Кинетика электрогенного транспорта двухвалентных катионов в митохондриях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Каспаринский, Феликс Освальдович

• Каспаринский, Феликс Освальдович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каспаринский, Феликс Освальдович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Роль митохондрий в метаболизме кальция.

1.1 Участие ионов кальция в регулировании метаболизма.

1.2 Контроль распределения внутриклеточного кальция.

1.3 Проведение кальциевого сигнала из цитозоля в матрикс митохондрий.

2. Электрогенный транспорт двухвалентных катионов в митохондриях.

2.1 Молекулярный механизм транспорта Ме2*.

2.2 Движущая сила аккумуляции Ме2* в митохондриях.

2.3 Кальциевая емкость митохондрий.

2.4 Контроль трансмембранного распределения Ме2*.

2.5 Кинетика транспорта Ме2*.

2.5.1 К(,5 иУШ1 транспорта Ме2+.

2.5.2 Кинетика насыщения начальных скоростей транспорта Ме2+.

2.5.3 Аллостерическая активация транспорта двухвалентных катионов.

2.5.4 «Быстрое поглощение Са2+».

2.5.5 Субстратная специфичность Са2+-унипортера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

2. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ.

2.1 Очистка реакционных сред от примесного Са2*.

2.1.1 Подготовка смолы АтЬег1ке Ш.С-718 к работе.

2.1.2 Приготовление ионообменных колонок со смолой АшЬегШе Ш.С-718.

2.1.3 Использование ионообменных колонок со смолой АтЬегШе 111С-718.

2.2 Получение препаратов изолированных митохондрий из печени крысы.

2.2.1 Стандартная процедура выделения митохондрий.

2.2.2 Модификации стандартной процедуры выделения митохондрий.

2.2.2.1 Поиск способа уменьшения содержания Са2+ в препаратах митохондрий.

2.2.2.2 Процедура получения препаратов митохондрий с низким содержанием Са2+.

3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.1 Определение концентрации ионов М^* и Са2* и Мп2* в стандартных растворах MgCl2, СаС12и МпС12 методом комплексонометрического титрования.

3.1.1 Титрование раствора М^СЬ с кальмагитом или эриохромом черным Т.

3.1.2 Титрование растворов СаСЬ и МпСЬ с кальконом.

3.2 Оценка концентраций Са2* в средах и содержания Са2* в митохондриях.

3.3 Регистрация митохондриалъного транспорта Ме?*.

3.4 Регистрация изменений мембранного потенциала митохондрий.

3.5 Измерение скорости дыхания митохондрий.

3.6 Определение концентрации белка митохондрий.

4. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ.

4.1 Среды.'.

4.1.1 Среда выделения.

4.1.2 Среда промывки.

4.1.3 Среда измерений.

4.2 Ме2*-зависимая активация митохондриалъного транспорта Ме2*.

4.2.1 Активация Са2+-унипортера в густой суспензии митохондрий.

4.2.2 Активация транспорта Ме2+ в среде измерений.

4.3 Деактивация митохондриалъного транспорта Ме2*.

4.3.1 Деактивация Са2~-унипортера в густой суспензии митохондрий.

4.3.2 Деактивация Са2+-унипортера митохондрий в среде измерений.

4.4 Концентрация митохондрий в среде измерений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Влияние внутримитохондриального Са2" на активность Са2+-унипортера.

2. Ме2+-зависимая активация Са2+-унипортера с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны.

2.1 Кинетика Са2*-зависимой активации транспорта Са2*.

2.2 Специфичность активации Ссг*-унипортера двухвалентными катионами.

2.3 Влияние температуры на активацию Са2*-унипортера.

3. Кинетика транспорта двухвалентных катионов.

3.1 Начальная скорость транспорта Ме2*.

3.2 Влияние Са2*-зависимой активации Са2*-унипортера на кажущийся порядок транспортной реакции.

3.3 Кинетика насыщения скоростей транспорта Ме2*.

3.4 Специфичность транспорта двухвалентных катионов.

4. Обратимость активации Са2+-унипортера.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетика электрогенного транспорта двухвалентных катионов в митохондриях»

Ионы Са2+ являются одним из универсальных регуляторов энергетического метаболизма и могут служить проводниками сигналов из цитозоля в матрикс митохондрий. К настоящему времени известно, что поглощение Са2+ является инвариантной функцией митохондрий позвоночных, а также растений, грибов и простейших. Это указывает на исключительную важность митохондриального транспорта Са2+ для поддержания жизнедеятельности организмов. Низкоамплитудные Са2+-сигналы (до 300 нМ), не сопровождающиеся значительным увеличением Са2+-нагрузки клеток (до 5 нмоль/мг сухого веса клетки), по-видимому, активируют Са2+-транспортирующие системы плазмалеммы и эндоплазматического ретикулума. При появлении высокоамплитудных и/или продолжительных Са2+-волн в цитозоле Са2+-сигнал передается внутрь митохондрий, что приводит к активации окислительного метаболизма и обеспечивает защиту от перегрузки цитозоля ионами Са2+. Исследование кинетики митохондриального транспорта Са2+ необходимо для понимания механизма, обеспечивающего амплитудно-частотную селективность проведения Са2+-сигналов из цитозоля в митохондриальный матрикс.

Перенос Са2+ по электрохимическому градиенту через внутреннюю мембрану митохондрий обеспечивает так называемый Са2+-унипортер, чувствительный к катионам лантанидов и рутениевому красному. Несмотря на то, что поглощение Са2+ в митохондрии из разных источников изучается уже около полувека, молекулярная структура унипортера до сих пор не установлена, а кинетические параметры транспорта по данным разных лабораторий сильно варьируют и часто

Введение противоречивы. Систематическое исследование кинетики транспорта Са2+ митохондриями было начато в начале 70-х годов. В 1971 г. Бигрейв, Рид и Спенсер, используя измерения накопления 45Са2+ в митохондрии печени, обнаружили «кооперативную» зависимость скорости транспорта от его концентрации. Два года спустя Виноградов и Скарпа провели детальный анализ кинетики накопления Са2+ и Мп2+ в митохондрии печени при помощи быстро-регистрирующей фотометрии с применением непроникающего в матрикс металлохромного индикатора мурексида. Ими было показано, что начальные скорости поглощения Са2+ и Мп2+ в митохондрии сигмоидально зависят от концентрации этих катионов. Было установлено, что сигмоидная кинетика транспорта Мп2+ исчезает после кратковременной преинкубации митохондрий с небольшими концентрациями Са2+. Авторы впервые предложили кинетическую модель функционирования унипортера, согласно которой переносчик функционально активен при связывании двух ионов переносимого катиона. С 1973 г. в литературе было опубликовано множество работ, в которых кинетические параметры транспорта (кажущаяся величина «Кт» и значения максимальных скоростей) и само существование кооперативности варьировали в очень широких пределах. В качестве причин кинетической изменчивости авторы рассматривали зависимость транспорта Са2+ от генерации ДЧ7, компенсации АрН, ионной силы окружающей среды а также присутствия активаторов и ингибиторов. Однако ни одна из предложенных моделей не позволяла непротиворечиво объяснить наблюдаемый в ряде случаев переход от сигмоидной кинетики митохондриального транспорта катионов к гиперболической.

Введение

В 1986 г. Лейкиным и Гонсальвес с использованием изотопного и спектрофотометрического методов регистрации было показано, что удаление Са2+ из внешней среды приводит к ингибированию выхода предварительно накопленного Са2+ из разобщенных митохондрий. В это же время Крёнер независимо показал, что продолжительная инкубация деэнергизованных митохондрий печени с ионами Са2+ ускоряет поглощение 45Са2+ в митохондрии после их энергизации. Из этих наблюдений логически следовало, что для функционирования унипортера необходимо специфическое связывание «активирующего» катиона - вывод, хорошо соответствующий модели кооперативного переноса Са2+ через внутреннюю мембрану митохондрий, ранее предложенной Виноградовым и Скарпа. Кинетика активации унипортера охарактеризована не была, хотя отдельные факты указывают на то, что эта реакция протекает медленно и обладает катионной специфичностью. Известные из литературы гипотезы о понижении энергии активации транспорта или увеличении канальной проводимости после насыщения «активирующих» центров позволяют объяснить лишь часть известных фактов. Таким образом, ни механизм Са2+-зависимой активации транспорта Са2+, ни его физиологическая значимость до настоящего времени оставались неизвестными.

Мы предположили, что катионная и амплитудно-частотная селективность Са2+-унипортера обеспечиваются тем же механизмом, который обусловливает появление кооперативности поглощения Ме2+, а именно интерференцией кинетики транспорта и его активации. Таким образом, основой диссертационной работы стал кинетический анализ взаимодействия митохондриального транспорта двухвалентных катионов и его активации.

Введение

В разделе «Обзор литературы», состоящем из двух частей, мы рассматриваем, каким образом кинетика митохондриального транспорта Са2+ определяет роль этого процесса в метаболизме клетки. В первой части раздела «Обзор литературы» перечислены основные способы регулирования внеклеточной и внутриклеточной концентрации Са2+ и обозначено место митохондрий в иерархии систем, участвующих в Са2+-сигнализации. Принимая во внимание ограниченный объем диссертационной работы, мы позволили себе ограничиться лишь узкими рамками при рассмотрении такой безбрежной темы, как метаболизм Са2+ и его роль в регулировании клеточных процессов. Вторая часть обзора литературы посвящена особенностям электрогенного транспорта Са2+ в митохондриях.

Раздел «Материалы и методы» состоит из четырех частей. В первых трех частях описаны применявшиеся в работе материалы и известные из литературы препаративные и аналитические методы исследования, а также разработанные нами способы модификации традиционных процедур. В частности, обсуждаются способы очистки инкубационных сред от примесного Са2+ и модификации процедуры выделения митохондрий печени крысы, которые позволяют получать сопряженные митохондрии с заданным количеством эндогенного Са2+. Четвертую часть раздела «Материалы и методы» мы посвятили способам оптимизации экспериментальных условий, без применения которых выполнение настоящей работы оказалось бы невозможным. Аргументирован перечень ингредиентов используемых в работе сред, а также рассмотрены преимущества и недостатки известных из литературы и предложенных нами способов активации и деактивации Са2+-унипортера митохондрий.

Введение

Раздел «Результаты исследования» состоит из четырех глав (частей). Первая часть посвящена исследованию влияния внутримитохондриального Са2+ на активность Са2+-унипортера. Полученные результаты указывают на асимметричность Са2+-зависимого регулирования унипортера относительно внутренней мембраны митохондрий. Во второй главе описано проанализирована и количественно описана кинетика активации унипортера ионами Са2+, 8г2+ и Ва2+. В третьей главе количественно охарактеризована кинетика транспорта Са2+, Бг2* и Ва2+ , а также ее вариации, обусловленные изменениями активности унипортера. Особое внимание уделено зависимости начальных скоростей транспорта катионов и их специфичности от активации унипортера. В четвертой главе показано, что активационные изменения кинетики транспорта Са2+ полностью обратимы и приведены количественные характеристики деактивации Са2+-унипортера.

В разделе «Обсуждение результатов» предложена кинетическая модель кооперативности между электрогенным транспортом Са2+ и его медленной активацией. Проведен анализ соответствия предлагаемой кинетической модели полученным нами и известным из литературы экспериментальным фактам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Каспаринский, Феликс Освальдович

выводы

1. Предложена модификация процедуры получения интактных митохондрий из печени крысы методом дифференциального центрифугирования, позволяющая снизить содержание эндогенного Са2+ до 0.5 нмоль/мг белка.

2. Исследовано взаимодействие кинетики активации Са2+-унипортера митохондрий в присутствии Са2+, 8г2+ и Мп2+ и транспорта перечисленных двухвалентных катионов. Определены величины кажущихся констант диссоциации комплексов Са2+, 8г2+ и Мп2+ из активационных и транспортных центров Са2+-унипортера митохондрий. Соотношение этих констант указывает на то, что ряд специфичности транспорта катионов формируется в большей степени на стадии активации, и в меньшей - при транслокации.

3. Активационный центр Са2+-унипортера обращен в межмембранное пространство и связывает не менее двух ионов Ме2+. Активация унипортера заключается в его медленном переходе из неактивной формы в активную и происходит независимо от энергизации митохондрий в соответствии с кинетикой обратимых реакций псевдопервого порядка. При отсутствии предварительной активации унипортера начальная скорость транспорта Ме2+ в митохондрии равна нулю.

4. Кажущиеся константы скорости активированного транспорта более чем на порядок превышают наблюдаемые константы скорости его активации в присутствии физиологических концентраций Ме2+. Такое соотношение констант скорости реакций приводит к искажению кинетики транспорта при условии его одновременной активации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Каспаринский, Феликс Освальдович, 2000 год

1. Предложена модель предполагаемого механизма кинетической кооперативности электрогенного транспорта двухвалентных катионов и его медленной активации.1. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2. Affolter, H. and Carafoli, E. (1981) Hyperbolic kinetics of the electrophoretic carrier of Ca2+ uptake in liver mitochondria. Eur.J.Biochem., 119, 199-201.

3. Akerman, K.E. and Nicholls, D.G. (1981) Ca2+ transport by intact synaptosomes: the voltage-dependent Ca2+ channel and re-evaluation of the role of Na+/Ca2+ exchange. Eur.J.Biochem., 117, 491-497.

4. Akerman, K.E.O. (1977) Effect of cations on the temperature sensitivity of Ca2+ transport in rat-liver mitochondria and safranine uptake by liposomes. J.Bioenerg.Biomembr., 141-149.

5. Akerman, K.E.O. (1977) Effect of Mg2+ and spermine on the kinetics of Ca2+ transport in rat-liver mitochondria. J.Bioenerg.Biomembr., 9, 65-72.

6. Akerman, K.E.O. (1978) Changes in membrane potential during calcium ion influx and efflux across the mitochondrial membrane. Biochim.Biophys.Acta, 502, 359-366.

7. Akerman, K.E.O. and Wikstrom, M.K.F. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Lett., 68, 191-197.

8. Akerman, K.E.O., Wikstrom, M.K.F. and Saris, N.-E.L. (1977) Effect of inhibitors on the sigmoidicity of Ca2+ ion transport. FEBS Lett., 78, 32-36.

9. Akerman, K.E.O., Wikstrom, M.K.F. and Saris, N.-E.L. (1977) Effect of inhibitors on the sigmoidicity of the calcium ion transport kinetics in rat liver mitochondria. Biochim.Biophys.Acta, 464, 287-294.

10. Allshire, A., Bernardi, P. and Saris, N.-E.L. (1985) Manganese stimulatescalcium flux through the mitochondrial uniporter. Biochim.Biophys.Acta, 807, 202-209.

11. Azzi, A. and Azzone, G.F. (1966) Swelling and shrinkage phenomena in liver mitochondria. 3. Irreversible swelling induced by inorganic phosphate and Ca2+. Biochim.Biophys.Acta, 113, 438-444.1. Список литературы

12. Babcock, D.F., Herrington, J., Goodwin, P.С., Park, Y.B. and Hille, B. (1997)

13. Mitochondrial participation in the intracellular Ca2+ network. J.Cell Biol., 136, 833-844.

14. Bazhenova, E.N., Deryabina, Y.I., Eriksson, O., Zvyagilskaya, R.A. and Saris,

15. N.E. (1998) Characterization of a high capacity calcium transport system in mitochondria of the yeast Endomyces magnusii. J.Biol.Chem., 273, 43724377.

16. Bazhenova, E.N., Saris, N.E. and Zvyagilskaya, R.A. (1998) Stimulation of theyeast mitochondrial calcium uniporter by hypotonicity and by ruthenium red. Biochim.Biophys.Acta, 1371, 96-100.

17. Becker, G.L. (1980) Steady state regulation of extramitochondrial Ca2+ by ratliver mitochondria: effects of Mg2+ and ATP. Biochim.Biophys.Acta, 591, 234239.

18. Behan, A.R., Krall, A.R. and Dogherty, W.S. (1985) Localization and hypotonicextraction of ruthenium-red-staining substances in mitochondria. Biochem. Soc. Trans., 13, 468-469.

19. Bernardi, P. (1984) Modulation of Ca2+ efflux and rebounding Ca2+ transport inrat liver mitochondria. Biochim.Biophys.Acta, 766, 277-282.

20. Bernardi, P. (1996) The permeability transition pore. Control points of acyclosporin A- sensitive mitochondrial channel involved in cell death. Biochim.Biophys.Acta, 1275, 5-9.

21. Bernardi, P. (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers,and permeability transition. Physiol.Rev., 79, 1127-1155.

22. Bernardi, P. and Azzone, G.F. (1983) Regulation of Ca2+ efflux in rat livermitochondria. Role of membrane potential. Eur.J.Biochem., 134, 377-383.

23. Bernardi, P., Colonna, R., Costantini, P., Eriksson, O., Fontaine, E., Ichas, F.,

24. Massari, S., Nicolli, A., Petronilli, V. and Scorrano, L. (1998) The mitochondrial permeability transition. Biofactors, 8, 273-281.

25. Bernardi, P., Paradisi, V., Pozzan, T. and Azzone, G.F. (1984b) Pathway foruncoupler-induced calcium efflux in rat liver mitochondria: Inhibition by ruthenium red. Biochemistry, 23, 1645-1651.

26. Bernardi, P. and Pietrobon, D. (1982) On the nature of Pi-induced, Mg2+ -prevented Ca2+ release in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 139(1), 9-12.

27. Bielawski, J. and Lehninger, A.L. (1966) Stoichiometric relationships in mitochondrial accumulation of calcium and phosphate supported by hydrolysis of adenosine triphosphate. J.Biol.Chem., 241, 4316-4322.

28. Blaich, G., Krell, H., Tafler, M. and Pfaff, E. (1984) On the state of calcium ions in isolated rat liver mitochondria. II. Effects of phosphate and pH on Ca2+-induced Ca2+ release. Hoppe Seylers.Z.Physiol. Chem., 365, 73-82.

29. Borle, A.B. (1975) Regulation of cellular calcium metabolism and calcium transport by calcitonin. J.Membr.Biol., 21, 125-146.

30. Bowser, D.N., Minamikawa, Т., Nagley, P. and Williams, D.A. (1998) Role of mitochondria in calcium regulation of spontaneously contracting cardiac muscle cells. Biophys.J., 75, 2004-2014.

31. Bragadin, M., Pozzan, T. and Azzone, G.F. (1979a) Activation energies and enthalpies during Ca2+ transport in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 104, 347-351.

32. Bragadin, M., Pozzan, T. and Azzone, G.F. (1979b) Kinetics of Ca2+ carrier in rat liver mitochondria. Biochemistry, 18, 5972-5978.

33. Bremel, R.D. and Weber, A. (1975) Calcium binding to rabbit skeletal myosin under physiological conditions. Biochim.Biophys.Acta, 376, 366-374.

34. Brierley, G.P., Davis, M. and Jung, D.W. (1987) Respiration-dependent uptake and extrusion of Mg2+ by isolated heart mitochondria. Arch.Biochem.Biophys., 253, 322-332.

35. Brini, M. and Carafoli, E. (2000) Calcium signalling: a historical account, recent developments and future perspectives. Cell Mol.Life Sci., 57, 354-370.

36. Broekemeier, K.M., Dempsey, M.E. and Pfeiffer, D.R. (1989) Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria. J.Biol.Chem., 264, 7826-7830.

37. Broekemeier, K.M., Krebsbach, R.J. and Pfeiffer, D.R. (1994) Inhibition of the mitochondrial Ca2+ uniporter by pure and impure ruthenium red. Mol.Cell Biochem., 139, 33-40.

38. Brustovetsky, N. and Klingenberg, M. (1996) Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+. Biochemistry, 35, 84838488.

39. Bygrave, F.L., Reed, K.C. and Spencer, T. (1971) Cooperative interactions in energy-dependent accumulation of Ca2+ by isolated rat liver mitochondria. Nat.New Biol., 230, 89-89.

40. Carafoli, E. (1967) In vivo effect of uncoupling agents on the incorporation of calcium and strontium into mitochondria and other subcellular fractions of rat liver. J.Gen.Physiol., 50, 1849-1864.

41. Carafoli, E. (1979) The calcium cycle of mitochondria. FEBS Lett., 104, 1-5.

42. Carafoli, E. (1994) The signaling function of calcium and its regulation, J.Hypertens.Suppl., 12, S47-56.

43. Carafoli, E. and Lehninger, A.L. (1971) A survey of the interaction of calcium ions with mitochondria from different tissues and species. Biochem. J., 122, 681-690.

44. Carafoli, E., Rossi, C.S. and Lehninger, A.L. (1965b) Uptake of adeninenucleotides by respiring mitochondria during active accumulation of Ca2+ and phosphate. J.Biol.Chem., 240, 2254-2261.1. Список литеоатиоы

45. Carafoli, E., Weiland, S. and Lehninger, A.L. (1965a) Active accumulation of Sr2*by rat-liver mitochondria. I. General features. Biochim.Biophys.Acta, 97, 8898.

46. Chance, B. (1965) The energy-linked reaction of calcium with mitochondria.

47. J.Biol.Chem., 240,"2729-2748.

48. Chance, B., Azzi, A. and Mela, L. (1969) Molecular Interactions of Calcium

49. Transport in Mitochondrial Membranes. In Tosteson, D.C. (ed.) The Molecular Basis of Membrane Function, Prentice Hall, Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, pp. 561-573.

50. Chance, B., Nakase, Y. and Itshak, F. (1979) Membrane energization at subzerotemperatures: calcium uptake and oxonol-V responses. Arch.Biochem.Biophys., 198, 360-369.

51. Chance, B. and Williams, G.R. (1956) The Respiratory Chain and Oxidative

52. Phosphorylation. Advanced Enzymol.Relat.Subj.Biochem., 17, 65-134.

53. Chazotte, B„ Wu, E.S., Hochli, M. and Hackenbrock, C.R. (1985) Calciummediated fusion to produce ultra large osmotically active mitochondrial inner membranes of controlled protein density. Biochim.Biophys.Acta, 818, 87-95.

54. Chen, C.H. and Lehninger, A.L. (1973) Ca2+ transport activity in mitochondriafrom some plant tissues. Arch.Biochem.Biophys., 157, 183-196.

55. Cheung, J.Y., Constantine, J.M. and Bonventre, J.V. (1986) Regulation ofcytosolic free calcium concentration in cultured renal epithelial cells. Am.J.Physiol., 251, F690-F701

56. Crompton, M. (1999) The mitochondrial permeability transition pore and its rolein cell death. Biochem.J., 341, 233-249.

57. Crompton, M., Capano, M. and Carafoli, E. (1976) The sodium-induced efflux ofcalcium from heart mitochondria. A possible mechanism for the regulation of mitochondrial calcium. Eur.J.Biochem., 69, 453-462.

58. Cullis, P.R., de Kruijff, B. and Hope, M.J. (1980) Phospholipids and membranetransport. Can.J.Biochem., 58, 1091-1100.

59. David, G., Barrett, J.N. and Barrett, E.F. (1998) Evidence that mitochondria buffer physiological Ca2+ loads in lizard motor nerve terminals see comments. J.Physiol.(Lond), 509, 59-65.

60. De Luca, H.F. and Engstrom, G.W. (1961) Calcium uptake by rat kidney mitochondria. Proc.NatiAcad.Sci.U.S.A., 47, 1744-1754.

61. Docampo, R. and Vercesi, A.E. (1989) Characteristics of Ca2+ transport by Trypanosoma cruzi mitochondria in situ. Arch.Biochem.Biophys., 272, 122129.

62. Dorogi, P.L. (1984) Kinetics and mechanism of Ca2+ binding to arsenazo III and antipyrilazo III. Biochim.Biophys.Acta, 799, 9-19.

63. Dorogi, P.L., Santarius, U. and Neumann, E. (1982) Arsenazo I and

64. Tetramethylmurexide as Optical Calcium Indicators. Anal.Biochem., 124, 2736.

65. Drahota, Z., Gazzotti, P., Carafoli, E. and Rossi, C.S. (1969) A comparison of the effects of different divalent cations on a number of mitochondrial reactions linked to ion translocation. Arch.Biochem.Biophys., 130, 267-273.

66. Duchen, M.R. (1999) Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signalling and cell death. J.Physiol.(Lond), 516, 1-17.

67. Exton, J.H. (1980) Mechanisms involved in alpha-adrenergic phenomena: role of calcium ions in actions of catecholamines in liver and other tissues. Am.J.Physiol., 238, E3-12.

68. Exton, J.H. (1988) The role of calcium and phosphoinositides in the mechanism of «-adrenergic and other agonists. Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol., 3, 118-224.

69. Ezawa, I. and Ogata, E. (1979) Ca2+-induced activation of succinate dehydrogenase and the regulation of mitochondrial oxidative reactions. J.Biochem.(Tokyo), 85, 65-74.

70. Favaron, M. and Bernardi, P. (1985) Tissue-specific modulation of themitochondrial calcium uniporter by magnesium ions. FEBS Lett., 183, 260264.1. Список литератиоы

71. Fierro, L., Dipolo, R. and Llano, I. (1998) Intracellular calcium clearance in

72. Purkinje cell somata from rat cerebellar slices. J.Physiol.(Lond), 510, 499512.

73. Fletcher, J.M., Greenfield, B.F., Hardy, C.J., Scargill, D. and Woodhead, J.L.1961) Ruthenium red. J.Chem.Soc., 5, 2000-2006.

74. Fonyo, A., Ligeti, E., Palmieri, F. and Quagliariello, E. (1975) Carrier mediatedtransport of phosphate in mitochondria, pp. 287- 306.1.:. Gardos. G,. Szasz. I,. ed. Biomembranes:. structure, and. function. Amsterdam,.1. North-Holland,., 35,

75. Frieden, C. (1970) Kinetic aspects of regulation of metabolic processes. Thehysteretic enzyme concept. J.Biol.Chem., 245, 5788-5799.

76. Gavin, C.E., Gunter, K.K. and Gunter, Т.Е. (1990) Manganese and calcium effluxkinetics in brain mitochondria. Relevance to manganese toxicity. Biochem.J., 266, 329-334.

77. Gavin, C.E., Gunter, K.K. and Gunter, Т.Е. (1999) Manganese and calciumtransport in mitochondria: implications for manganese toxicity. Neurotoxicology., 20, 445-453.

78. Goring, G.G., Nayler, W.G. and Spieckermann, P.G. (1977) The release ofcalcium from cardiac mitochondria: the importance of the calcium-protein ratio. Basic Res.Cardiol., 72, 77-81.

79. Gornall, A.G., Bardawill, C.J. and David, M.M. (1949) Determination of serumpriteins by means of the biuret reaction. J.Biol.Chem., 177, 751-766.

80. Gunter, K.K. and Gunter, Т.Е. (1994) Transport of calcium by mitochondria.

81. J.Bioenerg.Biomembr., 26, 471-485.

82. Gunter, Т.Е., Buntinas, L„ Sparagna, G.C. and Gunter, K.K. (1998) The Ca2+transport mechanisms of mitochondria and Ca2+ uptake from physiological-type Ca2+ transients. Biochim.Biophys.Acta, 1366, 5-15.

83. Gunter, Т.Е., Gunter, K.K., Puskin, I.S. and Russel, P.R. (1978) Efflux of Ca2+and Mg2+from rat liver mitochondria. Biochemistry, 17, 339-345.

84. Gunter, Т.Е. and Pfeiffer, D.R. (1990) Mechanisms by which mitochondriatransport calcium. Am.J.Physiol., 258, c755-c786

85. Gunter, T.E., Wingrove, D.E., Banerjee, S. and Gunter, K.K. (1988) Mechanisms of mitochondrial calcium transport. Adv.Exp.Med.Biol., 232, 1-14.

86. Hajnoczky, G., Hager, R. and Thomas, A.P. (1999) Mitochondria suppress local feedback activation of inositol 1,4,5- trisphosphate receptors by Ca2+. J.Biol.Chem., 274, 14157-14162.

87. Halestrap, A.P. (1989) The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria in vivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism. Biochim.Biophys.Acta, 973, 355-382.

88. Hansford, R.G. (1994) Physiological role of mitochondrial Ca2+ transport. J.Bioenerg.Biomembr., 26, 495-508.

89. Hansford, R.G. and Zorov, D. (1998) Role of mitochondrial calcium transport in the control of substrate oxidation. Mol.Cell Biochem., 184, 359-369.

90. Happel, R.D. and Krall, A.R. (1979) Partial reconstitution of calcium uptake with a soluble calcium- binding glycoprotein in rat liver mitochondria proceedings. Biochem.Soc.Trans., 7, 1311-1312.

91. Harris, E.J. and Zaba, B. (1977) The phosphate requirement for Ca2+ uptake by heart and liver mitochondria. FEBS Lett., 79, 284-290.

92. Heaton, G.M. and Nicholls, D.G. (1976) The calcium conductance of the inner membrane of rat liver mitochondria and the determination of the calcium electrochemical gradient. Biochem.J., 156, 635-646.

93. Hoser, N., Dawczynski, H., Winnefeld, K. and Dargel, R. (1978) Control of mitochondrial Mg++-efflux. Acta Biol.Med.Ger., 37, 19-29.

94. Hutson, S.M. (1977) Steady state kinetics of energy-dependent Ca2+ uptake in rat liver mitochondria. J.Biol.Chem., 252(13), 4539-4545.

95. Khodorov, B., Pinelis, V., Storozhevykh, T., Vergun, O. and Vinskaya, N. (1996)

96. Dominant role of mitochondria in protection against a delayed neuronal Ca2+ overload induced by endogenous excitatory amino acids following a glutamate pulse. FEBS Lett., 393, 135-138.

97. Kraus-Friedmann, N. (1990) Calcium sequestration in the liver. Cell Calcium,11, 625-640.

98. Kretsinger, R.H. (1976) Calcium-binding proteins. Annu.Rev.Biochem., 45, 239266.

99. Kroner, H. (1986a) "Allosteric regulation" of calcium-uptake in rat livermitochondria. Biol.Chem.Hoppe Seyler, 367, 483-493.

100. Kroner, H. (1986b) Ca2+ ions, an allosteric activator of calcium uptake in rat livermitochondria. Arch.Biochem.Biophys., 251, 525-535.

101. Kroner, H. (1988b) Spermine, another specific allosteric activator of calciumuptake in rat liver mitochondria. Arch.Biochem.Biophys., 267, 205-210.

102. Kroner, H. (1988a) The real kinetics of the mitochondrial calcium uniporter of theliver and its role in cell calcium regulation. Biol.Chem.Hoppe Seyler, 369, 149-155.

103. Kuboyama, M., Yong, F.C. and King, T.E. (1972) Studies on cytochromeoxidase. 8. Preparation and some properties of cardiac cytocrome oxidase. J.Biol.Chem., 247, 6375-6383.

104. Kun, E. (1976) Kinetics of ATP-dependent Mg2+ flux in mitochondria.

105. Biochemistry, 15, 2328-2336.

106. Kushnareva, Y.E., Haley, L.M. and Sokolove, P.M. (1999) The role of low (< or =1 mM) phosphate concentrations in regulation of mitochondrial permeability: modulation of matrix free Ca2+ concentration. Arch.Biochem.Biophys., 363, 155-162.

107. Langer, G.A. (1992) Calcium and the heart: exchange at the tissue, cell, andorganelle levels. FASEBJ., 6, 893-902.

108. Massari, S. (1996) Kinetic analysis of the mitochondrial permeability transition. J.Biol.Chem., 271, 31942-31948.

109. McCormack, J.G. (1989) Effects of spermine on mitochondrial Ca2+ transport and the ranges of extramitochondrial Ca2+ to which the matrix Ca2+- sensitive dehydrogenases respond. Biochem.J., 264, 167-174.

110. McCormack, J.G. and Denton, R.M. (1993) Mitochondrial Ca2+ transport and the role of intramitochondrial Ca2+ in the regulation of energy metabolism. Dev.Neurosci., 15, 165-173.

111. Medvedev, B.I., Azarashvily, T.S., Evtodienko, Yu.V., Luk'yanenko, A.I. and Yagushinskij, L.S. (1982) Isolation of calcium-transporting lipid from the mitochondrial glycolipoprotein. Mol.Cell Biochem., 48, 19-23.

112. Mela, L. (1968) Interactions of La3+ and local anesthetic drugs with mitochondrial Ca++ and Mn++ uptake. Arch.Biochem.Biophys., 123, 286-293.

113. Mela, L. and Chance, B. (1969) Calcium carrier and the "high affinity calcium binding site" in mitochondria. Biochem.Biophys.Res.Commun., 35, 556-559.

114. Metz, A. and Reinert, K. (1974) The influence of fat on the determination of protein by the biuret and the Folin-Ciocalteau methods in liver homogenates. Z.Klin. Chem.Klin.Biochem., 12, 361-366.

115. Miyamae, M., Camacho, S.A., Weiner, M.W. and Figueredo, V.M. (1996) Attenuation of postischemic reperfusion injury is related to prevention of Ca2+.m overload in rat hearts. Am.J.Physiol. , 271, H2145-53.

116. Monteith, G.R. and Blaustein, M.P. (1999) Heterogeneity of mitochondrial matrix free Ca2+: resolution of Ca2+ dynamics in individual mitochondria in situ. Am.J.Physiol., 276, C1193-204.

117. Moore, C.L. (1971) Specific inhibition of mitochondrial Ca++transport by ruthenium red. Biochem.Biophys.Res.Commun., 42, 298-305.

118. Moravec, C.S. and Bond, M. (1991) Calcium is released from the junctional sarcoplasmic reticulum during cardiac muscle contraction. Am.J.Physiol., 260, H989-H997

119. Nicchitta, C.V. and Williamson, J.R. (1984) Spermine. A regulator of mitochondrial calcium cycling. J.Biol.Chem., 259, 12978-12983.

120. Nicholls, D.G. (1974) The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-electrochemical gradient across the inner membrane of rat liver mitochondria as determined by ion distribution. Eur.J.Biochem., 50, 305-315.

121. Nicholls, D.G. (1978) The regulation of extramitochondrial free calcium ion concentration by rat liver mitochondria. Biochem.J., 176, 463-474.

122. Nicholls, D.G. and Budd, S.L. (1998) Neuronal excitotoxicity: the role of mitochondria. Biofactors, 8, 287-299.

123. Nicholls, D.G. and Scott, I.D. (1980) The regulation of brain mitochondrial calcium-ion transport. The role of ATP in the discrimination between kinetic and membrane- potential-dependent calcium-ion efflux mechanisms. Biochem.J., 186, 833-839.

124. Noack, E.A. and Heinen, E.M. (1977) A kinetic study of calcium transort by heart mitochondria. Eur.J.Biochem., 79, 245-250.1. Список литературы

125. Ohnuma, К., Kazawa, Т., Ogawa, S., Suzuki, N., Miwa, A. and Kijima, H. (1999)

126. Cooperative Ca2+ removal from presynaptic terminals of the spiny lobster neuromuscular junction. Biophys.J., 76, 1819-1834.

127. Panfili, E., Sandri, G„ Sottocasa, G.L., Lunazzi, G„ Liut, G. and Graziosi, G.1976) Specific inhibition of mitochondrial Ca2+ transport by antibodies directed to the Ca2+-binding glycoprotein. Nature, 264, 185-186.

128. Panov, A. and Scarpa, A. (1996) Mg2+ control of respiration in isolated rat livermitochondria. Biochemistry , 35, 12849-12856.

129. Pardee, A.B. and Potter, V.R. (1948) Inhibition of succinic dehydrogenase byoxaloacetate. J.Biol.Chem., 176, 1085-1090.

130. Pinton, P., Pozzan, T. and Rizzuto, R. (1998) The Golgi apparatus is an inositol1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2+ store, with functional properties distinct from those of the endoplasmic reticulum. EMBO J., 17, 5298-5308.

131. Pozzan, T. and Rizzuto, R. (2000) The renaissance of mitochondrial calciumtransport. Eur.J.Biochem., 267, 5269-5273.

132. Prentki, M., Janjic, D. and Wollheim, C.B. (1983) The regulation ofextramitochondrial steady state free Ca2+ concentration by rat insulinoma mitochondria. J.Biol.Chem., 258, 7597-7602.

133. Prestipino, G., Ceccarelli, D., Conti, F. and Carafoli, E. (1974) Interactions of amitochondrial Ca2+-binding glycoprotein with lipid bilayer membranes. FEBS Lett., 45, 99-103.

134. Puskin, J.S., Gunter, Т.Е. and Coene, M.T. (1980) On the role of inorganicphosphate in divalent-cation sequestration by mitochondria. Eur.J.Biochem., 106, 425-429.

135. Puskin, J.S., Gunter, Т.Е., Gunter, K.K. and Russell, P.R. (1976) Evidence formore than one Ca2+ transport mechanism in mitochondria. Biochemistry, 15, 3834-3842.

136. Rahamimoff, R„ Erulkar, S.D., LevTov, A. and Meiri, H. (1978) Intracellular andextracellular calcium ions in transmitter release at the neuromuscular synapse. Ann.N.Y.Acad.Sci., 307, 583-598.

137. Rasgado-Flores, H., Sanchez-Armass, S., Blaustein, M.P. and Nachshen, D.A. (1987) Strontium, barium, and manganese metabolism in isolated presynaptic nerve terminals. Am.J.Physiol., 252, C604-10.

138. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1974) A re-evaluation of energy-independent calcium-ion binding by rat liver mitochondria. Biochem.J., 142, 555-566.

139. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1974) Accumulation of lanthanum by rat liver mitochondria. Biochem.J., 138,239-252.

140. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1974) The inhibition of mitochondrial calcium transport by lanthanides and ruthenium red. Biochem.J., 140, 143-155.

141. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1975) A kinetic study of mitochondrial calcium transport. Eur.J.Biochem., 55, 497-504.

142. Reed, K.C. and Bygrave, F.L. (1975) Methodology for in vitro studies of Ca2+ transport. Anal.Biochem., 67, 44-54.

143. Reinhart, P.H., van de Pol, E., Taylor, W.M. and Bygrave, F.L. (1984) An assessment of the calcium content of rat liver mitochondria in vivo. Biochem.J., 218, 415-420.

144. Riley, W.W., Jr. and Pfeiffer, D.R. (1986) Rapid and extensive release of Ca2+ from energized mitochondria induced by EGTA. J.Biol.Chem., 261, 28-31.

145. Rizzuto, R., Pintón, P., Brini, M., Chiesa, A., Filippin, L. and Pozzan, T. (1999) Mitochondria as biosensors of calcium microdomains In Process Citation., Cell Calcium, 26, 193-199.

146. Rottenberg, H. and Marbach, M. (1990) Regulation of Ca2+ transport in brain mitochondria. I. The mechanism of spermine enhancement of Ca2+ uptake and retention. Biochim.Biophys.Acta, 1016, 77-86.

147. Rottenberg, H. and Scarpa, A. (1974) Calcium uptake and membrane potential in mitochondria. Biochemistry, 13, 4811-4817.

148. Rugolo, M. and Zoccarato, F. (1984) Magnesium transport by brain mitochondria: energy requirement and dependence on Ca2+ fluxes. J.Neurochem., 42, 1127-1130.1. Список литеоатиры

149. Sandri, G., Panfili, E. and Sottocasa, G.L. (1976) The calcium-bindingglycoprotein and mitochondrial calcium movements. Biochem.Biophys.Res. Commun., 68, 1272-1279.

150. Sandri, G., Sottocasa, G., Panfili, E. and Liut, G. (1979) The ability of themitochondrial Ca2+-binding glycoprotein to restore Ca2+ transport in glycoprotein-depleted rat liver mitochondria. Biochim.Biophys.Acta, 558, 214-220.

151. Saris, N.-E.L. and Akerman, K.E.O. (1980) Uptake and release of bivalentcations in mitochondria. Curr.Top.Bioenerg., 10, 103-179.

152. Saris, N.E. and Kröner, H. (1990) Regulation of Ca2+ fluxes in rat livermitochondria by Ca2+. Effects on Ca2+ distribution. J.Bioenerg.Biomembr., 22, 81-90.

153. Scarpa, A. (1979) Measurements of cation transport with metallochromicindicators. Methods Enzymol., 56, 301-338.

154. Scarpa, A. and Azzone, G.F. (1968) Ion transport in liver mitochondria. VI. Therole of surface binding on aerobic Ca++translocation. J.Biol.Chem., 243, 5132-5138.

155. Scarpa, A. and Azzone, G.F. (1970) The mechanism of ion translocation inmitochondria. 4. Coupling of K+ efflux with Ca2+ uptake. Eur.J.Biochem., 12, 328-335.

156. Schinder, A.F., Olson, E.C., Spitzer, N.C. and Montal, M. (1996) Mitochondrialdysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity. J.Neurosci., 16, 6125-6133.

157. Selivanov, V.A., Ichas, F., Holmuhamedov, E.L., Jouaville, L.S., Evtodienko,

158. Yu.V. and Mazat, J.P. (1998) A model of mitochondrial Ca2+-induced Ca2+ release simulating the Ca2+ oscillations and spikes generated by mitochondria. Biophys.Chem., 72, 111-121.

159. Selwyn, M.J., Fulton, D.V. and Dawson, A.P. (1978) Inhibition of mitochondrialanion permeability by local anaesthetics. FEBS Lett., 96, 1481-1451.

160. Siess, E.A., Kientsch-Engel, R.I. and Wieland, O.H. (1984) Concentration of free oxaloacetate in the mitochondrial compartment of isolated liver cells. Biochem.J., 218, 171-176.

161. Skulachev, V.P. (1996) Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maitenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants. Quarterly Reviews of Biophysics, 29, 169-202.

162. Slater, E.C. and Cleland, K.W. (1953) The Effect of Calcium on the Respiratory and Phosphorylative Activities of Heart-Muscle Sarcosomes. Biochem.J., 55, 566-572.

163. Sparagna, G.C., Gunter, K.K. and Gunter, T.E. (1994) A system for producing and monitoring in vitro calcium pulses similar to those observed in vivo. Anal.Biochem., 219, 96-103.

164. Sparagna, G.C., Gunter, K.K., Shen, S.S. and Gunter, T.E. (1995) Mitochondrial calcium uptake from physiological-type pulses of calcium A description of the rapid uptake mode. J.Biol.Chem., 270, 27510-27515.

165. Streb, H., Irvine, R.F., Berridge, M.J. and Schulz, I. (1983) Release of Ca2+from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature , 306, 67-69.

166. Szabo, I. and Zoratti, M. (1992) The Mitochondrial Megachannel Is the Permeability Transition Pore. J.Bioenerg.Biomembr., 24, 111-117.

167. Tashchmukhamedov, B.A., Gagel'gans, A.I., Mamatkulov, K.H. and

168. Makhmudova, E.M. (1972) Inhibiton of Ca2+Transport in Mitochondria by Selective Blockade of Memdrane Mucopolysaccharides by Hexamine Cobaltichloride. FEBS Lett., 28, 239-245.

169. Vainio, H., Mela, L. and Chance, B. (1970) Energy dependent bivalent cation translocation in rat liver mitochondria. Eur.J.Biochem., 12, 387-391.

170. Vasington, F.D. and Murphy, J.V. (1962) Ca++ uptake by rat kidney mitochondria and its dependence on respiration and phosphorylation. J.Biol.Chem., 237, 2670-2677.

171. Vinogradov, A. and Scarpa, A. (1973) The initial velocities of calcium uptake by rat liver mitochondria. J.Biol.Chem., 248, 5527-5531.

172. Vinogradov, A.D. (2000) Steady-state and pre-steady-state kinetics of the mitochondrial F(1)F(0) ATPase: is ATP synthase a reversible molecular machine? J.Exp.Biol., 203, 41-49.

173. Williamson, J.R., Williams, R.J., Coll, K.E. and Thomas, A.P. (1983) Cytosolic free Ca2+ concentration and intracellular calcium distribution of Ca2+-tolerant isolated heart cells. J.Biol.Chem., 258, 13411-13414.

174. Wingrove, D.E. and Gunter, T.E. (1986) Kinetics of mitochondrial calcium transport. I. Characteristics of the sodium-independent calcium efflux mechanism of liver mitochondria. J.Biol.Chem., 261, 15159-15165.

175. Yamaguchi, M. (1989) Effect of calcitonin on exchangeable calcium transport in isolated rat hepatocytes. Mol.Cell Endocrinol., 62, 313-318.

176. Ying, W.L., Emerson, J., Clarke, M.J. and Sanadi, D.R. (1991) Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo- bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry, 30, 4949-4952.

177. Zazueta, C., Zafra, G., Vera, G., Sanchez, C. and Chavez, E. (1998) Advances in the purification of the mitochondrial Ca2+ uniporter using the labeled inhibitor 103Ru360. J.Bioenerg.Biomembr., 30, 489-498.

178. Zhou, Z., Matlib, M.A. and Bers, D.M. (1998) Cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals in patch clamped mammalian ventricular myocytes. J.Physiol.(Lond), 507, 379-403.1. Список литературы

179. Автор благодарит заведующего кафедрой биохимии, доктора биологических наук, профессора Андрея Дмитриевича Виноградова за предоставление условий для проведения этой работы и проявленное к ней внимание.

180. Автор признателен своим первым учителям в области биоэнергетики Юрию Наумовичу Лейкину и Татьяне Вадимовне Жаровой - за привитые навыки и стиль научной работы.

181. Автор благодарен всем коллегам по кафедре за понимание и творческую атмосферу, а родным и близким за терпение и поддержку.