Клиническое значение дисфункции эндотелия в развитии акушерских и перинатальных осложнений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.01, доктор наук Миронов Алексей Валентинович

• Миронов Алексей Валентинович
• доктор наук
• 2021

Оглавление диссертации доктор наук Миронов Алексей Валентинович

ВВЕДЕНИЕ

1. ГЛАВА I. ДИСФУНКЦИЯ ЭНДОТЕЛИЯ У БЕРЕМЕННЫХ: ВОПРОСЫ ПАТОГЕНЕЗА, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

1.1. Особенности васкулогенеза в фетоплацентарном комплексе

1.2. Эндотелиальная дисфункция

1.2.1. Морфология и физиология эндотелиального аппарата

1.2.2. Механизмы поражения эндотелия

1.2.3. Эндотелиальная дисфункция и беременность

1.3. Методы диагностики дисфункции эндотелия

1.3.1. Функциональная диагностика

1.3.2. Биохимическая диагностика

1.3.3. Цитологическая диагностика

1.4. Морфометрия в диагностике патологии эндотелия

1.5. Терапия эндотелиальной дисфункции у беременных

2. ГЛАВА II. КОНТИНГЕНТ, МЕТОДЫ И ПРОГРАММА ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Контингент исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Клинико-статистическая характеристика

2.2.2. Лабораторные методы исследования

2.2.3. Инструментальные методы исследования

2.2.4. Статистическая обработка полученных данных

2.3. Программа исследования

3. ГЛАВА III. ДИАГНОСТИКА ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ В I ТРИМЕСТРЕ БЕРЕМЕННОСТИ

3.1. Клиническая характеристика обследованных групп

3.2. Морфометрия десквамированных эндотелиоцитов у беременных

3.3. Морфометрия сосудов ворсинчатого хориона плода

3.4. Биохимическая диагностика дисфункции эндотелия

4. ГЛАВА IV. СРЕДНИЙ ЭКВИВАЛЕНТНЫЙ ДИАМЕТР ДЕСКВАМИРОВАННЫХ ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ В ДИАГНОСТИКЕ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ У БЕРЕМЕННЫХ

5. ГЛАВА V. ПРОГНОЗИРОВАНИЕ МАТЕРИНСКОЙ, ПЕРИНАТАЛЬНОЙ И ДЕТСКОЙ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ

5.1. Клиническая характеристика обследованных женщин

5.2. Материнская заболеваемость в I триместре беременности

5.3. Материнская и перинатальная заболеваемостль во II и III триместрах беременности

5.4. Материнская и перинатальная заболеваемость в родах

5.5. Детская заболеваемость

5.6. Определение рисков развития материнской, перинатальной и детской заболеваемости с помощью витальной компьютерной морофометрии десквамированных эндотелиоцитов у женщин в I триместре беременности

6. ГЛАВА VI. ТЕРАПИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ У

БЕРЕМЕННЫХ

6.1. Влияние терапии препаратами прогестерона на состояние эндотелия у беременных

6.1.1. Клиническая характеристика исследуемых групп

6.1.2. Исследование состояния эндотелия у беременных в исследуемых группах

6.2. Влияние антиагрегантной терапии на состояние эндотелия у беременных

6.2.1. Клиническая характеристика исследуемых групп

6.2.2. Исследование свертывающей системы в исследуемых группах

6.2.3. Исследование состояния эндотелия у беременных в исследуемых группах

6.3. Влияние терапии препаратами низкомолекулярных гепаринов на состояние эндотелия у беременных

6.3.1. Клиническая характеристика исследуемых групп

6.3.2. Исследование свертывающей системы в исследуемых группах

6.3.3. Исследование состояния эндотелия у беременных в исследуемых группах

ГЛАВА VII. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

АПФ - ангиотензин-превращающий фермент

АФА - антифосфолипидные антитела

АФС - антифософолипидный синдром

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза

ГМФ - гуанозинмонофосфат

ГЦ - гомоцистеин

ГЭ - гиперплазия эндометрия

ДИ - доверительный интервал

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЭК - десквамированные эндотелиальные клетки

ИАЭ - индекс апоптоза эндотелиоцитов

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

ИМТ - индекс массы тела

ИППП - инфекции передающиеся половым путем ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

КДЭК - количество десквамированных эндотелиальных клеток

КММ - компьютерная морфометрия

КМДМ - компьютераная морфоденситометрия

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

МАУ - микроальбуминурия

МНО - международное нормализованное отношение НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат НМГ - низкомолекулярные гепарины ОРВИ - острая респираторно-вирусная инфекция

ПОНРП - прждевременная отслойка нормально расположенной плаценты

ПТИ - протромбиновый индекс

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭ - преэклампсия

РНК - рибонуклеиновая кислота

СДДЭК - средний диаметр десквамированных эндотелиоцитов

СЗРП - синдром задержки развития плода

СРБ - С-реактивный белок

СЭФР - сосудисто-эндотелиальный фактор роста

СДс - средний диаметр просвета сосуда

СПс - средняя площадь просвета сосуда

СТст - средняя толщина стенки сосуда

ФНО - фактор некроза опухоли

ФПН - фетоплацентарная недостаточность

ХГЧ - хорионический ганадотропин

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭТ - эндотелин

hsCRP - высокочувствительный С-реактивный белок ICAM - межклеточная молекула адгезии IL- нтерлейкин inf-y - интерферон

MTHFR - 5,10-метилентетрагидрофолат-редуктаза

MPV - средний объем тромбоцита

NOS - синтаза оксида азота

PAI-1- ингибитор активатора плазминогена I

РЕСАМ - тромбоцитарно-эндотелиальная молекула адгезии

PlGF - плацентарный фактор роста

PLT - тромбоциты

TF - тканевой фактор роста

TNFa - фактор некроза опухолей

tPA - тканевой активатор плазминогена

VCAM - сосудистая молекула адгезии

VEGF - васкулярный эндотелиальный фактор роста

vWF - фактор фон Виллебранда

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клиническое значение дисфункции эндотелия в развитии акушерских и перинатальных осложнений»

Актуальность исследования

Течение беременности определяется состоянием микроциркуляторного русла фетоплацентарного комплекса. Дефекты имплантации на ранних сроках беременности определяют изменение гемодинамики в функциональной системе мать-плацента-плод [12; 28; 61; 179]. На сегодняшний день важную роль в развитии акушерской патологии отводят интиме сосудов: доказано, что эндотелиоциты выполняют важную функцию поддержания сосудистого гомеостаза в системе микроцикуляции плаценты [12; 40; 47; 57; 91 и др.]. Плацента - массивный сосудистый орган и нарушение кровоснабжения в нем потенцирует нежелательные исходы беременности [49]. В научной литературе встречается большое количество работ, подтверждающих роль эндотелиальной дисфункции в развитии гестационных осложнений (фетоплацентарная недостаточность, преэклапсия, преждевременное прерывание беременности, СЗРП и т.д.) [34; 40; 57; 59; 75; 91; 106 и др.]. Неадекватная имплантация на фоне дисфункции эндотелия в ранние сроки беременности является причиной неэффективности терапии больших акушерских синдромов [28; 29] Вопросы раннего обнаружения и своевременной коррекции сосудистых нарушений в фетоплацентарной системе остаются решающими в профилактике материнской и перинатальной заболеваемости [59].

Степень разработанности темы исследования. Многими авторами изучалась роль маркеров нарушения функции эндотелия при сердечнососудистых заболеваниях, сахарном диабете, нарушениях мозгового кровообращения, метаболическом синдроме, почечной патологии [70; 94; 101; 105; 135; 148; 170]. В качестве биомаркеров эндотелиальной дисфункции применяют определение в сыворотке крови концентрации метаболитов оксида азота, эндотелина-1, высокочувствительного С-реактвиного белка, фактора фон

Виллебранда. К тестам диагностики дисфункции эндотелия относят также подсчет десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови и функциональные методы, основанные на оценке вазомотрных реакций. Важно отметить, что применение биохимической диагностики имеет некоторые ограничения: основной показатель нарушения функции эндотелия оксид азота нестабилен, срок жизни молекулы NO составляет от 5 до 30 секунд, что затрудняет его определение в биологических средах [142; 162], остальные же применяемые биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции дают косвенную оценку, т.к. сопровождают течение и многих других заболеваний, сопряженных с сосудистыми, гемостатическими или иммунными нарушениями. Функциональная диагностика также имеет ограничение: у беременной микроциркуляторное русло претерпевает изменения, требующие коррекции при интерпретации результатов, кроме того в акушерстве ограничено введение многих препаратов функциональных проб в связи с возможным негативным влиянием на плод.

Диагностическая технология, базирующаяся на морфологической характеристике эндотелиального аппарата, представляет перспективный вектор изучения сосудистых нарушений. Эндотелиоциты являются лабильными биоструктурами, что позволяет использовать регистрацию их морфологических изменений в качестве информативного критерия нарушений в микрососудистом русле. Компьютеные технологии сегодня позволяют фиксировать минимальные отклонения в структуре биологического объекта, маркируя доклинические стадии болезни. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции состоит в определении концентарции в периферической крови циркулирующих эндотиелиоцитов - десквамированных клеток внутренней оболочки сосудов [101; 162; 187]. Количество десквамированных эндотелиоцитов в кровотоке невелико, т.к. процесс самообновления интимы протекает медленно, и десквамированные клетки разрушаются макрофагами селезенки, печени, легких. В среднем, десквамированный эндотелиоцит находится в кровотоке от 24 до 42 часов [41]. Отмечено повышение концентрации этих клеток в периферической крови при

сепсисе, васкулитах, сахарном диабете, нарушениях мозгового кровообращения, сердечно-сосудистых заболеваниях и т.п. [101; 162; 187]. Десквамированные эндотелиальные клетки имеют плоскую форму и обладают выраженной морфологической неоднородностью. Толщина клетки составляет 1-2 мкм, диаметр может варьировать от 10 до 50 мкм. Морфологическая неоднородность клеток объясняется механизмом деструкции эндотелиоцитов путем апоптоза: в процессе повреждения объем цитоплазмы и ядра клетки уменьшаются, клетка фрагментируется, формируются апоптозные тельца [71; 101; 201]. Цифровой анализ изображения биологических объектов является на сегодняшний день доступным и быстро выполнимым диагностическим методом. В обзоре S. Schreier et al. (2020) указывается, что исследование циркулирующих клеток способствует продвижению жидкостной клеточной биопсии, как экономичной и малоинвазивной альтернативы современной клинической диагностики нарушения кровотока, обеспечивая междисциплинарный научный поиск новых диагностических биомаркеров. Исследования циркулирующих эндотелиоцитов до сих пор лишь частично затронули диагностический потенциал данного биологического объекта в отношении мощности интерпретации, информативности, малоинвазивности, технологической и экономической простоты [187]. Высокий уровень диагностического оборудования сегодня позволяет провести ультраточную визуализацию и цифровую обработку биологических микроструктур, обнаружить минимальные отклонения, сопряженные с «предболезнью», изменением гомеостаза в самом начале патологического процесса. Исследование эндотелия на начальном этапе формирования маточно-плацентарных отношений имеет важное диагностическое и прогностическое значение. Изучение морфофункционального состояния эндотелия на ранних сроках беременности расширяет потенциал пренатальной диагностики, способствуя сверхраннему обнаружению нарушений в микроциркуляторном русле функциональной системы мать-плацента-плод для эффективной профилактики осложнений беременности.

Цель исследования

Совершенствование прогнозирования, профилактики и лечения акушерских и перинатальных осложнений на основе исследования функции эндотелия у беременных.

Задачи

1. Изучить морфофункциональное состояние эндотелия у беременной в I триместре, провести морфометрию десквамированных эндотелиоцитов, определить диапазон колебаний значений исследуемых показателей при физиологическом и осложненном течении беременности.

2. Изучить морфофункциональное состояние эндотелия сосудов ворсинчатого хориона плода в I триместре, определить морфометрические показатели сосудов хориона плода при физиологическом и осложненном течении беременности.

3. Исследовать корреляционные связи между биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции, морфометрическими параметрами десквамированных эндотелиоцитов у беременной и морфометрическими показателями сосудов хориона плода.

4. Разработать информационную технологию объективизации сосудистых нарушений у беременных с применением витальной компьютерной морфометрии десквамированных эндотелиоцитов.

5. Проанализировать материнскую, перинатальную и детскую заболеваемость, выделить группы риска беременных по развитию акушерских и перинатальных осложнений с учетом результатов проведения в I триместре витальной компьютерной морфометрии десквамированных эндотелиоцитов.

6. Провести анализ влияния гормональной, антиагрегантной и антикоагулянтной терапии на состояние эндотелия у беременных с использованием витальной компьютерной морфометрии десквамированных эндотелиоцитов.

7. Разработать дифференцированный подход в прогнозировании, профилактике и лечении акушерских и перинатальных осложнений на основе исследования функции эндотелия с применением новой технологии объективизации сосудистых нарушений у беременных.

Научная новизна

В диссертацитонном исследовании впервые изучено функциональное состояние эндотелия при физиологическом и осложненном течении беременности с помощью морфометрии десквамированных эндотелиоцитов. Получены новые данные об оптических характеристиках десквамированных эндотелиоцитов у беременных, впервые определены референтные значения морфометрических показателей десквамированных эндотелиальных клеток при физиологическом течении беременности, а также диапазон колебаний этих параметров при нарушении гестации. Изучены морфометрические характеристики эндотелиоцитов ворсинчатого хориона, проведен корреляционно-регрессионный анализ морфологических изменений эндотелия у матери и плода на ранних сроках беременности. Разработана информационная технология объективизации сосудистых нарушений у беременных на основе витального компьютерного морфометрического исследования десквамированных эндотелиоцитов. Новая технология позволяет с помощью цифрового анализа изображения клетки зафиксировать в реальном времени минимальные отклонения оптических характеристик цитообъекта и дать наиболее точный и объективный анализ поражения эндотелия, зарегистрировать изменения, которые сопряжены с нарушением сосудистого гомеостаза на ранних стадиях заболевания. На основе созданной информационной технологии объективизации поражения сосудистой системы проведена оценка влияния гормональной, антиагрегантной и антикоагулянтной терапии на состояние эндотелия у беременных. Впервые осуществлен анализ течения беременности и перинатального исхода, неонатальной и детской заболеваемости с учетом результатов морфометрии десквамированных эндотелиоцитов в I триместре беременности.

Теоретическая и практическая значимость

Исследование функции эндотелия в I триместре беременности позволяет на доклинической стадии определять нарушения микроциркуляции в формирующемся фетоплацентарном комплексе. Изучение патогенеза дисфункции эндотелия позволяет рассматривать минимальные изменения в морфологии эндотелиоцита в качестве раннего маркера поражения сосудистой системы. Позиционирование апоптоза эндотелиальных клеток в период имплантации как патогенетического звена фетоплацентарной недостаточности открывает новые перспективы в поиске путей ранней диагностики, профилактики и лечения аушерских и перинатальных осложненй. Разработанная технология позволяет визуализировать изменения в ядрах десквамированных эндотелиоцитов: маргинацию и компактизацию хроматина, что открывает перспективу исследования деструкции эндотелиальных клеток на молекулярном уровне.

С помощью разработанного дифференцированного подхода предложены рекомендации по прогнозированию и профилактике материнской, перинатальной и детской заболеваемости с использованием новой информационной технологии объективизации поражения сосудистой системы у беременных. Новая технология может найти применение в практической медицине как дополнительный малоинвазивный, технологически и экономически доступный, быстровыполнимый тест пренатальной диагностики, эффективный для скринингового обследования женщин в I триместре беременности.

Апробация результатов работы

Предварительная защита диссертации состоялась на совместном заседании кафедры акушерства и гинекологии стоматологического факультета ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ и кафедры клинической лабораторной диагностики и патологической анатомии Академии постдипломного образования ФГБУ ФНКЦ ФМБА России 03 февраля 2021 г. (протокол №6).

Результаты диссертации доложены на Российском конгрессе "Ранние сроки беременности. Проблемы ВРТ" (1-3 июня 2017); Международном конгрессе

«Новые технологии в диагностике и лечения гинекологических заболеваний» (6 -9 июня, 2017); Московской научно-практической конференции посвященной "Международному дню недоношенных детей" (17 ноября 2017); собраниях кафедры акушерства и гинекологии стоматологического факультета ФГБОУ ВО МГМСУ им А.И.Евдокимова.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационной работы были внедрены в практику отделения гинекологии ГБУЗ ГКБ №13 ДЗ г. Москвы, используются на семинарах, лекциях и практических занятиях кафедры акушерства и гинекологии стоматологического факультета ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И.Евдокимова МЗ РФ.

По материалам диссертационного исследования опубликовано 42 научные работы, в том числе 2 монографии, 1 работа за рубежом (Великобритания) и 1 4 публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

По теме диссертационного исследования Федеральной службой интеллектуальной собственности (РОСПАТЕНТ) выдан патент на изобретение: «Способ диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных», №2020113194/14 G01N33/49(2006.01), авторы: Миронов А.В., Умаханова М.М., Торчинов А.М., Жукоцкий А.В (от 27.03.2020 г.).

Личный вклад автора в проведенное исследование

Автором лично разработан дизайн исследования, проанализированы и обобщены материалы современной научной литературы по изучаемой проблеме. Автор лично провел анализ историй болезни 530 беременных, 163 истории родов, а также 163 амбулаторных карт детей. Лично или под контролем автора осуществлено морфоденситометрическое исследование десквамированнх эндотелиоцитов у 530 пациенток. Автором проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов, на основании которых сформулированы выводы, а также разработаны рекомендации по планированию лечебно-профилактических

мероприятий с учетом проведения в I триместре беременности витальной компьютерной морфометрии десквамированных эндотиелиоцитов.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 250 страницах, иллюстрирована 80 таблицами и 49 рисунками, состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения.

Список литературы содержит 206 источников, из них 111 источников на русском языке, 95 - на других языках.

Положения, выносимые на защиту

1. Витальная компьютерная морфометрия десквамированных эндотелиоцитов является новым информативным, малоинвазивным, быстровыполнимым, экономически и технологически доступным методом диагностики сосудистых нарушений у беременных. Наиболее оптимальным морфометрическим показателем метода является средний эквивалентный диаметр десквамированных эндотелиоцитов.

2. Витальная компьютерная морфометрия десквамированных эндотелиоцитов имеет равную информативность с традиционными методами цитологической и биохимической диагностики эндотелиальной дисфункции. Морфометрические параметры десквамированных эндотелиоцитов у беременной в I триместре коррелируют с морфометрическими показателями сосудов хориона плода, что подтверждает информативность новой технологии в диагностике нарушений маточно-плодовых отношений.

3. Витальная компьютерная морфометрия десквамированных эндотелиоцитов позволяет выделять группы риска развития материнской, перинатальной и детской заболеваемости, прогнозировать течение беременности и перинатальный исход.

4. Разработанная информационная технология объективизации сосудистых нарушений у беременных позволяет применять дифференцированный подход в профилактике и лечении акушерских и перинатальных осложнений, а также осуществлять мониторинг эффективности терапевтического воздействия с целью снижения материнской, перинатальной и детской заболеваемости.

ГЛАВА I. ДИСФУНКЦИЯ ЭНДОТЕЛИЯ У БЕРЕМЕННЫХ: ВОПРОСЫ ПАТОГЕНЕЗА, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

1.1. Особенности васкулогенеза в фетоплацентарном комплексе

Снижение частоты гестационныхх осложнений, является важнейшей задачей современного акушерства и напрямую связано с исследованием процессов имплантации и плацентации, определяющих адекватность кровотока в фетоплацентарном комплексе [12; 88; 49; 180]. Тонкие механизмы ангио- и васкулогенеза на ранних сроках беременности программируют возможность развития гравидарных осложнений [152; 184; 205].

Как известно, уже с четвертой недели гестации стартует формирование сосудистой сети в хорионе с трасформацией вторичных (бессосудистых) ворсин в третичные. Фетальные капилляры, появляющиеся в мезенхиме ворсин хориона, уже содержат первые эндотелиальные клетки [8], а после четвертой недели при микроскопии хориальных капилляров обнаруживаются незрелые ядерные эритроциты, что свидетельствует о начале кровообращения в фетоплацентарной системе. Именно эти первичные капилляры, формирующиеся на ранних сроках беременности, будут осуществлять кровообращение в плаценте до родов, определяя маточно-плодовые отношения [197; 205]. Таким образом, период превращения вторичных ворсин в третичные является критическим, т.к. определяет функциональную полноценность формирующейся сосудистой сети фетоплацентарного комплекса [61].

Морфометрические параметры первых фетальных капилляров рознятся, что объясняется неровностью их просвета и прерывистостью эндотелиальной оболочки. Базальная мембрана и перициты у первичных капилляров отсутствуют. Эндотелий фетальных сосудов имеет крупные, неправильной формы ядра, площадь просвета капилляров составляет от 20 до 29 мкм2 [79]. Цитоплазма эндотелиоцитов образует выросты и отростки. Толщина стенок первичных

фетальных капилляров варьирует от 0,15 до 1,2 мкм и определяется только толщиной цитоплазмы эндотелиоцитов. Максимальная площадь сосудов в третичных ворсинах выявляется на сроке 7-8 недель и может достигать 40-45 мкм2, что объясняется высокой активностью трофобласта. Позже площадь капилляров становится меньше и не превышает 32-36 мкм2. Эндотелиальная оболочка непрерывна. Объем цитоплазмы эндотелиоцитов уменьшается. Суммарная площадь сосудов в каждой ворсине достигает 1300 мкм2 [79]. К 10 неделям происходит утолщение стенки капилляра за счет появляющихся клеток перицитов, что завершает формирование фетальных капилляров в хориальной ткани. Площадь просвета капилляров составляет от 12 до 16 мкм2. Стенка сосуда уже содержит все основные компоненты: эндотелий, перициты, базальную мембрану, перикапиллярные структуры. Толщина капиллярной стенки варьирует от 0,4 до 1,1 мкм. В эндотелиальных клетках объем цитоплазмы становится больше, в ней содержатся все характерные органеллы. Базальная мембрана тонкая и полностью покрывает капилляр, разделяясь на два листка в месте локализации перицитов, которые встречаются с большим постоянством и окружают эндотелиальную трубку своими отростками [72]. Суммарная площадь сосудов в каждой ворсине увеличивается и достигает 1900 мкм2 к концу I триместра беременности [79].

Нарушение гестационного процесса в I триместре отражается на состоянии сосудистого русла хориально-маточного кровотока. При самопроизвольных абортах на сроке 8-12 недель отмечается большое количество аваскулярных ворсин, лишь в трети ворсин содержится по 1-2 капилляра. Ворсинчатый хорион мономорфный, представлен преимущественно вторичными ворсинами. По данным литературы, для морфологической картины самопроизвольного аборта характерны множественные кровоизлияния с признаками нарушения кровообращения, сопровождающихся «дезорганизацией» апоптоза в измененных клетках [97]. Суммарная площадь сосудов в перерасчете на одну ворсину составляет лишь 60 мкм2 в 5-6 недель, что меньше аналогичного показателя при нормальном течении беременности. К концу I триместра общая площадь сосудов

в ворсинах хориона возрастает до 700 мкм2, однако не достигает физиологических показателей, соответствующих этому сроку беременности [79].

Таким образом, уже к 6-ти неделям физиологически протекающей беременности формируется хориально-маточный кровоток, который определяет все дальнейшее становление отношений в системе мать-плацента-плод. В этот период в хорионе появляются первичные капилляры, образующие в дальнейшем сосудистую сеть плацентарного кровобращения. Гемодинамическая система, состоящая из интегрированного кровотока матери и плода определяется полноценностью, так называемого, «сосудистого дерева» [61]. Морфометрические параметры формирующейся ангиосистемы изменяются параллельно увеличивающемуся сроку беременности и несут важную прогностическую роль в изучении патологии беременности [189]. Ультраточная цифровая характеристика сосудистых элементов функциональной системы мать-плацента-плод в период её формирования на ранних сроках гестации может являться эффективным инструментом прогнозирования течения беременности и перинатального исхода, исследование в данном направлении и было положено в основу проведенной нами работы.

1.2. Эндотелиальная дисфункция

1.2.1. Морфология и физиология эндотелиального аппарата

Микроциркуляторное русло представляет систему мелких сосудов: артериолы, венулы, капилляры и артериоло-венулярные анастомозы, формирующие сложный морфо-физиологический комплекс [94]. Гемокапилляр - конечная часть разветвления артериальной системы, состоящая из эндотелиоцитов, перицитов и базальной мембраны. Средний диаметр капилляра составляет 5-10 мкм. Внутренняя поверхность сосуда покрыта непрерывным слоем многоугольных эндотелиальных клеток толщиной 3-4 мкм и диаметром 30-50 мкм [54]. Большинство клеток эндотелия имеет одно ядро. В монослое встречаются клетки, у которых ядра нет. Апоптоз является основным

механизмом повреждения клеток эндотелия, и безъядерные клетки

представляют клетки, закончившие свой жизненный цикл [23; 71; 101; 201].

Эндотелий представляет однослойный пласт специализированных клеток мезенхимлаьного происхождения, чувствительных к механическому воздействию тока крови, а также обладающих рецепцией к другим различным физико-химическим раздражителям [9]. В 1980 г. впервые R.F. Furchgott и J.V. Zavadzki описали участие эндотелия в регуляции тонуса сосудов [136]: авторами была обнаружена способность изолированной артерии без участия центральных механизмов изменять свой тонус при введении раствора ацетилхолина. Эндотелиоциты выстланы гликокаликсом, выполняющим транспортную и связывающую функцию [132]. Соединение эндотелиальных клеток осуществляется посредством интегринов - трансмембранных клеточных рецепторов, и белка кадгерина, экспрессируемого эндотелиоцитами. Цитоплазматическая мембрана эндотелия содержит многочисленные механорецепторы, которые чувствительны к линейной скорости и объему движущейся крови [43]. Механорецепторы эндотелиоцитов испытывают 3 основные физические силы: 1) напряжение сдвига (касательное напряжение); 2) боковое давление на сосудистую стенку; 3) окружное растяжение между эндотелиоцитами [9]. Из перечисленных сил напряжение сдвига считается наиболее значимым механическим воздействием, т.к. стимулирует высвобождение вазоактивных веществ, определяющих работу эндотелиального аппарата. Напряжением сдвига называют силу, стремящуюся вызвать деформацию стенки сосуда путем сдвига вдоль плоскости, параллельной приложенному усилию. Основную роль восприятия изменения давления напряжения сдвига отводят гликокаликсу. Раздражение механорецепторов стимулирует выработку эндотелиальными клетками биологически активных веществ, учавствующих в гемодинамике, гемостазе, ангиогенезе, иммунных реакциях [132]. Кроме того, на цитоплазматической мембране эндотелиоцитов содержится большое количество хеморецепторов к биохимическим агентам -

ацетилхолину, кининам, серотонину, катехоламинам, которые также вызывают изменение секреторной активности эндотелиальных клеток [ 94].

По своей функции все активные вещества, синтезируемые эндотелием, разделяют на несколько групп. Важнейшей ролью эндотелиального аппарата является участие в регуляции тонуса сосудов. Особенностью секреторной функции эндотелия является способность вырабатывать медиаторы-антагонисты: интима сосудов при определенных условиях синтезирует и вазодилатирующие и вазоконстрикторные вещества, что лежит в основе поддержания сосудистого тонуса.

Основными вазодилатирующими веществами, синтезируемыми эндотелиальными клетками являются оксид азота NO и простациклин. NO считается «мощнейшим» из известных вазодилатирующих биологических веществ в организме человека [50], синтезируется из L-аргинина, O2 и НАДФ ферментом NO-синтазой (NOS). Принципиально, что действие NO происходит в течение короткого времени. Срок жизни молекулы NO составляет от 5 до 30 секунд: газообразный медиатор быстро проникает в гладкомышечные клетки стенки сосуда, где активирует цГМФ, открывает многочисленные калиевые и кальциевые каналы и приводит к вазодилатации [94; 142; 161]. Также NO оказывает влияние на процессы коагуляции в качестве дезагреганта тромбоцитов и обладает активностью в качестве эффектора клеточного иммунитета [ 4; 137].

Простациклин (простагландин I2) - высокоактивный метаболит арахидоновой кислоты, синтезируемый в эндотелии, активирующий аденлатциклазу, что повышает концентрацию цАМФ в гладкомышечных клетках сосудов и вызывает вазодилатацию. Кроме того, простациклин препятствует агрегации тромбоцитов: при его участии происходит активация аденилатциклазы и повышается уровень цАМФ в тромбоцитах, что обеспечивает уменьшение содержания в тромбоцитах ионов Са2+ [9].

Синтез вазодилаторов происходит в эндотелии в непрерывном режиме, поддерживая в норме базальный уровень тонуса сосудов.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Миронов Алексей Валентинович, 2021 год

% - - - -

Изучение акушерско-гинекологического анамнеза продемонстрировало следующие показатели (таблица 10). Первобеременные в основной группе составили 29 человек (32,2%). В группе с артифициальным абортом первобеременных выявлено не было. Невынашивание в анамнезе встречалось у 23 участниц основной группы исследования (25,6%). В группе контроля в анамнезе прерывание беременности обнаружено у 9 участниц (10%) ф<0,05; t=2,9). Исследование течения предыдущих беременностей выявило развитие ПЭ у 7 участниц основной группы (7,8%) и у 1 пациентки в группе контроля (1,1%) ф<0,05, t=2,21). Эклампсии или ПОНРП в анамнезе в исследуемых группах не обнаружено. 24 участницы основной группы исследования (26,7%) до настоящей беременности провели медицинский аборт по желанию, в контрольной группе медаборт до исследуемой беременности провели 52 женщины (57,7%) ф<0,001, t=4,43).

Таблица 10 - Акушерский анамнез в исследуемых группах.

Показатель Первобеременные Выкидыш на сроке до 8 недель Выкидыш на сроке 8-12 недель Выкидыш на сроке более 12 недель Привычное невынашивание ПЭ в анамнезе Артифициальные аборты

Основная группа, п=90 абс. 29 11* 10 2 6* 7* 24**

% 32,2 12,2* 11,1 2,2 6,7* 7,8* 26,7**

Контрол. группа, п=90 абс. - 3 6 - - 1 52

% - 3,3 6,7 - - 1,11 57,7

Примечание: * p<0,05 (достоверность различий установлена по отношению к показателям контрольной группы).

** p<0,001 (достоверность различий установлена по отношению к показателям контрольной группы).

При анализе гинекологических заболеваний в сравниваемых группах получены следующие результаты (таблица 11). Гиперплазия эндомтерия (ГЭ) в анамнезе: 1 женщина в основной группе (1,11%) и 2 пациентки в группе контроля (2,2%). Миома матки: 4 участницы основной группы (4,4%) и 6 - в группе контроля (6,7%). Эндометриоз: 7 пациенток основной группы исследования (7,8%) и 10 участниц в группе контроля (11,1%). Хронические воспалительные заболевания половой системы: 8 женщин основной группы (8,9%) и 13 участниц группы контроля (14,4%). Инфекции передающиеся половым путем (ИППП) диагностировались в течение 6 месяцев до исследования: у 20 участниц основной группы (21,1%) и у 14 беременных в группе контроля(15,6%). Дисфункциональные маточные кровотечения: 9 участниц основной группы исследования (10%) и 1 пациентка в контрольной группе (1,11%) ф<0,05; t=2,66).

Таблица 11 - Гинекологическая патология в исследуемых группах.

Показатель Бесплодие Гиперплазия эндометрия Миом матки Эндометриоз Двурогая матка Острый или хр. сальпингоофорит ИППП Дисфункциональные кровотечения Эктопия ш/матки

Основная абс. 2 1 4 7 1 8 20 9* 30

группа, п=90

% 2,2 1,1 4,4 7,8 1,1 8,9 21,1 10* 33,3

Контрол. абс. - 2 6 10 1 13 14 1 39

группа, п=90 % - 2,2 6,6 11,1 1,1 14,4 15,6 1,1 43,3

Примечание: * p<0,05 (достоверность различий установлена по отношению к показателям контрольной группы).

Таким образом, анализ клинико-статистических данных в группах I этапа исследования продемонстрировал следующие результаты. По возрасту и антропометрическим данным группы участниц были статистически идентичны. При изучении образа жизни выявлено, что гиподинамия встречалась гораздо чаще у пациенток основной группы исследования ф<0,001). Никотиновая зависимость вывлялась статистически достоверно чаще в группе контроля ф<0,001). Достоверно значимых различий при анализе хронических соматических заболеваний у участниц в сравниваемых группах не выявлено. При изучении акушерского анамнеза обнаружены более высокие показатели в основной группе по сравнению с данными группы контроля по частоте невынашивания, а также наличию ПЭ в анамнезе ф<0,05). При анализе гинекологической патологии следует отметить дисфунциональные маточные кровотечения, которые достоверно чаще встречались у участниц основной группы исследования ф<0,05). По остальным параметрам группы беременных были статистически сопоставимы.

3.2. Морфометрия десквамированных эндотелиоцитов у беременных

Целью I этапа исследования была унификация показателей функции эндотелия с помощью морфометрии циркулирующих ДЭК. Данный этап был необходим для аккумуляции достаточного объема выборок клеточных препаратов с целью оценки физиологических вариантов количественных и качественных особенностей ДЭК периферической крови у женщины во время беременности. Благодаря объему обработанной информации опытным путем была создана новая информационная технология объективизации поражения сосудистой системы у беременных с использованием витальной компьютерной морфометрии десквамированных эндотелиоцитов.

С помощью традиционного метода определения количества ДЭК, предложенного J.Hladovec и соавт. (1978) [147], мы осуществили морфометрическое исследование циркулирующих ДЭК для получения большего массива информации о функциональном состоянии эндотелия у беременных. В работе была применена модифицированная методика подсчета десквамированных эндотелиоцитов (Овсяник Д.М., Фомин А.В., 2014) [62], которая включала окраску цитологического препарата раствором 0,1% метиленового синего (рисунки 4а-4г).

в) г)

Рисунки 4а-4г - ДЭК в камере Горяева. Окраска метиленовый синий.

Увеличение 400 х.

Использованная в работе окраска раствором 0,1% метиленового синего окрашивала цитоплазму клеток в голубой цвет, фрагменты ядра - в темно-синий цвет для оптимального цветового контраста и четкости изображения при проведении КММ. У каждого пациента проводился подсчет количества ДЭК в 10 пробах камеры Горяева, и определялось среднее значение количества циркулирующих ДЭК. Одновременно проводилась съемка препарата с тубуса микроскопа фотокамерой, перенос и сохранение изображения с использованием программы для конвертирования файлов. В автоматическом режиме

осуществлялась тоновая коррекция изображения для минимизации уровня ошибок, связанных с окраской и освещением. Изображение биообъектов выделялось (сегментировалось) под контролем оператора и определялись средние морфометрические параметры десквамированных эндотелиоцитов.

При оценке количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови у исследуемых женщин контрольной группы получены следующие результаты (таблица 12).

Таблица 12 - Морфометрические показатели десквамированных

эндотелиоцитов у беременных контрольной группы (п=90).

Параметр Количество измерений Среднее, М Мах Мт Ст. отклонение, ±т

Количество, 104кл/100мл 900 5,5 15 1 2,12

Диаметр, мкм 9000 43,9 49,9 35 3,99

Периметр, мкм 9000 139,6 159,7 99,2 14,10

Площадь, мкм2 9000 1546,8 2003,9 775,9 294,11

Фактор формы 9000 12,7 12,98 12,54 0,11

Поляризация 9000 0,08 0,13 0,04 0,021

Среднее количество ДЭК в группе контроля составило 5,5*104 клеток/100мл. Диапазон колебания параметра: 1*104 - 15*104 клеток/100мл. Стандартное отклонение ±2,12*104 клеток/100мл.

Микросокпическое исследование обнаруживает неоднородность размера и формы ДЭК. Циркулирующий эндотелиоцит представляет собой дисковидную клетку неправильной формы, диаметр варьирует и может достигать 50 мкм. В работе использованы следующие морфометрические величины: средний эквивалентный диаметр клетки, средний периметр клетки, средняя площадь клетки, фактор формы клетки, поляризаця клетки.

Эквивалентный диаметр - это длина отрезка на плоскости между максимально удаленными пикселами изображения. Этот показатель составил в

группе контроля 43,9 мкм. Диапазон колебаний 35-50 мкм. Стандартное отклонение ±3,99 мкм (рисунок 5).

Рисунок 5 - Десквамированный эндотелиоцит, контрольная группа. Морфометрическое исследование в программе Leica Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. Окраска метиленовый синий. Увеличение 600 х.

Десквамированные эндотелиоциты имеют неправильную многоугольную форму, и определение периметра и площади клетки позволяет детализировать цитометрическую характеристику исследуемого объекта. Периметр - это сумма точек (пикселов), выполняющих линию границы оптического объекта. Средний периметр ДЭК у здоровых беременных составил 139,6 мкм. Диапазон колебаний 99,2-159,7 мкм. Стандартное отклонение ±14,10 мкм.

Площадь объекта - это сумма точек (пикселов) изображения, которые принимаются за исследуемый оптический объект. Средний показатель площади циркулирующих эндотелиоцитов в контрольной группе составил 1546,8 мкм2. Диапазон колебаний 775,9-2003,9 мкм2. Стандартное отклонение ±294,11 мкм2.

Фактор формы - это параметр изрезанности контура исследуемого оптического объекта - безразмерная величина, комбинация характеристик формы и размера клетки. Фактор формы круга равен 12,56. Данный параметр морфометрического исследования демонстрирует приближение формы оптического объекта к форме круга. Фактор формы циркулирующих эндотелиоцитов в группе контроля составил 12,7. Диапазон колебаний 12,5412,98. Стандартное отклонение ±0,11.

Поляризация - это характеристика эллиптичности исследуемого объекта, варьирует от 0 до 2. Деструкция эндотелиоцита сопровождается потерей округлой формы клетки. Данный параметр является дополнительной морфометрической характеристикой ДЭК. Поляризация циркулирующих эндотелиоцитов в группе контроля составила 0,08. Диапазон колебаний 0,04-0,13. Стандартное отклонение ±0,024.

Цитологическое исследование ДЭК у беременных основной группы продемонстрировало следующие результаты (таблица 13). При подсчете количества циркулирующих эндотелиальных клеток в основной группе показатель составил 12,6*104 клеток/100мл. Диапазон колебания: от 1*104 до 29*104 клеток/100мл. Стандартное отклонение ±5,89 клеток/100 мл.

Таблица 13 - Морфометрические показатели десквамированных

эндотелиоцитов у беременных основной группы (п=90).

Параметр Количество измерений Среднее, М Мах Мт Ст. отклонение, ±т

Количество, 104кл/100мл 900 12,6 29 1 5,89

Ср. диаметр, мкм 9000 29,5 49 11 9,40

Периметр, мкм 9000 93,8 156 36 29,90

Площадь, мкм2 9000 842,0 2122,6 113 484,44

Фактор формы 9000 11,2 14,5 9,39 0,77

Поляризация 9000 0,14 0,34 0,06 0,053

Средний эквивалентный диаметр ДЭК у беременных основной группы составил 29,5 мкм. Диапазон колебания параметра: 11 - 49 мкм. Стандартное отклонение ±9,40 мкм (рисунок 6).

Средний периметр ДЭК составил 93,8 мкм, диапазон колебания: 36 - 156 мкм. Стандартное отклонение ±29,90 мкм.

Рисунок 6 - Десквамированный эндотелиоцит, основная группа. Морфометрическое исследование в программе Leica Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. Окраска метиленовый синий. Увеличение 600 х.

Среднее значение площади ДЭК в основной группе исследования составила 842,0 мкм2. Диапазон отклонения параметра от среднего значения: 113 - 2122,6 мкм2. Стандартная ошибка значения составила ±484,44 мкм2.

Исследование фактора формы в основной группе показало следующие результаты. Средний показатель составил 11,2. Диапазон колебания: 9,39 - 14,5. Стандартное отклонение составило ±0,77.

Поляризация ДЭК в основной группе: среднее значение 0,14, диапазон колебания: 0,06 - 0,34, стандартное отклонение ±0,053.

Таким образом, при морфологическом изучении десквамированных эндотелиоцитов периферической крови помимо классического традиционного параметра количества ДЭК мы получили цифровой портрет клетки, что послужило основой для создания новой технологии исследования состояния эндотелия у человека. Полученные результаты цитологического исследования ДЭК, отраженны таблице 14. Расчет проводился с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Таблица 14 - Параметры десквамированных эндотелиоцитов периферической крови в исследуемых группах (N=180).

Показатель Группа Уровень р

основная (п=90) контрольная (п=90)

Количество ДЭК, *104 кл/100 мл 12,6±5,89 5,5±2,12 <0,0001

Средний диаметр ДЭК, мкм 29,5±9,40 43,9±3,99 <0,0001

Средний периметр ДЭК, мкм 93,8±29,90 139,6±14,10 <0,0001

Средняя площадь ДЭК, мкм2 842,0±484,44 1546,8±294,11 <0,0001

Фактор формы ДЭК 11,2±0,77 12,7±0,11 <0,0001

Поляризация ДЭК 0,14±0,053 0,08±0,021 <0,0001

Сравнительный анализ параметров среднего количества ДЭК в исследуемых группах обнаружил статистически достоверное повышение значения более чем в 2 раза в группе беременных с несостоявшимся выкидышем: 12,6*104 кл/100мл в основной и 5,5*104 кл/100мл - в контрольной группе (р<0,0001). Следует отметить, что разброс значений по этой переменной также был существенно выше в основной группе. Гистограмма распределения значений показателя «Количество ДЭК» (рисунок 7) наглядно показывает различия между группами.

35

§ 30

£ 25

о 20

х

а: 15 т Ч 8 10

т 5

Л 0

Основная

Контрольная

Группа

Рисунок 7 - Графики распределения количества ДЭК у беременных в

исследуемых группах.

При сравнительном анализе результатов КММ циркулирующих эндотелиоцитов также продемонстрирована статистическая достоверность отличий в группах участниц. Средний эквивалентный диаметр ДЭК у беременных в группе контроля составил 43,9 мкм, что в 1,5 раза превысило значение аналогичного показателя у участниц основной группы 29,5 мкм (р<0,0001). Следует отметить, что рассеивание значений по этой переменной также было существенно выше в основной группе исследования.

Графики распределения значений показателя «Средний эквивалентный диаметр ДЭК» (рисунок 8) наглядно демонстрируют различия между группами.

60

50

| 40

30

20

й. 10 и

0

Основная

Контрольная

Группа

Рисунок 8 - Графики распределения среднего эквивалентного диаметра ДЭК

у беременных в исследуемых группах.

Среднее значение периметра ДЭК у участниц группы контроля составило 139,6 мкм, в основной группе среднего значения аналогичного показателя составило 93,8 мкм (р<0,0001), разброс значений по этой переменной также существенно выше по сравнению с контрольной группой, т.е. контрольная группа выглядит более однородной и по среднему периметру ДЭК. Графики

распределения значений показателя «Средний периметр ДЭК» демонстрируют различия между группами (рисунок 9).

160

т 130

100

70

3 40

10

Основная

Контрольная

Группа

Рисунок 9 - Графики распределения среднего периметра ДЭК у беременных

в исследуемых группах.

Среднее значение площади ДЭК у участниц группы контроля составил1546,8 мкм2 и 842,00 мкм2 у беременных основной группы. Этот параметр также в основной группе исследования был намного ниже ф<0,0001), а разброс значений по этой переменной существенно выше в сравнении с показателями группы контроля, т.е. контрольная группа выглядит более

однородной и по средней площади ДЭК. Гистограмма распределения значений показателя «Средняя площадь ДЭК» также наглядно показывает различия между группами (рисунок 10).

30 1—

28 ■ 26 ■

Средняя площадь ДЭК, мимЛ2

2500

Гч1 <

£

| 2000 т

1500

.о =1

ш ?

о 1000

ос

I 500

и ср (_)

0

Рисунок 10 - Графики распределения показателя средней площади

десквамированных эндотелиоцитов в исследуемых группах.

Среднее значение фактора формы ДЭК составило 12,7 у беременных

группы контроля и 11,2 - у участниц основной группы (р<0,0001), разброс

значений также существенно выше, т.е. группа контроля выглядит более

однородной по данному морфометрическому параметру.

Основная

Контрольная

Группа

Среднее значение поляризации ДЭК: 0,08 в группе контроля и 0,14 в основной группе исследования (p<0,0001), разброс значений по этой переменной также существенно выше по сравнению с аналогичными показателями группы контроля*.

Таким образом, были получены референтные значения морфометрических показателей циркулирующих ДЭК у женщин в I триместре беременности, а также определены колебания значений этих показателей при нарушении гестации. Среднее значение количества циркулирующих эндотелиоцитов в группе участниц с физиологическим течением беременности составило 5,5±2,12*104 клеток/100мл, в группе с несостоявшимся выкидышем значение этого показателя был значительно выше и составило 12,6±5,89*104 клеток/100мл (р<0,0001). Показатель количества ДЭК по методике, предложенной J.Hladovec с соавт. в 1978 г., является классическим маркером эндотелиальной дисфункции, и полученные данные достоверно подтверждают верность выборки пациентов в исследуемых группах. Примененные нами морфометрические показатели среднего эквивалентного диаметра ДЭК, среднего периметра ДЭК, средней площади ДЭК, а также фактора формы и поляризации ДЭК в основной группе показали результат намного ниже, а разброс значений по этим переменным существенно выше по сравнению с аналогичными показателями группы контроля. Среднее значение диаметра ДЭК в группе контроля составило 43,9±3,99 мкм, в группе с неразвивающейся беременностью 29,5±9,40 мкм (р<0,0001). Среднее значение периметра исследуемых клеток в контрольной группе 139,6±14,10 мкм и 93,8±29,90 мкм - в основной группе участниц (р<0,0001). Средняя площадь ДЭК у здоровых беременных 1546,8±294,11 мкм2, в группе с несостоявшимся выкидышем 842,0±484,44 мкм2 (р<0,0001).

* Данные опубликованы в статьях - Роль эндотелиопатии в патогенезе неразвивающейся беременности/А.В.Миронов, А.М.Торчинов, О.В.Галачиев и др.//Патогенез. Научно-практический журнал. - 2016. - Т. 14, №3. - С. 53-57; Миронов, А.В., Умаханова, М.М. Жукоцкий, А.В. Эндотелиальная дисфункция в I триместре беременности // Гинекология. -2020. - №22 (3). -С. 59-64.

Фактор формы ДЭК в контрольной группе продемонстрировал результат 12,73 ±0,11 и 11,27 ± 0,77, поляризация ДЭК: 0,08±0,02 в группе здоровых беременных и 0,14±0,053 в группе с несостоявшимся выкидышем. Статистическая достоверность изменений морфометрических показателей десквамированных эндотелиоцитов при нарушении гестации позволяет рассматривать их как информативные маркеры сосудистых нарушений. Следует подчеркнуть, что в работе впервые использованы геометрические параметры ДЭК периферической крови в качестве диагностического критерия поражения эндотелия у человека.

3.3. Морфометрия сосудов ворсинчатого хориона плода

Исследуемый материал, полученный нами при вакуумной аспирации содержимого полости матки у беременных женщин, представляет фрагменты ткани элементов плодного яйца и эндометрия различной окраски от серого до темно-красного цвета эластической или губчатой консистенции. После 5-ти недель гестации в первичных ворсинах появляются мезенхимальные клетки, которые формируют вторичные ворсины хориона. В течение недели в мезенхимальных ворсинах появляются зачатки сосудов. Происходит формирование третичных ворсин. С 7 до 10 недель стенка фетального капилляра представлена монослоем формирующих её эндотелиоцитов. На срезе стенка сосуда содержит от 1 до 10 эндотелиальных клеток. При морфометрии толщина стеки капилляра фактически определяется толщиной эндотелиальной клетки. С 10 недели толщина стенки фетального сосуда увеличивается: в структуре стенки появляются перициты - отросчатые клетки соединительной ткани, осуществляющие питание эндотелиоцита, регуляцию его пролиферативной активности и формирующие базальную мембрану капилляра. Таким образом, микросокпическое исследование стенки капилляра хориона в на гестационном сроке 7-10 недель позволяет получить качественную оценку состояния фетальных эндотелиоцитов, а также определить их морфометрические параметры.

Всего исследовано 180 гистологических препаратов ворсинчатого хориона. У каждой пациентки проводилась компьютерная морфометрия 10 сосудов

третичных ворсин хориона плода (рисунок 11). В исследование включались сосуды, в которых отсутствовали перициты, что определяло унификацию метода исследования.

• VI 4

< V11 ГХ ^ V

л I

«л

V

2* Г'*

V-

Рисунок 11 - Сосуд ворсинчатого хориона (10 недель). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 600 х.

В ходе диссертационной работы анализировались следующие морфометрические показатели сосудов ворсинчатого хориона (рисунок 12):

1. Средняя толщина стенки сосуда.

2. Средний диаметр просвета сосуда.

3. Средняя площадь просвета сосуда.

4. Индекс Керногана - соотношение толщины стенки сосуда к диаметру просвета сосуда.

5. Индекс апоптоза эндотелиоцитов - соотношение количества эндотелиоцитов с признаками апоптоза к общему количеству исследованных клеток. Апоптоз в эндотелиальных клетках определялся с помощью сегментации ядерного материала при КММ: фиксировались участки компактизации, маргинации и фрагментации хроматина -морфологический признак апоптоза.

После подготовки препаратов с помощью указанных выше методик проведена микроскопия ворсинчатого хориона в контрольной группе. При описательной микроскопии полученных гистологических препаратов получены следующие результаты (таблица 15).

Рисунок 12 - Сосуд ворсинчатого хориона (8 недель). Морфометрия в программе Leica Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 600 x.

Частота некрозов ткани хориона в препаратах группы контроля составила 6,7% (6 чел.), кровоизлияния в строму третичных ворсин выявлены у 25 человек (27,8%), лейкоцитарная инфильтрация хориона обнаружена у 4 пациенток (4,4%), дистрофия ворсин хориона диагностирована у 7 человек (7,8%), отек стромы хориона зафиксирован у 12 беременных (13,3%).

Таблица 15 - Микросокпическое описание гистологических препаратов

хориона в контрольной группе (n=90).

Параметр Абсолютное значение Частота, %

Некротические изменения 6 6,7

Кровоизлияния 25 27,8

Лейкоцитарная инфильтрация 4 4,4

Дистрофия ворсин 7 7,8

Отек стромы ворсин 12 13,3

Согласно дизайну исследования была проведена компьютерная морфометрия сосудов хориона (таблица 16). Средняя толщина стенки сосуда в группе контроля составила 0,9 мкм. Диапазон колебания данного параметра: 1,25 - 0,67 мкм. Стандартное отклонение ±0,12 мкм.

Таблица 16 - Морфометрия сосудов ворсинчатого хориона у беременных

контрольной группы (п=90).

Параметр Количество измерений Среднее, М Мш Мах Ст. отклонение, ±т

Ср. толщина стенки сосуда, мкм 900 0,9 0,67 1,25 0,12

Средний диаметр просвета сосуда, мкм 900 6,9 4,53 8,92 0,93

Средняя площадь просвета сосуда, мкм2 900 39,8 16,59 63,84 10,96

Индекс Керногана 900 0,06 0,044 0,117 0,017

Индекс апоптоза, % 900 3,9 2 5,7 1,49

Среднее значение диаметра просвета сосуда в группе контроля составило 6,9 мкм. Диапазон колебания: 4,53 - 8,92 мкм. Стандартное отклонение ±0,93 мкм.

Средняя площадь просвета первичного капилляра хориона плода в контрольной группе составила 39,8 мкм2. Диапазон колебания: 16,59 - 63,84 мкм2. Стандартное отклонение ±10,96 мкм2.

Индекс Керногана составил в контрольной группе 0,06. Диапазон колебания индекса Керногана в контрольной группе составил от 0,044 до 0,117. Стандартное отклонение данного параметра составило ±0,017.

Индекс апоптоза эндотелиоцитов составил в контрольной группе 3,9%. Диапазон колебания: 2 - 5,7%, стандартное отклонение ±1,49%.

Структура хориона при несостоявшемся выкидыше имеет свои характерные особенности. Макросокпически материал представляет массы эластической или губчатой структуры темно-красного или серого цвета. На сроке 7 недель часто

можно встретить безсосудистые ворсины. В центарльной зоне третичных ворсин обнаруживаются единичные капилляры, обычно не более двух. В просвете сосудов часто визуализируются ядерные формы эритроцитов (рисунок 13). Можно обнаружить ворсины с отечной стромой, очагами некрозов или склероза, кровоизлияниями и тромбозами.

Рисунок 13 - Сосуд ворсинчатого хориона (10 недель). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 600 х.

В нашей работе при микроскопическом исследовании препаратов ворсинчатого хориона в основной группе некрозы ворсин хориона выявлены у 52 человек (57,8%). Кровоизлияния в строму ворсин обнаружены у 30 человек (33,3%). Лейкоцитарная инфильтрация хориона зафиксирована у 9 беременных основной группы (10%). Дистрофия ворсин хориона выявлена у 46 человек (51,1%). Отек стромы хориона обнаружен у 15 беременных основной группы (16,7%) (таблица 17).

Таблица 17 - Микросокпическое описание гистологических препаратов

хориона в основной группе (п=90).

Параметр Абсолютное значение Частота, %

Некротические изменения 52 57,8

Кровоизлияния 30 33,3

Лейкоцитарная инфильтрация 9 10

Дистрофия ворсин 46 51,1

Отек стромы ворсин 15 16,7

Согласно дизайну исследования была проведена компьютерная морфометрия сосудов хориона (рисунок 14).

Рисунок 14 - Сосуд ворсинчатого хориона (9 недель). Морфометрия в программе Leika Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 600 x.

У каждой пациентки основной группы проведена компьютерная морфометрия 10 сосудов ворсинчатого хориона. Полученные результаты представлены в таблице 18.

Среднее значение толщины стенки сосуда в основной группе исследования составило 0,7 мкм. Диапазон колебания: 0,48-0,99 мкм. Стандартное отклонение ±0,12 мкм.

Среднее значение диаметра просвета сосуда составило 6,73 мкм. Диапазон колебания показателя: 5,76-6,42 мкм. Стандартное отклонение ±0,38 мкм.

Среднее значение площади просвета сосуда составило 36,1 мкм2 в основной группе. Диапазон колебания: 22,97 мкм2-51,68 мкм2. Стандартное отклонение ±4,62 мкм2.

Среднее значение индекса Керогана сосудов хориона составило в основной группе 0,05. Диапазон колебания: 0,036-0,073. Стандартное отклонение ±0,008.

Индекс апопоптоза эндотелиоцитов в стенке сосудов ворсинчатого хориона в основной группе исследования составил 7,1%. Диапазон колебания 2,5-11,4%. Стандартное отклонение ±2,49%.

Таблица 18. Морфометрия сосудов ворсинчатого хориона у беременных

основной группы (п=90).

Параметр КММ Количество измерений Среднее, М Мт Мах Ст. отклонение, ±т

Ср. толщина стенки сосуда, мкм 900 0,7 0,48 0,99 0,12

Средний диаметр просвета сосуда, мкм 900 6,73 5,76 6,42 0,38

Средняя площадь просвета сосуда, мкм2 900 36,1 22,97 51,68 4,62

Индекс Керногана 900 0,05 0,036 0,073 0,008

Индекс апоптоза, % 900 7,1 2,5 11,4 2,49

Таким образом, при описании микроскопических препаратов ворсинчатого хориона в исследуемых группах получены достоверные отличия исследуемых признаков. Расчет проводился с помощью параметрического критерия Стьюдента (таблица 19).

Некротические изменения в ворсинах хориона выявлены в основной группе исследования с частотой статистически достоверно превышающей значение аналогичного показателя группы контроля ф<0,0001; t=8,76). Дистрофия ворсин хориона также значительно чаще встречалась в основной группе (р<0,0001; t=7,24). Остальные показатели также были выше в группе невынашивания беременности.

Таблица 19 - Сравнительная характеристика микросокпических параметры ворсинчатого хориона в исследуемых группах (N=180).

Группа

Показатель Основная ( п=90) Контрольная (п=90) Уровень р

абс. % абс. %

Некротические изменения 52 57,8 6 6,7 <0,0001

Кровоизлияния 30 33,3 25 27,8 >0,05

Лейкоцитарная инфильтрация 9 10 4 4,4 >0,05

Дистрофия ворсин 46 51,1 7 7,8 <0,0001

Отек стромы ворсин 15 16,7 12 13,3 >0,05

При проведении КММ мы также получили в исследуемых группах статистически достоверные отличия. Расчет проводился с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (таблица 20).

Таблица 20 - Морфометрическая оценка сосудов ворсинчатого хориона на сроке 7-10 недель.

Показатель Группа Уровень р

Основная (п=90) Контрольная (п=90)

Средняя толщина сосуда, мкм 0,7±0,11 0,9±0,12 <0,0001

Средний диаметр сосуда, мкм 6,7±0,38 6,9±0,93 <0,05

Средняя площадь сосуда, мкм2 36,1±4,62 39,8±10,96 <0,05

Индекс Керногана 0,05±0,008 0,06±0,017 <0,0001

Индекс апоптоза эндотелиоцитов, % 7,1±2,49 3,9±1,49 <0,0001

Среднее значение толщины стенки первичного сосуда составило 0,7±0,11 мкм у беременных основной группы и 0,9±0,12 мкм в группе контроля (р<0,0001) (рисунок 15).

Рисунок 15 - Средняя толщина стенки сосуда ворсинчатого хориона в

исследуемых группах.

При этом параметры среднего диаметра просвета сосуда и средней площади просвета сосуда были практически идентичны в группах исследования, что свидетельствует об унификации используемой методики подбора калибра первичных фетальных капилляров в проводимом исследовании.

Среднее значение диаметра просвета капилляра составило 6,7±0,38 мкм в основной группе и 6,9±0,93 в группе контроля (р<0,05) (рисунок 16).

Рисунок 16 - Средний диаметр просвета сосуда в исследуемых группах.

Среднее значение площади сосудов хориальных ворсин составило 36,1±4,62 мкм2 в основной группе исследования, и 39,8±10,96 мкм2 в группе контроля (р<0,05) (рисунок 17).

Рисунок 17 - Средняя площадь сосуда ворсинчатого хориона в

исследуемых группах.

Индекс Керногана также показал статистически достоверное отличие в исследуемых группах: этот параметр в основной группе составил 0,05±0,008 и 0,06±0,017 в группе контроля (р<0,0001) (рисунок 18).

0,14 0,12

ÜÜ 0,1 о

^ 0,06

л

S

0,04 0,02 J

Основная

Контрольная

Группа

■S 0,08

Риунок 18 - Индекс Керногана сосудов ворсинчатого хориона в исследуемых

группах.

Индекс апоптоза эндотелиоцитов в основной группе исследования был в 2 раза выше аналогичного параметра группы контроля. В группе с неразвивающейся беременностью значение этого параметра составило 7,1±2,49%, в группе с физиологическим течением беременности 3,8±1,49% (р<0,0001) (рисунок 19).

о

о

<и

15 12,5 10 7,5 5 2,5 0

Основная

Контрольная

Группа

Рисунок 19 - Индекс апоптоза эндотелиоцитов в сосудах ворсинчатого

хориона в исследуемых группах.

Таким образом, в исследовании установлены референтные параметры КММ сосудов ворсинчатого хориона при неосложненном течении беременности. Критерий включения срока гестации от 7 до 10 недель позволил косвенно оценить морофометрические параметры фетальных эндотелиоцитов, определить диапазон их референтных значений. Рассчитаны морфометрические параметры первичных сосудов хориона при несостоявшемся выкидыше. Полученные микросокпические параметры хориальной ткани продемонстрировали достоверные отличия в исследуемых группах. Сравнительный анализ параметров морфометрии сосудов хориона плода показал, что большинство изученных показателей были статистически выше в контрольной группе. Индекс апоптоза эндотелиоцитов, наоборот, был выше в группе с неразвивающейся беременностью. Статистическая достоверность отличий большинства изученных значений позволяет утверждать, что отклонение морфометрических параметров сосудов ворсинчатого хориона

может рассматриваться в качестве маркера патологических изменений в формирующемся фетоплацентарном комплексе, а их исследование правомочно в русле изучения сосудистых нарушений у беременных.

3.4. Биохимическая диагностика эндотелиальной дисфункции

В сравниваемых группах участниц I этапа исследования осуществлено определение биохимических маркеров дисфункции эндотиелия. Мы использовали показатели, наиболее доступные в лабораторной практике и объективно отражающие изменения в функциональном состоянии эндотелия. Данный этап исследовательской работы позволил нам оценить достоверность используемых морфометрических параметров ДЭК, а также проанализировать их корреляцию с традиционными маркерами эндотелиальной дисфункции.

Наиболее достоверными и достаточно доступными в практике лабораторными показателями изучаемой патологии были выбраны:

1) Высокочувствительный С-реактивный белок (ИбСЯР) сыворотки крови.

2) Фактор фон Виллебранда (vWf) сыворотки крови.

3) Микроальбуминурия (МАУ).

4) Белок апоптоза р53 сыворотки крови - единственный параметр в нашем исследовании, который не относят к общепринятым маркерам нарушения функции эндотелия, нами был использован в целях патогенетического обоснования разрабатываемой диагностической технологии.

В контрольной группе в данное обследование вошло 18 человек (таблица 21). Средний показатель ИбСЯР в сыворотке крови составил 1,8 мг/мл. Диапазон колебания: 0,2 - 4,8 мг/мл. Стандартное отклонение ±0,84 мг/мл.

Концентрация vWf в сыворотке крови составила в группе контроля 101,6%. Диапазон колебания: 98,5 - 12,6%. Стандартное отклонение ±9,47%.

Средний показатель МАУ группе контроля 0,01 мкг/мл. Диапазон колебания: 0-0,03 мг/мл, стандартное отклонение±0,006 мкг/мл

Коцентрация белка апоптоза р53 в плазме периферической крови у женщин с физиологическим течением I триместра беременности составил 0,003 Ед/мл. Диапазон колебания данного показателя: 0,001 - 0,01 Ед/мл. Стандартное отклонение концентрации р53 в сыворотке крови составило 0,0013 Ед/мл*. Таблица 21 - Биохимические маркеры функции эндотелия у беременных

контрольной группы.

Параметр Количество измерений Среднее, М Мах Min Ст. отклонение, ±m

hsCRP, мг/мл 18 1,8 4,8 0,2 0,84

vWf (%) 18 101,6 112,6 98,5 9,47

МАУ (мкг/мл) 18 0,01 0,03 0 0,006

Белок р53 (Ед/мл) 18 0,003 0,01 0,001 0,0013

В основной группе показатели состояния эндотелия оценены у 33 беременных. Средний показатель ИбСЯР 3,3 мг/мл, диапазон колебания: 0,4 - 10,3 мг/мл, стандартное отклонение ±2,12 мг/мл.

Измерение фактора vWf продемонстрировало средний результат 120,0%. Диапазон колебания: 97,5% - 165,8%, стандартное отклонение ±20,18%.

При исследовании уровня МАУ у беременных основной группы получен средний показатель 0,02 мкг/мл, диапазон колебания: 0,01 - 0,04 мкг/мл, стандартное отклонение этого показателя составил ±0,011 мкг/мл.

Коцентрация белка р53 в сыворотке крови у женщин несостоявшимся выкидышем в I триместре беременности составил 0,01 ±0,016 Ед/мл. Диапазон колебания данного показателя 0,011 - 0,069 Ед/мл. Стандартное отклонение ±0,011 Ед/мл . Результаты исследования внесены в таблицу 22.

* Данные опубликованы в статьях - Оценка степени тяжести эндотелиальной дисфункции при осложнениях беременности /А.В.Миронов, А.М.Торчинов, М.М.Умаханова и др.//Трудный пациент. - 2018. - Т.16, №8-9. - С. 30-36. 12; Миронов, А.В., Умаханова, М.М., Жукоцкий, А.В. Морфометрия десквамированных эндотелиоцитов в диагностике эндотелиальной дисфункции у беременных//Современная наука: актуальные проблемы теории и практики. Серия «Естественные и технические науки». - 2019. - №7. - С.158-164.

Таблица 22 - Биохимические маркеры функции эндотелия у беременных основной группы.

Параметр Количество измерений Среднее, М Мах Мт +т

С-реактивный белок, мг/мл 33 3,3 10,3 0,4 2,12

Фактор фон Виллебранда (%) 33 120,0 165,8 97,5 20,18

М/альбуминурия (мкг/мл) 33 0,02 0,04 0,01 0,011

Белок р53 (Ед/мл) 33 0,01 0,069 0 0,011

Таким образом, при изучении биохимических маркеров нарушения функции эндотелия продемонстрировано увеличение всех изучаемых показателей сыворотки крови и мочи в основной группе. Результаты сравнения представлены в таблице 23. Расчет достоверности различий исследуемых признаков проведен с помощью критерия Манна-Уитни.

Таблица 23 - Сравнительная характеристика биохимических параметров в

исследуемых группах

Показатель Группа Уровень р

Основная (п=33) Контрольная (п=18)

С-реактивный белок, мг/мл 3,3±2,12 1,8±0,84 0,0056

Фактор фон Виллебранада,% 120,0±20,18 101,6±9,47 0,0005

Микроальбуминурия, мкг/мл 0,02±0,011 0,01±0,006 0,0003

Белок р53, Ед/мл 0,01±0,011 0,003±0,0013 0,0009

Средний показатель ИбСКР составил 3,3± 2,12 мг/мл у участнипков основной группы, и 1,8± 0,84 мг/мл - в группе контроля (р=0,0056) (рисунок 20).

12,5

10

I 7,5

О)

5

а) 2,5 о.

"Г

Основная

Контрольная

Группа

Рисунок 20 - Высокчувствительный С-реактвиный белок в исследуемых

группах.

Средний показатель vWf у женщин основной группы исследования также превысил аналогичный показатель группы контроля: 120,0±20,18% в группе пациенток с несостоявшимся выкидышем и 101,6±9,47% - в группе женщин с физиологическим течением бееременности (р=0,0005) (рисунок 21).

180

160

ГО

а 140 ю

ш ц

1 120 т

I

£ 100

а о

* 80 го в

60

Основная

Контрольная

Группа

Рисунок 21 - Фактор фон Виллебранда в исследуемых группах.

0

Средний показатель МАУ в основной группе почти в 2 раза превысил соответствующее значение группы контроля: в группе женщин с неразвивающейся беременностью среднее значение этого параметра составило

0,02±0,011 мкг/мл, и 0,01±0,006 мкг/мл - в группе контроля (р=0,003) (рисунок 22).

0,05

0,04

о. 0,03

& 0,02 .о

с;

пз

а. 0,01

0

Основная

Контрольная

Группа

Рисунок 22 - Микроальбуминурия в исследуемых группах.

Среднее значение концентрации в сыворотке крови белка апоптоза р53 в основной группе исследования составило 0,01±0,011Ед/мл, и 0,003 ± 0,0013 Ед/мл в группе контроля (р=0,009) (рисунок 23).

0,09 -

0,075

| °,°6--

ш

Д 0,045 ср

эс

° 0,03 01 ш

0,015

0 ^

Основная

Группа

Рисунок 23 - Белок апоптоза р53 в исследуемых группах.

т

Контрольная

Таким образом, осуществлен анализ традиционных биохимических маркеров дисфункции эндотелия - высокочувствительного С-реактвиного белка, фактора фон Виллебранда и микроальбуминурии, а также маркера апоптоза -

белка р53. Результаты исследования продемонстрировали статистическую достоверность отличия изученных морфометрических значений в сравниваемых группах. У пациенток с неразвивающейся беременностью зафиксировано повышение традиционных биохимических маркеров нарушения функции эндотелия - концентрации в сыворотке крови высокочувствительного С-реактивного белка, фактора фон Виллебранада, а также микроальбуминурии. Увеличение в сыворотке крови уровня белка р53 в группе участниц с неразвивающейся беременностью подтверждает участие апоптоза в патогенезе изучаемой патологии. Проведенное исследование биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции демонстрирует участие эндотелиальной дисфункции в инициации процессов нарушения гестации, а также актуализирует изучение нарушения функции эндотелия в ракурсе поиска новых перспектив снижения материнской и перинатальной заболеваемости.

ГЛАВА IV. СРЕДНИЙ ЭКВИВАЛЕНТНЫЙ ДИАМЕТР ДЕСКВАМИРОВАННЫХ ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ В ДИАГНОСТИКЕ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ У БЕРЕМЕННЫХ

Апоптоз является основным механизмом деструкции эндотелиальных клеток [23; 71; 101]. Морфологические признаки апоптоза связаны с изменением геометрических параметров клетки: уменьшается объем цитоплазмы, клетка фрагментируется, образутся апоптозные тельца. В случае высокого уровня повреждения эндотелиоцитов, большая часть ДЭК выявляется при микроскопии в стадии блеббинга, что проявляется значительным снижением показателей морфометрии измененных клеток.

В проводимом исследовании продемонстрировано статистически достоверное уменьшение морфометрических параметров ДЭК в основной группе. Все изученные геометрические параметры циркулирующих ДЭК: средний эквивалентный диаметр, средний периметр, средняя площадь, поляризация и фактор формы ДЭК продемонстрировали меньшие значения, чем аналогичные показатели контрольной группы. В нашем исследовании при компьютерной морфометрии препаратов десквамированных эндотелиоцитов сегментация позволяла выделять оптические области ядер, в которых регистрировались признаки апоптоза клетки: компактизация, фрагментация и маргинация хроматина (рисунки 24а-24г).

а)

б)

в)

г)

Рисунки 24а-24г - ДЭК в камере Горяева. Окраска метиленовый синий. Стрелками указаны скопления конденсированного хроматина. Увеличение

600х.

В группе с несостоявшимся выкидышем выявлены более высокие показатели изученных в исследовании биомаркеров апоптоза. Так, индекс апоптоза эндотелиоцитов сосудов ворсинчатого хориона плода в группе пациенток с несостоявшимся выкидышем превысил аналогичный показатель группы женщин с физиологическим течением беременности почти в 2 раза: в основной группе этот параметр составил 7,1±2,49%, в группе контроля 3,9±1,49% (р<0,0001). Также в работе показано увеличение концентрации в сыворотке крови белка апоптоза р53 у участниц основной группы: концентрация белка р53 в плазме крои у беременных основной группы исследования составила 0,01±0,011 Ед/мл и 0,003±0,0013 Ед/мл в группе контроля (р= 0,009).

Объем полученных данных позволил систематизировать разработанные морфометрические параметры, полученные при витальной компьютерной морфометрии ДЭК. В основу диагностической технологии был положен показатель среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК), как информативный и достаточно простой в определении морфометрический параметр поражения эндотелия (рисунки 25а-25г).

а)

б)

в) г)

Рисунки 25а-25г - ДЭК в камере Горяева. Окраска метиленовый

синий. Увеличение 600 х.

В группе участниц с физиологическим течением беременности параметр СДДЭК в I триместре составил 43,9 ±3,99 мкм, у беременных с несостоявшимся выкидышем этот показатель составил 29,5 ±9,40 мкм (р<0,0001).

С целью проверки применяемой гипотезы о достоверности параметра среднего эквивалентного диаметра ДЭК в оценке нарушения функции эндотелия были проанализированы корреляционные связи между новым морфометрическим

показателем и общепринятыми маркерами дисфункции эндотелия. Анализ осуществлялся с помощью метода ранговой корреляции Спирмена.

Проанализирована связь между традиционным цитологическим маркером эндотелиальной дисфункции - количеством ДЭК (J.Hladovec с соавт., 1978 г), и разработанным нами параметром СДДЭК. Анализ проводился для основной группы, так как разброс значений переменной в ней был существенно выше, чем в группе контроля. Расчет коэффициента Спирмена обнаружил высокую силу корреляции между сравниваемыми параметрами. Статистический анализ продемонстрировал сильную обратную связь между количеством ДЭК и их средним диаметром: - 0,95. Иными словами, при повышении количества ДЭК в периферической крови их средний эквивалентный диаметр уменьшается. Диаграмма распределения значений количества ДЭК и среднего диаметра ДЭК представлена на рисунке 26.

Рисунок 26 - Диаграмма линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и среднего количества ДЭК (КДЭК).

Проанализированы корреляционные отношения между СДДЭК и биохимическими маркерами дисфункции эндотелия. Уровень концентрации в сыворотке крови hsCRP продемонстрировал сильную отрицательную связь с СДДЭК ъ= - 0,91. Коэффициент Спирмена МАУ и СДДЭК составил ъ= - 0,72. Коэффициент корреляции vWf и СДДЭК продемонстрировал результат - 0,69. Диаграммы корреляционных связей СДДЭК и исследованных биохимических параметров продемонстрированы на рисунках 27-30.

hsCRP, мг/мл

Рисунок 27 - Диаграмма линейной корреляции СДДЭК и концентарции

ЬэСЯР в сыворотке крови.

vWf, %

Рисунок 28 - Диаграмма линейной корреляции СДДЭК и концентрации vWf

в сыворотке крови.

МАУ, мкг/мл

Рисунок 29 - Диаграмма линейной корреляции СДДЭК и МАУ.

Белок р53, мг/мл

Рисунок 30 - Диаграмма линейной корреляции СДДЭК и концентрации в