Лазерная интерференционная микроскопия морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.21, кандидат физико-математических наук Игнатьев, Павел Сергеевич

• Игнатьев, Павел Сергеевич
• кандидат физико-математических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Игнатьев, Павел Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ ВЫСОКОСКОРОСТНЫХ МЕТОДОВ МИКРОСКОПИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ.

1.1 Атомно-силовая микроскопия локальных наномеханических колебаний клеточной стенки хлебопекарных дрожжей.

1.2 Трехмерная флуоресцентная микроскопия многофотонного возбуждения для исследования динамики эритроцитов.

1.3 Высокоскоростная конфокальная микроскопия медленных изменений морфологии кардиомиоцитов и клеток НеЬа.

1.4 Лазерная интерференционной микроскопии как альтернатива традиционным методам оптической микроскопии.

1.4.1 Гильберт-фазовая микроскопия динамики эритроцитов.

1.4.2. Оптическая когерентная томография клеток крови.

1.4.3 Динамическая микрофотометрия фликкера эритроцитов.

1.4.4 Когерентная фазовая микроскопия динамики биологических объектов.

1.4.5 Модуляционная интерференционная микроскопия внутриклеточных и мембранных процессов в нейронах.

ГЛАВА 2. РАЗВИТИЕ МЕТОДОВ ЛАЗЕРНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ МОРФОЛОГИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДИНАМИКИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.

2.1 Метод локальной динамической микроскопии для регистрации внутриклеточной динамики в реальном времени.

2.1.1. Модуляционный метод воспроизведения низкочастотных флуктуаций фазовой толщины.

2.1.2. Программное обеспечение метода локальной динамической микроскопии.

2.2 Новое поколение высокоскоростных модуляционных интерференционных микроскопов МИМ для исследования биологических объектов.

2.3 К вопросу о разрешении в интерференционной микроскопии.

2.3.1. Дифракционная модель сверхразрешения.

2.3.2 Метод топологических фаз.

2.3.3. Компенсационный метод измерения фазы.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОПРОБОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛОКАЛЬНОЙ ДИНАМИЧЕСКОЙ И МОДУЛЯЦИОННОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ ЛАЗЕРНОЙ МИКРОСКОПИИ НА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.

3.1 Исследование активации лимфоцитов.

3.2 Исследование изменений в морфологии эритроцитов при оксигенировании.

3.3 Определение жизнеспособности спор Nozema Apis методом модуляционной интерференционной микроскопии.

3.4 Исследование спонтанной самоорганизации газовых микропузырей в жидкости методом модуляционной интерференционной микроскопии.

3.5 Локализация «голосов» эритроцитов.

3.6 Исследование динамики нервных волокон методом модуляционной интерференционной микроскопии.

3.7 НСТ-116 Интерактивный диалог с клеткой.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лазерная интерференционная микроскопия морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени»

Современный уровень развития оптической электроники и вычислительной техники позволяет создавать и успешно внедрять новые инструменты исследования биологических объектов. Последние достижения в области компьютерной микроскопии и томографии [1-7] в сочетании с автоматизированными системами распознавания образов широко используются в качестве исследовательских и диагностических инструментов в биологии и медицине.

Исследования корреляции между функциональным состоянием отдельной клетки и физическими параметрами ее органелл является одной из актуальных проблем биологии [8-10]. Ее решение будет иметь фундаментальное значение для понимания внутриклеточной динамики, а также откроет перспективу разработки новых методов диагностики в молекулярной медицине. Практически важными приложениями таких методов являются скрининг биологически активных соединений и экспресс-диагностика ряда заболеваний на клеточном уровне [11].

Исследования в области динамики внутриклеточных процессов, таких как кинетика молекулярных моторов [12], кооперативные явления в мембранах и ферментных комплексах [13] и т.п. стимулировали дальнейший прогресс в развитии новых методов «прижизненной» микроскопии. Возникла острая необходимость регистрации динамических процессов в реальном времени.

В настоящее время для анализа динамических процессов в биологических объектах используются методы атомно-силовой микроскопии [14-17], однако вследствие инвазивности экспериментов 5 применение подобных методов для исследования клеток мягких тканей ограничено.

Использование современных методов высокоскоростной конфокальной микроскопии при [19-22] исследовании быстрых (более 10 Гц) динамических процессов также ограничено вследствие низкого пространственного и временного разрешения.

Значительных результатов в исследовании внутриклеточных процессов удалось достичь, используя метод флуоресцентной микроскопии [18]. При известных ограничениях и некой степени инвазивности этот метод позволяет получить количественную информацию о пространственно-временных флуктуациях мембранного потенциала. Однако ощутимых результатов в решении задач диагностики функциональных состояний субклеточной системы, метод традиционной флуоресцентной микроскопии не даёт. Это объясняется, в первую очередь, отсутствием механизма абсолютной нормировки интенсивности флуоресценции, а также сравнительно низкой чувствительностью и малым временным разрешением, которые ограничены в данном методе.

Наиболее перспективными оказываются методы интерференционной микроскопии, такие как когерентная фазовая [33] и динамическая фазовая [37] микроскопия, которые позволяют осуществлять неинвазивные исследования клеточной морфологии и динамики со сверхвысоким пространственным разрешением. Метод динамической фазовой микроскопии оказался весьма универсальным инструментом, охватывающим широкий класс биообъектов и регистрирующим динамические процессы с частотами от 0,05 до 500 Гц. Кроме того, высокое пространственное разрешение прибора, позволяет исследовать динамику отдельных органелл клетки.

В процессе реализации методов динамической фазовой микроскопии была выявлена непригодность классического критерия Релея в фазовых изображениях и возможность сверхразрешения [35].

Применение этих методов в биофизике позволило исследовать пространственно-временные флуктуации в органеллах клеток и поучить ряд принципиально новых научных результатов [38-46].

Целью настоящей работы было развитие методов когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии интерференционной микроскопии как новой методологической базы для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени. Следовало показать, что использование достижений оптической электроники позволяет увеличивать быстродействие существующих методов микроскопии для исследования динамики биообъектов в реальном времени. Результатом исследования должна быть новая информация о корреляции фазовой микроморфологии и внутриклеточной динамики с функциональным состоянием биологических объектов.

Предметом исследования были выбраны эритроциты и лимфоциты человека, нервные волокна лягушки, опухолевые клетки и пчелиные споры. Такой спектр объектов не случаен и объясняется желанием расширить возможности метода при исследовании широкого круга биологических объектов; кроме того, подобные исследования представляют актуальность для медицины, биофизики и ветеринарии.

Основные задачи работы:

1. Разработать набор дополнительных модулей к экспериментальной установке для реализации метода локальной динамической микроскопии;

2. Разработать современное программное обеспечение для регистрации обработки и анализа динамических процессов в реальном времени;

3. Реализовать модуляционный метод воспроизведения низкочастотных флуктуаций фазовой толщины;

4. Провести апробацию методов когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии на биологических объектах и сделать следующие эксперименты:

- Исследовать зависимость морфологии и характера динамических процессов в эритроцитах от степени их оксигенирования;

- Исследовать изменение морфологии лимфоцитов при их активации;

- Исследовать действие метаболических ингибиторов на опухолевые клетки НСТ-116;

- Исследовать различия в морфологии нормальных и инактивированных спор Nosema Apis;

- Определить параметры газовых микропузырей, спонтанно возникающих в водных средах;

- Показать, что применение техники Wavelet анализа позволяет выявлять нестационарные динамические процессы в нервных волокнах;

- Дать биофизическую интерпретацию полученным результатам. Краткая аннотация содержания работы:

Во введении кратко обоснована актуальность научной проблемы, описано состояние проблемы в настоящее время, обозначены цели и задачи исследования, приведены сведения о публикации результатов диссертационных исследований автора и краткие сведения о внедрении результатов исследования.

В первой главе отражен анализ известного научно-методического аппарата для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени и показана необходимость его совершенствования. Описаны основные методы, использующиеся для анализа клеточной морфологии и динамики внутриклеточных процессов в биологических объектах, приведены основные результаты работ по обозначенной тематике. В качестве наиболее перспективных выделены методы интерференционной микроскопии и показаны достижения этих методов в области исследования клеточной морфологии и динамики внутриклеточных процессов. В завершении первой главы сформулированы основные выводы и частные задачи исследования.

Во второй главе приведены описания методов локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии, приведены описания экспериментальных установок, на которых выполнялась работа. Рассмотрено программное обеспечение, разработанное для исследования биологических объектов в реальном времени. Показаны основные преимущества и недостатки описанных методов, а также перспективы их развития.

Третья глава посвящена экспериментальному обоснованию научных результатов работы. В этом разделе приведены основные методики и результаты исследования морфологии и динамики различных биологических объектов. Показано, что методы локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния клеток крови, нейронов, спор и опухолевых клеток по ряду морфологических признаков и динамических характеристик.

В заключении формулируются выводы по основным научным результатам исследования, подчеркиваются элементы новизны и вклада, вносимого автором, приводятся сведения об апробации результатов и опубликовании основных материалов диссертационных исследований, отмечаются вопросы, которые не удалось решить, и которые могут служить предметом дальнейших исследований.

Основные положения, вносимые на защиту

1. Предлагаемый автором приборно-методический комплекс может быть использован для неинвазивного исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением.

2. Ввиду относительной простоты и приемлемой точности получаемых результатов методы когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния биологических объектов по ряду морфологических параметров;

3. Результаты проведенных исследований позволяют утверждать что:

- Метод локальной динамической микроскопии позволяет исследовать внутриклеточные процессы биообъектов в реальном времени, что позволяет оценивать их функциональное состояние.

- Фазовая толщина биологических объектов, регистрируемая методами локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии, является объективным количественным параметром, отражающим функциональное состояние ряда биологических объектов.

Краткие сведения о публикации результатов диссертационной работы

По результатам диссертационной работы автором опубликовано 26 научных работы, 12 из которых входят в перечень изданий ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Основные результаты диссертационной работы доложены на 10 научно-практических конференциях, 7 из которых международные.

Сведения о внедрении результатов исследования

По результатам диссертационной работы разработаны методические указания по определению жизнеспособности микроспоридий рода Нозема методом лазерной интерференционной микроскопии.

Благодарности

Научному руководителю Бункину Н.Ф. за помощь в организации работ по теме диссертации, консультанту по спец. части Индукаеву К.В. за помощь в модификации экспериментальной установки, консультанту по биологической части Вышенской Т.В. за помощь в проведении экспериментов и интерпретации результатов, сотрудникам кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. Ломоносова и лично профессору Максимову Г.В. за помощь в подготовке экспериментов и биофизической интерпретации полученных результатов, сотрудникам Академической группы Московского областного научно-исследовательского клинического института им. Владимирского за помощь в приготовлении образцов лимфоцитов, руководству ООО «Лаборатории Амфора» за предоставленный для исследований микроскоп МИМ-310.

Заключение диссертации по теме «Лазерная физика», Игнатьев, Павел Сергеевич

Основные результаты работы

1. Показано, что метод локальной динамической микроскопии позволяет исследовать динамические процессы биологических объектов в реальном времени;

2. Показано, что фазовая толщина лимфоцита является объективным количественным параметром, отражающим степень активации клетки;

3. Показано, что форм фактор jul эритроцитов позволяет количественно различать эритроциты по степени их оксигенирования;

4. Показано, что методы лазерной интерференционной микроскопии позволяют в реальном времени оценивать жизнеспособность спор Nozema apis по ряду морфометрических признаков;

5. В глубоко очищенной воде и в растворе NaCl с концентрацией С = 0.01 М обнаружены спонтанно возникающие частицы микронного размера, обладающие признаками бабстонов или бабстонных кластеров.

6. На стенках эритроцита обнаружены температурно-зависимые фолуктуации фазовой толщины на частотах 2.5-2.8 Гц, вызванные поперечными колебаниями самого эритроцита;

7. При исследовании нервных волокон подтвердили наличие ритмических изменений показателя преломления на частотах 1.0, 0.3 и 0.8 Гц в районе границы перехвата Ранвье, описанных в [124-128], обнаружили повторяющуюся ритмическую компоненту 1,5 Гц (предположительно движение ворсинок швановской клетки), подтвердили наличие ритма 1,0 Гц обнаруженного в нейронах [123] связанного с активностью К+ каналов.

8. На границе ядрышка клеток НСТ-116 обнаружены локальные флуктуации фазовой толщины на частотах 2.5 - 3.0 Гц, вызванные предположительно синтезом прерибосом

Научная новизна работы заключается в том, что разработанные и использованные в настоящей работе методы (Локальная динамическая и Модуляционная интерференционная микроскопия) позволяют проводить неинвазивные исследования морфологии и динамики живых биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением.

Автором диссертации была доработана экспериментальная установка для регистрации динамических процессов в реальном времени, разработано программное обеспечение для регистрации и обработки динамических процессов в реальном времени, реализован модуляционный метод звукового воспроизведения низкочастотных флуктуаций ОРХ, выполнена серия экспериментов по апробации метода для исследования динамических процессов в биологических объектах.

Полученные в ходе работы результаты применяются для клинической диагностики иммунных нарушений, а также для оценки жизнеспособности спор Nosema Apis.

По теме диссертации опубликовано 23 научных работы, 10 из которых опубликованы в журналах, входящих в перечень изданий ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях.

В настоящей работе автору не в полной мере удалось достичь желаемых технических характеристик с использованием достижений оптической электроники и элементной базы. Автором показано, что при использовании современных оптико-электронных компонентов быстродействие и чувствительность метода локальной динамической микроскопии могут быть улучшены как минимум в 5 раз.

В ближайшее время планируется провести серию экспериментов по исследованию динамики стимулированных нейронов и нервных волокон, исследовать взаимодействие бабстонных кластеров с переменным электрическим полем, а также провести исследования морфологии биообъектов в реальном времени с использованием техники автоматического распознавания образов

Заключение

Полученные в ходе работы данные, свидетельствуют о перспективности применения методов локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии для интерактивного анализа морфологии и локальных метаболических процессов в живых микроорганизмах с целью оценки их функционального состояния.

Разработанные экспериментальные установки и программно-методическое обеспечение позволяют в реальном времени исследовать морфологию и динамику широкого класса биологических объектов.

Показана возможность биофизической интерпретации данных и применимость метода для биоскрининга медицинских препаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Игнатьев, Павел Сергеевич, 2010 год

1. B. Brehm-Stecher, E. Johnson, Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications // Microbiology and Molecular Biology Review.-2004. 68. P. 538-559.

2. Yasuaki Naito, Akio Toh-e and Hiro-o Hamaguchi. In vivo time-resolved Raman imaging of a spontaneous death process of a single budding yeast cell// J. Raman Spectrosc.-2005 36. P/ 837-839.

3. D. Carl, B. Kemper, G. Wernicke, G. von Bally. Parameter-optimized digital holographic microscope for high-resolution living-cell analysis // Appl. 0pt.-2004. 43. P. 6536-6544.

4. M. Lazebnik, D. Marks, K. Potgier, R. Gillete, S. Boppart. Functional optical coherence tomography for detecting neural activity through scattering changes // Opt. Lett. 28(14): P. 1218-1220.

5. G. Vishnyakov, G. Levin, V. Minaev, V. Pickalov, A. Likharev, Tomographic interference microscopy of living cells // Europ. J. of Microscopy and Analysis.-2004. 87. P. 19-21.

6. Kleinfeld, A. Laporta, Detection of action potentials in vitro by changes in refractive index // In: Light scattering in neural tissue function, Eds D. Rector and J. George, Humana Press Inc. (2003).

7. Y. Huang, T. Karashima, M. Yamamoto, T. Ogura, H. Hamaguchi. Raman spectroscopic signature of life in a living yeast cell. // J. Raman Spectrosc.-2004. 35. P. 525-526.

8. В. Rappaz, P. Marquet, E. Cuche, Y. Emery, C. Depeursinge, P. Magistretti. Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cell with digital holographic microscopy.// Optics Express.-2005.13 (23). P. 9361-9373.

9. C.A. Пикин. Структурные превращения в жидких кристаллах, //Наука, Москва, 1981.

10. Lu Н.Р., Xun L., Xie X.S. Single-molecule enzymatic dynamics // Science. 1998. Vol. 282. P. 1877-1882.

11. Mehta A. D., Rief M., Spudich J. A., Smith D. A., Simmons R. M. Single-Molecule Biomechanics with Optical Methods // Science. -1999. Vol. 283. P. 1689-1695.

12. Pelling A. E., Sehati, S., Gralla, E. В., Valentine, J. S., and Gimzewski, J.K. Local Nanomechanical Motion of the Cell Wall of Saccharomyces cerevisiae. // Science.-2004. 304, P. 1147.

13. Pelling A. E., Sehati, S., Gralla, E. B. and Gimzewski, J. K. Time Dependence of the Frequency and Amplitude of the Local Nanomechanical Motion of Yeast// Nanomedicine.-2005. 1.P.178.

14. Pelling, A. E., Veraitch, F. S., Chu, C., Nicholls, В. M., Hemsley, A., Mason, C. and Horton, M. A. Mapping correlated membrane pulsations and fluctuations in human cells // J. Molecular Recognit. 2007.

15. Haupt, B. J., Pelling, A. E. and Horton, M. A. Integrated Confocal and Scanning Probe Microscopy for Biomedical Research // TheScientificWorldJOURNAL.-2006. 6. P. 1609.

16. David M. Grant, J. McGinty, E. J. McGhee, T. D. Bunney, D. M. Owen. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events //Optics Express.-2006. Vol. 15. Issue 24. P. 15656-15673.

17. Derrick R. Chou, Bradley A. Bower, and Adam Wax, Low-cost, scalable laser scanning module for real-time reflectance and fluorescence confocal microscopy//Applied Optics. Vol. 44. Issue 11. P. 2013-2018.

18. M. Straub, S. W. Hell. Fluorescence lifetime three-dimensional microscopy with picosecond precision using a multifocal multiphoton microscope//App. Phys. Lett.-1998. 73. P. 1769-1771.

19. T. Collier, P Shen, В Pradier, Kung-Bin Sung. Near Real Time Confocal Microscopy of Amelanotic Tissue: Dynamics of Aceto-Whitening Enable Nuclear Segmentation 2000 // Optics express. Vol. 6. No. 2.

20. T. Tanaami, S. Otsuki, N. Tomosada, Y. Kosugi, M. Shimizu, and H. Ishida. High-Speed 1-Frame/ms Scanning Confocal Microscope with a Microlens and Nipkow Disks // Appl. 0pt.-2002. 41. P. 4704-4708.

21. T. Ikeda, G. Popescu, R.R. Dasari. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems // Opt. Lett.-2005. 30.10. P. 1165-1168.

22. N. Lue, G. Popescu, T. Ikeda, R. Dasari, K. Badizadegan, M. Feld. Live cell refractometry using microfluidic devices // Opt. Lett. 31(18). P. 2759-2761.

23. Y. Park, G. Popescu, K. Badizadegan, R. Dasari, M. Feld. Diffraction phase and fluorescence microscopy // Opt. Expr.-2006 14(18). P. 8263-8268.

24. Popescu G., Badizadegan K., Dasari R.R., Feld M.S. Observation of dynamic subdomains in red blood cells // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. № 4. P. 040503.

25. Вест Ч. Топографическая интерферометрия // M.: Мир, 1982.-С.504.

26. Метелин В.Б., Минаев B.JL, Валов A.JL, Конрадов А.А., Василенко И.А., Бабакова С.В. Компьютерная фазовоинтерференционная микроскопия в биологии и медицине // Сборник научных трудов. -2003.- г.Красноярск.

27. Левин Г.Г., Ковалев А.А., Минаев В.Л., Сухоруков К.А. Оценка точности измерения сухой массы клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе // Измерительная техника.- 2004.- С.62-67.

28. Левин Г.Г., Булыгин Ф.В., Вишняков Г.Н. Когерентные осцилляции состояния молекул белка в живых клетках // Цитология. — 2005. Т.47. №4. С.348-356.

29. Власов Н.Г. Получение изображений на основе использования когерентных свойств зондирующего излучения. // ЖНПФ,- 1999. Т.4. №5. С.67-74.

30. Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. Tomographic interference microscopy of living cells //Microscopy and Analysis.-2004. 87.p. 19-21.

31. Carol J. Cogswell, Kieran G.Larkin, Hanno U. Klemm. Fluorescence microtomography: Multi-angle image acquisition and 3D digital reconstruction // Proc. SPIE.- 1996.- V.2655.- P.109-115.

32. Кононенко B.JI. Фликкер эритроцитов. 1. Обзор теории и методов регистрации // Биол. мембраны. -2009. Т. 26. № 5. С. 352-369.

33. Кононенко В.Л., Шимкус Я.К. Когерентное и некогерентное оптическое зондирование динамических флуктуаций формы эритроцитов // Изв. РАН. Сер. физическая.- 1999. Т. 63. № 6. С. 1166— 1172.

34. Кононенко В.Л., Шимкус Я.К. Спонтанные и вынужденные колебания клеточной мембраны нормальных эритроцитов человека: отсутствие резонансных частот в области 0.03-500 Гц // Биол. мембраны. -2000. Т. 17. № 3. С. 289-301.

35. Kononenko V.L. Flicker spectroscopy of erythrocytes: a comparative study of several theoretical models // Proc. SPIE. -1994. V. 2082. P. 236-247.

36. Кононенко В.Л. Соотношение регулярности и хаотичности в динамике индивидуальных эритроцитов: Дис. д-ра физ.-мат. наук. М.: ИБХФ РАН, 2007. С. 288.

37. Kononenko V.L. Dielectro-deformations and flicker of erythrocytes: fundamental aspects of medical diagnostics applications // Proc. SPIE. -2002. V. 4707. P. 134-143.

38. Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов // Успехи физических наук,- 2001. 171. 6. С.649-662.

39. Лопарев А.В., Кретушев А.В., Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия: новый метод идентификации внутриклеточных структур по их оптическим и морфометрическим параметрам// Биофизика. 53. 2. С. 299-304.

40. В. П. Тычинский. Сверхразрешение и сингулярности в фазовых изображениях//УФН.-2008. 178.11. С. 1205-1214.

41. А.В. Кретушев, В.П. Тычинский. Сверхразрешение в сингулярных точках фазовых изображений // Кв. Электроника.-2002. 32.1. С. 66-70.

42. Тычинский В.П. Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой? // УФН.- 2007.177. С. 535-552.

43. Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Vyshenskaya T.V., Tikhonov A.N. A dynamic phase microscopy study of optical characteristics of individual chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta.-2004. 1665. C. 57-64.

44. Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Vyshenskaya Т. V., Tikhonov A.N. Coherent phase microscopy in cell biology: visualization of metabolic states // Biochim. Biophys. Acta.-2005. 1708. C. 362-366.

45. Тычинский В.П., Д. Вайсс, Вышенская Т.В., Ягужинский Л.С., Никандров С.Л. Кооперативные процессы в митохондриях: регистрация методом динамической фазовой микроскопии // Биофизика. 45(5). С. 870-877.

46. Тычинский В.ПКретушев., А.В., Клемяшов И.В., Вышенская Т.В., Штиль А.А., Зацепина О.В. Когерентная фазовая микроскопия -новый подход к исследованию физиологического состояния ядрышка// ДАН.-2005. 405(4). С. 432-436.

47. Tychinsky V. P., Kretushev A.V. , Klemyashov I.V., Reshetov I.V., Vyshenskaja T.V., Shtil A.A. The nucleolus and cellular stress: analysis by coherent phase microscopy, Tech. Proc. of the 2006 // Nanotechnology Confer. Boston, V. 2 (2006).

48. Tychinsky V. P., On superresolution of phase objects. // Opt. Comm.-1989. 74(1,2). C. 41-45.

49. Тычинский В.П., Тавров A.B., Шепельский Д.О., Щучкин А.Г., Экспериментальное подтверждение возможности сверхразрешения фазовых объектов // Письма в ЖЭТФ.-1991. 17(22) С. 80-83.

50. Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. // Microscopy and Analysis.-2004. 87.P. 19-21.

51. A.R. Brazhe, N.A. Brazhe, G.V. Maksimov, P.S. Ignatyev, A.B. et al. Phase-modulation laser interference microscopy: an advance in cell imaging and dynamics study // J Biomed Opt. 2007. Vol. 3. № 13.

52. Максимов Г.В. Регистрация методом ДФМ характерных частот флуктуаций фазовой высоты участков миелинового нервного волокна в покое и при стимуляции // Биофизика.-2002. 47. 2 С. 345-351.

53. Ерохова JI.A., Новиков С.М., Лазарев Г.Д., Казакова Т.А., Орлов Д.А., Индукаев К.В., Максимов Г.В. // Бюл. эксп. биол. и мед.-2005. 140. С. 237.

54. Sosnovtseva O.V., Pavlov A.N., Brazhe N.A., Brazhe A.R., Erokhova L.A., Maksimov G.V., Mosekilde EM Phys.Rev.Lett.-2005. 94. C. 218103.

55. Каюшин Л.П. и Людковская Р.Г. Изучение интерференционным методом упруго-объемных изменений в нерве при возбуждении. ДАН.-1995. 2. С. 253-255.

56. Колье O.P. Максимов Г.В. Раденович Ч.Н. // Биофизика ритмического возбуждения. Издательство МГУ 1993.

57. V. A. Andreev, К. V. Indukaev. The problem of subrayleigh resolution in interference microscopy., Journal of Russian Laser Research, V. 24, November 3, 2003.

58. A.B. Лопарев, П.С. Игнатьев, K.B Индукаев, П.А. Осипов, И.Н. Мазалов, A.B. Козырев. Высокоскоростной модуляционный интерференционный микроскоп для медико-биологических исследований. // Измерительная техника.- 2009. № 11. С. 60-64.

59. Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Лопарев A.B., Осипов П.А. Модуляционная интерференционная микроскопия // Материалы конференции XI Международного форума Высокие технологии XXI века. М., 2008. С. 78-80.

60. Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Лопарев A.B., Осипов П.А. Новое поколение лазерных микроскопов для медико-биологическихисследований // Материалы конференции цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты. М.2009. С. 34-36.

61. Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Лопарев А.В., Осипов П.А. Новые аспекты применения МИМ 310 для нанометрологии // Материалы конференции «Высокие технологии XXI века, М. 2009. С 17-22.

62. Борн М., Вольф Э. Основы оптики / Наука, 1970, С.720.

63. Солимено С., Крозиньяни Б., Ди Порто П. Дифракция и волноводное распространение оптического излучения / М, Мир, 1989, С.664.

64. Allen R.D., Travis J.L., Allen N.S., and Yilmas H. // Cell Motility.-1981. 1.275 C. 291.

65. Allen R.D., and Allen N.S. //J. Microsc.-21983.3.P.129.

66. Allen R.D// Ann.Rev.Biophys.Chem.-1985 14, P. 265.

67. Innoue S., Spring K.R. Video Microscopy: The Fundamentals // New York: Plenum Press, 1997.

68. Weiss D.J., and Maile W. Electronic Light Microscopy, New York, Wiley-Liss, 105 (1993); in Light Microscopy in Biology A Practical Approach (Ed. A.J. Lacey) (Oxford University Press, 1999).

69. Schneider et al., in Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes, Vol.2 (ed. J. Slavic) (New York: Plenum Press, 1998).

70. Баранова Н.Б., Зельдович Б ЯЛ ЖЭТФ-1981, 80, С. 1789.

71. Баранова Н.Б., Зельдович Б.Я., Мамаев А.В. // ЖЭТФ.- 1982. 83. С. 1702.

72. Bazhenov V.Yu., Soskin M.S., Vasnetsov M.V.// J.Mod.Optics.-1992,39, P. 985.

73. Basistiy I.V., Bazhenov V.Yu., Soskin M.S., Vasnetsov M.V. // Opt. Commun.-1993. 103. P. 422.

74. Даршт М.Я., Зельдович Б.Я., Катаевская И.В., Кундикова Н. Д. // ЖЭТФ.-1995. 107. С. 1468.

75. G. Yishnyakov, G. Levin, V. Minaev, V. Pickalov, A. Likharev, Tomographic interference microscopy of living cells // Europ. J. of Microscopy and Analysis.-2004. 87. P. 19-21.

76. Кардашова 3.3., Лезвинская E.M., Метелин В.Б. Современный взгляд на диагностику и лечение эритродермических вариантов злокачественных лимфом кожи // Лечащий врач. -2007. 9. С.22-25.

77. Ватазин А.В., Валов А.Л., Василенко И.А., Метелин В.Б. Параметры иммунокомпетентных клеток как критерий ранней диагностики отторжения ренального трансплантата // Вопросы современной клинической медицины. Пенза. ПТУ. 2006. С.58-59.

78. Korcakova L., Pekarek J., Rovensky J., Trnavsky K., Lukac J. Lymphocyte nucleolar activation as a marker of autoimmune disorders // Immunology. 31. P. 803-805.

79. Kysela K., Philimonenko A. , Philimonnenko, Janacek J., Kahic M., Hozak P. Nuclear distribution of actin and myosin I depends on transcriptional activety of the cell. Histochem // Cell Biol. -2005. 124. P. 347-358.

80. T.Karu. Low power laser therapy // Biomedical photonics handbook. Ch.48.CRC Press LLC, 2003.

81. Игнатьев П.С., Вышенская Т.В., Тычинский В.П., Василенко И.А. Исследование активации лимфоцитов методом Когерентной Фазовой Микроскопии // Альманах клинической медицины. -2008. Т.4. С. 65-67.

82. Игнатьев П.С., Василенко И.А.,. Вышенская Т.В., Метелин В.Б, Тычинский В.П. Исследование активации лимфоцитов методом Когерентной Фазовой Микроскопии // Вестник РАМН (принято в печать).

83. Ignatyev P.S., Tychinsky V.P., Vyshenskaya T.V., Metelin V.B., Vasilenko I.A. Investigation of lymphocyte activation by coherent phase microscopy // Proceedings of the topical meeting on optoinformatics, St. Petersburg, 2008.

84. Игнатьев П.С., Тычинский В.П., Вышенская T.B., Василенко И.А., Метелин В.Б. Исследование активации лимфоцитов методом Когерентной фазовой микроскопии // Материалы VI Международной научно-технической конференции Intermatic-2008. С. 157-159.

85. Е. Evans, Y.C. Fung, Improved measurements of erythrocyte geometry // Microvascular Researc.-1972. 4(4) P. 335-338.

86. S.M. Lewis, B.J. Bain, I. Bates, Dacie and Lewis practical hematology, 9th ed. Churchhill Livingstone, (2001)

87. D. Faber, M. Aalders, E. Mik, B. Hooper, M. Gemert, T, Leeuwen, Oxigen saturation-dependent absorption and scattering of blood, //Phys. Rev. Lett.-2004. 93. P. 9.

88. B. Rappaz, A. Barbul, F. Carriere, J. Kuhn, P. Marquet, R. Korenstein, C. Depeursinge, P. Magistretti, Erythrocyte volume and refractive index measurement with a digital holographic microscope // Proc. SPIE.-2007 v. 6445.

89. С. Curl, С. Bellair, В. Allman, A. Roberts, К. Nugent, P. Harris, L. Delbridge. Measurement of red blood cell volume changes in response to osmotic stimuli using quantitative phase microscopy // QPmbioApp.12.

90. Сохликов А.Б., Игнатьев П.С., Лазерная интерференционная микроскопия при нозематозе // Пчеловодство. 2008. №6. С. 31-33.

91. L. Bailey, Effect of Fumagillin upon Nosema apis (Zander) // Nature. 171. P. 212 213.

92. P. N. Pusey and W. van Megen, // Phys. Rev. Lett.- 1987. 59. P.2083.

93. K. Schatzel and B. J. Ackerson// Phys. Rev. E. -1993. 48. P.3766.

94. J. L. Harland and W. van Megen // Phys. Rev. E.-1997. 55.P. 3054(1997)

95. P. Jiang and M. J. McFarland // J. Amer. Chem. Soc.-2004. 126,1378.

96. H. Ф. Бункин, Ф. В. Бункин// ЖЭТФ. -1992. 100. С 512.

97. Н. Ф. Бункин, Ф. В. Бункин //ЖЭТФ.-2003. 123. 828.

98. N. F. Bunkin, К. V. Indukaev, P. S. Ignat'ev. Spontaneous self-organization of microbubbles in a liquid // Sov Phys JETP. -2007. 104:3. P. 486.

99. N. F. Bunkin, N. V. Suyazov, A. V. Shkirin, P. S. Ignat'ev, К. V. Indukaev. Study of nanostructure of highly purified water by measuring scattering matrix elements of laser radiation // Phys Wave Phen. -2008. 16:4. P. 243.

100. N. F. Bunkin, N. V. Suyazov, V. Shkirin, P. S. Ignatiev, К. V. Indukaev. Nanoscale structure of dissolved air bubbles in water as studied by measuring the elements of the scattering matrix // The journal of chemical physics.-2009.130. 1.

101. S. Rao, S. Balint, B. Cossins, V. Guallar, D. Petrov, Raman Study of Mechanically Induced Oxygenation State Transition of Red Blood Cells Using Optical Tweezers // Biophysical Journal. -2009 V. 96. 1. P. 209216.

102. P. Suga'r, K. Blasko, S. Gyorgyi, L. V. Shcagina, V. V. Malev, Cooperative Binding of Primycin and Gramicidin on Erythrocyte Membranes. A Cation Transport Study // Molecular Membrane Biology. -989. Vol. 8, No. l.P 1-10.

103. G. Popescu, Y. Parka, W. Choia, R. Dasaria, M. Felda, K. Badizadegan, Imaging red blood cell dynamics by quantitative phase microscopy // Blood Cells Molecules and Diseases.-2008. Vol. 41. Issue 1. P. 10-16.

104. Тычинский В.П., Вайсс Д., Вышенская Т.В., Ягужинский Л.С., Никандров С.Л.// Биофизика.-2000. 45. Р. 870.

105. Максимов Г.В., Никандров C.JL, Лазарева Е.С., Тычинский В.П., Рубин А.Б. // Бюл. эксп. биол. и мед.-2001. 131, С. 539.

106. Максимов Г.В., Никандров С.Л., Лазарева Е.С., Тычинский В.П. // Биофизика 47, 345 (2002)

107. Addison, P. S. The illustrated wavelet transform handbook. London, UK: IOP Publishing Ltd. 2002.

108. Allen, R. D. New observations on cell architecture and dynamics by video-enhanced contrast optical microscopy // Annu. Rev. Biophys. Cheml985. 14. P. 265-290.

109. Cohen, L. В., Keynes, R. D. & Hille, В. Light scattering and birefringence changes during nerve activity//Nature 1968. 218. C. 438-441.

110. Brazhe, N. A., Erokhova, L. A., Churin, A. A. & Maksimov, G. V. The relation of differentscale membrane processes under nitric oxide influence // J. Biol. Phys.-2005. 31. P. 531-546.

111. Brazhe, N. A., Brazhe, A. R., Pavlov, A. N., Erokhova, L. A., Yusipovich, A. I., Maksimov, G. V.,Mosekilde, E. & Sosnovtseva, О. V. Unravelling cell processes: interference imaging interwoven with data-analysis // J. Biol. Phys. -2006. 32. P. 191-208.

112. A.R. Brazhe, N.A. Brazhe, G.V. Maksimov, P.S. Ignatyev, A.B. et. al. Phase-modulation laser interference microscopy: an advance in cell imaging and dynamics study // J Biomed Opt. 2007. Vol. 3. - № 13. -034004

113. Иванов А.Б., Кретушев А.В., Игнатьев П.С., Тычинский В.П. и др. Растровый метод локализации динамических областей клетки // Российские нанотехнологии. 2007. - №6. - С. 54-59

114. Ivanov, A. Kretushev, P. Ignatiev, V. Tychinsky. Digital phase image processing of live cells: mapping of metabolic active areas // Proceedings of the topical meeting on optoinformatics, St. Petersburg. 2008.

115. P. Ignatyev, A. Ivanov, A. Kretushev, V. Tychinsky .Dynamic phase microscopy: a new method of theinteractive real-time investigations of local metabolic activity // Proceedings, Laser Applications in life sciences Moscow. 2007. TuL 03P4.

116. A. Ivanov, P. Ignatyev, A. Kretushev, V. Tychinsky. Coherent Phase Microscopy: New technique for location of intracellular dynamic processes // Proceedings, Laser Applications in life sciences . Moscow. 2007. TuL 03P7

117. Ю.С. Ченцов, Введение в клеточную биологию, // ИКЦ «Академкнига», 2004.

118. Yu-li, K. Hahn, R. Murphy, A. Horwitz. From imaging to understanding: Frontiers in live cell imaging // J. Cell Biol. 174 (2006) 481484.

119. T. Hattori, K. Watanabe, Y. Uechi, H. Yoshioka, Y. Ohta. repetitive transient depolarizations of the inner mitochondrial membrane induced by proton pumping // Biophys. J. 88(3): 2340-2349 (2005).

120. Donnert, G., J. Keller, R. Medda, M. A. Andrei, S. O. Rizzoli, R. Liihrmann, R. Jahn, C. Eggeling, S. W. Hell, Macromolecular-scale resolution in biological fluorescence microscopy// PNAS 103 ;11440-11445 (2006).

121. B. Rappaz, P. Marquet, E. Cuche, Y. Emery, C. Depeursinge, P. Magistretti, Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cell with digital holographic microscopy // Optics Express 2005, 13 (23). P. 9361-9373.

122. J. Millerd, N. Brock, J. Hayes, M. North-Morris, M. Novak, J. Wyant, Pixelated phase-mask dynamic interferometer // Proc. SPIE.- 2005. 5531. P. 304-316.

123. R. Langoju, A. Patil, P. Rastogi, Super-resolution Fourier transform method in phase shifting interferometry // Optics Express.- 2005. 13(18). P.7160-7173.

124. T. Ando, N. Kodera, E. T. Maruyama, K. Saito, A. Toda, A highspeed atomic force microscope for studying biological macromolecules, // PNAS. -2001. 98 P. 12468-12472.

125. H. Fried, U. Kutay, Nucleocytoplasmic transport: taking an inventory // Cellular and Molecular Life Sciences. -2003. 60. P. 1659-1688.

126. I. Raska, P. Shaw, D. Cmarko, Structure and function of the nucleolus in the spotlight // COCEBI.- 2006. 18: P. 1-10.

127. C. Mayer, H. Bierhoff, I. Grummt, The nucleolus as a stress sensor, // Genes&Development.-2005. 19. P. 933-941.

128. Grummt. Life on a planet of its own: regulation of RNA polymerase I transcription in the nucleolus // Gen&Dev.- 2003. 17. P. 16911702.

129. M. Dundr, Urs Hoffmznn-Rohrer, Quyue Ни, I. Grummt, L. Rothblum, R. Phair, T. Misteli. A kinetic framework for mammalian RNA polymerase in vivo // Science.- 2002. 298. P. 1623-1626.

130. D. Jackson, A. Pombo, F. Ibora. The balance sheet for transcription: an analysis of nuclear RNA metabolism in mammalian cells, // FASEB 2000. 14. P. 242-254.

131. Тычинский В.П., Голубев C.C., Вышенская T.B., Кретушев А.В., Ягужинский JI.C. Электро-оптический эффект в многослойных фосфолипидных мембранах // Биологические Мембраны.- 2005. 22(2). С. 131-136.

132. М. Gurau, G. Kim, Soon-Mi Lim, F. Albertorio, H. Fleisher, P. Cremer, Organization of water layers at hydrophilic interfaces // ChemPhysChem. -2003. 4. P.1231-1233.

133. S.J. Chen, K. Dill, RNA folding energy landscapes // PNAS.-2000. 97 .P.133-138.

134. L. Li, L.A. Mirny, E.I. Shakhnovich, Kinetics, thermodynamics and evolution of non-native interactions in a protein folding in folding nucleus // Nat. Struct. Biol. -2000. 7. C. 336-342 ().

135. C.A. Пикин, Структурные превращения в жидких кристаллах // Наука, Москва. 1981.

136. М. Derenzini, G. Pasquinelli, M.-F. O'Donohue, D. Ploton, Structural and functiomal organization of ribosomal genes within the mammalian cell nucleolus // J. of Hystochem&Cytochem.- 2006. 54(2). P. 131-145.

137. M. Dundr, T. Misteli, Functional architecture in the cell nucleus // Biochem. J. -2001. 356 P. 297-310.

138. T. Cheutin, M,-F. O'Donohue, A. Beorchia, M. Vandelaer, H. Kaplan, B. Defever, D. Ploton, M. Thiry. Three-dimensional organization of active rRNA genes within the nucleolus // J. of Cell Science 115: 3297-3307 (2002).

139. Yun Wah Lam, L. Trinkle-Mulcahy, A. Lamond, The nucleolus //J. of Cell Science.-2005. 118. P. 1335-1337.

140. R. White. RNA polymerases I and III, growth control and cancer // Nature Reviews, Molecular Cell Biology.-2005. P. 69-78.

141. Andreev, V. A. Indukaev, K. V. Phase modulation microscope MIM-2.1 for measurements of surface microrelief. General principles of design and operation // J. Russian Laser Res.-2005.26. P. 380-393.

142. Описание электроники Апувсап 4 В состав электронного блока входят:

143. Импульсный двух полярный преобразователь напряжения РББОЗПВ с последующей схемой стабилизации напряжения.

144. Рисунок 1 Стабилизированный преобразователь напряжения

145. Генератор модулирующего сигнала, форма выходного сигнала -пила, амплитуда 50 В., частота -60 Гц

146. Рисунок 2 Схема генератора модулирующего сигнала с умножителем напряжения.

147. Резистор Л7 и конденсатор С6 задают частоту колебаний керамики, резистор Я6- амплитуду колебаний

148. Рисунок 3 Схема генератора линейно меняющегося напряжения.

149. Генератор опорного меандра необходимого для определения момента запуска АЦП.оит.1 х; .л2 .

150. Рисунок 4 Схема генератора опорного меандра.

151. Упрощенная схема генератора сигнала прямоугольной формы, очень близким к меандру, изображена на Рис 4.с