Комплексный подход к микробиологической диагностике бактериальных осложнений при муковисцидозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, доктор наук Кондратенко Ольга Владимировна

• Кондратенко Ольга Владимировна
• доктор наук
• 2020

Оглавление диссертации доктор наук Кондратенко Ольга Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ 22 ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ МУКОВИСЦИДОЗЕ:

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ (обзор литературы)

1.1. Муковисцидоз: этиология, патогенез, 22 распространенность

1.2. Особенности проведения микробиологического 23 исследования при муковисцидозе

1.3. Основные респираторные патогены при муковисцидозе, 25 их значение и распространенность среди пациентов

1.4. Использование ПЦР-диагностики для раннего выявления 29 бактерий Burkholderia cepacia complex в нативной мокроте: мировой опыт и отечественные альтернативы

1.5. Влияние длительной колонизации на изменение 31 биологических свойств штаммов Burkholderia spp.

1.6. Исследование микрофлоры параназальных синусов как 38 способ ранней профилактики колонизации нижних дыхательных путей при муковисцидозе: мировой опыт и отечественные альтернативы

1.7. Источники и пути колонизации дыхательных путей при 44 муковисцидозе

1.7.1. Колонизация в условиях стационара и распространение 44 штаммов между пациентами

1.7.2. Внестационарные источники колонизации дыхательных 45 путей

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Дизайн исследования

2.2. Методики сбора и транспортировки материала

2.3. Методики первичного посева биоматериала

2.4. Методика идентификации выделенных культур

2.5. Методики определения чувствительности к 56 антибактериальным препаратам

2.5.1 Методика выявления резистентности к метициллину у 56 штаммов Staphylococcus aureus

2.5.2. Методика определения продукции Р-лактамаз 56 расширенного спектра действия у представителей порядка

Enterobacterales

2.5.3. Методика определения продукции карбапенемаз

2.5.4. Методика определения антимикробной активности 58 растительных экстрактов и индивидуальных соединений в отношении штаммов Burkholderia spp.

2.6. Методика ПЦР-исследования образцов мокроты

2.7. Методы математической обработки полученных данных

2.7.1. Методы анализа белковых профилей, полученных с 60 помощью MALDI-ToF масс-спектрометрии

2.7.2. Методы статистической обработки полученных

результатов

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ВИДОВОГО СОСТАВА 63 МИКРОФЛОРЫ НИЖНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ У ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

3.1. Видовой состав микрофлоры нижних дыхательных путей у 63 пациентов с муковисцидозом из различных регионов Российской Федерации за период 2015-2019 гг.

3.2. Динамика видового состава микрофлоры пациентов с 75 муковисцидозом Самарской области за период 2015-2019 гг.

3.3. Резюме 90 ГЛАВА 4. ВИДОВОЙ СОСТАВ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ 96 СВОЙСТВА И РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА BURKHOLDERIA СРЕДИ ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

4.1. Видовой состав и распространенность штаммов бактерий 96 рода Burkholderia среди пациентов с муковисцидозом из различных регионов Российской Федерации за период 20152019 гг.

4.2. Оценка динамических изменений в белковых профилях 98 штаммов бактерий рода Burkholderia, выделенных от пациентов с муковисцидозом с длительной колонизацией нижних дыхательных путей в разные сроки инфицирования с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии

4.3. Гетерогенность популяции штаммов бактерий рода 103 Burkholderia, выделенных от пациентов с муковисцидозом из различных регионов Российской Федерации

4.3.1. Гетерогенность популяции штаммов Burkholderia spp., 104 выделенных в 2018 году

4.3.2. Гетерогенность популяции штаммов Burkholderia, 105 выделенных в 2019 году

4.3.3. Возможности применения MALDI-ToF масс- 108 спектрометрии для оценки белковых профилей гетерогенных изолятов Burkholderia spp.

4.4. Возможности использования ПЦР-диагностики для 110 раннего выявления Burkholderia cepacia complex у пациентов с муковисцидозом

4.4.1. Характеристика исследуемых респираторных образцов и 111 результаты апробации тест - системы №1 для раннего выявления бактерий Burkholderia cepacia complex в клиническом материале от пациентов с муковисцидозом методом ПЦР

4.4.2. Характеристика исследуемых респираторных образцов и 117 результаты апробации тест - системы №2 для раннего выявления бактерий Burkholderia cepacia complex в клиническом материале от пациентов с муковисцидозом методом ПЦР

4.5. Оценка влияния некоторых растительных экстрактов и 123 индивидуальных соединений на биологические свойства штаммов Burkholderia cepacia complex, выделенных от пациентов с муковисцидозом

4.6. Резюме 133 ГЛАВА 5. МОНИТОРИНГ МИКРОФЛОРЫ 138 ПАРАНАЗАЛЬНЫХ СИНУСОВ ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ КАК СПОСОБ РАННЕЙ ПРОФИЛАКТИКИ КОЛОНИЗАЦИИ НИЖНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫМИ ШТАММАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ

5.1. Общая характеристика штаммов микроорганизмов, 138 выделенных из жидкости назального лаважа

5.2. Видовой состав и характеристика штаммов, имеющих 140 доказанное клиническое значение при муковисцидозе, выделенных из жидкости назального лаважа

5.3. Видовой состав и характеристика штаммов, выделенных из 152 жидкости назального лаважа, имеющих неустановленное клиническое значение при муковисцидозе

5.3.1. Характеристика штаммов неферментирующих 152 грамотрицательных бактерий

5.3.2. Характеристика штаммов представителей порядка

Enterobacterales

5.3.3. Характеристика штаммов представителей порядка

A ctinomycetal es

5.3.4. Характеристика выделенных штаммов грибов

5.4. Видовой состав и характеристика штаммов - 156 представителей нормальной микрофлоры дыхательных путей

и окружающей среды, выделенных из жидкости назального лаважа

5.5. Резюме 159 ГЛАВА 6. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ МИКРОФЛОРЫ 162 ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ВОЗМОЖНОСТЬ ВНЕСТАЦИОНАРНОЙ КОЛОНИЗАЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ

6.1. Общая характеристика выделенной микрофлоры

6.2. Оценка влияния микрофлоры членов семьи на возможность 164 колонизации дыхательных путей пациентов с муковисцидозом

6.3. Оценка влияния качества обработки небулайзеров на 166 колонизацию дыхательных путей клинически значимыми микроорганизмами

6.4. Оценка влияния микрофлоры объектов с места постоянного 168 проживания пациента на возможность колонизации дыхательных путей

6.4.1. Оценка роли мест с повышенной влажностью, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами неферментирующих грамотрицательных бактерий

6.4.1.1. Особенности микрофлоры, выделенной со смывов с санитарных узлов

6.4.1.2. Особенности микрофлоры, выделенной со смывов с поверхностей кухни

6.4.3. Оценка роли мест для хранения овощей, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое значение при муковисцидозе

6.4.4. Оценка роли объектов из комнаты пациента, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое значение при муковисцидозе

6.4.5. Оценка роли систем кондиционирования и вентиляции, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое значение при муковисцидозе

6.4.6. Оценка роли объектов быта, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое значение при муковисцидозе

6.5. Резюме

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПОДХОДА К

172

176

177

178

179

179

180

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ

ДИАГНОСТИКЕ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ

ОСЛОЖНЕНИЙ

ПРИ

МУКОВИСЦИДОЗЕ

7.1. Обоснование разработки комплексного подхода к 183 микробиологической диагностике бактериальных осложнений

при муковисцидозе

7.2. Алгоритмы комплексного подхода к микробиологической 186 диагностике пациентов с муковисцидозом в зависимости от их микробиологического статуса

7.3. Опыт реализации модели комплексного подхода к 191 микробиологической диагностике

7.4. Резюме 194 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 198 ВЫВОДЫ 219 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 221 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 223 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ НАЗВАНИЙ 224 МИКРООРГАНИЗМОВ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексный подход к микробиологической диагностике бактериальных осложнений при муковисцидозе»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Микробиологическая диагностика возбудителей бактериальных осложнений при муковисцидозе (МВ) является важной задачей современного здравоохранения. Актуальность изучения и проработки этой темы объясняется увеличением количества пациентов с МВ, как в Российской Федерации, так и в мире, что связано с оптимизацией подходов к ранней диагностике и терапии [1, 55, 123, 189, 190, 249, 259, 296]. Между тем, видовой состав бактериальных возбудителей, выделяемых из респираторных образцов от пациентов с МВ, отличается значительной видовой широтой и уникальностью [3, 8,11, 21, 22, 29, 30, 37, 39, 54, 60, 105, 168, 187, 206, 208, 231]. Спектр этих микроорганизмов существенно увеличился с момента внедрения в рутинную практику микробиологических лабораторий метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF) [6, 16, 26, 199, 204]. Это обстоятельство, с одной стороны, позволило повысить качество микробиологической диагностики, а с другой - открыло перед микробиологами и клиницистами значительный перечень микроорганизмов с неустановленным клиническим значением при МВ.

В то же время, несмотря на внедрение данного метода, многие бактериологи сталкиваются со сложностями, связанными не с идентификацией, а с выделением микроорганизмов из первичного посева, что вызвано, прежде всего, отсутствием современной нормативной документации. Некоторые разработанные к настоящему моменту документы, касающиеся микробиологии и эпидемиологии МВ, к сожалению, остались на этапе проектов. Между тем, многие бактерии, выделяемые из респираторных образцов от пациентов с МВ, имеют особенности культивирования, связанные как с длительностью инкубации и скоростью роста, так и с необходимостью использования расширенного перечня питательных сред [2, 32, 104]. В результате этого, современная микробиология на данном этапе столкнулась с отсутствием единых разработанных алгоритмов и схем по

практической работе с биоматериалом от больных МВ. Пациенты с данным заболеванием проживают во всех регионах и субъектах Российской Федерации и должны иметь возможность получения качественной микробиологической диагностики по месту своего жительства [53, 57, 62].

Стагнация в изучении этого направления в Российской Федерации обусловлена его узкоспецифичностью и малой выборкой пациентов. Одним из факторов, определяющим недостаточный уровень проработки темы, является отсутствие современной нормативной документации для врачей-бактериологов.

Среди имеющихся на данных момент документов, регламентирующих микробиологические исследования при МВ у пациентов в Российской Федерации можно выделить Национальный консенсус «Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия», 2016 г. [34]. В представленном документе, носящим рекомендательный характер, в качестве мероприятий по контролю микрофлоры дыхательного тракта пациентов с МВ прописан лишь посев мокроты или мазка с задней стенки глотки с кратностью не реже 1 раза в 3 месяца.

Кроме того, в этом же документе обозначено, что «качественный ответ по микробиологическому мониторингу мокроты у пациента можно получить лишь в специализированной лаборатории, имеющий опыт работы с материалом больных МВ» [25,34]. Указанное обстоятельство привело к тому, что пациенты стали направлять свой биоматериал в ограниченное количество лабораторий страны, имеющих многолетний опыт работы с данными образцами, что привело к формированию «порочного круга» - пациенты из регионов не обследуются в своих лабораториях, потому что бактериологи в них не имеют опыта работы с материалом от пациентов с МВ, что связано с отсутствием современной нормативной документации и образцов от пациентов с МВ.

Сложившаяся десятилетиями узкая направленность бактериологической диагностики при МВ, ограниченная лишь рамками рутинного ежеквартального исследования мокроты, безусловно, не удовлетворяет на данном этапе представлений о микробиологии, микроэкологии и эпидемиологии МВ, современных потребностей лабораторной службы.

В Российской Федерации недостаточно изучена микрофлора верхних дыхательных путей (ВДП) при МВ и ее потенциальное влияние на формирование хронической легочной инфекции, несмотря на то, что в последние годы все больше оториноларингологов, работающих с такими пациентами, обращают на это внимание клиницистов [7, 18, 38, 40, 63]. Не в полной мере освещены вопросы ранней профилактики формирования инфекции нижних дыхательных путей (НДП), не установлено потенциальное значение окружающей пациента среды, возможность колонизации через ее объекты, а также возможность ее ранней детекции, к примеру, с помощью ПЦР-исследования, для того, чтобы можно было принять терапевтические меры, как в отношении данного пациента, так и не допустить потенциальной колонизации других больных.

Таким образом, вектор изучения этого направления, по нашему мнению, должен быть направлен на учет всех возможных факторов и механизмов, способных повлиять на колонизацию НДП, и очевидно, что микробиологическое обследование пациентов с МВ должно не ограничиваться рутинным исследованием мокроты, а включать в себя совокупность методик обследования, направленных на раннее выявление бактериальных возбудителей и профилактику формирования хронической инфекции НДП, как в рамках микробиологического метода, так и с применением молекулярно-генетических и протеомных исследований.

Цель исследования

Разработка комплексного подхода к микробиологической диагностике бактериальных осложнений для улучшения качества обследования при муковисцидозе.

Задачи исследования

1. Изучить видовой состав возбудителей инфекций нижних дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом из различных регионов Российской Федерации, а также его динамику у пациентов с муковисцидозом Самарской области.

2. Провести оценку распространенности и биологического разнообразия штаммов Burkholderia spp., выделенных от пациентов с муковисцидозом из различных регионов Российской Федерации.

3. Изучить биологические свойства штаммов Burkholderia spp. с применением MALDI-ToF масс-спектрометрии.

4. Провести апробацию тест-систем для раннего поиска генов представителей Burkholderia cepacia complex в клиническом материале от пациентов с муковисцидозом методом ПЦР.

5. Изучить антимикробную активность растительных экстрактов и индивидуальных соединений выделенных из тополя черного Populus nigra L., каштана конского обыкновенного Aesculus hippocastanum L., мяты перечной Mentha piperita L., эвкалипта прутовидного Eucalyptus viminalis L., чабреца Thymus L., аниса Pimpinella anisum L., укропа Anethum graveolens L., тясячелистника обыкновенного Achillea milleofolium L., монарды дудчатой Monarda fistulosa L., аскомицет семейства Parmeliaceae и рода Cladonia в отношении клинических штаммов Bukhholderia cepacia complex методом двойных серийных разведений.

6. Изучить видовой состав микрофлоры из жидкости назального лаважа от пациентов с муковисцидозом, а также оценить его влияние на колонизацию нижних дыхательных путей.

7. Выявить особенности потенциального влияния микрофлоры объектов окружающей среды на возможность внестационарной колонизации дыхательных путей пациентов с муковисцидозом.

8. Разработать алгоритмы комплексного микробиологического обследования пациентов с муковисцидозом.

Методология и методы диссертационного исследования

Исследования по оценке культуральных свойств микроорганизмов,

идентификации с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии, протеомный

анализ полученных белковых спектров проводились на базе кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (зав.каф. - з.д.н. РФ, д.м.н., проф. А.В. Жестков). Методологический принцип исследовательской работы заключался в комплексном подходе по оценке видового состава и распространенности микроорганизмов, выделенных из респираторных образцов от пациентов с МВ в Российской Федерации, разработке методов сбора и первичного посева, а также оценке видового состава микрофлоры жидкости назального лаважа, анализе гетерогенности выделенных культур и возможностей исследования белковых профилей выделенных штаммов, оценке возможности применения молекулярно-генетических методов исследования, а также установления роли объектов окружающей среды в возможной колонизации дыхательных путей пациентов с МВ. Первичный посев клинического материала, смывов с объектов окружающей среды, постановка ПЦР-исследований проводились на базе КДЛ Клиник ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (зав.лаб. - д.м.н., доцент О.А. Гусякова).

Разработка наборов для ПЦР-диагностики генов B.cepacia complex в нативной мокроте пациентов с МВ проводилась ООО «Нуклеоген», г. Ульяновск (ген. директор - Д.А. Викторов). Получение растительных экстрактов и индивидуальных соединений для определения антимикробной активности в отношении штаммов Burkholderia spp. производилось на базе кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии (зав. каф. - ЗРВШ РФ, д.ф.н., профессор В.А. Куркин). Материал, включенный в работу, был собран в период с 2015 по 2019 гг. В исследование были включены 12806 штаммов, среди которых 12069 штаммов, выделенных из 4100 респираторных образцов от 936 пациентов с МВ из 55 регионов Российской Федерации за период 2015-2019 гг. За период 20162018 гг. среди пациентов Самарской области было проведено, параллельно с рутинными посевами мокроты, исследование 61 образца жидкости назального лаважа. Выделено 333 штамма микроорганизмов. В период 2016-2018 гг. параллельно с рутинными посевами было отобрано 192 пробы мокроты для постановки ПЦР-исследования. За период 2016-2017 гг. также было проведено

исследование 176 проб с объектов окружающей пациентов среды, при этом выделено 404 штамма.

Все культуры выделенных микроорганизмов были идентифицированы с использованием метода MALDI-ToF масс-спектрометрии. У штаммов Burkholderia spp. было проведено изучение биологических свойств в виде оценки гетерогенности микробной популяции, оценки чувствительности различных морфотипов к антибактериальным препаратам (в соответствии с критериями CLSI M100-ED29: 2019 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 29th Edition), оценки антимикробной активности ряда растительных экстрактов и индивидуальных соединений в отношении выделенных штаммов методом двойных серийных разведений, а также анализ белковых спектров, полученных при MALDI-ToF масс-спектрометрии с использованием программы Flex Analysis Version 3.4.

Проведена статистическая обработка полученных результатов с использованием пакета программ Microsoft Excel® 2013.

В работе проводился биоинформационный анализ белковых спектров выделенных культур с использованием программного пакета Flex Analysis 3.4 на базе MALDI-ToF масс-спектрометра Microflex LT (Bruker®).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность полученных результатов достигнута за счет применения в качестве методологической и теоретической базы фундаментальных трудов в области микробиологии; соответствия результатов современному уровню методик проведения исследований.

Основные положения диссертации обсуждены на VI ежегодной СевероЗападной с международным участием научно-практической конференции по муковисцидозу «Генетика, диагностика, осложнения, реабилитация» (Санкт-Петербург, 2015), Семинаре-практикуме «Современные подходы в лечении больных муковисцидозом» (Тюмень, 2016), Научно-практической конференции «Муковисцидоз болезнь детей и взрослых. Междисциплинарный подход в лечении

муковисцидоза» (Екатеринбург, 2016), Научно-практической конференции «Особенности амбулаторного наблюдения пациентов с муковисцидозом» (Тольятти, 2016), VII ежегодной Северо-Западной с международным участием научно-практической конференции по муковисцидозу «Практика лечения муковисцидоза» (Санкт-Петербург, 2016), II образовательном семинаре для врачей и родителей города Набережные Челны «Решение актуальных проблем пациентов с муковисцидозом в России» (Набережные Челны, 2016), Научно-практической конференции «Особенности амбулаторного наблюдения и стационарного лечения пациентов с муковисцидозом» (Рязань, 2016), Научно-практической конференции «Муковисцидоз: междисциплинарный подход к диагностике и терапии осложнений» (Самара, 2016), Всероссийской научно-практической конференции «Инновации в медицинской, фармацевтической, ветеринарной и экологической микробиологии» (Санкт-Петербург, 2017), Российско-Китайском конгрессе по медицинской микробиологии, эпидемиологии и клинической микологии (XX Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2017), III Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2017), Школе для родителей и пациентов с муковисцидозом «Методы терапии при заболевании муковисцидоз» (Красноярск, 2018), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы пульмонологии детского возраста и взрослых пациентов с муковисцидозом» (Казань, 2018), IX ежегодной Северо-Западной с международным участием научно-практической конференции по муковисцидозу «Практика лечения муковисцидоза: вопросы микробиологии, пульмонологии, эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2018), Научно-практической конференции «Муковисцидоз сегодня: от ребенка к взрослому» (Чебоксары, 2019), Республиканской научно-практической конференции «Муковисцидоз: вчера, сегодня, завтра» (Казань, 2019), Межрегиональной научно-практической конференции «Муковисцидоз (клиническая картина, диагностика, лечение, диспансеризация)» (Оренбург, 2019), XIV Национальном конгрессе «Актуальные проблемы муковисцидоза» с международным участием (Красноярск, 2019), Всероссийской школе «Муковисцидоз: современные технологии в повседневной

практике» (Красноярск, 2019), Российско-Китайском конгрессе по медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической микологии и иммунологии (XXII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2019), III Всероссийской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодых ученых и специалистов «Эндогенные бактериальные инфекции: клинико-микробиологические и иммунологические аспекты» (Оренбург, 2019), Школе по муковисцидозу «Муковисцидоз (клиническая картина, диагностика, лечение, диспансеризация)» (Нижний Новгород, 2019), Евразийском конгрессе по антимикробной терапии и клинической микробиологии (Уфа, 2019), Форуме специалистов лабораторной медицины Республики Татарстан «Современные подходы к организации лабораторной службы, профессиональные стандарты и образование, перспективные технологии в медицинской практике (Казань, 2020).

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку научной гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования, формулировка цели и задач, разработка дизайна исследования проводилась совместно с научным консультантом з.д.н. РФ, д.м.н., профессором А.В. Жестковым. Экспериментальные исследования, анализ полученных данных, их интерпретация, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях и конгрессах проводились совместно с сотрудниками кафедр общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (зав. каф. - з.д.н. РФ, д.м.н., профессор А.В. Жестков), фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (зав. каф. - ЗРВШ РФ, д.ф.н., профессор В.А. Куркин), КДЛ Клиник ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (зав. - д.м.н., доцент О.А. Гусякова), ООО ««Нуклеоген», г.Ульяновск (ген. директор - Д.А. Викторов).

Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, статистическая обработка первичных данных, написание и оформление рукописи диссертации проведены лично диссертантом.

Положения, выносимые на защиту

1. Среди микроорганизмов, выделенных из респираторных образцов от пациентов с муковисцидозом, доминируют представители неферментирующих грамотрицательных бактерий. В последние годы отмечается тенденция к росту неферментирующих грамотрицательных бактерий с неустановленным к настоящему времени клиническим значением при муковисцидозе.

2. В связи с тем, что бактерии рода Burkholderia являются наиболее прогностически неблагоприятными возбудителями при муковисцидозе, в дополнение к микробиологическому исследованию целесообразно определение молекулярно-генетических и протеомных характеристик, а также учет гетерогенности выделенных от пациента штаммов.

3. Видовой состав микрофлоры параназальных синусов коррелирует с составом микрофлоры нижних дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом. Регулярное микробиологическое исследование микрофлоры из жидкости назального лаважа позволяет выявить клинически значимые микроорганизмы на раннем этапе и может рассматриваться как способ ранней профилактики формирования хронической бактериальной инфекции нижних дыхательных путей при муковисцидозе. Пациентов, имеющих высев клинически значимых патогенов из жидкости назального лаважа, следует рассматривать, как находящихся в группе риска по формированию бактериальных осложнений нижних дыхательных путей.

4. Пациенты с муковисцидозом могут подвергаться риску колонизации дыхательных путей клинически значимыми штаммами микроорганизмов не только в условиях стационара, но и в быту.

5. Внедрение в рутинную практику комплексного подхода к микробиологической диагностике бактериальных осложнений при муковисцидозе дает возможность выявлять колонизацию клинически значимыми штаммами микроорганизмов на раннем этапе, что повышает качество микробиологического обследования при муковисцидозе.

Научная новизна

Впервые разработан и внедрен в рутинную практику способ первичного посева биоматериала, выделенного из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом (Патент РФ на изобретение № 2668406). Впервые проведена оценка видового состава штаммов Burkholderia spp., выделенных от пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации на основании их белковых спектров с помощью MALDI-ToF масс-спектрометрии. Впервые в Российской Федерации проведено изучение антимикробной активности растительных экстрактов и индивидуальных соединений выделенных из тополя черного Populus nigra L., каштана конского обыкновенного Aesculus hippocastanum L., мяты перечной Mentha piperita L., эвкалипта прутовидного Eucalyptus viminalis L., чабреца Thymus L., аниса Pimpinella anisum L., укропа Anethum graveolens L., тясячелистника обыкновенного Achillea milleofolium L., монарды дудчатой Monarda fistulosa L., аскомицет семейства Parmeliaceae и рода Cladonia в отношении клинических штаммов B.cenocepacia и B.multivorans, а также на основании полученных данных разработано средство, обладающее антимикробной активностью - средство на основе травы Монарды дудчатой, обладающее активностью в отношении штамма Burkholderia при муковисцидозе (Патент РФ на изобретение № 2695663), а также способ получения настойки из листьев тополя черного, обладающей активностью в отношении штаммов Burkholderia (Патент РФ на изобретение №2695661). Впервые в Российской Федерации разработан и внедрен в рутинную практику способ сбора и первичного посева жидкости назального лаважа от пациентов с муковисцидозом для микробиологического исследования и проведено ее изучение (Патент РФ на изобретение № 2659155). Успешно апробированы тест-системы для раннего поиска генов представителей B. cepacia complex в клиническом материале от пациентов с муковисцидозом методом ПЦР. Впервые в Российской Федерации изучены факторы риска внестационарной колонизации дыхательных путей при муковисцидозе. Впервые в Российской Федерации разработаны алгоритмы комплексного подхода к микробиологической диагностике при муковисцидозе.

Теоретическая и практическая значимость работы

В теоретическом плане установлено значение микробиологического исследования жидкости назального лаважа в рутинной практике, что требует пересмотра алгоритма микробиологического исследования пациентов с муковисцидозом (Патент РФ на изобретение № 2659155).

Практическое значение состоит в том, что данные о видовом составе выделенной микрофлоры, полученные в результате исследования, с 2016 года находят свое ежегодное отражение в Регистре больных муковисцидозом в Российской Федерации. Предложенный способ первичного посева биоматериала от пациентов с муковисцидозом внедрен в рутинную практику микробиологических лабораторий, работающих с указанным биоматериалом (Патент РФ на изобретение № 2668406). Применение питательных сред, входящих в перечень предложенных в Способах, может быть использовано не только для улучшения качества выделения «классических» бактериальных возбудителей, но и редких и атипичных микроорганизмов (Патент РФ на изобретение № 2711957, Патент РФ на изобретение № 2711954). Использование элективных питательных сред, а также пролонгирование сроков культивирования посевов с последующим детальным изучением биологических свойств выделенной популяции, с учетом всех присутствующих в образце морфотипов и определением антибиотикорезистентности каждого из них позволяет улучшить микробиологическую диагностику при муковисцидозе. На основании результатов проведенного исследования антимикробной активности ряда растительных экстрактов и индивидуальных соединений, разработаны средства, обладающие антимикробной активностью в отношении штаммов Burkholderia spp. (Патент РФ на изобретение № 2695661, Патент РФ на изобретение № 2695663), а также определены соединения, обладающие антибактериальной активностью, что раскрывает перспективы их возможной дальнейшей разработки для получения препаратов на их основе для практического применения у пациентов с муковисцидозом.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в учебный процесс и используются в научно-исследовательской деятельности кафедр общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии; госпитальной педиатрии; фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Результаты диссертационной работы используются в практической деятельности микробиологического отдела КДЛ Клиник Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самарского областного центра по лечению муковисцидоза, расположенного на базе инфекционного боксированного отделения государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Самарская областная детская клиническая больница им. Н.Н. Ивановой» Министерства здравоохранения Самарской области, бактериологической лаборатории Областного государственного бюджетного учреждения здравоохранения Белгородской области «Детская областная клиническая больница» (г. Белгород), городского детского центра муковисцидоза, расположенного на базе инфекционно-боксированного отделения №3 Санкт-Петербургского государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Детская городская больница Святой Ольги» (г. Санкт-Петербург), лаборатории бактериологических исследований бюджетного учреждения здравоохранения Воронежской области «Воронежский областной центр профилактики и борьбы со СПИД» (г. Воронеж), лаборатории клинической бактериологии государственного автономного учреждения здравоохранения «Республиканская клиническая больница» Министерства здравоохранения Республики Татарстан (г. Казань), бактериологической лаборатории государственного бюджетного учреждения

здравоохранения «Городская клиническая больница №15 им. О.М.Филатова Департамента здравоохранения города Москвы» (г. Москва).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 264 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами и 61 рисунком, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 5 глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 68 отечественных и 240 зарубежных источников. По теме диссертации опубликовано 37 работ: 1 монография, 22 работы в научных журналах и изданиях, которых включены в перечень российских рецензируемых научных журналов, и изданиях для опубликования основных научных результатов диссертации (из них 2 работы -в международных базах Scopus, WoS, Pubmed, 14 в рецензируемых научных изданиях из перечня ВАК, 6 патентов РФ на изобретение), 13 работ опубликовано в материалах Всероссийских и международных конференций, 1 публикация в электронном научном издании.

ГЛАВА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛАБОРАТОРНОЙ

ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ МУКОВИСЦИДОЗЕ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ

(обзор литературы)

1.1. Муковисцидоз: этиология, патогенез, распространенность

МВ является самым распространенным генетическим заболеванием, наследуемым по аутосомно-рецессивному типу, приводящим к нарушению нормального функционирования экзокринных желез организма и значительно сокращающим продолжительность жизни пациента [34, 41, 52, 53]. Показано, что носительство гена МВ среди представителей европейской расы составляет 1:25 человек. Частота встречаемости МВ в странах Северной Европы и Северной Америки достаточно высока, и составляет в среднем 1:2000-2500 новорожденных, а среди представителей коренного населения Азии и Африки, напротив, очень низкая, менее 1:100000 новорожденных. В Российской Федерации частота заболевания в различных регионах колеблется от 1:8500 до 1:12900 новорожденных [56]. В последние годы, вследствие улучшения качества терапии, микробиологической диагностики, а также благодаря введению неонатального генетического скрининга новорожденных продолжительность жизни пациентов стала расти. Так, по данным Регистра больных МВ в Российской Федерации за 2016 год, ожидаемая продолжительность жизни пациентов, рожденных в 2011 году составит 42,75 года, в 2014 году - 50,96 года, а для рожденных в 2016 году уже 55,45 года [52]. Вследствие увеличения продолжительности жизни, а также общего количества пациентов первостепенной задачей здравоохранения, на наш взгляд, должно стать сохранение их легочной функции, посредством предотвращения формирования хронической бактериальной инфекции дыхательных путей.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Кондратенко Ольга Владимировна, 2020 год

быть источником

6.4.1.2. Особенности микрофлоры, выделенной со смывов с поверхностей кухни

Для оценки степени контаминации объектов на кухне пациента исследовано 14 проб с раковин, кранов и сушилок для посуды. Был выделен 41 штамм микроорганизмов, при этом доминирующее положение в структуре занимали представители НФГОБ - 22 (53,7%) штамма. Спектр выделенных штаммов НФГОБ представлен на рисунке 60.

16,0% — 14,0% — 12,0% — 10,0% 8,0% —

6,0% 4,6% 4,6% 4,6% 4,6% 4,6% 4,6% 4,0%

13,5% 13,5% 13,5%

2,0% 0,0%

MPseudomonas spp. MP.putida MP.montelli MP.alcaphila MA.lwojf

MA.pitti MA.johnsonii MAjunii ш S.maltophilia MA.spanius

MC.gleum ■ C.indologenes MS.multivorum MB.diminuta ■ R.radiobacter

Рисунок 60 - Спектр штаммов НФГОБ, выделенных со смывов с поверхностей кухни (в%)

Из представленной диаграммы видно, что среди выделенных штаммов НФГОБ преобладают представители рода Acinetobacter, реже рода Pseudomonas, при этом не было выделено штаммов, имеющих доказанное клиническое значение при МВ, в том числе P. aeruginosa. Было выделено 3 (13,5%) штамма S.maltophilia, что нужно непременно учитывать, т.к. данный возбудитель может колонизировать НДП при МВ. Отдельный интерес представляет случай выделения штамма

A.spanius. Несмотря на то, что указанный вид на данный момент не описан как имеющий значение при МВ, многие представители другие представители рода Achromobacter способны приводить к значительному снижению легочной функции.

Значение выделенных штаммов представителей родов Chryseobacterium, Sphingobacterium, Brevundimonas на данный момент не установлено, однако они выделяются из респираторных образцов от пациентов с МВ.

Также получен рост 13 (31,7%) штаммов представителей порядка Enterobacterales, среди которых 4 (30,8%) штамма Klebsiella spp., 8 (61,5%) штаммов Enterobacter spp., 1 (2,4%) штамм Aeromonas spp. Кроме этого, выделено 3 (7,3%) штамма Bacillus spp. и 1 (2,4%) штамм Aspergillus spp., а также 2 (4,9%) штамма Enterococcus spp.

Таким образом, на поверхностях на кухне могут создаваться оптимальные условия для размножения штаммов НФГОБ, в том числе представителей, имеющих клиническое значение при МВ, и при недостаточном уровне и регулярности обработки этих объектов и их просушке они также могут быть источником распространения указанных возбудителей.

6.4.3. Оценка роли мест для хранения овощей, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое значение при муковисцидозе

При оценке 12 проб с ящиков для хранения овощей выделено 47 штаммов микроорганизмов. Среди грамположительных бактерий доминирующее положение занимали спорообразующие палочки - 25 (53,2%) штаммов, среди которых 21 (84,0%) штамм рода Bacillus spp., а также 4 (8,6%) штамма Enterococcus spp.

Среди энтеробактерий выделено 5 (10,6%) штаммов, среди которых 2 (40,0%) штамма Enterobacter spp., по 1 (20,0%) штамму Pantoea spp., Raoutellla spp., Providencia spp., соответственно.

Среди НФГОБ выделено 8 (17,0%) штаммов, по 1 штамму (по 12,5%) P.putida, S.multivorum, A.lwoffi, F.saccarophillum, A.radioresistens, A.ardleyensis, A.schindleri, R.radiobacter, соответственно.

Среди выделенных штаммов НФГОБ не было представителей, имеющих клиническое значение при МВ, однако все они способны колонизировать дыхательные пути пациентов и могут быть выделены из клинического материала.

Кроме этого выделено 5 (10,6%) штаммов грибов рода Aspergillus, которые могут иметь клиническое значение при МВ.

Таким образом, ящики для хранения овощей могут быть источниками колонизации штаммами Aspergillus spp. для пациентов, а также некоторыми представителями НФГОБ. Учитывая это обстоятельство, рекомендуется хранить их в недоступном для пациентов месте, а также регулярно проводить их дезинфекцию.

6.4.4. Оценка роли объектов из комнаты пациента, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое значение при муковисцидозе

При исследовании 11 проб, взятых из детских комнат и спален, в которых проживают пациенты с МВ, выделено 16 штаммов микроорганизмов, среди которых 10 (62,5%) - представители грамположительной кокковой флоры (5 (50,0%) штаммов Staphylococcus spp., 3 (30,0%) штамма - Micrococcus spp., 2 (20,0%) штамма Streptococcus spp., 4 (25,0%) штамма спорообразующих палочек рода Bacillus, а также 2 (12,5%) штамма НФГОБ, среди которых по 1 (50,0%) штамму P. putida и A. lwoffi, соответственно.

Таким образом, нами не было выделено штаммов НФГОБ, имеющих значение для пациентов с МВ, а также штаммов представителей порядка Enterobacterales, грибов рода Aspergillus, что свидетельствует о достаточном уровне гигиенической обработки помещений.

6.4.5. Оценка роли систем кондиционирования и вентиляции, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое значение при муковисцидозе

При исследовании 7 проб, взятых с систем кондиционирования и вентиляции, выделено 10 штаммов микроорганизмов, при этом в 3 (42,9%) пробах не было получено роста микрофлоры. Среди выделенных штаммов преобладали НФГОБ -4 (40,0%) штамма, среди которых 3 (75,0%) штамма A.ursungii и 1 (25,0%) штамм P.stutzeri. Реже встречались представители грамположительной кокковой флоры -3 (30,0%) штамма (2 (66,7%) штамма - Micrococcus spp., 1 (33,3%) штамм Streptococcus spp.), 2 (20,0%) штамма спорообразующих палочек рода Bacillus, а также 1 (10,0%) штамм грибов рода Aspergillus.

Выявление в посевах проб грибов рода Aspergillus должно расцениваться как неблагоприятный фактор, свидетельствующий о низком качестве инженерного обслуживания системы вентиляции в доме, указывающий на возможные риски колонизации дыхательных путей пациента и членов его семьи указанными штаммами грибов.

6.4.6. Оценка роли объектов быта, как потенциальных источников для колонизации дыхательных путей штаммами, имеющими клиническое

значение при муковисцидозе

При исследовании 7 проб грунта из цветочных горшков выделено 39 штаммов микроорганизмов, при этом в одной (14,3%) пробе не выявлено роста.

Среди выделенных штаммов лидирующее место занимали спорообразующие палочки рода Bacillus - 15 (38,5%) штаммов. На втором месте по частоте встречаемости были НФГОБ - 12 (30,8%) штаммов, по 1 штамму (8,3%) P.graminis, P.alcaligenes, A.junii, A.schindleri, S.maltophilia, A.spanius, A.denitrificans, A.piechaudii, C.gleum, S.multivorum, O.intermedium и A.sulfureus, соответственно.

На третьем месте по частоте выделения были грибы - 4 (10,2%) штамма. При этом 1 (25,0%) штамм Candida spp., 2 (50,0%) штамма Aspergillus spp. и 1 (25,0%) штамм Mucor spp.

Выделено 5 (12,8%) штаммов грамположительных кокков (2 штамма Staphylococcus spp., 2 штамма Enterococcus spp. и 1 штамм Streptococcus spp.).

Кроме этого, выделено 3 (7,7%) штамма энтеробактерий, среди которых 2 (66,7%) штамма Citrobacter spp. и 1 (33,3%) штамм Enterobacter spp.

Таким образом, грунт из цветочных горшков может быть контаминирован значительным количеством возбудителей. Несмотря на то, что в исследуемых нами пробах не было выделено штаммов, имеющих клиническое значение при МВ, присутствие их в аналогичных образцах возможно, т.к. почва и ризосфера ряда растений является их естественной средой обитания.

6.5. Резюме

Таким образом, подводя итог представленным в главе результатам проведенных исследований, следует отметить, что родственники и члены семей пациентов с МВ могут являться источниками штаммов микроорганизмов, в том числе S. aureus. Несмотря на то, что среди обследованных нами семей не было случаев носительства штаммов MRSA, нужно учитывать, что колонизация дыхательных путей пациентов с МВ подобными штаммами возможна не только в условиях стационара, но и в быту. Кроме того, несмотря на то, что нами не было выявлено случаев носительства потенциально опасных микроорганизмов для этой группы больных, таких как P.aeruginosa, Achromobacter spp., S.maltophilia, B.cepacia complex и других у членов семьи пациентов, нами были выявлены носители НФГОБ, с неустановленным клиническим значением.

Важным фактором, препятствующим распространению штаммов, имеющих значение для пациентов с МВ, является качественная обработка элементов небулайзеров и других ингаляторов. При несоблюдении правил обработки элементов небулайзера, а также не полной их просушке эти приборы могут быть

потенциально опасными источниками концентрации и распространения штаммов НФГОБ и других микроорганизмов.

В результате проведенного исследования микрофлоры объектов с места постоянного проживания пациента нами было выявлено, что наибольший риск для возможной колонизации дыхательных путей штаммами НФГОБ, имеющими клиническое значение при МВ представляют места с повышенной влажностью, а именно сливы ванн, раковин, поддоны душевых кабин, а также поддоны сушилок для тарелок на кухне. Учитывая это обстоятельство, родителям и пациентам следует обращать особое внимание на обработку этих объектов дезинфицирующими средствами, не допускать длительного скопления воды на объектах (протирать и просушивать резиновые контуры стиральных машин, поддоны для посуды). Кроме того, ящики для хранения овощей могут быть источниками колонизации штаммами Aspergillus spp., а также некоторыми представителями НФГОБ, а грунт из цветочных горшков может быть контаминирован значительным количеством возбудителей. Несмотря на то, что в исследуемых нами пробах не было выделено штаммов, имеющих клиническое значение при МВ, присутствие их в аналогичных образцах возможно, т.к. почва и ризосфера ряда растений является их естественной средой обитания. Кроме того, при наличии в доме систем кондиционирования воздуха необходимо уделять особое внимание их регулярному профилактическому инженерному обслуживанию, с целью недопущения размножения и распространения штаммов, представляющих опасность для пациентов с МВ.

Таким образом, пациенты с МВ могут подвергаться риску колонизации дыхательных путей агрессивными штаммами не только в условиях стационара, но и в быту.

Учитывая все вышеизложенное, становится очевидным, что микробиологическое обследование пациентов с МВ не должно ограничиваться рамками рутинного исследования мокроты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ, ИЗЛОЖЕННЫМ В 6 ГЛАВЕ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Кондратенко, О. В. Оценка влияния микрофлоры объектов окружающей среды на возможность внестационарной колонизации дыхательных путей пациентов с муковисцидозом / О. В. Кондратенко // Ульяновский медико -биологический журнал. - 2018. - № 4. - С. 156-165.

Патенты:

2. Патент RU 2668406 С1 Российская Федерация, МПК СВД 1/04 (2006.01), С^ 1/20 (2006.01), СЖ 1/01 (2006.01). Способ первичного посева биоматериала, выделенного из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом: заявка № 2017122657, 27.06.2017 : опубл. 28.09.2018 / О. В. Кондратенко, А. В. Лямин, Д. Д. Исматуллин. - Бюл. № 28. - 9 с.

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПОДХОДА К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ МУКОВИСЦИДОЗЕ

В последние десятилетия в вопросах улучшения качества диагностики и терапии осложнений при МВ достигнут значительный прогресс. Пациенты, которым благодаря внедрению неонатального скрининга был поставлен диагноз и назначено лечение уже не отличимы по ряду физикальных параметров от здоровых детей и подростков. Однако, по-прежнему, значительную сложность представляют диагностика и лечение хронической респираторной инфекции. Бактериальные инфекции легких у пациентов с МВ остаются одной из главных причин ранней летальности. Большинство возбудителей, имеющих потенциальное клиническое значение при МВ, приводит к формированию хронической инфекции в легочной ткани, крайне сложно ликвидируемой терапевтически.

7.1. Обоснование разработки комплексного подхода к

микробиологической диагностике бактериальных осложнений при

муковисцидозе

На современном этапе микробиологическая диагностика при МВ сводится лишь к регулярному, ежеквартальному исследованию респираторных образцов и, как следствие, назначению антибактериальной терапии и ее коррекции по результатам данного заключения.

Между тем, большинство оппортунистических патогенов, вызывающих инфекционный процесс при МВ изначально колонизируют ВДП, однако в рутинной практике исследование микрофлоры указанного локуса у данной группы больных часто сводится лишь к ежегодному посеву мазков из носа на носительство S.aureus.

Как известно, самой прогностически неблагоприятной группой возбудителей при МВ являются бактерии B.cepacia complex. На данном этапе остается не до конца понятной длительность инкубационного периода при данной инфекции, однако работы зарубежных авторов демонстрируют, что ДНК Burkholderia spp. обнаруживается в мокроте у ряда пациентов при проведении ПЦР-исследования задолго до первого высева. Ввиду этого, регулярное ПЦР-исследование, на современном этапе, является залогом ранней профилактики инфекции у пациентов и фактором, способствующим предотвращению внутристационарных вспышек инфекции среди пациентов указанной группой возбудителей.

В то же время, пациенты с хронической инфекцией, ассоциированной с B.cepacia complex также нуждаются в динамическом микробиологическом наблюдении. В процессе многолетней колонизации штаммы изменяют свои биологические свойства в условиях длительной гипоксии, дефицита железа, действия антибактериальных препаратов. Все эти воздействия находят свое отражение в формировании гетерогенного бактериального сообщества, в котором различные морфотипы отличаются по скорости роста, размеру колоний, чувствительности к антибактериальным препаратам и другим признакам. Различные по своим биологическим свойствам штаммы бактерий одного вида, могут иметь отличия при изучении их белковых профилей. Явление гетерогенности необходимо учитывать при определении антибиотикорезистентности, однако количество колоний, которое необходимо снять для исследования в отношении данного возбудителя не регламентировано.

В течение длительной колонизации под влиянием ряда неблагоприятных факторов происходят динамические изменения белковых профилей штаммов, своевременное выявление которых может помочь в прогнозировании снижения легочной функции и, возможно, предотвратить развитие «cepacia»-синдрома. Однако, в настоящее время, возможность применения MALDI-ToF масс-спектрометрии с целью динамической оценки и прогнозирования течения инфекции недостаточно изучена и не регламентирована нормативными документами, и, как следствие, не проводится, несмотря на то, что в последние

годы все большее количество лабораторий, занимающихся микробиологической диагностикой осложнений у пациентов с МВ оснащены данным оборудованием.

Отдельную группу пациентов, требующую разработки подходов к раннему выявлению и профилактике бактериальных осложнений со стороны дыхательных путей, являются пациенты с МВ нуждающиеся в билатериальной трансплантации легких, как в периоперационном, так и в послеоперационном периоде. Как правило, эти пациенты имеют хроническую бактериальную инфекцию легких, ассоциированную со штаммами P.aeruginosa и/или B.cepacia complex, приведшей к снижению дыхательной функции и необходимости пересадки органа. Несмотря на то, что работами зарубежных авторов показана реколонизация трансплантата флорой из ВДП, идентичной флоре из эксплантированных легких, микрофлора параназальных синусов у пациентов с МВ в Российской Федерации до и после операции не мониторируется, что может приводить к формированию инфекции в транспланированных легких.

Пациенты после трансплантации, находясь на иммуносупрессивной терапии подвержены риску реколонизации легких не только флорой из ВДП, но и через объекты быта пациента и окружающей среды. При этом возможность выборочного микробиологического обследования отдельных элементов быта пациента, при условии потенциального риска колонизации или подозрении на колонизацию штаммами из окружающей среды в большинстве случаев недоступна для пациентов. В то же время, своевременное выявление источника колонизации является залогом высокой вероятности эрадикации штамма. Пациентам с МВ все же следует воздерживаться от посещения мест, несущих потенциальную опасность колонизации дыхательных путей. Кроме того, больные МВ должны воздерживаться от посещения мест не только опасных по колонизации штаммами B.cepacia complex и другими значимыми при МВ бактериями, но и эндемичных регионов по колонизации штаммами B.pseudomalei, т.к. их легкие более уязвимы в отношении данного патогена.

С учетом микробиологических и эпидемиологических особенностей микроорганизмов, колонизирующих дыхательные пути пациентов с МВ, а также

особенностей патогенеза респираторной инфекции при данном заболевании становится очевидным целесообразность расширения спектра микробиологического обследования у данной группы больных с выполнением не просто рутинных исследований респираторных образцов, а применением комплексного подхода к лабораторной диагностике.

Под комплексным подходом к микробиологической диагностике при МВ мы понимаем совокупность исследований различных биологических образцов с применением сочетания разных методик, как в рамках микробиологического метода, так и с применением молекулярно-генетических и протеомных исследований.

7.2. Алгоритмы комплексного подхода к микробиологической диагностике пациентов с муковисцидозом в зависимости от их микробиологического статуса

В зависимости от доминирующего возбудителя, колонизирующего НДП, перечень и кратность проводимых исследований могут различаться. В связи с этим, всех пациентов с МВ на основании их микробиологического статуса предложено ранжировать на четыре группы.

Первая группа - пациенты, не имеющие высевов в мокроте клинически значимой микрофлоры.

Вторая группа - пациенты, имеющие интермиттирующие высевы P.aeruginosa или иных грамотрицательных бактерий.

Третья группа - пациенты, имеющие хроническую инфекцию НДП, ассоциированную с клинически значимыми бактериями, кроме B.cepacia complex.

Четвертая группа - пациенты, имеющие хроническую инфекцию НДП, ассоциированную с B.cepacia complex.

В отношении первой группы пациентов комплексный подход целесообразно строить на основании профилактических принципов, целью которого является

максимально раннее выявление клинически значимых бактерий в образце и принятие мер по недопущению развития хронической бактериальной инфекции.

В отношении пациентов второй группы ключевым аспектом комплексного подхода является поиск локуса первичной колонизации и его своевременная санация. В большинстве случаев, интермиттирующие высевы возбудителей из НДП объясняются первичной колонизацией штамма в параназальных синусах и периодической миграцией возбудителя в составе носоглоточной слизи на заднюю стенку глотки и в НДП. При этом, без соответствующей ингаляционной антибактериальной терапии, затрагивающей ВДП добиться эрадикации возбудителя из организма только лишь небулайзерной терапией на НДП невозможно.

В отношении пациентов третьей группы комплексный подход должен быть направлен как на эрадикацию клинически значимых штаммов, так и на предотвращение дополнительной колонизации дыхательных путей новыми штаммами бактерий. В большинстве случаев, хронические высевы возбудителей из НДП объясняются первичной колонизацией штамма в параназальных синусах с последующей миграцией возбудителя в составе носоглоточной слизи на заднюю стенку глотки и позднее в НДП с формированием в них хронической инфекции. При этом возможность успешной санации определяется рядом аспектов, включающими длительность колонизации, комплаентность пациента, чувствительность выделенной флоры к антибактериальным препаратам, способностью к биопленкообразованию и другими факторами. При этом, как и в случае с интермиттирующей инфекцией, без соответствующей ингаляционной антибактериальной терапии, затрагивающей ВДП добиться эрадикации возбудителя из организма только лишь небулайзерной терапией на НДП невозможно.

В отношении пациентов четвертой группы ключевым аспектом комплексного подхода является поиск микробиологических предикторов снижения легочной функции и своевременной коррекции терапии с целью предотвращения развития «сepacia»-синдрома. Хроническая инфекция НДП, ассоциированная с

B.cepacia complex является наиболее сложным и прогностически неблагоприятным вариантом бактериальной инфекции легких при МВ. При этом прогноз для пациента во многом определяется видом возбудителя, а также его сиксенс-типом и источником колонизации. Наиболее тяжелое течение и серьезный прогноз в Российской Федерации имеют пациенты, выделяющие B.cenocepacia, колонизированные в условиях стационара в рамках межпациентских контактов. В то же время, при колонизации НДП неэпидемическими клонами B.cepacia complex в ряде случаев у части пациентов, особенно в случае первого высева, можно добиться эрадикации штамма. Кроме того, пациенты с отличающимися сиквенс-типами не должны госпитализироваться совместно с другими пациентами с эпидемическими клонами буркхольдерий. Поэтому определение сиквенс-типа буркхольдерий является необходимой частью лабораторной диагностики при МВ. Ввиду этого, все впервые выделенные штаммы бактерий B.cepacia complex рекомендовано передавать на секвенирование врачами-бактериологами в специализированную лабораторию с указанием локуса выделения. При хронической инфекции, ассоциированной с B.cepacia complex возбудитель присутствует как в параназальных синусах, так и в легочной ткани. При этом возможность успешной санации определяется рядом аспектов, включающих длительность колонизации, комплаентность пациента, чувствительность выделенной флоры к антибактериальным препаратам, способностью к биопленкообразованию, сиквенс-типом и другими факторами.

У пациентов с хронической инфекцией, ассоциированной с B.cepacia complex рекомендовано динамическое исследование штаммов в референсных лабораториях или региональных лабораториях, в которых имеются технические возможности MALDI-ToF масс-спектрометрии и обученные специалисты.

Нами были разработаны алгоритмы комплексного подхода к диагностике с учетом особенностей микробиологического статуса пациентов, представленные на рисунке 61.

Первая группа 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Вторая группа • • • 1 1 1 1 1 1 Третья группа Четвертая группа

Микробиологическое исследование респираторных образцо 2668406. Патент РФ № 2711957. Патент РФ№ 2711954) 1 раз i перед каждой госпитализацией в (Патент РФ № 3 месяца, а также

Микробиологическое исследование жидкости назального лаважа (Патент РФ№ 2659155) 1 раз в 3 месяца, собирается и исследуется параллельно с респираторными образцами

ПЦР-исследование мокроты для раннего поиска генов В. cepacia complex.

i ■

Кратность обследования 1 раз в 3 месяца ! Кратность обследования 1 раз в год

I 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Ооследование ВДП членов семьи пациента для выявления колонизации МКБА -1 раз в год

Выоорочное микробиологическое исследование ооъектов быта пациента. -индивидуально по показаниям

Исследование белковых профилей штаммов, выделенных из жидкости назального лаважа и респираторных образцов - индивидуально по показаниям

Снятие и

динамическое

исследование

белковых

профилей

штаммов В.

cepacia complex.

выделенных из

каждого

респираторного

образца *

Секвенирование

выделенных

штаммов**

Проводится для оценки гетерогенности популяции, а также оценки динамических изменений белковых профилей и поиска предикторов снижения легочной функции. ** Проводится для определения сиквенс-типа. что определяет тактику ведения, прогноз для пациента и степень возможности эрадикации.

-!-!-;-

Рисунок 61 - Алгоритмы комплексного подхода к диагностике с учетом особенностей микробиологического статуса пациента

В случае выявления клинически значимых бактерий, в том числе и ранее не выделяемых у пациента из респираторных образцов необходимо незамедлительно сообщать об этом лечащему врачу для определения в отношении его терапевтической тактики.

В случае первого выявления клинически значимых бактерий из респираторных образцов и жидкости назального лаважа необходимо незамедлительно сообщать об этом лечащему врачу, вне зависимости от титра выделенных микроорганизмов, для определения тактики в отношении ведения данного пациента. Кроме этого, рекомендована консультация оториноларинголога, для определения возможности хирургического вмешательства, с последующим назначением антибактериальной терапии как на ВДП (предпочтительнее с использованием ингалятора с пульсовой подачей лекарственного вещества), так и на НДП с использованием небулайзерной антибактериальной терапии.

При назначении лечебной тактики клиницистам следует принимать во внимание возможное присутствие нескольких различающихся по антибиотикорезистентности морфотипов штаммов P.aeruginosa, 8.таЫорИШа, Б.аигвш или A.xylosoxidans, что должно быть непременно отражено в заключении по результату микробиологического исследования.

В случае положительного результата ПЦР-исследования необходимо также сообщить об этом лечащему врачу и провести повторное подтверждающее исследование. В случае повторного положительного результата ПЦР-исследования решение о назначении антибактериальной терапии принимается лечащим врачом. Кратность ПЦР-исследования у пациентов 1- 3 групп составляет 1 раз в 3 месяца, в то время как для пациентов четвертой группы - 1 раз в год. В случае отсутствия положительных высевов указанных штаммов в течение года, ПЦР-диагностика может быть подтверждающей эрадикацию методикой.

В случае выявления клинически значимых для пациента с МВ штаммов с ВДП родственников и членов семьи пациента рекомендована консультация терапевта (педиатра) для подбора препаратов для местной терапии.

При выявлении клинически значимых бактерий с объектов быта пациента рекомендована коррекция режимов обработки объектов с последующим повторным контрольным исследованием.

7.3. Опыт реализации модели комплексного подхода к микробиологической

диагностике

Проведя анализ полученных данных в отношении значительного количества пациентов с МВ из различных регионов Российской Федерации, мы стали применять разработанные алгоритмы комплексного подхода в рутинной микробиологической практике лаборатории.

Для пациентов Самарской области исследование жидкости назального лаважа уже вошло в протокол регулярного обследования. Благодаря этому, в 2019 году удалось на раннем этапе выявить колонизацию, а клиницистам назначить терапию затрагивающую ВДП у двух пациентов со штаммами A.xylosoxidans и одного пациента со штаммом P.aeruginosa с использованием ингаляторов с пульсовой подачей антибактериальных препаратов. Аналогичным образом, на основании проведенного исследования жидкости назального лаважа и выявления в ней штаммов P.aeruginosa была скорректирована лечащими врачами терапия пациента из республики Татарстан (достигнута микробиологически подтвержденная эрадикация из носа и зева), а также пациентки Оренбургской области (достигнута эрадикация штамма из легких, рост культуры из жидкости назального лаважа сохраняется, отмечено снижение количества с 105 до 102 КОЕ/мл жидкости).

Клинический пример 5.

Использование алгоритмов комплексного подхода к терапии особенно наглядно иллюстрируется примером пациента С., 6 лет, наблюдающегося в центре по лечению МВ Самарской области с диагнозом: МВ, смешанная форма, тяжелое течение, мутации AF508/3849+10kbC-T. C декабря 2015 года первый высев B.cenocepacia в количестве 102 КОЕ при исследовании мазка с задней стенки глотки. Анамнестически не имел контактов с другими пациентами с МВ. Не имеет

отрицательной динамики по результатам физикального обследования и по результатам КТ легких.

Были обследованы родственники и члены семьи пациента. Носительства микрофлоры, имеющей клиническое значение при МВ, не выявлено. При исследовании качества обработки небулайзеров также не обнаружено роста значимых микроорганизмов.

Проведено неоднократное исследование смывов с объектов с места проживания пациента. Выявлен штамм A.xylosoxidans в смыве со слива раковины в ванной комнате. При этом из респираторных образцов от ребенка штамм никогда ранее не выделялся. Были предложены меры по корректировке режимов дезинфекции, после их внедрения повторного выделения указанных штаммов не было выявлено.

В 2016 и 2017 годах было проведено ПЦР-исследование мокроты пациента. Результаты исследования обеих проб оказались отрицательными.

С 2015 года ребенок находился на непрерывной антибактериальной комбинированной терапии, включающей в себя ингаляционный и пероральный приемы препаратов. Пациент проходил регулярное микробиологическое обследование с момента первого высева. Ребенок практически не отделяет мокроту, поэтому в большинстве случаев исследовались мазки с задней стенки глотки. С 2016 по 2018 гг. пациент имел интермиттирующие высевы штамма с кратностью от одного (в 2016 и 2017гг) до двух (2018 г.) раз в год в количестве от 102 до 104 КОЕ при общей кратности посевов от 6 до 11 в год.

В январе 2019 года был получен рост штамма в количестве 102 КОЕ, при исследовании мазков из полости носа роста не выявлено.

В феврале 2019 года пациенту было проведено параллельное исследование мазка с задней стенки глотки и жидкости назального лаважа. В первом исследовании роста B.cenocepacia получено не было. При исследовании жидкости назального лаважа был получен рост штамма в количестве 32 КОЕ/мл лаважной жидкости. Мы предположили, что, вероятно, основным резервуаром инфекции в данном случае являются ВДП.

Ребенку была назначена консультация ЛОР-врача, проведено хирургическое лечение гайморовых пазух носа.

К этому моменту ребенок более 3 лет получал непрерывную антибактериальную терапию, что естественно нашло отражение в видовом составе микрофлоры его кишечника. При иследовании кала было выявлено резкое снижение количества лактобактерий, а также отсутствие лактозопозитивной кишечной палочки.

Совместно с лечащим врачом было принято решение об изменении схемы ведения пациента - отказе от системной антибактериальной терапии, и назначении антибактериальной терапии на ВДП с использованием ингалятора с пульсовой подачей препарата.

В марте 2019 года при исследовании жидкости назального лаважа выявлен рост B.cenocepacia в количестве 1950 КОЕ/мл лаважной жидкости. Данный факт, по-видимому, был связан с тем, что после промывания у пациента улучшился отток из пазух. В мазке с задней стенки глотки, несмотря на отмену терапии, роста не получено. С марта по июль 2019 года пациент обследован восьмикратно, при этом параллельно исследованы мазки с задней стенки глотки и жидкости назального лаважа. Роста возбудителя не было получено ни в одной пробе.

В июле получен рост культуры из жидкости назального лаважа в количестве 5 КОЕ/мл, позднее также был получен рост возбудителя из указанного материала в октябре и декабре 2019 и марте 2020 года. Все остальные пробы жидкости назального лаважа были отрицательными в отношении данного возбудителя.

Если обратиться к результатам посевов мазков с задней стенки глотки, то интерес представляет тот факт, что несмотря на отсутствие антибактериальной терапии на НДП у пациента не было выявлено ни одного положительного посева с января 2019 года по июнь 2020 года, когда описывается данный клинический случай. Согласно критериям эрадикации, а при B.cenocepacia ими является отсутствие роста в пробах в течение одного года, мы можем говорить о том, что вероятно легкие пациента свободны от этой инфекции [34]. Но закономерно возникает сомнение в том, что у этого пациента имела место истинная инфекция

НДП. Можно предположить, что в данном случае речь идет о крайне редком явлении - изолированной синоназальной колонизации штаммом B.cenocepacia у пациента с МВ.

Спустя несколько месяцев после отмены системной антибактериальной терапии мы провели повторное исследование микрофлоры кишечника ребенка, и обнаружили восстановление лактозопозитивной кишечной палочки.

Таким образом, применение комплексного подхода в отношении данного пациента позволило установить первичный очаг инфекции, скорректировать антибактериальную терапию, что привело к снижению нагрузки на весь организм, но в том числе и на кишечную микрофлору и позволило избежать развития тяжелых последствий, таких как развитие C.difficile-ассоциированного колита, а также способствовало восстановлению нормальной микрофлоры кишечника.

7.3. Резюме

Таким образом, разработка и внедрение в рутинную практику комплексного подхода к микробиологической диагностике бактериальных осложнений при МВ является актуальной задачей современной медицины. Предложенные подходы и алгоритмы диагностики позволяют выявить колонизацию клинически значимыми штаммами бактерий на раннем этапе, что может служить эффективной профилактической мерой в отношении недопущения развития хронической бактериальной инфекции, особенно у тех пациентов, НДП которых еще не колонизированы указанными возбудителями. Своевременное выявление и назначение терапии в отношении указанных бактерий будет способствовать сохранению легочной функции и, как следствие, увеличению продолжительности жизни пациентов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ, ИЗЛОЖЕННЫМ В 7 ГЛАВЕ

Руководства:

3. Руководство по микробиологической диагностике инфекций дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом / С. В. Поликарпова, С. В. Жилина, О. В. Кондратенко [и др.]. - Тверь, 2019. - 128 с.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

4. Редкие осложнения терапии муковисцидоза: Clostridium difficile-ассоциированный колит / О. В. Кондратенко, А. В. Лямин, Е. А. Васильева [и др.] // Пульмонология. - 2016. - Т. 26, № 5. - С. 556-559.

5. Кондратенко, О. В. Оценка влияния микрофлоры объектов окружающей среды на возможность внестационарной колонизации дыхательных путей пациентов с муковисцидозом / О. В. Кондратенко // Ульяновский медико-биологический журнал. - 2018. - № 4. - С. 156-165.

6. Мониторинг микрофлоры параназальных синусов как способ ранней профилактики колонизации нижних дыхательных путей клинически значимыми штаммами микроорганизмов у пациентов с муковисцидозом / О. В. Кондратенко, А. В. Жестков, Е. Д. Медведева [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2018. - Т. 20, № 5(4). - С. 569-578.

7. Особенности спектра патогенных генетических вариантов гена CFTR у больных муковисцидозом из Российской Федерации / Н. В. Петрова, Е. И. Кондратьева, А. В. Поляков [и др.] // Сибирское медицинское обозрение. -2019. - № 2. - С. 47-59.

8. Разработка и апробация тест-систем для раннего выявления ДНК бактерий Burkholderia cepacia complex в мокроте методом полимеразной цепной реакции при муковисцидозе / О. В. Кондратенко, Д. А. Викторов, А. Н. Тороповский [и др.] // Астраханский медицинский журнал. - 2019. - Т. 14, № 3. - С. 71-79.

9. Кондратенко, О. В. Гетерогенность популяции штаммов рода Burkholderia, выделенных от пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации / О. В. Кондратенко // Иммунопатология, аллергология, инфектология.

- 2019. - № 3. - С. 71-74.

10. Кондратенко, О. В. Адаптация и гетерогенность популяции штаммов Burkholderia cepacia complex в условиях хронической инфекции при муковисцидозе / О. В. Кондратенко // Астраханский медицинский журнал. - 2020.

- Т. 15, № 1. - С. 65-73.

Публикации в других изданиях:

11. Динамический мониторинг микрофлоры нижних дыхательных путей при муковисцидозе / О. В. Кондратенко, А. В. Лямин, А. В. Козлов [и др.] // Лаборатория. - 2016. - № 1. - С. 23.

12. Кондратенко, О. В. Динамика микрофлоры нижних дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом (на примере регионального центра) / О. В. Кондратенко, Д. Д. Исматуллин, А. В. Лямин // Материалы Международной научно-практической конференции «Микробное разнообразие: актуальные проблемы и решения», посвященной 25-летию Независимости Республики Казахстан. - Астана, 2016. - С. 276.

13. Кластерный анализ популяции штаммов Burkholderia cepacia complex, выделенных в Самарской области / Я. Д. Флегонтова, Д. Д. Исматуллин, А. В. Лямин [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2017. - Т. 19, № 2. - С. 149.

14. Исследование микрофлоры назального лаважа как фактор ранней профилактики инфицирования нижних дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом / О. В. Кондратенко, Е. Д. Медведева, А. В. Ермолаева [и др.] // Лабораторная служба. - 2017. - Т. 6, № 3. - С. 120.

Патенты:

15. Патент RU 2659155 С1 Российская Федерация, МПК G01N 33/487 (2006.01). Способ сбора и первичного посева жидкости назального лаважа от пациентов с муковисцидозом для микробиологического исследования : заявка № 2017122649, 27.06.2017 : опубл. 28.06.2018 / О. В. Кондратенко, А. В. Лямин, Е. Д. Медведева, А. В. Ермолаева. - Бюл. № 19. - 6 с.

16. Патент RU 2668406 С1 Российская Федерация, МПК СВД 1/04 (2006.01), С^ 1/20 (2006.01), СЖ 1/01 (2006.01). Способ первичного посева биоматериала, выделенного из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом : заявка № 2017122657, 27.06.2017 : опубл. 28.09.2018 / О. В. Кондратенко, А. В. Лямин, Д. Д. Исматуллин. - Бюл. № 28. - 9 с.

17. Патент RU 2711954 С1 Российская Федерация, МПК С^ 1/20 (2006.01), C12R 1/01 (2006.01). Способ предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий с использованием универсальной хромогенной среды : заявка № 2019114859, 14.05.2019 : опубл. 23.01.2019 / А. В. Лямин, Д. Д. Исматуллин, О. В. Кондратенко [и др.]. - Бюл. № 3. - 6 с.

18. Патент RU 2711957 С1 Российская Федерация, МПК С^ 1/20 (2006.01), С12Я 1/01 (2006.01). Способ первичного посева клинического материала для выделения нетуберкулезных микобактерий : заявка № 2019114858, 14.05.2019 : опубл. 23.01.2020 / А. В. Лямин, Д. Д. Исматуллин, О. В. Кондратенко [и др.]. -Бюл. № 3. - 5 с.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В изучении фундаментальных и прикладных аспектов МВ, подходов к диагностике и терапии осложнений в последние десятилетия в Российской Федерации произошел прорыв такого уровня, который не сравним с имеющимися научными и практическими достиженими при других орфанных заболеваниях [1, 9, 17, 50, 124, 189, 190, 249, 259, 296]. Данный факт объясняется большой социальной значимостью проблемы. С 2006 года в Российской Федерации введен неонатальный скрининг на МВ, что стало важной вехой в диагностике и ранней профилактике осложнений у пациентов [55]. За эти годы совершенствовались подходы к их ведению, сохранению и улучшению нутритивного статуса, профилактике остеопороза и других осложнений. Эти и другие обстоятельства привели к увеличению продолжительности жизни пациентов, повышению ее качества, а также увеличению общего количества больных.

Одним из факторов, определяющих продолжительность жизни пациентов, потребность в трансплантации легких, по-прежнему остаются респираторные осложнения, во многом определяемые микробиологическим статусом пациента.

В виду этого диагностика бактериальных осложнений при МВ в последние годы приобретает большое научное и практическое значение. Важно, что все большее количество практикующих бактериологов в регионах проявляют интерес к данным исследованиям, оптимизируют и внедряют у себя на местах методики первичного посева и идентификации штаммов, а также оценки их клинического значения. Микробиологическая диагностика при МВ является, пожалуй, одним из самых сложных разделов практической бактериологии, требующем от врача максимальной внимательности, глубоких знаний и высокой эмпатии к пациентам.

Микрофлора, выделяющаяся из респираторных образцов от пациентов с МВ, отличается значительной широтой видового разнообразия и перечень возбудителей, с которыми сталкиваются бактериологи в своей работе, увеличивается с каждым годом [105]. Значительные сложности в микробиологической диагностике при МВ по-прежнему связаны с отсутствием

современной отечественной нормативной документации, в которой были бы прописаны протоколы исследований и особенности выделения бактерий различных групп. Отдельную проблему представляет собой отсутствие в Клинических рекомендациях «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (Версия от 03.2018) указаний по тестированию ряда клинически значимых при МВ штаммов, в частности B.cenocepacia, A. xylosoxidans, Chryseobacterium spp. и других [20]. Безусловно, необходимость разработки критериев в отношении указанных групп возбудителей является актуальной задачей ближайшего времени.

Тем не менее, качество микробиологической диагностики бактериальных осложнений при МВ в последние годы возросло. Это связано как с улучшением технических условий работы бактериологов, в частности с внедрением МЛЬВ1-ТоЕ масс-спектрометрии во многих регионах Российской Федерации, использованием расширенного перечня питательных сред, так и с повышением квалификации бактериологов в этом вопросе, что происходит благодаря организации тематических секций по микробиологии МВ в рамках ряда российских конгрессов, а также возможности прохождения обучения на рабочем месте на базе лабораторий экспертного уровня (г. Москвы и г. Самары) [6, 16, 26, 32, 56, 200, 206].

Существующая парадигма подхода к микробиологической диагностике при МВ на данном этапе знаний и представлений не соответствует потребностям современной медицины. Ограничение стандартов обследования пациентов ежеквартальным исследованием мокроты позволяет оценить видовой состав микрофлоры, в ряде случаев даже ее антибиотикорезистентность, но не дает клиницисту и бактериологу возможности прогнозирования развитие ситуации, не позволяет отследить и ликвидировать потенциального патогена «на дальних рубежах» инфекционного процесса. Узость данного микробиологического подхода не только не способствует раннему выявлению возбудителей у пациента, но и не предупреждает вероятности распространения штаммов среди пациентов.

Казалось бы, возникает парадокс. Элементы комплексного подхода к диагностике бактериальных осложнений при МВ в том или ином формате описаны

рядом исследователей. Но дистанцированность науки и практики не позволила экстраполировать имеющиеся научные разработки на рутинную диагностику.

Между тем, в своем исследовании мы постарались связать доступные на сегодняшний день методики и техники, способные, при применении в комплексе, привести к улучшению микробиологического обследования пациентов с МВ в Российской Федерации.

Для этого в первой главе исследования было проведено исследование 12069 штаммов микроорганизмов, выделенных из 4100 респираторных образцов от 936 пациентов с МВ из 55 регионов Российской Федерации.

Установлено, что 3672 (30,4%) штамма имели доказанное клиническое значение при МВ, при этом доминирующим возбудителем в этой группе был S.aureus - 1698 штаммов (46,2% от всех клинически значимых бактерий и 14,1% от общего количества выделенных штаммов), что соотносится с данными Регистра больных МВ в Российской Федерации [52, 53]. На втором месте по распространенности были штаммы P.aeruginosa - 1060 (29,0% от всех клинически значимых бактерий и 8,8% от общего количества выделенных штаммов), на третьем месте - штаммы Burkholderia spp. - 500 штаммов, доля которых составила 13,6% от всех клинически значимых бактерий и 4,1% от общего количества выделенных штаммов, на четвертом месте S.maltophilia - 258 (7,0% от всех клинически значимых бактерий и 2,1% от общего количества выделенных штаммов) штаммов, замыкали пятерку 156 штаммов A. xylosoxidans, доля которого среди всех клинически значимых штаммов составила 4,2% от всех клинически значимых бактерий и 1,3% от общего количества выделенных штаммов.

Кроме этого, получено 43 (0,4%) штамма представителей порядка Actinomycetales, среди которых 42 (97,6%) штамма M.abscessus и 1 (2,4%) штамм N.farcinica. Первичный рост указанных возбудителей отмечался на среде для B.cepacia в условиях продленной инкубации посевов (от 5 до 28 суток культивирования).

В структуре грамотрицательной микрофлоры выделено 19 (0,1%) штаммов H.influenzae, а также 31 (0,3%) штамм A.baumanii.

Выявлено 1007 (8,3%) штаммов с неустановленным клиническим значением при МВ, среди которых были представители 25 родов бактерий. Наиболее распространенными из них были Chryseobacterium spp. и Acinetobacter spp., не относящиеся к виду A.baumanii, а также Pseudomonas spp., не относящиеся к P.aeruginosa.

Среди 159 штаммов (15,8% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 1,3% от общего количества выделенных штаммов) бактерий рода Pseudomonas, не относящихся к P.aeruginosa, выделены представители 25 видов, при этом доминировали P.montelli, P.putida и P.stutzeri. Среди 142 (14,1% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 1,2% от общего количества выделенных штаммов) штаммов Chryseobacterium spp., отмечены представители 10 видов, из которых наиболее распространенными оказались C.gleum и C.indologenes. Выделено 44 (4,3% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 0,4% от общего количества выделенных штаммов) штамма Sphingobacterium spp., среди которых доминировали S.multivorum - 40 (90,9%) штаммов, реже встречались S.spiritivorum - 2 (4,6%) штаммов, и по 1 (2,3%) штамму S.faecium и S.muzitaii, соответственно.

Также выделено 35 (3,5% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 0,3% от общего количества выделенных штаммов) штаммов Sphingomonas spp. Среди них доминирующим видом был S.paucimobilis - 27 (77,1%) штаммов, также встречались S. koreensis - 2 (5,7%) штамма, 1 (2,9%) штамм S.aurantiaca, а также 5 (14,3%) штаммов S.pseudosangiunis. Среди 15 (1,5% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 0,1% от общего количества выделенных штаммов) штаммов Elizabethkingia spp. преобладала E.miricola - 9 (60,0%) штаммов и реже встречалась E.meningoseptica - 6 (40,0%) штаммов. Среди 6 (0,6% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и менее 0,1% от общего количества выделенных штаммов) штаммов бактерий рода Commamonas чаще

встречалась C.aquatica - 5 (83,3%) штаммов, в одном случае (16,7%) выделена культура С.квШв^И.

Выделено 449 (44,6% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 3,7% от общего количества выделенных штаммов) штаммов бактерий рода Лсте^Ъа^вг, не относящихся к Л.Ъаиташ, среди которых были представители 16 видов, доминирующими были Л.рШи и Л.]ипи. Среди 20 (1,9% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 0,2% от общего количества выделенных штаммов) штаммов бактерий рода Бгвуи^топа8 13 штаммов (65,5%) - относились к виду БМттШа и 7 (34,5%) штаммов - к виду Б.аигаШаса. Помимо этого, было выделено 5 (0,5% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и менее 0,1% от общего количества выделенных штаммов) штаммов ЛнИтоЪа^ег Брр., среди них 3 (60,0%) штамма Л.polychromogenes и по 1 (20,0%) штамму Л.ситт^и и ЛлсЫтошав, соответственно. Частота выделения штаммов КМвтМАсат и W.falsenii составила по 30 (3,0% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 0,2% от общего количества выделенных штаммов) штаммов, соответственно. Выделено 18 (1,8% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 0,1% от общего количества выделенных штаммов) штаммов Я.га^оЪа^вг, 16 штаммов O.antropi - 16 (1,6% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и 0,1% от общего количества выделенных штаммов), и 6 (0,6% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и менее 0,1% от общего количества выделенных штаммов) штаммов Р.а8ас^ат1уисит. Получен рост 7 (0,7% от штаммов бактерий с неустановленным клиническим значением при МВ и менее 0,1% от общего количества выделенных штаммов) штаммов S.pitrifaciens, что вызывает озабоченность, ввиду ее возможного влияния на респираторную функцию, как и случаи выявления P.apista, которые с свою очередь, как и штаммы ЛЛвтрвгат и E.Ъrevis, выделялись с частотой 0,2% от всех бактерий указанной группы. Кроме этого выделено по 1 штамму (0,1%) рьгсус, С.жсашг, M.odoratus, V.paradoxus, Л.faecalis, R.insidiosa, соответственно, при этом выявление последнего возбудителя

также вызывает опасение. Несмотря на то, что в литературе не описано патогенетическое значение представителей указанного вида, другие представители рода могут приводить к снижению легочной функции при МВ [248, 260].

Как нам представляется, количество бактерий данной группы достаточно велико для того, чтобы обратить на них внимание как бактериологов, так и клиницистов. В литературе можно встретить упоминания о случаях выделения штаммов с неустановленным клиническим значением при МВ из респираторных образцов от пациентов. Однако значение в отношении большинства видов не установлено. Вероятно это связано с тем, что мы работаем по стандартному алгоритму, считая лишь узкий перечень бактериальных патогенов, таких как S.aureus, P.aeruginosa, B.cepacia complex, A.xylosoxidans и S.maltophilia, имеющими значение в развитии респираторных осложнений. Обратившись к данным Российского регистра МВ мы увидим, что перечень других представителей НФГОБ и энтеробактерий представлен лишь тремя наиболее часто встречающимися представителями [52]. Между тем, проведенные нами исследования показали достоверное увеличение в последние годы случаев выделения штаммов НФГОБ с неустановленным клиническим значением при МВ. И если в отношении ряда из них, в частности, близкородственных родов Chryseobacterium, Elizabethkingia, Wautersiella описано клиническое значение для пациентов с иммуносупрессией, как этиологических агентов развития сепсиса, артритов, эндокардитов, что раскрывает перед нами перспективу разработки нормативной документации по определению антибиотикорезистентности у этих таксонов, то в отношении многих других бактерий клиническое значение остается неустановленным. Вероятно, в решении этого вопроса было бы значимым ведение регистра в отношении редких НФГОБ, что могло бы в совокупности с учетом динамики состояния пациентов быть важным для оценки клинического значения и, может быть, уже через несколько лет позволило установить его в отношении бактерий рода Chryseobacterium, а также других представителей. Достаточно вспомнить пример бактерий рода Burkholderia, которые не рассматривались изначально, как способные вызывать заболевания у человека, и в частности у пациентов с МВ.

Потребовалось два десятка лет и сотни жизней пациентов, для того, чтобы сегодня нам стало очевидно - Burkholderia spp. это не просто фитопатоген, это первая причина летальных исходов у пациентов с МВ. И несмотря на установленое клиническое значение, бактериологи сталкиваются с невозможностью определения чувствительности к указанным штаммам ввиду отсутствия критериев интерпретации зон задержки роста.

Нужно ли говорить о том, что подобная проблема существует и в отношении штаммов Achromobacter spp., не говоря уже о тех бактериях, которые уже в ближайшем будущем могут приобрести клиническое значение для пациентов. И в случае установления возможного влияния тех или иных представителей на развитие или усугубление патологического процесса в легочной ткани, первостепенное значение будет иметь вопрос возможности определения чувствительности к антибиотикам у выделенных штаммов. К настоящему моменту, этот вопрос не разработан, ввиду недостаточного количества проведенных исследований в мире, однако его решение должно стать приоритетным в ближайшем будущем.

Кроме этого, было выделено 1105 (9,2%) штаммов представителей порядка Enterobacterales, наиболее часто отмечали случаи выявления бактерий родов Enterobacter и Klebsiella, а также E.coli. При оценке антибиотикорезистентности установлено, что 168 (15,2%) из них были продуцентами БЛРС, при этом наибольшее количество резистентных штаммов было среди представителей родов Escherichia, Citrobacter и Proteus.

Немаловажный вклад в общий перечень выделенных микроорганизмов внесли микромицеты. Было выделено 1445 (11,9%) штаммов, при этом доминировали грибы рода Candida, значительно реже встречались Aspergillus spp., в отдельных случаях другие представители.

По результатам проведенной нами оценки динамики возбудителей за период 2015-2019 гг. среди пациентов Самарской области было выявлено достоверное увеличение количества посевов от пациентов (p=0,019) и среднего количества исследований на пациента в год (p=0,001).

Среди выделенных 2785 штаммов микроорганизмов 901 (32,3%) имели доказанное клиническое значение в развитии респираторной патологии при МВ. Среди них наиболее часто выделялись штаммы 8.ажвш - 348 штаммов (38,6% от всех клинически значимых штаммов и 12,5% от общего количества выделенных штаммов) за 5 лет, штаммов М^БА не выделено. Отмечена некоторая тенденция к увеличению количества штаммов в последние годы (р=0,084).

Среди других грамположительных бактерий было выделено 86 (3,1%) штаммов S.pneumoniae, а также 11 (0,4%) штаммов Е^вю^сс^ Брр.

Кроме этого, в 2019 г. выло впервые выделено 2 (0,2%) штамма МмЬясвяят у пациентов Самарской области. Данные пациенты взяты на динамическое наблюдение.

Среди грамотрицательной флоры выделено значительное количество штаммов НФБОБ. Из них 179 (19,8% от всех клинически значимых штаммов и 6,4% от общего количества выделенных штаммов) штаммов P.aeruginosa, 154 (86,0%) в немукоидной и 25 (14,0%) - в мукоидной форме. Штаммов, продуцентов карбапенемаз не выделено. Не выявлено тенденции к увеличению или снижению количества штаммов в динамике. Выделен 31 штамм (3,4% от всех клинически значимых штаммов и 1,1% от общего количества выделенных штаммов) S.maltophilia. Процентное соотношение указанного возбудителя от общего количества выделенных штаммов было невелико и колебалось в пределах от 0,8% в 2017 году до 4,5% в 2019 году.

Значительный вклад в общее количество выделенных патогенов у пациентов Самарской области внесли штаммы Б.cenocepacia. За исследуемый период был идентифицирован 331 (36,7% от всех клинически значимых штаммов и 11,9% от общего количества выделенных штаммов) штамм. Процент пациентов, инфицированных указанными штаммами в Самарской области в целом выше, чем в среднем по Российской Федерации, что обусловлено эпидемиологическими особенностями. Некоторое снижение процентного количества выделенных штаммов в 2018-2019 гг. связано со смертью части инфицированных пациентов,

отсутствием новых случаев заражения, а также и с увеличением общего количества выделенных в этот период микроорганизмов (p=0,053).

Кроме этого, среди клинически значимых возбудителей выделено 12 (1,3% от всех клинически значимых штаммов и 0,4% от общего количества выделенных штаммов) штаммов A.xylosoxidans, отмечена незначительная тенденция к росту их количества (p=0,083).

Также, выделен значительный перечень штаммов НФГОБ - 170 (6,1%), с неустановленным клиническим значением при МВ, среди них представители 16 родов, из которых доминировали Pseudomonas spp., Chryseobacterium spp. и Acinetobacter spp.

При этом, в последние годы наметилась тенденция к росту редких представителей НФГОБ. Отмечено достоверное увеличение доли штаммов Chryseobacterium spp. (p=0,042), а также Rhizobium spp. среди выделенных бактерий (p=0,041).

Выделено 130 (4,7%) штаммов представителей порядка Enterobacterales среди которых были представители 9 родов. Наиболее часто встречались штаммы E.coli, Klebsiella spp., а также Enterobacter spp. При оценке антибиотикорезистентности лишь 2 штамма E.coli, выделенные в 2017 году оказались продуцентами БЛРС.

Кроме этого, выделено 230 штаммов грибов, из них 200 (87,0%) - рода Candida, 23 (10,0%) штамма Aspergillus spp., по 3 (1,3%) штамма Scopulariopsis spp. и Penicillum spp., а также 1 (0,4%) штамм Alternaria spp.

Проведенный динамический мониторинг микрофлоры НДП у пациентов с МВ позволяет оценивать общую картину и микробиологические сдвиги в ней как у отдельных пациентов, так и в целом по региону, и прогнозировать тенденции по ее изменениям в дальнейшем.

Однако, несмотря на увеличение в последние годы количества бактерий НФГОБ с неустановленным клиническим значением при МВ, самыми прогностически неблагоприятными возбудителями при данном заболевании остаются представители B.cepacia complex.

Микробиологические особенности выделенных штаммов Burkholderia spp. были описаны во второй главе собственных результатов исследования. Говоря о Burkholderia spp., как о микроорганизме, чья клиническая значимость описана десятками исследований, стоит сказать, что в Российской Федерации по-прежнему остро стоит вопрос как с выделением микроорганизма из первичного материала, так и с его идентификацией. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что бактерии рода Burkholderia широко распространены среди пациентов из многих регионов нашей страны. За период 2015-2019 гг. было выделено и изучено 500 представителей рода. При этом доминирующим видом была B.cenocepacia - 445 (89,0%) штаммов, что соотносится с данными Российского регистра [52, 53]. Помимо этого, выделено 18 (3,6%) штаммов B.stabilis, 16 (3,2%) штаммов B.contaminans, 11 (2,2%) штаммов B.gladioli, 8 (1,6%) штаммов B.multivorans и 2 (0,4%) штамма B.vietnamensis.

Проведенные исследования демонстрируют изменения биологических свойств выделенных штаммов, что находит отражение, в том числе, и в изменении их белковых профилей. Нами было установлено, что от начала колонизации и вплоть до развития «cepacia»- синдрома штаммы Burkholderia spp. способны терять часть своих белков, что сопоставляется с клиническим состоянием пациента.

Исперпывающий литературный поиск показал отсутствие публикаций, описывающих эти особенности у штаммов, выделенных от пациентов с МВ. Между тем, учитывая тенденцию к улучшению технического оснащения многих бактериологических лабораторий, изучение этих аспектов в рутинной практике лабораторий центров МВ могло бы способствовать оптимизации диагностики осложнений, и, как следствие, терапии пациентов.

Проведенные исследования также показали, что популяция буркхольдерий часто является гетерогенной. В рамках одного образца могут присутствовать два и более морфотипа, различающихся по своим биологическим свойствам, в том числе антибиотикорезистентности. Нами были получены достоверные различия по чувствительности у стандартных и малых морфотипов колоний в отношении меропенема (p=0,001) и цефтазидима (p=0,012). Важное значение имеет появление

малых колониальных вариантов буркхольдерий, отличающихся более медленной скоростью роста, меньшим размером колоний, более высокой резистентностью к антибактериальным препаратам и отличиями по белковым профилям при исследовании с использованием метода MALDI-ToF масс-спектрометрии. Было показано, что колонии стандартного размера и малые колониальные варианты, выделенные в рамках одного респираторного образца, могут отличаться не только по чувствительности к препаратам, но и по своим белковым профилям. При этом у малых колониальных вариантов могут отсутствовать белки, характерные для морфотипа колоний стандартного размера.

В то же время, мы не нашли ни одного российского исследования, освещающего эти аспекты, и выявили лишь единичные публикации зарубежных коллег, описывающих гетерогенность популяции буркхольдерий в исследованиях с малой выборкой штаммов [99, 103, 153, 195, 213, 292]. Между тем, гетерогенность популяции буркхольдерий непременно должна учитываться как врачами-бактериологами с обязательным указанием всех выделенных морфотипов, так и врачами-клиницистами при назначении терапии. Но в этой связи также возникает вопрос о технических аспектах этого исследования. В частности, к настоящему времени не регламентировано количество колоний, которое необходимо взять в исследование для определения антибиотикорезистентности.

Крайне важным для успешной терапии и прогноза в отношении пациента является раннее выявление штаммов Burkholderia spp. на том этапе, когда еще отсутствуют клинические и рентгенологические признаки снижения легочной функции. Одним из методов, внедрение которого в практику рутинного микробиологического обследования при МВ, могло бы стать важным в решении этой задачи могло бы стать ПЦР-исследование. Для решения поставленной перед нами задачи была проведена апробация двух тест-систем для раннего выявления генов представителей рода Burkholderia. В результате исследования были получены результаты параллельного микробиологического и ПЦР-обследования 192 проб мокроты.

На первом этапе эксперимента изучены результаты параллельного обследования 84 проб мокроты от 81 пациента с МВ из 9 регионов Российской Федерации. При этом в 28 (33,3%) пробах был получен рост культуры бактерий рода Burkholderia. Среди них 25 (89,3%) проб B.cenocepacia и 3 (10,7%) пробы B.multivorans. Из них все пробы, в которых был получен рост B.cenocepacia (100%) показали положительный результат при ПЦР-исследовании, но ни одна проба, в которой был получен рост B.multivorans, не дала положительный результат при ПЦР-исследовании. Использование тест-системы №1 послужило дополнительным методом подтверждения эпидемической вспышки, ассоциированной с B.cenocepacia у 10 пациентов Кемеровской области, а также косвенно позволило подтвердить эрадикацию штамма B.cenocepacia у пациента с МВ Самарской области, имевшего рост культуры на протяжении 3 лет в анамнезе, но не имеющего высева в течение последних 5 лет. Таким образом, разработанная тест-система для раннего поиска генов B.cepacia complex в клиническом материале от пациентов с МВ методом ПЦР, показала себя как высокочувствительная для выявления B.cenocepacia (чувствительность Se =100%, специфичность Sp =98%).

На втором этапе исследования были изучены результаты параллельного обследования 108 проб мокроты от 92 пациентов с МВ из 14 регионов Российской Федерации с использованием тест-системы №2.

При этом в 22 (20,4%) пробах от 16 (17,4%) пациентов был получен рост культуры бактерий рода Burkholderia. Из них в 19 (86,4%) пробах от 13 (81,3%) пациентов выделена B.cenocepacia, в 2 (9,1%) пробах от 2 (12,5%) пациентов B.multivorans и 1 (4,5%) пробе от 1 пациента B.gladioli (6,2%).

Из них все пробы, в которых был получен рост B.cenocepacia и B.multivorans, показали положительный результат при ПЦР-исследовании, а проба, в которой был получен рост B.gladioli, напротив, показала отрицательный результат.

Использование тест-системы №2 послужило дополнительным методом подтверждения эпидемической вспышки, ассоциированной с B.cenocepacia у 3 пациентов Кемеровской области, а также косвенно позволило подтвердить эрадикацию штамма B.cenocepacia у пациента с МВ Самарской области, имевшего

рост культуры на протяжении 3 лет в анамнезе, но не имеющего высева в течение последних 5 лет. Таким образом, разработанная тест-система №2 для раннего поиска генов B.cepacia complex в клиническом материале от пациентов с МВ методом ПЦР показала себя как высокочувствительная для выявления видов B.cenocepacia и B.multivorans (чувствительность Se = 100%, специфичность Se = 99%).

Внедрение такого доступного и недорогого анализа, как ПЦР-исследование мокроты в рутинную практику обследования пациентов с МВ в регионах Российской Федерации, позволит выявлять колонизацию дыхательных путей клинически значимыми штаммами еще на том этапе, когда они не выявляются в рамках микробиологического метода. Это обстоятельство позволит вовремя скорректировать терапевтическую тактику в отношении пациента, своевременно изолировать его, и позволит не допустить распространения инфекции среди пациентов региональных центров МВ.

Известно, что многие растительные экстракты и индивидуальные соединения обладают антимикробной активностью, однако нами не было найдено публикаций, освещающих подобные эффекты в отношении штаммов Burkholderia spp. Исходя из этого, для реализации поставленной перед нами задачи была проведена оценка антимикробной активности ряда растительных экстрактов и индивидуальных соединений в отношении клинических штаммов B.cenocepacia и B.multivorans, выделенных от пациентов с МВ в период 2015-2019 гг. методом двойных серийных разведений.

Среди исследуемых веществ были настойки 1:5 почек и побегов тополя черного Populus nigra L. на 40, 70, 80 и 96% этиловом спирте, водно-спиртовые извлечения из почек и цветков каштана конского обыкновенного Aesculus hippocastanum L., соединения, выделенные из мяты перечной Mentha piperita L, эвкалипта прутовидного Eucalyptus viminalis L., чабреца Thymus L., аниса Pimpinella anisum L., укропа Anethum graveolens L., тясячелистника обыкновенного Achillea milleofolium L., настойки из травы монарды дудчатой Monarda fistulosa L. на 40, 70 и 96% этиловом спирте, водно-спиртовые извлечения из талломов аскомицет

семейства Parmeliaceae и рода Cladonia в 70% этиловом спирте в соотношении «сырье-экстрагент» 1:50..

Единственным соединением, не оказавшим ни бактерицидного, ни бактериостатического эффекта даже в минимальных разведениях оказалась настойка из листьев эвкалипта на 95% этиловом спирте.

Анисовый альдегид, напротив, обладал самым выраженным антибактериальным действием как в отношении штаммов B.cenocepacia, так и B.miltivorans, оказывая бактерицидный эффект на все тестируемые штаммы даже в разведении 1:4096. Однако, учитывая его токсичность, возможность его применения резко ограничена.

Все остальные соединения оказывали бактерицидный и бактериостатический эффекты в разных разведениях.

Так, хорошую эффективность в отношении тестируемых образцов имели некоторые соединения мяты перечной, эвкалипта и чабреца. В частности, раствор ментола 5% оказывал бактерицидное действие на штаммы в разведении 1:256, а эфирное масло мяты и ее настойки 40%, 70% и 96% - в разведении 1:32. Эфирное масло эвкалипта оказывало бактерицидное действие на штаммы до разведения 1:32 включительно. Выраженный бактерицидный эффект в разведениях до 1:1024 для штаммов B.cenocepacia, и до 1:512 для штаммов B.multivorans показал эвгенол. Значительный бактерицидный эффект на штаммы был также продемонстрирован тимолом 5% на 95% спирте от 1:128 для B.cenocepacia до 1:256 для B.miltivorans. При этом в отношении первого микроорганизма отмечался бактериостатический эффект вплоть до разведения 1: 2048. Тимол 10% на 95% этиловом спирте оказывал бактерицидное действие в отношении штаммов B.cenocepacia, в разведениях до 1:512, а бактериостатическое действие вплоть до разведения 1:2048 включительно; бактерицидный эффект в отношении штаммов B.multivorans отмечался до разведения 1:128. Очень хороший эффект in vitro был также продемонтрирован эфирным маслом чабреца. При этом бактерицидное действие в отношении штаммов B.cenocepacia сохранялось в диапазоне разведений до 1:256, а бактериостатическое действие оказывалось в разведениях от 1:512 до 1:4096. В

отношении штаммов B. multivorans бактерицидный эффект был получен в разведениях до 1:4096 включительно.

Среди соединений, полученных из тополя черного, наибольший эффект в виде бактерицидного действия был получен у настоек почек 80% и 70% в отношении штаммов B.multivorans в разведениях до 1:256 (Патент РФ на изобретение № 2695661).

Настойки плодов аниса 40% и 96% оказывали бактерицидное действие на штаммы B.cenocepacia до разведения 1:256, а в отношении B.multivorans до 1:64. Эфирное масло укропа оказывало бактерицидное действие в разведениях до 1:32, а настойки укропа 40%, 70% и 96% - в разведениях 1:16 в отношении всех тестируемых штаммов.

Настойка травы тысячелистника обыкновенного 1:5 40% оказывала антибактериальное действие в отношении штаммов B.cenocepacia в разведениях до 1:128, в то время как аналогичная настойка 70% и 96% оказывала меньший эффект - до 1:64 и 1:16, соответственно. Настойка травы тысячелистника обыкновенного 1:5 40% оказывала антибактериальное действие в отношении штаммов B.multivorans в разведениях до 1:8, в то время как аналогичная настойка 70% и 96% оказывала больший эффект - до 1:16.

Эфирное масло тысячелистника 1:5 оказывало бактерицидный эффект на штаммы B.cenocepacia в разведениях до 1:64, и менее выраженный на штаммы B.multivorans - в разведениях до 1:16, и бактериостатическое действие в разведении до 1:64 включительно.

Интерес представляет антагонистический эффект в отношении штаммов буркхольдерий, который был продемонстрирован представителями рода Cladoni a, классификационно относящимся к грибам отдела аскомицетов. В литературе описаны антагонистические свойства других аскомицет в отношении штаммов Burkholderia spp., в частности штаммов Alternaria alternata.

Наибольший бактерицидный эффект продемонстрировали водно-спиртовые извлечения на основе слоевищ Cladonia rangiferina. В отношении B.cenocepacia он отмечался до разведений 1:512 включительно, а в отношении B.multivorans был

менее выраженным, и наблюдался в разведениях до 1:64 включительно. Подобный эффект вероятно может быть связан с действием вторичных метаболитов, характерных для данного вида - фумарпротоцетраровой кислоты и атранорина.

Сопоставимый эффект оказали аскомицеты вида C. phyllophora, в отношении штаммов B.cenocepacia и B.multivorans бактерицидный эффект наблюдался в разведениях до 1:256 и 1:64, соответственно.

Большинство остальных протестированных соединений, в частности производные Монарды дудчатой, оказывали бактерицидный эффект на тестируемые штаммы в диапазонах разведений от 1:4 до 1:32 (Патент РФ на изобретение №2695663).

Таким образом, показано, что многие растительные экстракты и индивидуальные соединения in vitro могут оказывать выраженное антимикробное действие в отношении штаммов B.cepacia complex. Данное обстоятельство раскрывает перспективы дальнейшего изучения темы с целью разработки лекарственных форм на основе соединений, обладающих антимикробной активностью в отношении штаммов Burkholderia spp.

Как было отмечено ранее, колонизация НДП пациентов с МВ клинически значимыми штаммами, в том числе и представителями рода Burkholderia, осуществляется из ВДП. Для понимания возможности раннего выявления указанных штаммов из параназальных синусов с использованием неинвазивных методов исследования в третьей главе собственных результатов были описаны результаты параллельного исследования 61 образца жидкости назального лаважа и мокроты от 44 пациентов с МВ за период 2016-1018 гг. Показано выделение 333 штаммов микроорганизмов, среди которых 54 (16,2%) имеют доказанное клиническое значение при МВ, 112 (33,6%) штаммов с неустановленным клиническим значением и 167 (50,2%) штаммов представителей нормальной микрофлоры, не имеющих клинического значения при МВ. У 33 (75,0%) пациентов выделены клинически значимые микроорганизмы при исследовании жидкости назального лаважа. При этом в 76,2% случаев у пациентов с высевом S.aureus из мокроты, отмечался параллельный высев идентичного штамма из жидкости

назального лаважа. В 23,8% случаев штамм был выделен из жидкости назального лаважа и никогда ранее не выделялся из мокроты. У 89,9 % пациентов с высевом P.aeruginosa из мокроты выделен идентичный штамм из жидкости назального лаважа. У 11,1% обследованных штамм выделялся из жидкости назального лаважа и никогда ранее не выделялся из мокроты.

У 50,0% пациентов с хронической инфекцией НДП, ассоциированной с

A.xylosoxidans, отмечался рост идентичного штамма из жидкости назального лаважа, а то время, как из мокроты оставшихся 50,0% пациентов никогда ранее не выделяли указанные штаммы и рост бы получен только из образца жидкости назального лаважа. У 100% пациентов с высевом 8.шаиорИШа из жидкости назального лаважа не было получено роста указанного штамма в материале из НДП. В то же время у всех 20 (100%) пациентов с высевом штамма В.сепосерааа из жидкости назального лаважа возбудитель присутствовал в материале из НДП. За исследованный период нами не было выявлено случаев изолированного выделения

B.сепосерааа из жидкости назального лаважа, однако, в 2019 году, после внедрения указанной методики в рутинную практику микробиологической лаборатории мы имели пример такого случая.

Все пациенты, у которых микроорганизмы уже были выделены из жидкости назального лаважа, но еще не выделены из образцов мокроты были определены как входящие в группу риска по формированию бактериальных осложнений НДП.

В результате исследования, впервые проведенного у пациентов с МВ в Российской Федерации, было показано, что видовой состав микрофлоры, выделенной из параназальных синусов коррелирует с микрофлорой НДП. Данное обстоятельство соотносится с результатами международных публикаций [89, 90, 91, 117, 118, 146, 152, 198, 216, 245, 247, 275, 278, 301]. Регулярное микробиологическое исследование микрофлоры из жидкости назального лаважа позволяет выявить клинически значимые микроорганизмы на раннем этапе и может рассматриваться как способ ранней профилактики формирования хронической бактериальной инфекции НДП при МВ. Ввиду этого необходимо внедрять это исследование в стандарты микробиологического обследования при

МВ. Ежеквартальное микробиологическое исследование жидкости назального лаважа может быть рекомендовано всем пациентам с МВ, а особенно пациентам, планирующим трансплантацию легких, а также находящихся в периоперационном периоде. Все пациенты, имеющие высев клинически значимых бактериальных возбудителей из жидкости назального лаважа должны рассматриваться как находящиеся в зоне риска по формированию бактериальных осложнений НДП, и исходя из этого, антибактериальная терапия при МВ строится с учетом этих особенностей и затрагивать не только НДП, но и параназальные синусы.

В четвертой главе собственных результатов исследования были приведены данные микробиологической оценки влияния факторов окружающей пациента среды на возможность внестационарной колонизации дыхательных путей. Проведено исследование 176 проб, из них 59 проб с ВДП родственников и членов семьи пациента, 29 проб с небулайзеров до и после обработки, 37 проб с поверхностей ванной комнаты и санузлов, 12 проб с ящиков для хранения овощей, 11 проб с поверхностей в спальне пациента, по 7 проб с фильтров кондиционеров и грунта цветочных горшков. В результате исследования было выделено 404 штамма микроорганизмов. Было показано, что родственники и члены семей пациентов с МВ могут являться источниками распространения агрессивных штаммов, в том числе быть источником распространения штаммов S. aureus. Несмотря на то, что среди обследованных нами семей не было случаев носительства штаммов MRSA, нужно учитывать, что колонизация дыхательных путей пациентов с МВ подобными штаммами возможна не только в условиях стационара, но и в быту. Кроме того, несмотря на то, что нами не было обнаружено случаев носительства потенциально опасных микроорганизмов для этой группы больных, таких как P.aeruginosa, Achromobacter spp., S. maltophilia, B. cepacia complex и других у членов семьи пациентов, были выявлены носители НФГОБ с неустановленным клиническим значением при МВ, в частности штаммов P.nitroreducens, P.stutzeri, A.lwoffi, A.radioresistens, A.ursungii.

Важным фактором, препятствующим распространению штаммов, имеющих значение для пациентов с МВ, является качественная обработка элементов

небулайзеров и других ингаляторов. При несоблюдении правил обработки элементов небулайзера, а также не полной их просушке эти приборы могут быть потенциально опасными источниками концентрации и распространения штаммов НФГОБ и других микроорганизмов. Нами не было выявлено случаев выделения клинически значимых штаммов микроорганизмов с элементов небулайзера как из проб, взятых сразу после ингаляции, так и из проб после обработки в паризаторе и полной просушки.

В результате проведенного исследования микрофлоры объектов с места постоянного проживания пациента было выявлено, что наибольший риск для возможной колонизации дыхательных путей штаммами НФГОБ, имеющими клиническое значение при МВ представляют места с повышенной влажностью, а именно сливы ванн, раковин, поддоны душевых кабин, а также поддоны сушилок для тарелок на кухне. Выявлены штаммы A.xylosoxidans, S.maltophilia, Pseudomonas spp., Chryseobacterium spp, Pandoraea spp., Schewanella spp., Rhizobium spp. и других представителей. Учитывая это обстоятельство, родителям и пациентам следует обращать особое внимание на обработку этих объектов дезинфицирующими средствами, не допускать длительного скопления воды на объектах (протирать и просушивать резиновые контуры стиральных машин, поддоны для посуды). Кроме того, ящики для хранения овощей могут быть источниками колонизации штаммами Aspergillus spp., а также некоторыми представителями НФГОБ, а грунт из цветочных горшков может быть контаминирован значительным количеством возбудителей. Несмотря на то, что в исследуемых нами пробах почвы не было выделено штаммов, имеющих клиническое значение при МВ, присутствие их в аналогичных образцах возможно, т.к. почва и ризосфера ряда растений является их естественной средой обитания. Кроме того, при наличии в доме систем кондиционирования воздуха необходимо уделять особое внимание их регулярному профилактическому инженерному обслуживанию, с целью недопущения размножения и распространения штаммов, представляющих опасность для пациентов с МВ. На основании проведенного исследования были сделаны выводы, что пациенты с МВ могут подвергаться риску

колонизации дыхательных путей клинически значимыми штаммами не только в условиях стационара, но и в быту.

Подводя итог всем проведенным исследованиям и анализируя полученные данные, становится очевидной необходимость расширения перечня обследований в рамках микробиологической диагностики у пациентов с МВ с выполнением не просто рутинных посевов респираторных образцов, а с применением комплексного подхода к диагностике, выражающемся в совокупности исследований различных биологических образцов с применением сочетания разных методик, как в рамках микробиологического метода, так и с применением молекулярно-генетических и протеомных исследований. Нами предложены алгоритмы комплексного обследования пациентов с учетом особенностей их микробиологического статуса.

Внедрение разработанных подходов и алгоритмов диагностики позволяет выявить колонизацию клинически значимыми штаммами бактерий на раннем этапе, что является эффективной профилактической мерой в отношении недопущения развития хронической бактериальной инфекции, особенно среди тех пациентов, НДП которых еще не колонизированы указанными возбудителями. Использование предложенных алгоритмов диагностики позволяет улучшить качество микробиологического обследования при МВ, что полностью отражает реализацию цели, поставленной в выполненном исследовании. Своевременное выявление и санация указанных бактерий будет способствовать сохранению легочной функции, а, следовательно, и увеличению продолжительности жизни пациентов.

Перспективы дальнейшей разработки темы.

Дальнейшее развитие работы планируется в следующих направлениях:

1. Изучение биологических свойств и особенностей антибиотикорезистентности штаммов НФГОБ с неустановленным клиническим значением при МВ.

2. Исследования по стандартизации методик изучения биологических свойств бактерий рода Burkholderia spp., в том числе с учетом гетерогенности выделенной популяции.

3. Изучение особенностей почвенного состава и ризобиома растений Самарской области с целью выявлениях штаммов Burkholderia spp., имеющих клиническое значение для пациентов с МВ, определения их биологических свойств и установления степени родства со штаммами, выделяемыми из респираторных образцов от пациентов с МВ.

4. Дальнейшее изучение антимикробной активности растительных экстрактов и индивидуальных соединений, в том числе наиболее перспективных веществ (эвгенола, эфирного масла чабреца, ментола, а также водно-спиртовых извлечений из аскомицет рода Cladonia) в отношении штаммов B.cepacia complex с целью разработки лекарственных форм на их основе, обладающих антимикробной активностью в отношении штаммов Burkholderia spp.

ВЫВОДЫ

1. В видовом составе возбудителей инфекций нижних дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом из различных регионов Российской Федерации преобладают представители неферментирующих грамотрицательных бактерий, при этом в последние годы отмечен рост выделения микроорганизмов с неустановленным клиническим значением при данном заболевании.

2. Распространенность штаммов Burkholderia spp. среди пациентов с муковисцидозом из различных регионов Российской Федерации за период 2015-2019гг. составила 4,2% от всех выделенных штаммов. Среди выделенных видов преобладали B.cenocepacia (89,0%), реже выделялись B.stabilis (3,6%), B.contaminans (3,2%) B.gladioli (2,2%), B.multivorans (1,6%) и B.vietnamensis (0,4%).

3. При оценке биологических свойств штаммов Burkholderia spp. выявлена способность к росту в виде гетерогенной популяции с достоверными различиями у выделенных морфотипов к антибактериальным препаратам. Показана возможность применения метода MALDI-ToF масс-спектрометрии для оценки гетерогенности и динамических изменений белковых профилей штаммов Burkholderia spp., выделенных от пациентов с муковисцидозом.

4. Проведена апробация двух тест-систем для раннего поиска генов представителей Burkholderia cepacia complex в клиническом материале от пациентов с муковисцидозом методом ПЦР. Установлена чувствительность тест-системы №1 в отношении штаммов B.cenocepacia (чувствительность Se=100%, специфичность Se = 98%), и тест-системы №2 в отношении штаммов B.cenocepacia и B.multivorans (чувствительность Se=100%, специфичность Se = 99%).

5. Изучена антимикробная активность ряда растительных экстрактов и индивидуальных соединений, выделенных из тополя черного Populus

nigra L., каштана конского обыкновенного Aesculus hippocastanum L., мяты перечной Mentha piperita L., эвкалипта прутовидного Eucalyptus viminalis L., чабреца Thymus L., аниса Pimpinella anisum L., укропа Anethum graveolens L., тясячелистника обыкновенного Achillea milleofolium L., монарды дудчатой Monarda fistulosa L., аскомицет семейства Parmeliaceae и рода Cladonia в отношении клинических штаммов Burkholderia cepacia complex методом двойных серийных разведений. Наибольший бактерицидный эффект в отношении клинических штаммов Bukhholderia cepacia complex установлен у эвгенола (до 1:1024), эфирного масла чабреца (до 1:4096), в также водно-спиртовых извлечений на основе слоевищ Cladonia rangiferina (до 1:512).

6. При исследовании жидкости назального лаважа у 75% пациентов выделены штаммы микроорганизмов с доказанным клиническим значением при муковисцидозе, при этом доминирующими видами были S.aureus (38,9%), B.cenocepacia (37,0%), реже встречались P.aeruginosa (16,7%), A.xylosoxidans (3,7%), S.maltophilia (3,7%). Показано, что верхние дыхательные пути могут быть зоной для первичной адаптации бактерий и последующей колонизации нижних дыхательных путей, при этом группу риска по формированию хронической инфекции легких составили 18,1% обследованных пациентов с изолированным высевом клинически значимых штаммов из жидкости назального лаважа.

7. Установлено, что пациенты с муковисцидозом могут быть подвержены риску внестационарной колонизации дыхательных путей штаммами бактерий и грибов, в том числе в случае носительства указанных штаммов, членами семьи пациентов, а также при присутствии их на объектах быта.

8. Разработаны алгоритмы комплексного микробиологического обследования пациентов с муковисцидозом с учетом особенностей доминирующей микробиоты респираторного тракта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью повышения качества микробиологического исследования респираторных образцов от пациентов с муковисцидозом следует использовать расширенный перечень питательных сред, включающий 5% кровяной агар, универсальную хромогенную среду, шоколадный агар, селективную среду для Burkholderia cepacia complex, среду Сабуро, а также применять продленную инкубацию посевов (не менее 7 суток с их ежедневным просмотром, с пролонгированием культивирования чашек со средами для Burkholderia cepacia complex для выявления представителей семейства Actinomycetales до 21 суток). (Патент РФ на изобретение №2668406, Патент РФ на изобретение № 2711957). Дополнительное использование для пересева колоний, подозрительных на нетуберкулезные микобактерии, универсальной хромогенной среды позволяет осуществлять их предварительную идентификацию по культуральным признакам (Патент РФ на изобретение №2711954).

2. Для раннего выявления колонизации клинически значимыми штаммами микроорганизмов, а также подтверждения эрадикации возбудителя целесообразно применение в рутинной практике микробиологических лабораторий методики сбора и первичного посева жидкости назального лаважа (Патент РФ на изобретение №2659155).

3. При оценке результатов микробиологического исследования целесообразно учитывать случаи выделения штаммов неферментирующих грамотрицательных бактерий с неустановленным клиническим значением, особенно при отсутствии в образце роста штаммов с доказанным клиническим значением на фоне имеющейся у пациента симптоматики респираторного обострения.

4. Следует рассмотреть вопросы включения в микробиологический раздел Регистра пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации критериев оценки роли микроорганизмов с неустановленным клиническим значением для определения степени их влияния на снижение респираторной функции.

5. Необходимо разработать нормативную документацию по определению антибиотикорезистентности представителей неферментирующих грамотрицательных бактерий, как клинически значимых при муковисцидозе, так и тех патогенов, чье значение в настоящее время дискутабельно.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

«cepacia»- - Осложнение хронической колонизации легких

синдром штаммами B.cepacia complex, возникающее у 20%

пациентов, характеризующееся развитием

некротизирующей пневмонии, септицемии, часто приводящее к летальному исходу.

ATCC American Type Culture Collection

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute

EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility

Testing

HCCA a-cyano-4-hydroxycinnamic acid

MALDI- - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight ToF

MLST - Multilocus sequence typing

MRSA - Метициллин-резистентный золотистый стафилококк

MSSA - Метициллин-чувствительный золотистый стафилококк

БЛРС - Бета-лактамазы расширенного спектра действия

ВДП - Верхние дыхательные пути

ДНК - Дезоксирибонуклеионовая кислота

КОЕ - Колониеобразующие единицы

КОЕ/мл - Колониеобразующие единицы/миллилитр

МВ - Муковисцидоз

МВТР - Муковисцидозный трансмембранный регулятор

НДП - Нижние дыхательные пути

НМБ - Нетуберкулезные микобактерии

НФГОБ - Неферментирующие грамотрицательные бактерии

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ НАЗВАНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

A.denitrificans

A.piechaudii

A.ruhlandii

A.spanius

A.xylosoxidans

A.delafiensi

A.temperans

A.baumanii

A.baylyi

A.bereziniae

A.calcoaceticus

A.guillouiae

A.haemolyticus

A.johnsonii

A.junii

A.lwoffii

A.nosocomiales

A.parvus

A.pittii

A .radioresistens

A.schindleri

A.tjernbergiae

A.towneri

A.ursungii

A.oris

A.viridans

A.bestiarum

A.caviae

A.hydrophila

A.media

A.italicus

A.faecalis

A.cumminsii

A.polychromogenes

A.scleromae

A.sulfureus

A.ardleyensis

A.fumigatus

B.cereus B.marisflavii B.megaterium B.mojavensis B.murales

- Achromobacter denitrificans

- Achromobacter piechaudii

- Achromobacter ruhlandii

- Achromobacter spanius

- Achromobacter xylosoxidans

- Acidovirax delafiensi

- Acidovorax temperans

- Acinetobacter baumanii

- Acinetobacter baylyi

- Acinetobacter bereziniae

- Acinetobacter calcoaceticus

- Acinetobacter guillouiae

- Acinetobacter haemolyticus

- Acinetobacter johnsonii

- Acinetobacter junii

- Acinetobacter lwoffi

- Acinetobacter nosocomiales

- Acinetobacter parvus

- Acinetobacter pittii

- Acinetobacter radioresistens

- Acinetobacter schindleri

- Acinetobacter tjernbergiae

- Acinetobacter towneri

- Acinetobacter ursungii

- Actinomyces oris

- Aerococcus viridans

- Aeromonas bestiarum

- Aeromonas caviae

- Aeromonas hydrophila

- Aeromonas media

- Agromyces italicus

- Alcaligenes faecalis

- Arthrobacter cumminsii

- Arthrobacter polychromogenes

- Arthrobacter scleromae

- Arthrobacter sulfureus

- Arthrobacter ardleyensis

- Aspergillus fumigatus

- Bacillus cereus

- Bacillus marisflavii

- Bacillus megaterium

- Bacillus mojavensis

- Bacillus murales

B.pumilus.

B.simplex

B.subtillus

B.thuringensis

B.vasillismortis

B.vietnamensis

B.weinstephanensis

B.casei

B.aurantiaca

B.diminuta

B. intermedia

B.vesicularus

B. ambifaria

B.cenocepacia

B.cepacia complex

B.contaminans

B.dolosa

B.gladioli

B.multivorans

B. rinojensis sp.nov

B. seminal is

B.stabilis

B. thailandensis

B.vietnamensis