Криоконсервация клеток морских беспозвоночных и увеличение их пролиферативной активности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Киселев, Константин Вадимович

• Киселев, Константин Вадимович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Киселев, Константин Вадимович

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Криоконсервирование - сохранение биологического материала при помощи сверхнизких температур.

1.1.1 Развитие методов криоконсервирования.

1.1.2. Классификация криопротекторов.

1.1.3. Естественные способы устойчивости к низким температурам и криопротекторы.

1.1.4. Криоконсервация морских животных.

1.1.5. Криопротекторы на основе липидов.

1.1.6. Жизнеспособность, целостность и функциональная активность в популяции клеток после замораживания-оттаивания.

1.2. Культуры клеток в морской биотехнологии.

1.2.1. Продукция биологически-активных веществ в культуре клеток

1.2.2 Культуры клеток морских беспозвоночных.

1.2.3. Увеличение пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных с помощью белковых активаторов. 1.2.3.1. Факторы роста морских ежей.

1.2.3.2. Новый подход для увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных.

1.2.3.3. Gal4 - представитель универсальных активаторов транскрипции эукариотических генов.

1.2.3.4. Возможность цис-регуляции гена ЭРФ морских ежей белком Gal4.

1.3. Перенос экзогенной ДНК в морской биотехнологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2. МАТЕРИАЛЫ. 2.1. Животные.

2.2. Плазмиды.

3. МЕТОДЫ.

3.1. Приготовление препаратов липидов.

3.2. Замораживание клеточной суспензии.

3.3. Оттаивание клеточных культур.

3.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия липидов.

3.5. Трансфекция эмбрионов морских ежей.

3.6. Получение первичных культур из клеток морских беспозвоночных

3.7. Фракционирование суспензии эмбриональных клеток морских ежей

3.8. Трансфекция первичных клеточных культур, полученных из эмбрионов морских ежей со стадии бластулы.

3.9. Выделение тотальной ДНК из эмбриональных клеток морских ежей

3.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием тотальной ДНК, выделенной из эмбриональных клеток морских ежей.

3.11. Выделение тотальной РНК из эмбрионов морских ежей и ее очистка . 34 • 3.12. Получение фракции матричной РНК.

3.13. ОТ-ПЦР анализ.

3.14. Рестрикционный анализ продуктов амплификации.

3.15. Включение Н3-тимидина.

3.16. Включение С14-уридина.

3.17. Фотосъемка.

3.18. Приготовление полутонких срезов.

3.19. Выделение и определение содержания нафтохиноновых пигментов из клеток первичных культур морского ежа.

Ф 3.20. Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Эмбриональное развитие морского ежа и мидии.

4.2. Криосохранение эмбриональных и соматических клеток морских беспозвоночных.

4.2.1. Жизнеспособность личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания.

4.2.2. Уровень синтеза РНК в первичных культурах личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания.

4.2.3. Температуры фазовых переходов общих липидных экстрактов морских беспозвоночных.

4.2.4. Особенности замораживания-оттаивания клеток морских беспозвоночных.

4.3. Влияние активатора транскрипции gal4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей.

4.3.1. Трансфекция оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов морских ежей геном gal4.

4.3.2. Детекция генов, гомологичных генам цитоплазматических актинов Cyllb и СуШЬ морского ежа St. purpuratus в клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР.

4.3.3. Детекция гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР.

4.3.4. Экспрессия гена, гомологичного гену цитоплазматического актина Cyllb St. purpuratus в клетках плоского морского ежа.

Щ, 4.3.5. Доказательство экспрессии гена gal4.

4.3.6. Рестрикционный анализ продуктов амплификации.

4.3.7. Количество эмбрионов с ОПС у разных видов морских ежей

4.3.8. Количество эмбрионов с окрашенными ОПС у разных видов морских ежей.

4.3.9. Образование ОПС в процессе культивирования эмбрионов морских ежей.

4.3.10. Влияние количества плазмидной ДНК на образование эмбрионов с ОПС у морских ежей.

4.4. Очистка эмбриональных клеток морских ежей фракционированием в ступенчатом градиенте плотности перколла.

4.5. Влияние ингибиторов киназ и фосфотаз на развитие эмбрионов морских ежей.

4.6. Пролиферативная активность клеток морских ежей, трансформированных геном gal4.

4.6.1. Трансфекция первичных клеточных культур морских ежей геном gal4.

4.6.2. Клеточные культуры, полученные из трансфецированных геном gal4 эмбрионов морских ежей.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Криоконсервация клеток морских беспозвоночных и увеличение их пролиферативной активности»

За последние 10 лет было описано более 5000 химических соединений из морских организмов, причем многие из этих природных биоактивных метаболитов обладают высоким фармакологическим потенциалом. Особый интерес среди данных организмов привлекают губки, иглокожие, моллюски и другие морские беспозвоночные, которые представляют собой источник ценных биологически активных веществ, многие из которых не встречаются в наземных организмах (Ireland et al., 1988). В частности плоский морской еж Scaphechinus mirabilis содержит нафтохиноидные пигменты, главным из которых является эхинохром (Nishibori, 1957). Препарат Гистохром®, созданный на его основе, обладает уникальными терапевтическими свойствами (Еляков и др., 1999 а,б; Мищенко и др., 2003).

Некоторые виды морских беспозвоночных имеют обширную сырьевую базу, другие являются редкими. В любом варианте, в свете современных тенденций сохранения биоразнообразия, было бы заманчиво разработать технологии промышленного культивирования клеток этих животных с целью получения биологически активных веществ. Продукция биологически активных веществ in vitro может стать альтернативой химическому синтезу или аквакультуре, но при условии, что клетки в культуре будут обладать высоким потенциалом роста. До сих пор в мировой практике, несмотря на многочисленные исследования, получено лишь две культуры из тканей морских беспозвоночных и низших позвоночных: из тканей кораллов (Frank et al., 1994) и асцидий (Rinkevich, Rabinowitz, 1994; Kawamura, Fujiwara, 1995).

Низкая пролиферативная активность клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. Проблему получения клеточной линии можно решить путем вывода клеток морских беспозвоночных из состояния дифференцировки, изменив экспрессию генов ростовых факторов, но до сих пор в мировой практике эта проблема не нашла своего решения. Поэтому актуальность дальнейших широких и углубленных исследований особенностей культивирования клеток морских беспозвоночных не вызывает сомнений.

Наиболее перспективным источником получения делящихся клеток морских беспозвоночных является эмбриональный материал, но его получение носит сезонный характер. Это существенно снижает интенсивность исследований. Поэтому важным направлением нашей работы стала разработка методов криоконсервации для создания постоянного источника клеток этих животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка научных основ криоконсервирования клеток и получения клеточных культур морских беспозвоночных. Предлагается стимулировать скорость деления клеток морских беспозвоночных через изменение уровня экспрессии факторов роста. Для этой цели мы использовали транскрипционный активатор транскрипции, ген gal4.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы криоконсервации клеточных культур морских беспозвоночных путем подбора оптимальных криопротекторов. Оценить жизнеспособность и провести анализ уровня синтеза РНК в клетках морских ежей и моллюсков после замораживания и оттаивания в присутствии разных криопротекторов.

2. Найти эффективный способ переноса чужеродных генов в клетки морских ежей.

3. Получить трансгенные культуры морских ежей и доказать экспрессию в них гена активатора транскрипции gal4.

4. Исследовать влияние гена gal4 на эмбриональное развитие морских ежей и проли-феративную активность клеток в первичных культурах.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан метод криоконсервации морских беспозвоночных, при использовании которого жизнеспособность клеток составляет 32 % для морских ежей и 30 % для мидии.

2. Осуществлен перенос гена gal4 в эмбрионы морских ежей и показано, что ген эффективно в них экспрессируется.

3. Экспрессия гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей приводит к дедиф-ференциации клеток и увеличивает их пролиферативную активность.

4. Предложен новый для морской биотехнологии способ увеличения пролифератив-ной активности клеток, заключающийся в использовании генов-активаторов транскрипции.

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ДВГУ, а также в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН.

Выделение липидных экстрактов и анализ температур их фазовых переходов были проведены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета: профессором д.б.н. Э.Я. Костецким и доцентом к.б.н. Н.М.Саниной. Определение содержания нафтохиноновых пигментов в клетках морских ежей проведено совместно с сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН - к.х.н. Е.А. Кольцовой и к.х.н. В.П.Глазуновым.

Автор приносит глубокую благодарность всем перечисленным сотрудникам и коллегам, своим научным руководителям, а также доктору М. Пташне (США) за предоставление образцов плазмидной ДНК.

Данная работа выполнена при частичной финансовой поддержке НОЦ ДВГУ за счет средств фонда US CRDF (проект VL-003) и Министерства Образования РФ (АОЗ-2.12-524) и президиума ДВО РАН (04-3-Г-06-023 и 04-3-А-06-047).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Киселев, Константин Вадимович

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод крноконсервации клеток морских беспозвоночных, который позволяет получать около 30 % жизнеспособных клеток морских ежей и моллюсков.

2. ДМСО (10 %) в сочетании с трегалозой (3 мг/мл) обладают наилучшими криопротек-торными свойствами при замораживании-оттаивании клеток моллюсков и морских ежей. Липидные экстракты с низкими температурами фазовых переходов обладали эффективными криопротекторными свойствами.

3. Разработана методика ПЭГ-индуцированной трансфекции эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей геном gal4. Показано, что ген встраивается в ДНК клеток морских ежей и экспрессируется там.

4. Экспрессия гена gal4 приводит к нарушению эмбрионального развития морских ежей и формированию опухолеподобных структур на поверхности эмбрионов.

5. Экспрессия гена gal4 увеличивает число клеток и уровень синтеза ДНК в первичной культуре морских ежей. Это позволило разработать новый для морской биотехнологии метод увеличения пролиферативной активности клеток, который заключается в использовании генов-активаторов транскрипции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Морские беспозвоночные представляют собой источник ценных биологически активных веществ. Разработка биотехнологий получения воспроизводимого источника этих веществ представляется важной задачей.

Уменьшение пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. В данной работе описан подход, который позволяет преодолеть это естественное затруднение. В последующих исследованиях могут использоваться те или иные регуля-торные гены, либо гены, кодирующие факторы роста, специфичные для морских животных, а также различные промоторы. Их эффективность будет повышаться, и несомненно, клеточные линии и штаммы будут получены. Особенность настоящей работы заключается в том, что она впервые показала принципиальную возможность использования чужеродных генов для увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных.

Методически, осуществить перенос трансгена оказалось не сложно. Критическим фактором в осуществленном нами ПЭГ-переносе является состояние "компетентности" эмбрионов, которое зависит от времени, которое прошло после их оплодотворения. Важными факторами является также концентрация эмбрионов и плазмидной ДНК.

По-видимому, появление опухолеподобных структур, описанных нами как результат трансфекции гена gal4, обусловлен экспрессией этого гена. Наши исследования показали, что. перенос чужеродной плазмидной ДНК сам по себе вызывает сходную морфологическую аномалию. Однако, сравнение результатов экспериментов с полноразмерным геном gal4, и его аналогом, лишенным активаторных доменов, говорит о том, что ген, несомненно, функционирует и вызывает неорганизованное деление клеток.

В ходе работы возникло много вопросов, которые ждут своего исследования. В последующей работе важно будет установить, какова стабильность чужеродного белка в клетках морского ежа, определить его мишень, какие сигнальные пути затронуты, стабильна ли модификация этих путей в делящихся клетках. Полученные в ходе настоящей работы данные говорят о том, что поиск мишени гена gal4 должен проводиться среди ми-тогенных факторов, таких как эпидермальный фактор роста. Теоретически, представляется вероятной следующая схема действия гена gal4. Белок, продукт гена, активирует экспрессию какого-либо митогенного фактора (или факторов), нарушая его своевременное выключение. Это приводит к нарушению дифференциации клеток, увеличивает их про-лиферативную активность. Другими словами, клетка продолжает делиться вместо того, чтобы специализироваться.

В этой связи особый интерес представляет изучение того, что представляют собой "опухолеподобные структуры", которые образуются в результате трансфекции. Важным шагом в настоящей работе было установление того факта, что эти структуры не являются описанными ранее обычными аномалиями развития эмбрионов, такими как экзогаструля-ция. Однако пока не ясно, происходит ли злокачественная трансформация клеток. Клетки морских ежей в природных условиях не подвержены процессам злокачественной трансформации, и соответственно морфология новообразований не описана. Понятно, что морские ежи, как и другие организмы, содержат протоонкогены. По-видимому, отсутствие какого-либо эффекта протоонкогенов на клетки морских беспозвоночных можно объяснить отсутствием ферментов, необходимых для метаболической активации канцерогенов (Anderson, 1978) либо существованием антионкогенов, например, специфичных сульфо-липидов у морских ежей (Sahara et al., 1997).

В практическом плане, мы считаем, что увеличение пролиферативной активности клеток, достигнутое в результате экспрессии гена gal4, позволяет получить постоянную культуру клеток. Однако, все культуры, которые нормально развивались в течение довольно продолжительного времени (до 3 мес.), были потеряны в результате микробного заражения. В этой связи, на первое место выходит необходимость разработки технологий, позволяющих избавиться от микроорганизмов. Первые эксперименты, выполненные для очистки клеток в градиенте перколла, позволяют надеяться на успешность такого подхода.

Важным аспектом работы явилась разработка методов криоконсервирования клеток морских беспозвоночных. С успешным завершением этих экспериментов, появилась возможность работать с этим объектов в течение всего года, а не в течение двух месяцев, как это было ранее.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Киселев, Константин Вадимович, 2004 год

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: «Мир», 1983.128 с.

2. Анализ генома: Методы / Под ред. Дейвиса К. М: «Мир», 1990. 246 с.

3. Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криоконсервация. М.: «Высшая школа», 1987. 80 с.

4. Виленчик М.М. Сколько лет можно хранить зародышевые клетки в криоконсервированном состоянии без существенного повреждения их генома? Пущино: 1983. 20 с.

5. Гахова Э.Н., Крате И.В., Найденко Т.Х. и др. Развитие зародыша морского ежа после низкотемпературной консервации// Онтогенез. 1988. Т. 19(2). С. 175-180.

6. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: «Мир», 1997. 624с.

7. Грищенко В.И., Панков Е.Я., Обозная Э.Я. Качественное обновление свойств клеток после криоконсервирования // Успехи современной биологии. 1989. Т. 108. С. 299-309.

8. Еляков Г.Б., Федореев С.А., Максимов О.Б., Мищенко Н.П., Кольцова Е.А., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А.А. Препарат гистохром для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз // Патент № 2134107. Бюл. № 22. 1999 (а).

9. Лебедев А.В., Иванова М.В., Красновид Н.И., Кольцова Е.А. Активность и взаимодействие с супероксид анион радикалом эхинохрома и его структурных аналогов // Вопросы медицинской химии 1999. Т. 45(2). С. 123-130.

10. Лейрих А.Н. 1985. Холодоустойчивость, температурные условия зимовки и пространственное распределение муравьев на Верхней Колыме: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Л. - 17 с.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: «Мир», 1982. 480 с.

12. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Багирова В.Л. Новый оригинальный отечественный препарат гистохром® // Хим-фармацевтический журнал. 2003. Т. 37(1). С. 49-53.

13. Найденко Т.Х., Кольцова Е.А. Использование антиоксиданта эхинохрома при криоконсервации личинок морских ежей // Биология моря. 1998. Т 3. С. 198-201.

14. Одинцова Н.А. Основы культивирования клеток морских беспозвоночных. Владивосток: Дальнаука, 2001. 162 с.

15. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Плотников С.В., Булгаков В.П. Патент РФ № 2205873. Способ увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных. МКИ7 С 12 N 5/10. Приоритет от 04.04.2002 г. Опубл. 10.06.2003 г., Бюлл. № 16.

16. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Ленинград: «Наука», 1988. 322 с. Попов A.M. 2003. Биологическая активность и механизмы действия вторичных метаболитов из наземных растений и морских беспозвоночных: Автореф. дис. .доктора биол. наук. В. - 28 с.

17. Стехова С.И., Шенцова Е.Б., Кольцова Е.А., Кулеш Н.И. Антимикробная активность полигидроксинафтохинонов из морских ежей // Антибиотики и химиотерапия. 1988. Т. 33(11). С. 831-833.

18. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х т. Т. 2. Пер. с англ. М.: "Мир", 1998. 391с.

19. Akasaka К, Nishimura A., Hijikata К., Iuchi Y., Morokuma J., Takahashi M., Morikawa H., Shimada H. Introduction of DNA into sea urchin eggs by particle gun // Molecular Marine Biology and Biotechnology. 1995. Vol. 4(3). P. 255-261.

20. Akasaka K, Nishimura A., Takata K., Mitsunaga K., Mibuka F., Ueda H., Hirose S., Tsutsui K. and Shimada H. Upstream element of sea urchin arylsulfatase gene serves as an insulator // Cellular and Molecular Biology. 1999. Vol. 45(5). P. 555-565.

21. Armstrong J.L., Childs G.V. Regulation of c-fos expression by EGF and GnRH in specific anterior pituitary cells from proestrous female rats // Journal of Histochemistry, and Cytochemistry. 1998. Vol. 46(8). P. 935-943.

22. Asahia E., Takahashi T. Cryopreservation of sea urchin embryos and sperm // Growth and Differentiation. 1979. V. 21(5). P. 423-430.

23. Anderson R.S. Developing an invertebrate model for chemical carcinogenesis: metabolic activation of carcinogens // Comparative Pathobiology. 1978. Vol. 4. P. 11-24.

24. Bale J.S., Worland M.R. and Block W. Effects of summer frost exposures on the cold tolerance strategy of a sub-Antarctic beetle // Journal of Insect Physiology. 2001. Vol. 47(10). P. 1161-1167.

25. Baynes S.M., Scott A. P. Cryopreservation of rainbow trout spermatozoa: the influence of sperm quality, egg quality and extender composition on post-thaw fertility // Aquaculture. 1987. Vol. 66. P. 53-67.

26. Block W. Cold tolerance of insects and other arthropodos // Functional Ecology, 1991. Vol. 5. P. 284-290.

27. Brewster E., Nicholson B.L. In vitro maintenance of amoebocytes from the American oyster Crassostrea virginica // Journal of Fish Res. Board. Can. 1979. Vol. 36(4). P. 461-467.

28. Bogo M.R., Vainstein M.H., Aragao F.J.L., Rech E., Schrank A. High frequency gene conversion among benomyl resistant transformants in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliaell FEMS Microbiology Letters. 1996. Vol. 142. P. 123-127.

29. Bulgakov V.P., Odintsova N.A., Plotnikov S.V., Kiselev K.V., Zaharov E.V., Zhuravlev Yu.N. Ga/4-gene-dependent alterations of embryo development and cell growth in a primary culture of the sea urchins // Marine Biotechnology. 2002. Vol. 4. P. 480-486.

30. Camaioni A., Russo M.A., Odorisio Т., Gandolfi F., Fazio V.M., Siracusa G. Uptake of exogenous DNA by mammalian spermatozoa: specific localization of DNA on sperm heads // Journal of Reproduction Fertility. 1992. Vol. 96. P. 203-212.

31. Cecil J.T. Mitoses in cell cultures from cardiac tissue of the surf clam Spisula solidissima // Journal of Invertebrate Pathology. 1969. Vol. 14(3). P. 407-410.

32. Chao N., Chiang C., Hsu H., Tsai C., Lin T. Toxicity tolerance of oyster embryos to selected cryoprotectants // Aquatic Living Resources. 1994. Vol. 7. P. 99-104.

33. Chao N.H., Lin T.T., Chen Y.J., Hsu H.W., Liao I.C. Cryopreservation of late embryos and early larvae in the oyster and hard clam // Aquaculture. 1997. Vol. 155(1-4). P. 31-44.

34. Chao N.H., Liao I.C. Cryopreservation of finfish and shellfish gametes and embryos // Aquaculture. 2001. Vol. 197. P. 161-189.

35. Chen L., DeVries A.L., Cheng C.C. Evolution of antifreeze glycoprotein gene from a trypsinogen gene in Antarctic notothenioid fish // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. Vol. 94. P. 3811-3816.

36. Chen L., DeVries A.L., Cheng C.C. Convergent evolution of antifreeze glycoproteins in Antarctic notothenioid fish and Arctic cod // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. Vol. 94. P. 3817-3822.

37. Chen S.N., Wen C.M. Establishment of cell lines derived from oyster, Crassostrea gigas Thunberg and hard clam, Meretrix lusoria Roding // Methods in Cell Science 1999. Vol. 21. P. 183-192.

38. Chen Y., Foote R., Brockett C. Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine and blood serum on survival of frozen bull sperm // Cryobiology. 1993. Vol. 30(4). P. 423-431.

39. Chen Z.Q., Kan N.C., Pribyl L., Lautenberger J.A., Moudrianakis E., Papas T.S. Molecular cloning of the ets proto-oncogene of the sea urchin and analysis of its developmental expression // Developmental Biology. 1988. Vol. 125(2). P. 432-440.

40. Cheng C.C., Chen L. Evolution of an antifreeze glycoprotein // Nature. 1999. Vol. 401. P. 443-444.

41. Cheng C.H., DeVries A.L. Structures of antifreeze peptides from the antarctic eel pout, Austrolycicthys brachycephalus // Biochimica et Biophysica Acta. 1989. Vol. 27(997). P. 55-64.

42. De Vries A.L. The role of antifreeze glycopeptides and peptides in the freezing avoidance of antarctic fishes // Comparative Biochemistry and Physiology. 1988. V. 90(B). P. 611-622.

43. De Vries A.L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes // Annual Review of Physiology. 1983. Vol. 45. P. 245-60.

44. DiCosmo F., Misawa M. Plant cell and tissue culture: alternatives for metabolite production // Biotechnology Advances.1995. Vol.l3(3). P. 425-453.

45. Domart-Coulon I., Doumeng D., Auzoux-Bordenave S., Fichant Y.L. Identification of media supplements that improve the viability of primarily cell cultures of Crassostrea gigas oysters // Cytotechnology. 1994. Vol. 16. P. 109-120.

46. Ellis L.L., Brodey M.M., Bishop S.H. Preparation of cell cultures from oyster heart and mantle // In Vitro Cell Developmental Biology. 1985. Vol. 21(3). P. 32a.

47. Ellis L.L. Electroporation of oyster cells // In Vitro Cell Developmental Biology. 1991. Vol. 27(2). P. 42a.

48. Frank U., Rabinowitz C., Rinkevich B. In vitro establishment of continuous cell cultures and cell lines from ten colonial cnidarians // Marine Biology. 1994. Vol. 120, P. 491-499.

49. Fujita Y., Tabata M. Cell cultures of Lithospermum erythrorhizon I I Plant Cell and Tissue Culture.1987. Vol. 43. P. 169-185.

50. Gao D., Critser J.K. Mechanisms of cryoinjury in living cells // ILAR J. 2000. Vol. 41(4). P. 187-196.

51. Griko Yu.V., Privalov P.L., Sturtevant J.M., Venyaminov K.P. Cold denaturation of staphylococcal nuclease // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1988. Vol. 85. P. 3343-3347.

52. Glonek Т., Greiner J. Method and composition for cryopreservation of tissue // Canadian patent №CA1335723. 1999.

53. Goncharova S.N., Sanina N.M., Kostetsky E.Y. Role of lipids in molecular thermoadaptation mechanisms in a seagrass Zostera marina // Biochemical Society Transaction. 2000. Vol. 28(6). P. 789-892.

54. Goodwin R.H. Replacement of vertebrate serum with lipid and other factors in the culture of invertebrate cells, tissue, parasites and pathogens // In Vitro Cell Developmental Biology. 1991. Vol. 27(A). P. 470-478.

55. Hursh D.A., Andrews M.E. and Raff R.A. A sea urchin gene encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor // Science. 1987. Vol. 237(4821). P. 1487-1490.

56. Hetrick F.M., Stephens E., Lomax N., Luttrell K. Attempts to develop a marine molluscan cell line. In report of Department of Microbiology University of Maryland 1981.

57. Honadel, Kallian Cryopreservation of murine embryos with trehalose and glycerol // Cryobiology. 1998. V. 25(4). P. 331-337.

58. Kalinina I.V., Gromov D.B. The nucleus of non-vible frozen-thawed amoeba has normal morphology and high function activity // Cryo-Letters. 1991. V. 12(3). P. 87-92.

59. Karanova M.V., Mezhevikina L.M., Petropavlov N.N. Study of cryoprotective properties of antifreeze glycoproteins from the white sea cod Gadus morhua on low temperature freezing of mouse embryos //Biofizika. 1995. Vol. 40(6). P. 1341-1347.

60. Kawamura K, Fujiwara S. Establishment of cell lines from multipotent epithelial sheet in the budding tunicate, Polyandrocarpa misakiensis // Cell Structure and Function. 1995.- Vol. 20(1). P. 97-106.

61. Khoo H.W., Ang L.H., Lim H.B., Wong K.Y. Sperm cells as vector for introducing foreign DNA into zebrafish // Aquaculture. 1992. Vol. 107. P. 1-9.

62. Koike H., Akasaka K., Mitsunaga-Nakatsubo K., Shimada H. Proximal cis-regulatory elements of sea urchin arylsulfatase gene // Development Growth and Differentiation. 1998. Vol. 40(5). P. 537-544.

63. Koltsova E.A., Boguslavskay L.V., Maximov O.B. On the functions of quinonoid pigment in sea urchin embryos // Journal of Invertebrate Reproduction. 1981. Vol. 4(1). P. 17-23.

64. Kominami Т., Takata H. Process of pigment cell specification in the sand dollar, Scaphechinus mirabilis // Development Growth and Differentiation. 2002. Vol. 44 (2). P. 113125.

65. Ma J., Przibilla E., Hu J., Bogorad L., Ptashne M. Yeast activators stimulate plant gene expression // Nature. 1988. Vol. 334. P. 631-633.

66. Ma J., Ptashne M. Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments // Cell. 1987. Vol. 48. P. 847-853.

67. MacKintosh C., Cohen P. Identification of high levels of type 1 and type 2A protein phosphatases in higher plants // Journal of Biochemistry. 1989. Vol. 262. P. 335-339.

68. Maramorosch K. Biotechnology in invertebrate pathology and cell culture. San Diego; London: Acad. Press, 1987. 511 p.

69. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells // Cryobiology. 1977. Vol.14. P. 251-272.

70. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications // American Journal of Physiology. 1984. Vol. 247. P. 125-142.

71. McCoon P.E., Angerer R.C. and Angerer L.M. SpFGFR, a new member of the fibroblast growth factor receptor family, is developmentally regulated during early sea urchin development //Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol. 271(33). P. 20119-20125.

72. Mitsuhashi J. Invertebrate cell system application. Boca Raton: GRC Press, 1989. Vol. 1, 2. 180 p.

73. Mifflin D., Robinson J.J. Proto-oncogene homologous sequences in the sea urchin genome //BioscienceReports. 1988. Vol. 8(5). P. 415-419.

74. McCoon P.E., Angerer R.C. and Angerer L.M. SpFGFR, a new member of the fibroblast growth factor receptor family, is developmentally regulated during early sea urchin development // Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol. 271(33). P. 20119-20125.

75. Naidenko T. Cryopreservation of Crassostrea gigas oocytes, embryos and larvae using antioxidant echinochrome A and antifreeze protein AFP1// Cryo-Letters. 1997. Vol. 18. P. 375382.

76. Odintsova N.A.,. Khomenko A.V. Primary cell culture from embryos of the Japanese scallop Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia) // Cytotechnology. 1991. Vol. 6. P. 49-54.

77. Odintsova N.A., Tsal L.G. Cryopreservation of primary cell cultures of bivalvia // Cryo-Letters. 1995. Vol.16. P. 13-20.

78. Odintsova N.A., Ermak A.V., Tsal L.G. Substrate selection for long-term cultivation of marine invertebrate cells // Comparative Biochemistry and Physiology. 1994. Vol. 107A. P. 613619.

79. Odintsova N.A., Bulgakov V.P., Plotnikov S.V. Engineering of sea urchin embryo development. In abstracts of 5th International Marine Biotechnology Conference Townsville, Australia 29 September 4 October 2000.

80. Odintsova N., Kiselev K., Sanina N., Kostetsky E. Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebrates // Cryo-Letters. 2001. Vol. 22(5). P. 299-310.

81. О'Neil L., Paynter S.J., Fuller В J., Shaw R.W., DeVries A.L. Vitrification of mature mouse oocytes in a 6 M Me2SO solution supplemented with antifreeze glycoproteins: the effect of temperature // Cryobiology. 1998. Vol. 37(1). P. 59-66.

82. Patil J.G., Khoo H.K. Nuclear internalization of foreign DNA by zebrafish spermatozoa and its enhancement by electroporation // Journal of Experimental Biology. 1996. Vol. 274. P. 121-129.

83. Pearl M., Arav A. Chilling sensitivity in zebrafish (Brachydanio rerio) oocytes is related to lipid phase transition I I Cryo-Letters. 2000. Vol. 21. P. 171-178.

84. Polovina M. Method and composition for cryopreservation of tissue // Canadian patent № CA2214280.1996.

85. Privalov P.L., Griko Y.V., Venyaminov S.Y., Kutyshenko V.P. Cold denaturation of myoglobin. // Journal of Molecular Biology. 1986. Vol. 190. P. 487-498.

86. Ptashne M., Gann A. Activators and targets // Nature. 1990. Vol. 346. P. 329-331.

87. Quantin В., Breathnach R. Epidermal growth factor stimulates transcription of the c-jun proto-oncogene in rat fibroblast // Nature. 1988. Vol. 334. P. 538-539.

88. Renard P. Cooling and freezing tolerances in embryos of the pacific oyster, Crassostrea gigas methanol and sucrose effects // Aquaculture. 199.1. Vol. 92(1). P. 43-57.

89. Ring R.A., Tesar D. Adaptations to cold in Canadian Arctic insects // Cryobiology. 1981. Vol. 18(2). P. 199-211.

90. Rinkevich В., Rabinowitz C. Acquiring embryo-derived cell cultures and aseptic metamorphosis of larvae from the colonial protochordate Botryllus schlosseri // Invertebrate Reproduction and Development. 1994. Vol. 25. P. 59-72.

91. Rinkevich B. Cell cultures from marine invertebrates: obstacles, new approaches and recent improvements // Journal of Biotechnology. 1999. Vol. 70(1-3). P. 133-153.

92. Rubinsky В., Arav A., Devries A.L. The cryoprotective effect of antifreeze glycopeptides from antarctic fishes // Cryobiology. 1992. Vol. 29(1), P. 69-79.

93. Ruggieri G.D. Drugs from the sea // Science. 1976. Vol. 194. P. 491-497.

94. Sanina N.M., Kostetsky E.Ya., Shnyrov V.L. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 1991. Vol. 27. P. 265-274.

95. Schells G., Cobl C., Anderson S. Tissue cryopreservation method // Canadian patent № CA2078873.1992.

96. Shaw C.H., Carter G.H., Watson M.D., Shaw C.H. A functional map of the nopaline synthase promoter // Nucleic Acids Research. 1984. Vol. 12. P. 7831-7846.

97. Skouteris G.G., Kaser M.R. Expression of exogenous c-myc oncogene does not initiate DNA synthesis in primary rat hepatocyte culture // Journal of Cell Physiology. 1992. Vol. 150. P. 353-359.

98. Sin F.Y.T., Bartley A.L., Walker S., Sin I.L., Symonds J.E., Hawke L., Hopkins C.L. Gene transfer in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA//Aquaculture. 1993. Vol. 117. P. 57-69.

99. Sin F.Y.T. Transgenic fish // Reviews in Fish Biol, and Fisheries. 1997. Vol. 7. P. 417441.

100. Sparks K.A. Synopsis of invertebrate pathology. Exclusive of insects. Amsterdam: Elservier Science, 1985. 510 p.

101. Stephens E.B., Hetrick F.M. Preparation of primary cell cultures from The American oyster Crassostrea virginica I I In Vitro Rockville. 1979. Vol. 15(3). P. 198-199.

102. Storey K.B., Storey J.M. Natural freeze tolerance in ectothermic vertebrates // Annual Review of Physiology. 1992. Vol. 54. P. 619-637.

103. Symonds J.E., Walker S.P., Sin F.Y.T. Electroporation of salmon sperm with plasmid DNA: evidence of enhanced sperm/DNA association // Aquaculture. 1994. Vol. 119. P. 313-327.

104. Swales N., Utesch D. Metabolic activity of fresh and cryopreserved dog hepatocyte suspensions //Xenobiotica. 1998. Vol. 28(10). P. 937-948.

105. Tamaoki T. Use and specificity of staurosporine, UCN-01, and calphostin С as protein kinase inhibitors // Methods in Enzymology. 1991. Vol. 201. P. 340-347.

106. Tanaka S., Tajima M., Tsukada M., Tabata M.A comparative study on anti-inflammatory activities of the enantiomers, shikonin and alkannin // Journal of National Products. 1986. Vol. 49(3). P. 466-469.

107. Torres M., Siemens J., Meixner M., Sacristan M.D. // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1997. Vol. 47. P. 111-118.

108. Tsai H.J., Tseng F.S. Electroporation of a foreign gene into black Acanthopagrus schlegeli embryos I I Fish Science. 1994. Vol. 60. P. 787-788.

109. Usheva L.N., Odintsova N.A. Tumor-like lesions in the mantle of the mussel Modiolus dijficilis from the Sea of Japan // Diseases of Aquatic Organisms. 1999. Vol. 35(1). P. 63-68.

110. Jeyalectumie C., Subramoniam T. Cryopreservation of spermatophores and seminal plasma of the edible crab Scylla serrat Ц Biological Bulletin. 1989. Vol. 177. P. 247-253.

111. Voci A., Massajoli M., Bottazzi C., Demori I., Gallo G. Relationship between DNA synthesis and growth factor expression in primary cultures of adult rat hepatocytes // Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1996. Vol. 72. P. 139-145.

112. Voituron Y., Storey J.M., Grenot C., Storey K.B. Freezing survival, body ice content and blood composition of the freeze-tolerant European common lizard, Lacerta vivipara // Journal of Comparative Physiology В. 2002. Vol. 172(1). P. 71-76.

113. Yamasu K., Suzuki G., Horii K., Suyemitsu T. Transcriptional regulation of the gene for epidermal growth factor-like peptides in sea urchin embryos // International Journal of Developmental Biology. 2000. Vol. 44. P. 777-784.

114. Yu J.K., Yan W., Zhang Y.L., Shen Y, Yan S.Y. Sperm-mediated gene transfer and method of detection of integratid gene by PCR // Acta Zoologica Sin. 1994. Vol. 40. P. 96-99.

115. Yuh CH, Bolouri H, Davidson EH. Genomic cis-regulatory logic: experimental and computational analysis of a sea urchin gene // Science. 1998. Vol. 279. P. 1896-902.

116. Watson PF in Effects of Low Temperatures on Biological Membranes, (eds) GJ Morris & A Clarke, Academic Press, London. 1981. pp 189-218 (a).

117. Watson PF The roles of lipid and protein in the protection of ram spermatozoa at 5 degrees С by egg-yolk lipoprotein // Journal of Reproduction and Fertilization. 1981. Vol. 62(2). P. 48392 (6).

118. Wiggins, Philippa M., Ferguson, Alexander B. Compositions and methods for preservation of living tissues //United States Patent № 5962.213,1999.

119. Worland M.R. and Block W. Desiccation stress at sub-zero temperatures in polar terrestrial arthropods // Journal of Insect Physiology. 2003. Vol. 49(3). P. 193-203.

120. Zhang X.S., Zhao L., Hua T.C., Zhu H.Y. A study on the cryopreservation of common carp Cyprinus carpio embryos // Cryo-Letters. 1991. Vol. 10. P. 271-278.