Исследование внутриклеточных процессов методом динамической фазовой микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.27.03, кандидат технических наук Никандров, Сергей Леонидович

• Никандров, Сергей Леонидович
• кандидат технических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат технических наук Никандров, Сергей Леонидович

Введение

Глава I. Современные методы прижизненной микроскопии биообъектов

Глава II. Описание экспериментальной установки

2.1. КФМ «Цитоскан»

2.2. Диссектор

Глава III. Принципы динамической фазовой микроскопии

3.1. Количественные данные, получаемые методом ДФМ

3.2. Влияние фокусировки на фазовое изображение сфер латекса

3.3. Получение высокого разрешения на фазовых изображениях вирусов

Глава IV. Апробация метода

4.1. Эксперимент с пьезокерамикой

4.2. Измерения испарения жидкости - модели с измененяющейся оптической разностью хода

4.3. Регистрация активности в клетке лука. Возможность построения динамической модели

Глава V. Основные результаты измерений, полученные методом ДФМ

5.1. Влияние ионов N02~ на фазовое изображение эритроцитов

5.2. Получение динамических характеристик подвижности бактерий Pseudomonas

5.3. Исследование влияния пролонгированного возбуждения на миелиновое нервное волокно

5.4. Регистрация работы кластеров АТФ-азы в мембранах липосом юз

5.5. Исследование активности митохондрий при АТФ-стимулировании

5.6. Регистрация внутриядерной динамики конденсации хроматина клеток СПЭВ в норме и при апоптозе

5.7. "Картирование" активности биологического объекта методом ДФМ 14g

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование внутриклеточных процессов методом динамической фазовой микроскопии»

Неинвазивные методы оптической прижизненной микроскопии занимают особое место в арсенале современных средств, поскольку они, в отличие от сканирующей электронной микроскопии и туннельной микроскопии, допускают исследования на клеточном уровне биообъектов в нативном состоянии.

Основные недостатки традиционной оптической микроскопии биообъектов, присущие в различной степени фозоконтрастным и конфокальным микроскопам, состоят в ограниченном пространственном разрешении и в необходимости окрашивания объектов для усиления контраста.

Конформационные изменения и движения органелл сопровождаются, как правило, заметным изменением оптической разности хода (ОРХ) в их интерференционном изображении, в то время как изменение локального поглощения света, регистрируемое в обычных амплитудных изображениях, может быть незначительным и недоступным измерениям.

Также хорошо известно, что наблюдение внутриклеточных динамических процессов является источником очень важной информации о митозе, трансмембранном транспорте, формировании цитоскелета и влиянии на клетку внешних факторов. Видеофильмы дают хорошее общее представление о совокупности процессов в реальном времени, но не позволяют получать локальные количественные характеристики.

В последние годы появилась перспектива преодоления этих ограничений методами лазерной фазовой микроскопии. Здесь следует отметить, что помимо сверхразрешения (при больших числовых апертурах объективов здесь возможно значительное (до 5 раз) превышение над классическим пределом разрешения) не менее важным достоинством компьютерного фазового микроскопа (КФМ) «Цитоскан» и предлагаемого метода динамической фазовой микроскопии (ДФМ) является высокая чувствительность к локальным временным изменениям фазы, что позволило наблюдать внутриклеточные динамические процессы с разрешением по времени до 1 мс, получать Фурьеспектры и другие статистические характеристики в произвольных точках или сечениях объекта. Эта особенность фазового метода имеет решающее значение для биологических применений, что позволило получить ряд новых результатов на различных биообъектах.

Настоящая диссертационная работа посвящена экспериментальному подтверждению возможности исследования биообъектов методом ДФМ на КФМ «Цитоскан», что позволит расширить область применения лазерных интерферометров в биофизике и медицине.

Приведем основные положения, выносимые на защиту:

1. Возможность получения высокого латерального разрешения в фазовых изображениях непротяженных структур, таких как сферы латекса-100 нм.

2. Соответствие экспериментальных данных, полученных методом ДФМ, теоретическим при условии наличия адекватной физической модели.

3. Доказана возможность использования метода ДФМ при исследовании следующих явлений:

- регистрации ритмических ответов мембранных структур миелинового нервного волокна при ритмическом возбуждении;

- работы АТФ-азы, встроенного в мембрану липосомы;

- влияния АТФ на характер флуктуаций ОРХ мембранных структур митохондрий;

- процессов, происходящих в клетках СПЭВ на разных стадиях клеточного цикла.

4. Возможность "картирования" живой клетки методом ДФМ.

Заключение диссертации по теме «Квантовая электроника», Никандров, Сергей Леонидович

Выводы. Основной целью методов прижизненной микроскопии является получение новой количественной информации о внутриклеточных процессах и ее интерпретация в соответствии с современными представлениями. Для установления причинно-следственных связей во временных процессах необходимо одновременно производить измерения в нескольких участках объекта.

Примером фундаментальной задачи, в которой решающее значение имеет изучение последовательности динамических процессов, может служить исследование фаз митотического цикла в ядре. Например, в фазе С1 характерным процессом является интенсивный синтез рибосом в ядрышках. Затем в 8-фазе происходит активный транспорт аминокислот через ядерную мембрану и репликация хромосом. В профазе - образование центриолей и веретена. Многие из этих процессов имеют характерные признаки самоорганизации и пространственно-временной корреляции. Можно предполагать, что кроме хорошо изученных структурных изменений они будут также сопровождаться более быстрыми конформационными изменениями с характерными временными параметрами (амплитудами, периодами).

Поэтому, "картирование" клетки методом ДФМ может стать источником новой важной дополнительной информации для генной инженерии и биотехнологии.

В заключение, сформулируем основные выводы диссертационной работы:

1. Экспериментально подтверждена возможность получения высокого латерального разрешения в фазовых изображениях непротяженных структур, таких как сферы латекса-100 нм.

2. Проведенные измерения фиксированных образцов различных вирусов и риккетсий позволили получить фазовые изображения реальных биологических объектов с размерами от 0,1 мкм, что находится вне обычных пределов оптического разрешения.

3. Апробированы алгоритм проведения измерений и методика обработки данных.

4. Исследование процесса испарения жидкости методом ДФМ показано соответствие экспериментальных данных теоретическим при условии наличия адекватной физической модели.

5. Обнаружены и экспериментально исследованы методом ДФМ следующие явления:

- влияние ионов на NO2 на размер эритроцитов;

- получены численные значения величин, характеризующих подвижность бактерий Pseudomonas;

- ритмический ответ миелинового нервного волокна на пролонгированное возбуждение;

- работа кластеров АТФ-азы, встроенных в мембрану липосомы;

- изменения характера флуктуаций ОРХ у митохондрий при АТФ-стимулировании;

- процессы, происходящие в клетках СПЭВ на разных стадиях клеточного цикла.

6. Проведено "картирование" клетки Vero методом ДФМ, что позволило выявить распределение областей с равной активностью по всему исследуемому объекту.

Данные, получаемые методом ДФМ, в ряде случаев, носят уникальный характер. Это позволит в будущем получить новую дополнительную информацию в таких областях, как биофизика, биохимия, цитология, токсикология, медицина и др. Поэтому есть все основания полагать, что разработанный метод дополнит арсенал средств, находящийся у современного исследователя.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Никандров, Сергей Леонидович, 2000 год

1. Innoue S. Video Microscopy, New York: Plenum, 1986.

2. Dieter G.Weiss, Dieter Seitz-Tutter, George M.Langford. Characteristics of the motor responsible for the gliding of native microtubules from squid axoplasm, J. of cell science, S14, pp. 157-161, 1991.

3. Weiss D.G., Maile W. Principles, practice and applications of video-enhanced microscopy, Chapter in Electronic Light Microscopy, New York: Wiley-Liss, pp. 105-140, 1993.

4. Hiroyuki Noji, Ryohei Yasuda, Masasuke Yoshida, Kazuhiko Kinosita Jr. Direct observation of the rotation of FrATPase // Nature / vol. 386, pp. 299-302, 1997.

5. Evert L. de Beer, Annamiek M.A.T. Sontrop, Miklos S.Z.Kellermayer, Czaba Galambos, Gerald H. Pollack. Actin-filament motion in the in vitro motility assay has aperiodic component, Cell Motility, 38, pp. 341-350, 1997.

6. C. Rotsch, K. Jacobson, M. Rademacher. The dynamic of active and stable edges in motile fibroblasts investigated by atomic force microscopy, Proc. Natl. Acad. Sci. 96, pp. 921-926, 1999.

7. Rademacher M. Measuring the elastic properties of biological samples with the atomic force microscopy, IEEE Eng. In Med. And Biol., 16 (2), pp. 47-57, 1997.

8. M.Straub, S.W. Hell. Fluorescence lifetime three-dimensional microscopy with picosecond precision using a multiphoton microscope, Appl. Phys. Lett., vol. 73, 13, pp. 1769-1771, 1998.

9. Андрущак E.A., Левинсон Г.Р., Тычинский В.П. Активный лазерный профилограф, Новые элементы в информационных системах, МИРЗА, М., с. 85-90, 1977.

10. Андрущак Е.А., Тычинский В.П. Применение лазерной микроинтерферометрии для изучения оптических и физических свойств тонких пленок, Новые элементы в информационных системах, МИРЭА, М., с. 91-106, 1977.

11. Тычинский В.П., Бабенко В.П., Панков В.Л. Прецизионный лазерный измеритель микроперемещений, Новые элементы в информационных системах, МИРЭА, М., с. 107-109,1977.

12. Бабенко В.П., Панков В.Л., Тычинский В.П. Интерферометр для наблюдения медленных процессов деформации и релаксации материалов, Заводская лаборатория, т.45, № 8, с. 770-772, 1979.

13. Андрущак Е.А., Тычинский В.П. Цифровая фазометрическая система счета целой и дробной доли полосы для гомодинного микроинтерферометра, ПТЭ, с. 169-173, 1980.

14. Андрущак Е.А., Тычинский В.П. Устройство реверсивного счета полос для гомодинного интерферометра, ПТЭ, с. 173-175, 1980.

15. Фунтиков А.И., Андрущак Е.А., Орехова Т.С., Тычинский В.П., Эршлер Л.Б. Интерферометрический метод измерения электромодуляции фазы световой волны, отраженной от электрода, Электрохимия, т. 17, с. 1763-1770, 1981.

16. Андрущак Е.А., Вилков С.А., Поддубняк В .Я., Тычинский В.П. Измеритель топографии ультразвуковых колебаний поверхности, Электронная промышленность, вып. 7, с. 103, 1981.

17. Андрущак Е.А., Вилков С.А., Мазалов И.Н., Тычинский В.П. Лазерно-интерферометрический измеритель спектров сложных механических колебаний, Электронная промышленность, вып. 8, с. 104, 1981.

18. Андрущак Е.А. Квазиоптимальная лазерно-интерферометрическая система для топографирования вибрационных полей, Вибрационная техника, М., с.78-82, 1984.

19. Андрущак Е.А., Силин И.В., Тычинский В.П. Поликвадратурный гомодинный лазерный виброметр, Вибрационная техника, М., с.82-83, 1984.

20. Андрущак Е.А. Лазерно-интерферометрический виброметр диффузных объектов, Вибрационная техника, М., с.83-88, 1984.

21. Андрущак Е.А., Силин И.В. Корреляционный метод лазерной интерферометрии для измерения амплитуд колебаний диффузных объектов, Лазерн. средства измерений и перспективы их прим-я, Киев, с. 3-8, 1985.

22. Андрущак Е.А., Носов С.А., Гладышев В.В. Лазерное профилографирование поверхности, Лазерн. средства измерений и перспективы их прим-я, Киев, с. 110-115, 1985.

23. И.Н.Мазалов, К.Б.Самсонов, В.П.Тычинский. Измерительный комплекс для объективного контроля микрорельефа полупроводниковых структур. Электронная промышленность, № 5, с. 54, 1987.

24. Тычинский В.П. Компьютерный фазовый микроскоп, Знание, М., с. 64, 1989.

25. Tychinsky V., Masalov L, Pankov V., Ublinsky D. Computerized Phase Microscope for Investigation of Submicron Structures, Optical Communications, 74, pp. 37-40, 1989.

26. Тычинский В.П., Тавров А.В. Компьютерный поляризационный микроскоп, Письма в ЖТФ, т.5, № 10, с. 36-41, 1989.

27. Тычинский В.П., Тавров А.В. Лазерный компьютерный микроскоп с разрешением 10 нм, Квантовая электроника, № 3, с. 264, 1990.

28. С.С.Ветохин, И.Р.Гулаков, А.Н.Перцев. Одноэлектронные фотоприемники, Э н ер го атом из дат, 1986.

29. Y.P. Tychinsky, E.V. Perevedentseva, T.V. Vyshenskaya, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. The method of measurements of living cell dynamics. Proceedings of SP1E, 1995.

30. V.P. Tychinsky, E.V. Perevedentseva, T.V. Vyshenskaya, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. Imaging of Living Cell in Real Time. Proceedings of SPIE, vol.2926, p.289, 1996.

31. C.JI. Никандров. Регистрация динамических процессов в биообъектах на компьютерном фазовом микроскопе «Цитоскан» // Сборник трудов XLVIII научно-технической конференции МИРЭА / часть 2, с.28, 1999.

32. В.Г. Потемкин. Система MATLAB, Справочное пособие, М., 1997.

33. В.П. Тычинский, Г.Э. Куфалъ, Т.В. Вышенская, Е.В. Переведенцева, С.Л. Никандров. Измерения субмикронных структур на лазерном фазовом микроскопе "Эйрискан" // Квантовая Электроника / 24, № 8, с.754-758, 1997.

34. V.P. Tychinsky, N.V. Kaverin, T.V. Vyshenskaja, E.V. Perevedentseva, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. Studies of Influenza Virus Interaction with MDCK-Cells using Computer-aided Phase Microscope "Airyscan", Proceedings of SPIE, vol.3197, p.53, 1997.

35. Ж.-К. Ролан, А. Селоши, Д. Селоши. Атлас по биологии клетки, М., 1974.

36. К. Вилли, В. Детье. Биология, М., 1974.

37. В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин. Структура и биология вирусов животных, Наука, М., 1983.ч

38. М. Борн, Э. Вольф. Основы оптики / Изд. 2-е, Пер. с англ., М.: Наука, 1973.

39. Ю.Ю. Стойлов. Колебания жидкостей при испарении и парадоксы испаляторов, УФН, т. 170, №1, с. 41-56, 2000.

40. В.П. Тычинский. Микроскопия субволновых структур, УФН, т. 166, №11, 1996.

41. Irene К. Lichtcheild, Dieter G. Weiss. Visualization of submicroscopic structures in the cytoplasm of Allium сера inner epidermal cells by video-enhanced contrast light microscopy, European Journal of Cell Biology, 46, pp. 376-382, 1988.

42. П. Каппуччинелли. Подвижность живых клеток, Мир, М., с. 10-34, 1982.

43. J. Salanki. Neurobiolohy of invertebrates // Mechanisms of rhythm regulation / Budapest, p.252, 1973.

44. Латманизова Л.В. Возрастная микроэлектрофизиология/ Л., 1973.

45. Monnier A.M. S.R. / Soc. Seances Biol. Ses. Fil., vol.114, pp.1295-1297, 1933.

46. P. Колье, Г.В. Максимов, Ч.Н. Раденович. Биофизика ритмического возбуждения (механизмы генерации и распространения) / М.: Изд-во МГУ, 208 е., 1993.

47. С.Л. Никандров, Б.С. Лазарева, В.П. Тычинский, Г.В. Максимов. Влияние ритмического возбуждения на флуктуации фазовой высоты участков миелинового нервного волокна // Доклады МОИГ1. Общая биология / № 1844, В-00, 1999.

48. С.Л. Никандров, Е.С. Лазарева. Регистрация активности нервного волокна методом динамической фазовой микроскопии // Сборник трудов XL1X научно-технической конференции МИРЭА / Тезисы, 2000 (в печати).

49. LazarevaE.S., Nikandrov S.L., Maximov G.Y., Tychinsky V.P. Axoglial dynamic characteristic in myeline nerve researched by Dynamic Phase Microscopy // IV European Meeting On Glial Cell Function In Health And Disease, Abstracts / 2000.

50. Matti Saraste. Oxidative Phosphorylation at the fin de siecle // Science / vol. 283, pp. 1488-1492, 1999.

51. В.П. Скулачев. Енергетика биологических мембран / М.: Наука, 1989.

52. Manfred Auer, Gene A. Scarborough, Werner Kulbrandt. Three-dimensional map of the plasma membrane H+ -ATPase in the open conformation // Nature / vol. 392, pp. 840-843, 1998.

53. Hongyun Wang, George Oster, Energy transduction in the Fi motor of ATP synthase 11 Nature / vol. 396, pp. 279-282, 1998.

54. Shmuel Tuvia, Shlomo Levin, Arkady Bitler, Rafi Korenstein. Mechanical Fluctuations of the Membrane-Skeleton are Dependent on F-actin ATPase in Human Erythrocytes // Journal of Cell Biology / vol. 141, pp. 1551-1561, 1998.

55. Shimizu H., Haken H. Cooperative Dynamics in organelles // J.Theor.Biol. / vol. 104, pp. 261-273, 1983.

56. Шольц Х.Ф., Лагутина JI.C., Мамаев Д.В. Простой и быстрый метод получения больших однослойных липосом, пригодных для реконструкции мембранных белков // II съезд биофизиков России. Тезисы докладов / т. 2, стр. 574, 1999.

57. Дж. Бендат, А. Пирсол. Измерение и анализ случайных процессов / Пер. с англ., М.: Мир, 1974.

58. Д.Метцлер. Биохимия /М.: Мир, 1980.

59. М.В. Волысенштейн. Биофизика / Учеб. рук., 2-е изд., М.: Наука, 592 е., 1988.

60. Skulachev V.P. Molecular Mechanisms in Bioenergetics / Ernster L. ed., Elsevier,1. Amsterdam, p.37-73, 1992.

61. D.G. Weiss. Computer-aided light microscopy: New techniques for measuring physiological parameters in living cells // Eur. J. Physiol. / Pflugers Archiv, 426, Suppl. R157, 1994.

62. Dieter G.Weiss. Video-Enhanced Contrast Microscopy // Cell Biology: A Laboratory Handbook / Academic Press, pp.77-85, 1994.

63. Krasinskaia LP., Yagushinsky L.S. // FEBS / Lett. 167 , pp. 176-180, 1984.

64. Von Richard C. Duke, David M. Ojcius and J.Ding-E Yong. Die Apoptose-Regeln und Fehler beim Zellselbmord // Spektrum der Wissenschaft / ss. 26-35, 1997.

65. Программированная клеточная гибель / Под ред. Новикова B.C., Санкт-Петербург: Наука, 1996.

66. Б. Албертс, Д. Бей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон. Молекулярная биология клетки / т.З, М.: Мир, 1994.

67. Тычинский В.П., Вышенская T.B., Никандров СЛ., Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Идентификация стадий клеточного цикла методом динамической фазовой микроскопии // 2-й Съезд Биофизиков России, Тезисы докладов / т.2, с.627, 1999.

68. Angus 1. Lamond, William С. Earnshaw. Structure and Function in the Nucleus // Science / vol. 280, pp. 547-553, 1998.

69. Ясуо Кагава. Биомембраны / Пер. с яп. A.A. Селищевой, М.: Высш. шк., 303 е., 1985.

70. Л.П. Ярославский. Введение в цифровую обработку изображений / М.: Сов. радио, 312 с., 1979.

71. Л.П. Ярославский. Цифровая обработка сигналов в оптике и голографии: введение в цифровую оптику / М.: Радио и связь, 296 е., 1987.

72. Э.А. Витриченко, В.П. Лукин, Л.А. Пушной, В.А. Тартаковский. Проблемы оптического контроля / Новосибирск: Наука, 351 е., 1990.

73. М.Я. Шульман. Автоматическая фокусировка оптических систем / Л.: Машиностроение, 224 е., 1990.

74. Цифровые и оптико-цифровые методы обработки изображений // Межвузовский научно-технический сборник / Научн. ред. В.А. Кочегуров, Томск, изд. ТПИим. С М. Кирова, 169 е., 1985.

75. The Center for Frontier Sciences at Temple University: Frontier Perspectives / Volume 8, Number 1, 1999.

76. David M. Shotton. An Introduction to Electronic Light Microscopy // Cell Biology: A Laboratory Handbook / Second Edition, Vol. 3, p. 75, 1998.

77. Lance A. Ladic. The Use of Internet Graphics Software for the Processing and Display of Digital Microscopy Data // Cell Biology: A Laboratory Handbook / Second Edition, Vol. 3, p. 189, 1998.

78. Dieter Seitz-Tutter. Organellentransport und Eigenbewebgung der Mikrotubuli im Axoplasma des Tintenfisch-Riesenaxons // Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultat fur Biologie der Ludwig-Mzximilians-Universitat München / München, 1990.

79. Ф.А. Кузин. Кандидатская диссертация. Методика написания, правила оформления и порядок защиты / Практическое пособие для аспирантов и соискателей ученой степени, М.: «Ось-89», 208 е., 1999.