функции БХЭ является преимуществом, поскольку избыток БХЭ не влияет на какой-либо физиологический процесс. Животные безопасно переносят дозы БХЭ, которые превышают эндогенные уровни в тысячу раз [43, 44].

БХЭ может выполнять функцию АХЭ при нейропередаче, так как БХЭ способна гидролизовать ацетилхолин [45]. Это было показано в экспериментах на нокаутных по АХЭ мышах [46]. В настоящее время активно исследуется роль БХЭ при прогрессирующей болезни Альцгеймера [47, 48].

Одной из основных физиологических функций БХЭ считают гидролиз гормона голода октаноил-грелина до неактивных продуктов, таким образом, фермент играет роль в регуляции аппетита [49].

Интерес к исследованию БХЭ также связан с ее функцией как биомаркера отравления фосфорорганическими соединениями [28, 50].

1.2 Измерение активности холинэстераз

Уровень активности холинэстераз - важный параметр при оценке состояния здоровья человека. Снижение или увеличение активности ХЭ связано со многими заболеваниями: хронические заболевания печени (цирроз, гепатит, холецистит), злокачественные новообразования; инфаркт миокарда; нейродегенеративные заболевания, бронхиальная астма, ожирение, алкоголизм и др. Ксенобиотики, такие как лекарственные препараты и фосфорорганические соединения, также являются причиной угнетения активности фермента. Снижение активности ХЭ наблюдается при использовании ингибиторов ХЭ для лечения глаукомы, болезни Альцгеймера;

глюкокортикоидов при противовоспалительной терапии или в качестве иммуносупрессоров [5].

Следует отметить, что единичный анализ ХЭ имеет ограниченную диагностическую значимость, так как интервал нормальных значений активности БХЭ в сыворотке составляет от 59,96 до 98,36 мкмоль/с-л [51]. Большее значение имеют данные об изменении активности фермента, полученные при систематическом обследовании пациента в течение определенного периода времени - лабораторный мониторинг. Так, например, монотонное снижение активности ХЭ у больных с заболеваниями печени указывает на прогрессирование печеночной недостаточности, а увеличение активности -на эффективность лечения.

Измерение активности холинэстераз применяют для изучения ингибиторов холинэстераз как фармакологических агентов. При создании новых лекарственных препаратов для лечения болезни Альцгеймера создают «эстеразные профили» — набор кинетических констант, описывающих ингибиторную активность соединения в отношении сериновых эстераз различной функциональной значимости [11].

Мониторинг активности холинэстраз необходимо проводить у контингента лиц, связанных с производством или использованием ингибиторов ХЭ, в том числе на объектах по уничтожению химического оружия.

Холинэстеразы широко представлены в организме человека. Однако цельная кровь и тем более плазма крови являются наиболее удобным биоматериалом для проведения анализов в клинической лабораторной диагностике, а также при проведении химико-токсикологической экспертизы. Установлено, что кинетические параметры холинэстеразы эритроцитов схожи с параметрами для АХЭ мозга и мыщц [ 52 ]. Следовательно, анализ активности АХЭ в крови является адекватной моделью для исследования ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями.

Активность холинэстераз измеряют с ипользованием потенциометрических, титрометрических, колориметрических, флюориметрических и других методов, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения применения [53].

Потенциометрический (электрометрический) метод Мичела [54] для определения активности ацетилхолинэстеразы состоит в измерении снижения рН реакционной смеси за счет выделения уксусной кислоты, образующейся в результате гидролиза субстрата ацетилхолина ферментом. Недостатками метода являются достаточно низкая

чувствительность, длительные периоды инкубации, большой объем образца. Современные модификации метода позволяют применять данный метод для анализа активности АХЭ в образцах крови человека и животных при отравлении пестицидами [55, 56, 57 ]. Модификацией потенциометрического метода определения активности АХЭ является титрометрический метод [58]

Колориметрические методы являются наиболее простыми, воспроизводимыми и имеют широкое применение, к ним относится метод Хестрина и метод Эллмана.

Метод Хестрина был предложен для измерения активности АХЭ еще в 1949г. [59]. В настоящее время метод применяют для скрининга остаточного содержания ФОВ при проведении работ по уничтожению химического оружия, а также перепрофилированию заводов по уничтожению химического оружия. В работе Прокофьевой и соавт. описаны методики определения содержания фосфорорганических соединений с помощью микропланшетного варианта спектрофотометрического анализа, основанного на методе Эллмана и методе Хестрина. Главной отличительной чертой метода Хестрина является то, что отклик зависит от концентрации субстрата (ацетилхолина). В качестве хромогена выступает смесь гидроксиламина с хлоридом железа(Ш), поглощение регистрируют при 540 нм. В работе использовали коммерческую АХЭ эритроцитов человека. Пределы обнаружения ФОВ с помощью биохимических методов очень низкие. Предел обнаружения методом Эллмана составляет для 55 пмоль/л зомана и 19 пмоль/л для УЯ; методом Хестрина -165 пмоль/л зомана и 38 пмоль/л для УЯ [60, 61]. Главным недостатком метода является невозможность измерения скорости убыли субстрата [53].

Наиболее часто применяемым методом измерения активности холинэстераз является колориметрический метод Эллмана. Он был предложен Дж. Эллманом для прямого измерения активности АХЭ в крови в 1960 г. [62]. Суть метода состоит в том, что фермент гидролизует субстрат ацетилтиохолин (АТХ) до тиохолина и уксусной кислоты. Тиохолин затем реагирует с хромогеном - 5,5'-дитиобис-(2-нитро-бензойная кислота), с образованием окрашенной в желтый цвет 2-нитро-5-тиобензойной кислоты (ТНБ). Продукт реакции обладает сильным поглощением при 412 нм. Молярный коэффициент экстинкции составляет 13700 М-1 см-1. Скорость образования ТНБ пропорциональна активности АХЭ. Однако, высокое значение молярного коэффициента экстинкции позволяет проводить измерения только для сильно разбавленных образцов. Использование более концентрированных образцов невозможно также в силу другой

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мурашко Екатерина Александровна, 2021 год

Список литературы

1 Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении [Электронный ресурс] - Режим доступа: https://www. opcw. org/sites/default/files/documents/CWC/CWC_ru.pdf

2 Legay, C. Why So Many Forms of Acetylcholinesterase? / C. Legay // Microscopy research and technique. - 2000. - V. 49. - P. 56-72.

3 Nachmansohn, D. On the physiological significance of choline esterase / D. Nachmansohn //Yale Journal of Biology and Medicine. - 1940. - V. 12. - N.5 - P. 565-589.

4 Wessler, I. Acetylcholine beyond neurons: the non-neuronal cholinergic system in humans / I. Wessler, C.J. Kirkpatrick // British Journal of Pharmacology. - 2008. - V. 154. - P. 1558-1571.

5 Старостина, В.К. Холинэстераза: методы анализа и диагностическое значение. Информационно-методическое пособие / В.К. Старостина, С.А. Дёгтева - Новосибирск, 2008. - 36 C.

6 Soreq, H. Molecular cloning and construction of the coding region for human acetylcholinesterase reveals a G+C-rich attenuating structure / H. Soreq, R. Ben-Aziz, C.A. Prody, S. Seidman, A. Gnatt, L. Neville, J. Lieman-Hurwitz, E. Lev-Lehman, D. Ginzberg, Y. Lapidot-Lifson, H. Zakut // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Neurobiology. - 1990. - V. 87. - P. 9688-9692.

7 Meshorer, E. Virtues and woes of AChE alternative splicing in stress-related neuropathologies / E. Meshorer, H. Soreq // Trends in Neurosciences. - 2006. - Vol. 29. - P. 216-224.

8 Cygler, M. Relationship between sequence conservation and three-dimensional structure in a large family of esterases, lipases, and related proteins / M. Cygler, J.D. Schrag, J.L. Sussman, M. Harel, I. Silman, M.K. Gentry, B.P. Doctor // Protein Science. - 1993. - V. 2. - P. 366-382.

9 Cheung, J. Structures of Human Acetylcholinesterase Bound to Dihydrotanshinone I and Territrem B Show Peripheral Site Flexibility / J. Cheung, E.N. Gary, K. Shiomi, T.L. Rosenberry // ACS Medicinal Chemistry Letters. - 2013. - V. 4. - N. 11. - P. 1091-1096.

10 Cheung, J. Structures of Human Acetylcholinesterase in Complex with Pharmacologically Important Ligands / J. Cheung, J. M. Rudolph, F. Burshteyn, M. S. Cassidy, E. N. Gary, J. Love, M. C. Franklin, J. J. Height. // Journal of Medical Chemistry. - 2012. - V. 55 - P.10282-10286.

11 Махаева, Г. Ф. Ингибиторы холинэстераз и карбоксилэстераз как фармакологические агенты / Г. Ф. Махаева, Е. В. Рудакова, Н. В. Ковалева, С. В. Лущекина, Н. П. Болтнева, А. Н. Прошин, Е. В. Щегольков, Я. В. Бургарт, В. И. Салоутин. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2019 - N. 5. - C. 967-984.

12 Costa, L.G. Current issues in organophosphate toxicology / L.G. Costa // Clinica Chimica Acta. - 2006. - V. 366. - P. 1-13.

13 Jokanovic, M., Kosanovic M., Brkic D., Vukomanovic P. Organophosphate induced delayed polyneuropathy in man: an overview / M. Jokanovic, M. Kosanovic, D. Brkic, P. Vukomanovic // Clinical Neurology and Neurosurgery. - 2011. - V.113. - P. 7-10.

14 Silman, I. Acetylcholinesterase: 'classical' and 'non-classical'functions and pharmacology / I. Silman, J. L Sussman // Current Opinion in Pharmacology. - 2005. - V. 5. -P. 293-302.

15 Grisaru, D. A peptide derived from the stress-associated acetylcholinesterase variant, has hematopoietic growth promoting activities / D. Grisaru // Molecular Medicine. - 2001. -V.7. - P. 93-105.

16 Jiang, H. Acetylcholinesterase and apoptosis. A novel perspective for an old enzyme. / H. Jiang, X.J. Zhang // FEBS. - 2008. - V. 275. - № 4. - Р. 612-617.

17 Xi H.-J. Role of acetylcholinesterase in lung cancer // Thoracic Cancer. - 2015. - V. 6. - P. 390-398.

18 Botti, S.A. Electrotactins: a class of adhesion proteins with conserved electrostatic and structural motifs / S.A. Botti // Protein Engineering. - 1998. - V. 11. - P. 415-420.

19 Scholl, F.G. Making connections: cholinesterase-domain proteins in the CNS / F.G. Scholl, P. Scheiffele // Trends Neurosciense. - 2003. - V. 26. - P. 618-624.

20 Inestrosa, N.C. Acetylcholinesterase accelerates assembly of amyloid-beta-peptides into Alzheimer's fibrils: possible role of the peripheral site of the enzyme / N.C. Inestrosa, A.

Alvarez, C.A. Perez, R.D. Moreno, M. Vicente, C. Linker, O.I. Casanueva, C. Soto, J. Garrido // Neuron. - 1996. - V.16. - P. 881-891.

21 Carvalho F.A. Modulation of erythrocyte acetylcholinesterase activity and its association with G protein-band 3 interactions / F.A. Carvalho // Journal of membrane biology. -2009. - V. 228. - P. 89-97.

22 Alles, G.A. Cholinesterases in the blood of man / G.A. Alles, R.C. Hawes // Journal of Biological Chemistry. - 1940. - V.133. - P. 375-390.

23 Hawkins, R.D., Gunter, J.M. Studies on cholinesterase. The selective inhibition of pseudo-cholinesterase in vivo / R.D. Hawkins, J.M. Gunter // Biochemical Journal. -1946. -V.40. - P. 192-197.

24 Mendel, B. Studies on cholinesterase I. Cholinesterase and pseudocholinesterase / B. Mendel, H. Rudney // Biochemical Journal. - 1943. - V. 37. - P. 59-63.

25 Liddell, J. A 'silent' pseudo-cholinesterase gene / J. Liddell, H. Lehmann, E. Silk, // Nature. - 1962. - V. 193. - P.561-562.

26 Manoharan, I. A medial health report on individuals with silent butyrylcholinesterase in Vysya community of India / I. Manoharan, R. Boopathy, S. Darvesh, O. Lockridge // Clinica Chimica Acta. - 2007. - V. 378. - P. 128-35.

27 Broomfield, C.A. Protection by butyrylcholinesterase against organophosphorus poisoning in nonhuman primates / C.A. Broomfield, D.M. Maxwell, R.P. Solana, C.A. Castro, A.V. Finger, D.E. Lenz // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - V. 259. -P. 633-638.

28 Marsillach, J. Protein adducts as biomarkers of exposure to organophosphorus compounds / J. Marsillach, L. G. Costa, C.E. Furlong // Toxicology. 2013. - V. 307. - P. 46-54.

29 Lockridge, O. Review of human butyrylcholinesterase structure, function, genetic variants, history of use in the clinic, and potential therapeutic uses / O. Lockridge // Pharmacology & Therapeutics. - 2015. - V.148. - P. 34-46.

30 Nicolet, Y. Crystal structure of human butyrylcholinesterase and of its complexes with substrate and products / Y. Nicolet, O. Lockridge, P. Masson, J.C. Fontecilla-Camps, F. Nachon // Journal of Biological Chemistry. - 2003. - V.278. - P. 41141-41147.

31 Boyko, K. M. 3D structure of the natural tetrameric form of human butyrylcholinesterase as revealed by cryoEM, SAXS and MD / K. M. Boyko, T. N. Baymukhametov, Y. M. Chesnokov, M. Hons, S.V. Lushchekina, P.V. Konarev, A. V. Lipkin, A. L. Vasiliev, P. Masson, V.O. Popov, M. V. Kovalchuk // Biochimie. - 2019. - V. 156. - P. 196-205.

32 Masson, P. Role of Aspartate 70 and Tryptophan 82 in binding of succinyldithiocholine to human butyrylcholinesterase / P. Masson, P. Legrand, C.F. Bartels, M. T. Froment, L. M. Schopfer, O. Lockridge // Biochemistry. - 1997. - V.36. - P. 2266-2277.

33 Grigoryan, H. Mechanism of hydrolysis of dicholine esters with long polymethylene chain by human butyrylcholinesterase / H. Grigoryan, G. Halebyan, B. Lefebvre, B. Brasme, P. Masson // Biochimica et Biophysica Acta. - 2008. - N. 1784. - P. 1818-1824.

34 Zelinski, T. Molecular basis of succinylcholine sensitivity in a prairie Hutterite kindred and genetic characterization of the region containing the BCHE gene / T. Zelinski, G. Coghlan, J. Mauthe, B. Triggs-Raine // Molecular Genetics and Metabolism. - 2007. - V. 90. -P. 210-216.

35 Rozengart, E.V. Indophenol chromogenic substrates of cholinesterases of different origin / E.V. Rozengart, N.E. Basova, A.A. Suvorov, A.E. Khovanskikh // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. - 2002. - N. 38. - P. 16-23.

36 Ilyushin, D.G. Chemical polysialylation of human recombinant butyrylcholinesterase delivers a long-acting bioscavenger for nerve agents in vivo / D.G. Ilyushin, I.V. Smirnov, A.A. Belogurov, I.A. Dyachenko, T. Zharmukhamedova, T.I. Novozhilova, E.A. Bychikhin, M.V. Serebryakova, O.N. Kharybin, A.N. Murashev, K.A. Anikienko, E.N. Nikolaev, N.A. Ponomarenko, D.D. Genkin, G.M. Blackburn, P. Masson, A.G. Gabibov // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. - 2013. - V. 110. - P. 1243-1248.

37 Lushchekina, S. Catalytic bioscavengers against organophosphorus agents: mechanistic issues of self-reactivating cholinesterases / S. Lushchekina, P. Masson // Toxicology. - 2018. - V.409. - P. 91-102.

38 Gaydess, A. Visualization of exogenous delivery of nanoformulated butyrylcholinesterase to the central nervous system / A. Gaydess, E.G. Duysen, Y. Li, V.

Gilman, A. Kabanov, O. Lockridge, T. Bronich // Chemico-Biological Interactions. - 2010. -V.187. - P. 295-308.

39 Parikh, K. Gene-delivered butyrylcholinesterase is prophylactic against the toxicity of chemical warfare nerve agents and organophosphorus compounds / K. Parikh, E.G. Duysen, B. Snow, N.S. Jensen, V. Manne, O. Lockridge, N. Chilukuri // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 2011. - V. 337. - P. 92-101.

40 Duysen, E.G. Increased hepatotoxicity and cardiac fibrosis in cocaine-treated butyrylcholinesterase knockout mice / E.G. Duysen, B. Li, M. Carlson, Y.F. Li, S. Wieseler, S.H. Hinrichs, O. Lockridge // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. - 2008. - V. 103. -P. 514-521.

41 Barricklow, J. 2-Arachidonoylglycerol is a substrate for butyrylcholinesterase: a potential mechanism for extracellular endocannabinoid regulation / J. Barricklow, M. Blatnik, // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2013. - V. 536. - P. 1-5.

42 Yuan, J. Characterization of procaine metabolism as probe for the butyrylcholinesterase enzyme investigation by simultaneous determination of procaine and its metabolite using capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection / J. Yuan, J. Yin, E. Wang // Journal of Chromatography A. - 2007. - V. 1154. - P. 368-372.

43 Saxena, A. Pretreatment with human serum butyrylcholinesterase alone prevents cardiac abnormalities, seizures, and death in ottingen minipigs exposed to sarin vapor / A. Saxena, W. Sun, P.A. Dabisch, S.W. Hulet, N.B. Hastings, E.M. Jakubowski, R.J. Mioduszewski, B.P. Doctor // Biochemical Pharmacology. - 2011. - V.82. - P. 1984-1993.

44 Murthy, V. Physiologic and metabolic safety of butyrylcholinesterase gene therapy in mice / V. Murthy, Y. Gao, L. Geng, N.K. LeBrasseur, T.A. White, R.J. Parks, S. Brimijoin // Vaccine. - 2014. - V. 32. - P. 4155-4162.

45 Johnson, G. Why has butyrylcholinesterase been retained? Structural and functional diversification in a duplicated gene/ G. Johnson, S.W. Moore // Neurochemistry International. -2012. - V.61. - P. 783-797.

46 Lockridge O. Butyrylcholinesterase: overview, structure, and function (In Anticholinesterase Pesticides: Metabolism, Neurotoxicity, and Epidemiology / O. Lockridge,

E.G. Duysen, P. Masson; T. Satoh, R.C. Gupta (Eds.) - Singapore: John Wiley &Sons, Inc., 2011. - P. 25-41.

47 Ballard, C. Cholinesterases: roles in the brain during health and disease / C. Ballard, N. Greig, A. Guillozet-Bongaarts, A. Enz, S. Darvesh // Current Alzheimer Research. - 2005. -V.2. - N.3. - P. 307-318.

48 Makhaeva, G.F. Conjugates of tacrine and 1,2,4-thiadiazole derivatives as new potential multifunctional agents for Alzheimer's disease treatment: Synthesis, quantum-chemical characterization, molecular docking, and biological evaluation / G.F. Makhaeva, N.V. Kovaleva, N.P. Boltneva, S. V. Lushchekina, E. V. Rudakova, T.S. Stupina, A.A. Terentiev, I. V. Serkova, A. N. Proshin, E. V. Radchenko, V.A. Palyulin, S.O. Bachurin, R.J. Richardson // Bioorganic Chemistry. - 2020. - V. 94. - P. 103387.

49 Pope, C.N. Cholinesterases and the fine line between poison and remedy / C.N. Pope, S. Brimijoin // Biochemical Pharmacology. - 2018. - V. 153. - P. 205-216.

50 Мурашко, Е.А. Аддукты фосфорорганических отравляющих веществ с белками крови как маркёры отравления / Е.А. Мурашко, Я.А. Дубровский, В.Н. Бабаков // Медицина экстремальных ситуаций. - 2019. - T.S1. - C. 14-29.

51 Lepage, L. Total cholinesterase in plasma: biological variations and reference limits / L. Lepage, F. Schiele, R. Gueguen, G. Slest // Clinical Chemistry. - 1985. - V.31. - N.4. -P.381-386.

52 Herkert, N.M. Comparative kinetics of organophosphates and oximes with erythrocyte, muscle and brain acetylcholinesterase / N.M. Herkert, G. Freude, U. Kunz, H. Thiermann, F. Worek // Toxicology Letters. -2012. - V. 209. - N.2. - P. 173-178.

53 Holas, O. The progress in the cholinesterase quantification methods. / O. Holas, K. Musilek, M. Pohanka, K. Kuca // Expert Opinion on Drug Discovery. - 2012. - V.7. - N. 12. -P. 1207-1223.

54. Michel, H.O. An electrometric method for the determination of red blood cell and plasma cholinesterase activity / H.O. Michel // Journal of Laboratory and Clinical Medicine. -1949. - V.34. - P.1564-1568.

55 Mohammad, F. K. Electrometric Measurement of Plasma, Erythrocyte, and Whole Blood Cholinesterase Activities in Healthy Human Volunteers / F. K. Mohammad, A. S. Alias, O. A. H. Ahmed // Journal of Medical Toxicology. - 2007. - V.3. - N. 1. - P. 25-30.

56 Mohammad, F. K. Application of an electrometric method for measurement of in vitro inhibition of blood cholinesterases from sheep, goats and cattle by dichlorvos and carbaryl / F.K. Mohammad, B.K. Al-baggou', A.S. Alias, G.A-M. Faris // Veterinarni Medicina. - 2006. -V.51. - N.2. - P. 45-50.

57 Askar, K. A. Comparative analysis of cholinesterase activities in food animals using modified Ellman and Michel assays / K. A. Askar, A. C. Kudi, A. J. Moody// The Canadian Journal of Veterinary Research. - 2011. - V. 75. - P. 261-270.

58 Kuca, K In vitro reactivation of sarin-inhibited brain acetylcholinesterase from different species by various oxime / K. Kuca, J. Cabal, J. Kassa // Journal of Medicinal Chemistry. - 2005. - V. 20. - P. 227-232.

59. Hestrin, S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application / S. Hestrin // Journal of Biological Chemistry. -1949. - V. 180. - N 1. - P. 249-261.

60 Prokofieva, D.S. Microplate spectroscopic methods for determination of the organophosphate soman / D.S. Prokofieva, N.G. Voitenko, L.K. Gustyleva, V.N. Babakov, E.I. Savelieva, R.O. Jenkins, N.V. Goncharov // Journal of Environmental Monitoring. - 2010. -V.12. - N.6. P.1349-1354.

61 Prokofieva, D.S. Microplate biochemical determination of Russian VX: Influence of admixtures and avoidance of false negative results / D.S. Prokofieva, R.O. Jenkins, N.V. Goncharov // Analytical Biochemistry. - 2012. - V. 424. - N. 2. - P. 108-113.

62 Ellman, G.L. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity / G.L. Ellman, K.D. Courtney, V. Jr. Andres, R.M. Feather-Stone // Biochemical Pharmacology. - 1961. - V.7. - P. 88-95.

63 Worek, F. Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood / F. Worek, U. Mast, D. Kiderlen, C. Diepold, P. Eyer // Clinica Chimica Acta. - 1999. -V. 288. - P. 73-90.

64 Dingova, D. Optimal detection of cholinesterase activity in biological samples: modifications to the standard Ellman's assay / D. Dingova, J. Leroy, A. Check, V. Garaj, E. Krejci, A. Hrabovska // Biochemical Pharmacology. - 2014. - V.462. - P.67-75.

65 Wagner, G. M. Spectrin oxidation correlates with membrane vesiculation in stored RBCs / G. M. Wagner, D. T. Chiu, J. H. Qju, R. H. Heath, B. H. Lubin // Blood. -1987. - V.69. -P.1777-1781.

66 Pohanka, M. Photometric microplate assay for estimation of the efficacy of paraoxon-inhibited acetylcholinesterase reactivation / M. Pohanka, D. Jun, K. Kuca. // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. - 2008. - V. 23. - N.6. - P. 781-784.

67 Mukhametgalieva, A. R. A new sensitive spectrofluorimetric method for measurement of activity and kinetic study of cholinesterases / A. R. Mukhametgalieva, I. V. Zueva, A. R. Aglyamova, S. V. Lushchekinac, P. Masson/ BBA - Proteins and Proteomics. - 2020. - V. 1868. - N 1. P.140270.

68 Dafferner, A.J. Characterization of butyrylcholinesterase in bovine serum / A.J. Dafferner, S. Lushchekina, P. Masson, G. Xiao, L. M. Schopfer, O. Lockridge // Chemico-Biological Interactions. - 2017. - V. 266. - P. 17-27.

69 Worek, F. Determination of acetylcholinesterase activity by the Ellman assay: A versatile tool for in vitro research on medical countermeasures against organophosphate poisoning / F. Worek, P. Eyer, H. Thiermann // Drug Test. Analysis. - 2012. - V.4. - P.282-291.

70 Makhaeva, G. Esterase profiles of organophosphorus compounds in vitro predict their behavior in vivo / G. F. Makhaeva, E.V. Rudakova, O. G. Serebryakova, A. Yu. Aksinenko, S. V. Lushchekina, S. O. Bachurin, R.J. Richardson // Chemico-Biological Interactions. - 2016. -V.259. - P. 332-342.

71 Cerasoli, D.M. In vitro and in vivo characterization of recombinant human butyrylcholinesterase (ProtexiaTM) as a potential nerve agent bioscavenger / D.M. Cerasoli, E.M. Griffiths, B.P. Doctor, A. Saxena, J.M. Fedorko, N.H. Greig, Q.S. Yu, Y. Huang, H. Wilgus, C.N. Karatzas, I. Koplovitz, D.E. Lenz // Extended abstracts / Chemico-Biological Interactions. 2005. - V. 157-158. - P. 353-434.

72 Kovarik, Z. Counteracting tabun inhibition by reactivation by pyridinium aldoximes that interact with active center gorge mutants of acetylcholinesterase / Z. Kovarik, N. M. Hrvat, J. Kalisiak, M. Katalinic, R.K. Sit, T. Zorbaz, Z. Radic, V.V. Fokin, K. B. Sharpless, P. Taylor // Toxicology and Applied Pharmacology. - 2019. - V.372. - P. 40-46.

73 Jennings, L.L. Direct Analysis of the Kinetic Profiles of Organophosphate-Acetylcholinesterase Adducts by MALDI-TOF Mass Spectrometry / L. L. Jennings, M. Malecki, E. A. Komives, P. Taylor // Biochemistry. - 2003. - V.42. - P 11083-11091.

74 Yan, L. A liquid chromatography tandem mass spectrometric method on in vitro nerve agents poisoning characterization and reactivator efficasy evaluation by determination of specific peptide adducts in acetylcholinesterase / L. Yan, J. Chen, B. Xu, L. Guo, Y. Xie, J. Tang, J. Xie. // Journal of Chromatography A. - 2016. - V.1450. - P.86-93.

75 Sun, J. Development of a MALDI-TOF-MS method to identify and quantify butyrylcholinesterase inhibition resulting from exposure to organophosphate and carbamate pesticides / J. Sun, B.C. Lynn // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. -2007. - V.8. - P.698-706.

76 Sun J., Lynn B.C. Development of a LC/MS/MS method to analyze butyrylcholinesterase inhibition resulting from multiple pesticide exposure / J. Sun, B.C. Lynn // Journal of chromatography B. - 2009. - V.877. - P. 3681-3685.

77. Аrbuzоv, A.E. // Russian Journal of Physical Chemistry Society. - 1906. - V.38. -

P.687.

78 Bajgar, J. Organophosphates/nerve agent poisoning: mechanism of action, diagnosis, prophylaxis, and treatment / J. Bajgar // Advances in clinical chemistry. - 2004. - V.38. - P.151-216.

79 Karczmar, A. Invited Review Anticholinesterases: dramatic aspects of their use and misuse / A. Karczmar // Neurochemistry International. 1998. - V.32. - P. 401-411.

80 Mangas, I. New insights on molecular interactions of organophosphorus pesticides with esterases / I. Mangas, J. Estevez, E. Vilanova, T. C. C. Fran?a // Toxicology. - 2017. -V.376. - P. 30-43.

81 Shafferman, A. Aging of phosphylated human acetylcholinesterase: catalytic processes mediated by aromatic and polar residues of the active centre / A. Shafferman, A.

Ordentlich, D. Barak, D. Stein, N. Ariel, B.Velan // Biochemical Journal. - 1996. - V.318. - P. 833-840.

82 Barak, D. Evidence for P-N bond scission in phosphoroamidate nerve agent adducts of human acetylcholinesterase / D. Barak, A. Ordentlich, D. Kaplan, R. Barak, D. Mizrahi, Ch. Kronman, Y. Segall, B.Velan, A. Shafferman // Biochemistry. - 2000. - V.39. P.1156-1161.

83 Masson, P. Structural approach to the aging of phosphylated cholinesterases / P. Masson, F. Nachon, O. Lockridge // Chemico-Biological Interactions. - 2010. - V.187. - P. 157-162.

84 Jiang, W. Mice treated with chlorpyrifos or chlorpyrifos oxon have organophosphorylated tubulin in the brain and disrupted microtubule structures, suggesting a role for tubulin in neurotoxicity associated with exposure to organophosphorus agents / W. Jiang, E.G. Duysen, H. Hansen, L. Shlyakhtenko, L.M. Schopfer, O. Lockridge // Toxicological Sciences. - 2010. - V. 115. - N.1. - P. 183-193.

85 Verstappen, D.R. Interactions of organophosphates with keratins in the cornified epithelium of human skin / D.R. Verstappen, A.G. Hulst, A. Fidder, N. P. E. Vermeulen, D. Noort. Chemico-Biological Interactions. - 2012. - V. 197. - N. 2-3. - P.93-102.

86 Schmidt, C. V-type nerve agents phosphonylate ubiquitin at biologically relevant lysine residues and induce intramolecular cyclization by an isopeptide bond / C. Schmidt, F. Breyer, M. Blum, H. Thiermann, F. Worek, H. John // Analytical and Bioanalytical Chemistry. -2014. -V. 406. -P. 5171-5185.

87 Grigoryan, H. Mass spectrometry identifies covalent binding of soman, sarin, chlorpyrifos oxon, diisopropyl fluorophosphate, and FP-biotin to tyrosines on tubulin: a potential mechanism of long term toxicity by organophosphorus agents / H. Grigoryan, L.M. Schopfer, C.M. Thompson, A. V. Terry, P. Masson, O. Lockridge // Chemico-Biological Interactions. - 2008. - V. 175. - N. 1-3. - P. 180-186.

88 Grigoryan, H. Mass spectral characterization of organophosphate-labeled lysine in peptides / H. Grigoryan, B. Li, W. Xue, M. Grigoryan, L. M. Schopfer, O. Lockridge // Analytical Biochemistry. - 2009. - V. 394. - N. 1. - P. 92-100.

89 Schopfer, L. M. Chlorpyrifos oxon promotes tubulin aggregation via isopeptide cross-linking between diethoxyphospho-Lys and Glu or Asp: Implications for neurotoxicity / L. M.

Schopfer, O. Lockridge // Journal of Biological Chemistry. - 2018. - V. 293. - N.35. - P. 1356613577.

90 Kranawetvogl, A. Identification of novel disulfide adducts between the thiol containing leaving group of the nerve agent VX and cysteine containing tripeptides derived from human serum albumin / A. Kranawetvogl, J. Küppers, M. Gütschow, F. Worek, H. Thiermann, P. W. Elsinghorstb, H. John // Drug Testing and Analysis. - 2017. - V. 9. - P. 1192-1203.

91 Gillet, L.C. Mass spectrometry applied to bottom-Up proteomics: Entering the high-throughput era for hypothesis testing / L.C. Gillet, A. R. Leitner, Aebersold // Annual review of analytical Chemistry. - 2016. - P. 449-472.

92 Краснов, Н. В. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в протеомном анализе / Н. В. Краснов, Я. И. Лютвинский, Е. П. Подольская // Научное приборостроение. - 2010. - Т. 20. - N.4. - С. 5-20.

93 Мурашко, Е.А. Идентификация аддуктов фосфорорганических отравляющих веществ с белками крови методами фосфопротеомики / Е.А. Мурашко, Я.А. Дубровский, Е.П. Подольская, В.Н. Бабаков // Медицинский академический журнал. - 2012. - Т. 12. -N. 3. - С. 77-79.

94 Лебедев, А.Т. Основы масс-спектрометрии белков и пептидов / А.Т. Лебедев, К.А. Артеменко, Т.Ю. Самгина // Изд-во Техносфера ВМСО. Москва. - 2012. - 174 С.

95 Roepstorff, P. Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides / P. Roepstorff, J. Fohlman // Biological Mass Spectrometry. - 1984. -V.11. - N. 11. -P. 601.

96 Boersema, P. Phosphopeptide fragmentation and analysis by mass spectrometry / P. Boersema, S. Mohammed, A. J. R. Heck // Journal of Mass Spectrometry. - 2009. - V. 44. - P. 861-878.

97 Syka, J. E. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry / J. E. Syka, J. J. Coon, M. J. Schroeder, J. Shabanowitz, D. F. Hunt // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2004. - V. 101. - P. 9528-9533.

98 Kandasamy, K. Evaluation of several MS/MS search algorithms for analysis of spectra derived from electron transfer dissociation experiments / K. Kandasamy, A. Pandey, H. Molina // Analytical Chemistry. - 2009. - V. 81. - P. 7170-7180.

99 Molina, H. Global proteomic profiling of phosphopeptides using electron transfer dissociation tandem mass spectrometry / H. Molina, D. M Horn, N. Tang, S. Mathivanan, A. Pandey // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2007. - V. 104. - P. 2199-2204.

100 Nalivaeva N. N., Turner A. J. Post-translational modifications of proteins: Acetylcholinesterase as a model system / N. N. Nalivaeva, A. J. Turner // Proteomics. - 2001. -V.1. - P. 735-747.

101 Saez-Valero, J. Glycosylation of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase changes as a function of the duration of Alzheimer's Disease / J. Saez-Valero, L.R. Fodero, M. Sjogren, N. Andreasen, S. Amici, Gallai V., Vanderstichele H., E. Vanmechelen, L. Parnetti, K. Blennow, D. H. Small // Journal of Neuroscience Research. - 2003. - V. 72. - P. 520-526.

102. Kolarich, D. Glycoproteomic characterization of butyrylcholinesterase from human plasma. / D. Kolarich, A. Weber, M. Pabst, J. Stadlmann, W. Teschner, H. Ehrlich, H. Schwarz, F. Altmann // Proteomics. - 2008. - V. 8. - P. 254-263.

103 Blume-Jensen, P. Oncogenic kinase signaling / P. Blume-Jensen, T. Hunter // Nature. -2001. -V. 411. -P. 355-365.

104 Grunwald, J. Large-scale purification and long-term stability of human butyrylcholinesterase: a potential bioscavenger drug / J. Grunwald, D. Marcus, Y. Papier, L. Raveh, Z. Pittel, Y. Ashani // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. - 1997. -V.34. - P. 123-135.

105 Lockridge, O. Purification of recombinant human butyrylcholinesterase on Hupresin® / O. Lockridge, E. David, L. M. Schopfer, P. Masson, X. Brazzolotto, F. Nachon // Journal of Chromatography B. - 2018. - V.1102-1103. - P. 109-115.

106 Lockridge O. Large scale purification of butyrylcholinesterase from human plasma suitable for injection into monkeys; a potential new therapeutic for protection against cocaine and nerve agent toxicity / O. Lockridge, M. L. Schopfer, G. Winger, J. H. Woods // Journal of Med. Chem. Biol. Radiol. - 2005. - Def. 3. - P. 1-22.

107 Saxena, A. Pilot-scale production of human serum butyrylcholinesterase suitable for use as a bioscavenger against nerve agent toxicity, / A. Saxena, P. Tipparaju, C. Luo, B.P. Doctor // Process Biochemistry. - 2010. - V.45. - P. 1313-1318.

108 Rosenberg, Y. Pharmacokinetics and immunologic consequences of exposing macaques to purified homologous butyrylcholinesterase / Y. Rosenberg, C. Luo, Y. Ashani, B.P. Doctor, R. Fischer, G. Wolfe, A. Saxena // Life Sciences. - 2012. - V. 72. - P. 125-134.

109 George, S. Serum aryl acylamidases of primates & non-primates: association with serum cholinesterase, amine sensitivity and immunological reactivity / S. George, A.S. Balasubramanian // Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. - 1983. - V.20. - P. 331337.

110 Ralston, J.S. Use of procainamide gels in the purification of human and horse serum cholinesterases/ J.S. Ralston, A.R. Main, B.F. Kilpatrick, A.L. Chasson // The Biochemical journal. - 1983. - V.211. - P. 243-250.

111 Saxena, A. Characterization of butyrylcholinesterase from porcine milk / Saxena A., Belinskaya T., Schopfer L.M., Lockridge O. // Archives of Biochemistry and Biophysics. -2018. - V. 652. - P. 38-49.

112 Xie, W. An improved cocaine hydrolase: the A328Y mutant of human butyrylcholinesterase is 4-fold more efficient / W. Xie, C.V. Altamirano, C.F. Bartels, R.J. Speirs, J.R. Cashman, O. Lockridge // Molecular Pharmacology. - 1999. - V. 55. - P. 83-91.

113 Sun, W. Pharmacokinetics and immunologic consequences of repeated administrations of purified heterologous and homologous butyrylcholinesterase in mice / W. Sun, C. Luo, R.S. Naik, B.P. Doctor, A. Saxena// Life Sciences. - 2009. - V. 85. - P. 657-661.

114 Huang, Y.J. Recombinant human butyrylcholinesterase from milk of transgenic animals to protect against organophosphate poisoning / Y.J. Huang, Y. Huang, H. Baldassarre,

B. Wang, A. Lazaris, M. Leduc, A.S. Bilodeau, A. Bellemare, M. Cote, P. Herskovits, M. Touati,

C. Turcotte, L. Valeanu, N. Lemee, H. Wilgus, I. Begin, B. Bhatia, K. Rao, N. Neveu, E. Brochu, J. Pierson, D.K. Hockley, D.M. Cerasoli, D.E. Lenz, C.N. Karatzas, S. Langermann // Proceedings of the National Academy of Sciences (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. - 2007. - V.104. - P. 13603-13608.

115 Li, S. High-level expression of functional recombinant human butyrylcholinesterase in silkworm larvae by Bac-to-Bac system / S. Li, D.T. Ip, H.Q. Lin, J.M. Liu, Y.G. Miao, L.J. Ke, D.C. Wan // Chemico-Biological Interactions. - 2010. - V. 187. - P. 101-105.

116 Geyer, B.C. Transgenic plants as a source for the bioscavenging enzyme, human butyrylcholinesterase / B.C. Geyer, L. Kannan, I. Cherni, R.R. Woods, H. Soreq, T.S. Mor // Plant Biotechnology Journal. - 2010. - V. 8. - P. 873-886.

117 Brazzolotto, X. Human butyrylcholinesterase produced in insect cells: huprine-based affinity purification and crystal structure / X. Brazzolotto, M. Wandhammer, C. Ronco, M. Trovaslet, L. Jean, O. Lockridge, P.Y. Renard, F. Nachon // The FEBS journal. - 2012. - V. 279. - P. 2905-2916.

118 Onder, S. Hupresin retains binding capacity for butyrylcholinesterase and acetylcholinesrase after sanitation with sodium hydroxide / S. Onder, E. David, O. Tacal, L. M. Schopfer, O. Lockridge // Frontiers in Pharmacology. - 2017. - V. 8. - Art.713.

119 Li, H. Carbofuran poisoning detected by mass spectrometry of butyrylcholinesterase adduct in human serum / H. Li, I. Ricordel, L. Tong, L. M. Schopfer, F. Baud, B. Mégarbane, E. Maury, P. Masson, O. Lockridge // Journal of Applied Toxicology. - 2009. - V. 29. - P. 149155.

120 Li, B. Dichlorvos, Chlorpyrifos Oxon, and Aldicarb adducts of butyrylcholinesterase, detected by mass spectrometry, in human plasma following deliberate overdose / B. Li, I. Ricordel, L. M. Schopfer, F. Baud, B. Mégarbane, P. Masson, O. Lockridge // Journal of Applied Toxicology. - 2010. - V. 30. - N.6. - P. 559-565.

121 Fidder, A. Retrospective detection of exposure to organophosphorus anticholinesterases: mass spectrometric analysis of phosphylated human butyrylcholinesterase / A. Fidder, A.G. Hulst, D. Noort, R. de Ruiter, M.J. van der Schans, H.P. Benschop, J.P. Langenberg // Chemical Research in Toxicology. - 2002. - V.15.- P. 582-590.

122 Tsuge, K. Detection of human butyrylcholinesterase-nerve gas adducts by liquid chromatography-mass spectrometric analysis after in gel chymotryptic digestion / K. Tsuge, Y. Seto // Journal Chromatography B. - 2006. - V. 838. - I. 1. - P. 21-30.

123 van der Schans, M.J. Verification of exposure to cholinesterase inhibitors: generic detection of OPCW Schedule 1 nerve agent adducts to human butyrylcholinesterase / M.J. van der Schans, A. Fidde r, D. van Oeveren, A.G. Hulst, D. Noort // Journal of Analytical Toxicology. - 2008. - V. 32. - P. 125-129.

124 Read R. W., Riches J.R., Stevens J. A., Stubbs S. J., Black R. M. Biomarkers of organophosphorus nerve agent exposure: comparison of phosphylated butyrylcholinesterase and phosphylated albumin after oxime therapy / R.W. Read, J.R. Riches, J.A. Stevens, S. J. Stubbs, R. M. Black // Archives of Toxicology. - 2010. - V. 84. - P. 25-36.

125 John, H. Small-scale purification of butyrylcholinesterase from human plasma and implementation of a ^LC-UV/ESI MS/MS method to detect its organophosphorus adducts / H. John, F. Breyer, C. Schmidt, B. Mizaikoff, F. Worek, H. Thiermann // Drug Testing and Analysis. - 2015. - V. 7. - N.10. - P. 947-956.

126 Liu, C. Simultaneous quantification of soman and VX adducts to butyrylcholinesterase, their aged methylphosphonic acid adducts and butyrylcholinesterase in plasma using an off-column procainamide-gel separation method combined with UHPLC-MS/MS / C. Liu, G. Huang, Ha. Xia, S. Liu, J. Liu, H. Yu, S. Zhou, L. Liang, L. Yuan // Journal of Chromatography B. - 2016. - V. 1036-1037. - P. 57-65.

127 Moser, A. C. Immunoaffinity chromatography: an introduction to applications and recent developments / A. C. Moser, D. S. Hage // Bioanalysis. - 2010. - V. 2. - N 4. - P. 769790.

128 Whiteaker, J.R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass spectrometry-based quantification of serum biomarkers / J.R. Whiteaker, L. Zhao, H.Y. Zhang, L.C. Feng, B.D. Piening, L. Anderson, A. Paulovich // Analytical Biochemistry. - 2007. - V. 362. - P. 44-54.

129 Sporty, J. L. S. Immunomagnetic separation and quantification of butyrylcholinesterase nerve agent adducts in human serum / J. L. S. Sporty, S. W. Lemire, E. M. Jakubowski, J. A. Renner, R. A. Evans, R. F. Williams, J. G. Schmidt, M. J. van der Schans, D. Noort, R. C. Johnson // Analytical Chemistry. - 2010. - V. 82. - P. 6593-6600.

130 Pantazides, B. G. An enhanced butyrylcholinesterase method to measure organophosphorus nerve agent exposure in humans / B. G. Pantazides, C. M. Watson, M. D. Carter, B. S. Crow, J.W. Perez, T. A. Blake, J. D. Thomas, R. C. Johnson // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2014. - V. 406. - P. 5187-5194.

131 John, H. Fatal sarin poisoning in Syria 2013: forensic verification within an international laboratory network / H. John, M. J.van der Schans, M. Koller, H.E. T. Spruit, F. Worek, H. Thiermann, D. Noort // Forensic toxicology. - 2017. - V.36. N. 1. - P. 61-71.

132 Дубровский, Я.А., Масс-спектрометрическая идентификация аддуктов бутирилхолинэстеразы с фосфорорганическими соединениями с помощью концентрирования иммунопреципитацией из плазмы крови / Е.А. Мурашко, П.П. Бельтюков, Е.П. Подольская, В.Н. Бабаков // Medline.ru. Российский биомедицинский журнал. - 2015. - Т. 16. - N. 2. - С. 481-488.

133 Aryal, U.K. Identification of phosphorylated butyrylcholinesterase in human plasma using immunoaffinity purification and mass spectrometry / U.K. Aryal, C.T. Lin, J.S. Kim, T.H. Heibeck, J. Wang, W.J. Qian, Y. Lin // Analytica Chimica Acta - 2012. - V.723. - P. 68-75.

134 Park, S.-J. Detection of organophosphate bound butyrylcholinesterase using a monoclonal antibody / S.-J. Park, D.-H. Kim, J. Yoo, E. Y. Hwang, M.-S. Shin, N.-T. Lee, Il-R. Cho, H.-G. Kan, Y.-J. Kim, S. Park, Y.-W. Kim // Applied Biological Chemistry. -2017. - V. 60. - N.3. - P.233-240.

135 Wiesner, J. Acetylcholinesterases - the structural similarities and differences / J. Wiesner, Z. Kriz, K. Kuca, D. Jun, J. Koca // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. - 2007.- V. 22. - N4. - P. 417-424.

136 Toker, L. Polyproline-rich peptides associated with Torpedo californica acetylcholinesterase tetramers / L. Toker, I. Silman, T. Zeev-Ben-Mordehai, J. L. Sussman, L.M. Schopfer, O. Lockridge // Chemico-Biological Interactions. - 2020. - V. 319. - I. 109007.

137 Mohamed, M.A. Purification and characterization of acetylcholinesterase in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae) / M.A. Mohamed, S. Shaalan, A.-E. M. Ghazy, A.A. Ali, A. M. Abd-Elaziz, M.E. Ghanem, S.A. Abd-Elghany // International Journal of Biological Macromolecules. - 2020. - V. 147. - P. 1029-1040.

138 Fischer, M., Expression and reconstraction of biologically active human acetylcholiesterse from Escherichia coli / M. Fischer, A. Ittah, I. Liefer, M.Gorecki // Cellular and Molecular Neurobiology. - 1993. - V. 13. - P. 25-38.

139 Onder, S. Use of Hupresin to capture red blood cell acetylcholinesterase fordetection of soman exposure / S. Onder, L. M. Schopfer, J. R. Cashman, O. Tacal, R. C. Johnson, T. A. Blake, O. Lockridge // Analytical Chemistry. - 2018. - V. 90. - P. 974-979.

140 Dafferner, A. J. Immunopurification of acetylcholinesterase from red blood cells for detection of nerve agent exposure / A.J. Dafferner, L. M. Schopfer, G. Xiao, J. R. Cashman, U. Yerramalla, R. C. Johnson, T. A. Blake, O. Lockridge // Chemical Research in Toxicology. -2017. - V. 30. - P. 1897-1910.

141 De la Hoz, D. A simplified procedure for the purification of large quantities of fetal bovine serum acetylcholinesterase / D. De la Hoz, B.P. Doctor, J.S. Ralston, R.S. Rush, A.D. Wolfe // Life Sciences. - 1986. - V.39. - P. 195-199.

142 Sharif, M.S.A. Assessment of acetylcholinesterase from Channa micropeltes as a source of enzyme for insecticides detection / M.S.A. Sharif, M.I.E. Halmi, A. Syahir, W.L.W. Johari, M.Y. Shukor // International Journal of Agriculture and Biology. - 2014. - V.16. - P. 389-394.

143 Li, F. Purification and characterization of acetylcholinesterase from cotton aphid (Aphis gossypii Glover) / F. Li, Z. Han // Archives of insect biochemistry and physiology. -2002. - V.51. - P. 37-45.

144 Bocquene, G. Cholinesterases from the common oyster (Crassostrea gigas). Evidence for the presence of a soluble acetylcholinesterase insensitive to organophosphate and carbamate inhibitors / G. Bocquene, A. Roig, D. Fournier // FEBS Letters. 1997. - V.407. - P. 261-266.

145 Carletti, E. Aging of cholinesterases phosphylated by tabun proceeds through O-dealkylation / E. Carletti, H. Li, B. Li, F. Ekstrom, Y. Nicolet, M. Loiodice, E. Gillon, M.T. Froment, O. Lockridge, L.M. Schopfer, P. Masson, F. Nachon // Journal of the American Chemical Society. - 2008. - V. 130. - P. 16011-16020.

146 Kronman, C. Production and secretion of high levels of recombinant human acetylcholinesterase in cultured cell lines: microheterogeneity of the catalytic subunit / C. Kronman, B. Velan, Y. Gozes, M. Leitner, Y. Flashner, A. Lazar, D. Marcus, T. Sery, A. Papier, H. Grosfeld, S. Cohen, A. Shafferman // Gene. - 1992. - V.121. - P. 295-304.

147 Geyer, B.C. Purification of transgenic plant-derived recombinant human acetylcholinesterase-R / B.C. Geyer, M. Muralidharan, I. Cherni, J. Doran, S.P. Fletcher, T.

Evron, H. Soreq, T.S. Mor // Chemico-Biological Interactions. - 2005. - V.157-158. - P. 331334.

148 Rosenberg, Y.J. A highly stable minimally processed plant-derived recombinant acetylcholinesterase for nerve agent detection in adverse conditions / Y.J. Rosenberg, J. Walker, X. Jiang, S. Donahue, J. Robosky, M. Sack, J. Lees, L. Urban // Scientific reports. - 2015. -V.5. - I. 13247.

149 Schaller, J. Human Blood Plasma Proteins: Structure and Function / J. Schaller, S. Gerber, U. Kämpfer, S. Lejon, Ch. Trachsel. -John Wiley & Sons, Ltd., 2008. - 538 p.

150 Рембовский, В.Р. Подтверждение факта воздействия фосфорганических отравляющих веществ на организм по результатам анализа биопроб: методические рекомендации ФМБА России / В.Р. Рембовский, А.С. Радилов, Е.И. Савельева, Н.Л. Корягина, В.Н. Бабаков, Н.С. Хлебникова, Г.В. Каракашев, В.А. Копейкин, Е.С. Уколова, Я.А. Дубровский, П.Н. Сорокоумов, Т.Е. Морозова, Е.А. Мурашко, М.Д. Шачнева. // СПб: изд-во Политехнического института, 2016. - 20 с.

151 Holland, K.E. Modifications to the organophosphorus nerve agent-protein adduct refluoridation method for retrospective analysis of nerve agent exposures / K.E. Holland, K.E. Solano, R.C. Johnson, V.L. Mario, J.R. Barr // Journal of Analytical Toxicology. - 2008. - V.32. -P. 116-124.

152 Корягина, Н.Л. Особенности анализа фосфорорганических отравляющих веществ, реактивированных из состава аддуктов с белками крови, при установлении факта воздействия химического оружия / Н.Л. Корягина, Е.И. Савельева, Н.С. Хлебникова, В.А. Копейкин, В.Ю. Конева, Радилов А.С. // Токсикологический вестник. -2014. - Т.4.- N. 127. - C. 39-46.

153 Корягина, Н. Л. Определение конъюгированных с белками метаболитов фосфорорганических отравляющих веществ в плазме крови / Н.Л. Корягина, Е. И. Савельева, Г.В. Каракашев, В.Н. Бабаков, Я.А. Дубровский, Е.С. Уколова, Н. С. Хлебникова, Е.А. Мурашко, В.Ю. Конева, А.И. Уколов, В.А. Копейкин, А. С. Радилов // Журнал аналитической химии. - 2016. - Т.71. - N.8. - С. 883-893.

154 Nakajima, T. Urinary metabolites of sarin in a patient of the Matsumoto sarin incident / T. Nakajima, K. Sasaki, H. Ozawa, Y. Sekijima, H. Morita, Y. Fukushima, N. Yanagisawa // Archives of Toxicology. - 1998. - V.72. - N.9. - P. 601-603.

155 Black, R.M. Derivatisation reactions in the chromatographic analysis of chemical warfare agents and their degradation products / R.M. Black, R.W. Muir // Journal of Chromatography A.- 2003. - V.1000. - N. 1-2. - P.253-281.

156 Riches, J. The trace analysis of alkyl alkylphosphonic acids in urine using gas chromatography-ion trap negative ion tandem mass spectrometry / J. Riches, I. Morton, R.W. Read, R.M. Black // Journal of Chromatography B. - 2005. - V.816. - N.1-2. - P.251-258.

157 Корягина, Н.Л. Хроматомасс-спектрометрическое определение алкилметилфосфоновых кислот в моче / Н.Л. Корягина, Е.И. Савельева, Н.С. Хлебникова, А.И. Уколов, Е.С. Уколова, Г.В. Каракашев, А.С. Радилов // Масс-спектрометрия. - 2015. -Т. 12. - N.4. - С.236-246.

158 Black, R.M. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site / R.M. Black, J.M. Harrison, R.W. Read // Archives of Toxicology. - 1999. - V.73. - N.2. - P.123-126.

159 Peeples, E.S. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry / E.S. Peeples, L.M. Schopfer, E.G. Duysen, R. Spaulding, T. Voelker, C.M. Thompson, O. Lockridge // Toxicological Sciences. - 2005. - V.83. - P.303-312.

160 Li, B. Detection of adduct on tyrosine 411 of albumin in humans poisoned by dichlorvos / B. Li, I. Ricordel, L.M. Schopfer, F. Baud, B. Megarbane, F. Nachon, P. Masson, O. Lockridge // Toxicological Sciences. - 2010. - V.116. - P. 23-31.

161 Bao, Y. Quantification of nerve agent adducts with albumin in rat plasma using liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry / Y. Bao, Q. Liu, J. Chen, Y. Lin, B. Wu, J. Xie // Journal of Chromatography A. - 2012. - V.1229. - P.164-171.

162 Jiang, W. Phos-select iron affinity beads enrich peptides for the detection of organophosphorus adducts on albumin / W. Jiang, P. Masson, L.M. Schopfer, O. Lockridge, Y.A. Dubrovskii, E.A. Murashko, V. Babakov, E.P. Podolskaya, F. Nachon // Chemical Research in Toxicology. - 2013. - V.26. - N.12. - P.1917-1925.

163 Дубровский, Я.А. Оптимизация условий проведения металл-аффинной хроматографии для выделения фосфонилированных пептидов / Я.А. Дубровский, Е.А. Мурашко, Е.П. Подольская, В.Н. Бабаков, Н.В. Краснов, А.С. Радилов // Научное приборостроение. - 2013.- Т.23. - N.3. - С.13-19.

164 van der Schans, M.J. New tools in diagnosis and biomonitoring of intoxications with organophosphorothioates: Case studies with chlorpyrifos and diazinon / M.J. van der Schans, A.G. Hulst, D. van der Riet - van Oeveren, D. Noort, H.P. Benschop, Ch. Dishovsky. // Chemico-Biological Interactions. - 2013 - V. 203. - P. 96-102.

165 Mathews, T. P. High-confidence qualitative identification of organophosphorus nerve agent adducts to human butyrylcholinesterase / T. P. Mathews, M. D. Carter, D. Johnson, S. L. Isenberg, L.A. Graham, J. D. Thomas, R. C. Johnson // Analytical Chemistry. - 2017. -V. 89. - N. 3. - P. 1955-1964.

166 Graham, L. A. High-throughput uhplc-ms/ms method for the quantification of five aged butyrylcholinesterase biomarkers from human exposure to organophosphorus nerve agents / L. A. Graham, D. Johnson, M. D. Carter, E. G. Stout, H. A. Erol, S. L. Isenberg, T. P. Mathews, J. D. Thomas, R. C. Johnson // Biomedical Chromatography. - 2017. - V. 31. - N.4. -P. 1-30.

167 Dubrovskii, Ya. Mass spectrometry based proteomic approach for the screening of butyrylcholinesterase adduct formation with organophosphates / Ya. Dubrovskii, E. Murashko, O. Chuprina, P. Beltyukov, A. Radilov, N. Solovyev, V. Babakov // Talanta. -2019. - V. 197. -P. 374-382.

168 Nagao, M. Definitive Evidence for the acute sarin poisoning diagnosisin the tokyo subway / M. Nagao, T. Takatori, Y. Matsuda, M. Nakajima, H. Iwase, K. Iwadate // Toxicology and applied pharmacology. - 1997. - V. 144. - P. 198-203.

169 Karnovsky M.J. "Direct-Coloring" thiocholine method for cholinesterases / M.J. Karnovsky, L.A. Roots // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. - 1964. - V.12. - P. 219-221.

170 Рембовский, В.Р. Методы по обогащению фосфонилированных аддуктов белков крови. МР ФМБА России 4.1.33-2014 / В.Р. Рембовский, А.С. Радилов, П.П.

Бельтюков, В.Н. Бабаков, Я.А. Дубровский, Е.А. Мурашко, М.С. Ануров - СПб.: изд-во Политехнического института. - 2014. - 30 с.

171 Silyavka, E.S. Collapsed monomolecular thin films as surface nanomodification techniques for bioorganic MALDI analysis / E. S. Silyavka, A. A. Selyutin, N. G. Sukhodolov, V. V. Shilovskikh, P. A. Oleneva, A.A. Mitrofanov, O. A. Keltsieva, P. S. Dubakova, V. N. Babakov, M. L. Alexandrova, N. V.Krasnov, E. P. Podolskaya // AIP Conference Proceedings. -2019. - V.2064. - N.1. - WoS. 0.220.

172 Дубровский, Я.А. Масс-спектрометрическая идентификация посттрансляционных модификаций белков крови ксенобиотиками методом МАЛДИ-МС в ретроспективном химико-токсикологическом анализе: дисс.канд.биол.наук: 14.03.04; 03.01.04 / Дубровский Ярослав Александрович. - СПб., 2013. - 121 с.

173 Рембовский, В.Р. Определение фосфонилированных модификаций холинэстераз. МР ФМБА России 12.05 - 2016 / В.Р. Рембовский, А.С. Радилов, П.П. Бельтюков, В.Н. Бабаков, Я.А. Дубровский, Е.А. Мурашко, Т.И. Пушкарева, О.И. Чуприна - СПб.: изд-во Политехнического института. - 2016. - 20 с.

174 Abi-Ghanem, D.A. Immunoaffinity Chromatography: A Review (in Affinity chromatography) /D.A. Abi-Ghanem, L. R. Berghman, D.S. Magdeldin (Eds.) - Croatia: InTech, 2016. - P. 91.

175 Carr, S. A. Targeted Peptide Measurements in Biologyand Medicine: Best Practices for MassSpectrometry-based Assay Development Usinga Fit-for-Purpose Approach / S. A. Carr, S. E. Abbatiello, B. L. Ackermann, C. Borchers, B. Domon, E. W. Deutsch, R. P. Grant, A. N. Hoofnagle, R. Hu ' ' ttenhain, J. M. Koomen, D. C. Liebler, T. Liu, B. MacLean, D.R Mani, E. Mansfield, H. Neubert, A. G. Paulovich, L. Reiter, O. Vitek, R. Aebersold, L.Anderson, R. Bethem, J. Blonder, E. Boja, J. Botelho, M. Boyne, R. A. Bradshaw, A. L. Burlingame, D. Chan, H. Keshishian, E. Kuhn, Christopher Kinsinger,Jerry S.H. Lee, S. Lee, R. Moritz, J. Oses-Prieto, N. Rifai, J. Ritchie, H. Rodriguez, P. R. Srinivas, R. R. Townsend, J. Van Eyk, G. Whiteley, A. Wiita, S. Weintraub // Molecular & Cellular Proteomics. - 2014. - V. 13.3. - P. 907-917.

176 Percy, A. J. Protocol for Standardizing High-to-Moderate Abundance Protein Biomarker Assessments Through an MRM-with-Standard-Peptides Quantitative Approach / A.

J. Percy, J. Yang, A. G. Chambers, Y. Mohammed, T. Miliotis, C. H. Borchers // Advances in Experimental Medicine and Biology. - 2016. - P. 515-530.

177 Dodge, J. T. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes / J.T. Dodge, C. Mitchell, D.J. Hanahan // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1963. - V. 100. - N.1. - P. 119-130.

178 Kakhniashvili, D. G. The Human Erythrocyte Proteome / D.G. Kakhniashvili, L.A. Bulla, S.R. Goodman // Molecular & Cellular Proteomics. - 2004. - V. 3. - N.5. - P. 501-509.

179 Gautier, E. Absolute proteome quantification of highly purified populations of circulating reticulocytes and mature erythrocytes / E. Gautier, M. Leduc, S. Cochet, K. Bailly, C. Lacombe, N. Mohandas, F. Guillonneau, W. El Nemer, P. Mayeux // Proteomics of reticulocytes and erythrocytes. - 2018. - V. 2. - N. 20, P. 2646-2657.

180 van Gestel, R. A. Quantitative erythrocyte membrane proteome analysis with Blue-Native/SDS PAGE / R. A., van Gestel, W. W. van Solinge, H.W.P. van der Toorn, G. Rijksen,

A. J. R. Heck, R. van Wijk, M. Slijper // Journal of proteomics. - 2010. - V. 73. - P. 456 - 465.

181 Jiang, W. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of titanium oxide-enriched peptides for detection of aged organophosphorus adducts on human butyrylcholinesterase / W. Jiang, E.A. Murashko, Y.A. Dubrovskii, E.P. Podolskaya, V.N. Babakov, J. Mikler, F. Nachon, P. Masson, L.M. Schopfer, O. Lockridge // Analytical Biochemistry. - 2013. - V. 439. - N. 2. - P. 132-141.

182 Babakov, V.N. Application of lanthanum stearate monolayers as a metal-affinity sorbent for the selective sorption of soman adducts to human serum albumin / V.N. Babakov, E.V. Shreiner, O.A. Keltsieva, Y.A. Dubrovskii, V.V. Shilovskikh, I.M. Zorin, N.G. Sukhodolov, I.G. Zenkevich, E.P. Podolskaya, A.A. Selyutin // Talanta. - 2019. - V. 195. - P. 728-731.

183 Рембовский, В.Р. Подтверждение факта воздействия фосфорорганических отравляющих веществ по результатам анализа биопроб. МР ФМБА России 12.038-2016 /

B.Р. Рембовский, А.С. Радилов, Е.И. Савельева, Н.Л. Корягина, В.Н. Бабаков, Н.С. Хлебникова, Г.В. Каракашев, В.А. Копейкин, Е.С. Уколова, Я.А. Дубровский, П.Н. Сорокоумов, Т.Е. Морозова, Е.А. Мурашко, М.Д. Шачнева - СПб.: изд-во Политехнического института. - 2016. - 86 с.

184 Jiang, W. Mass spectrometry method to identify aging pathways of sp- and rp-tabun adducts on human butyrylcholinesterase based on the acid labile P-N bond / W. Jiang, J. R. Cashman, F. Nachon, P. Masson, L.M. Schopfer, O. Lockridge // Toxicological sciences. -2013. - V. 132. - N.2. - P. 390-398.

185 Tsurkan, L.G. Inhibition of human carboxylesterases hCE1 and hiCE by cholinesterase inhibitors / Tsurkan L.G., Hatfield M. J., C. C. Edwards, J. L. Hyatt, Potter P. M. // Chemico-Biological Interactions. - 2013. - V.203. - N 1. - P. 226-230.