Экспериментальное доказательство возможности создания тканеспецифических ингибиторов ацетилхолинэстеразы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат биологических наук Никиташина, Александра Дмитриевна

• Никиташина, Александра Дмитриевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Никиташина, Александра Дмитриевна

оглавление

Список сокращений ^

Введение ^

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функциональная организация нервно-мышечного синапса

1.1.1. Пресинаптические структуры и секреция ацетилхолина

1.1.2. Постсинаптические структуры и действие ацетилхолина

1.1.3. Синаптическая щель и завершение действия ацетилхолина

1.2. Холинэстеразы в области синаптического контакта

1.3. Ацетилхолинэстераза в гладкой мускулатуре

1.4. Ингибиторы холинэстераз

1.4.1. Фосфорорганические соединения

1.4.2. Производные карбаминовой кислоты

1.4.3. Алкиламмониевые соли

1.4.4. Соединения типа №547 ^ ^

1.5. Ингибиторы ацетилхолинэстеразы в медицинской практике ^

1.6. Миастения Гравис ^

1.7. Миастеноподобные расстройства ^

1.7.1. Врожденный миастенический синдром

1.7.2. Миастенический синдром Ламберта-Итена

1.8. Лечение миастении Гравис и врожденных миастенических

синдромов

1.9. Экспериментальная аутоиммунная миастения Гравис

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования 5

2.2. Методы исследования

2.2.1. Электрофизиологические исследования

2.2.2. Тензометрические исследования

2.2.3. Определение активности АХЭ

2.2.4. Экспериментальная аутоиммунная модель миастении ^ Гравис

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 5

3.1. Влияние соединения №547 на амплитуду и постоянную времени спада МПКП в диафрагме мышей «дикого типа» и без 55 БуХЭ

3.2. Влияние соединения №547 на амплитуду и постоянную времени спада МПКП в диафрагме мутантных мышей без АХЭ в 59 синапсах

3.3. Влияние соединения №547 на амплитуду и постоянную времени спада МПКП диафрагмы мутантных мышей без отдельных 61 молекулярных форм АХЭ в синапсах

3.4. Влияние соединения №547 на амплитуду и постоянную ^ времени спада МТКП в т. ЕБЬ крыс после функциональной

нагрузки

3.5. Сравнение эффектов пиридостигмина и соединения № 547 в

отношении скелетной и гладкой мускулатуры

3.5.1. Сравнение эффектов пиридостигмина бромида в отношении скелетной и гладкой мускулатуры

3.5.2. Сравнение эффектов соединения №547 в отношении скелетной и гладкой мускулатуры ^2

3.6. Экспериментальная модель миастении Гравис

3.6.1. Миографические исследования

3.6.2. Микроэлектродные исследования

3.7. Скрининг новых соединений - ингибиторов АХЭ 81 3.7.1. Биохимические исследования

3.7.2. Исследование эффективности новых соединений в

83

отношении скелетной и гладкой мускулатуры

3.4.3. Соединение № 7 и экспериментальная модель миастении

Гравис

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АХ Ацетилхолин

АХР Ацетилхолиновый рецептор

АХЭ Ацетилхолинэстераза

БуХЭ Бутирилхолинэстераза

ВМС Врожденный миастенический синдром

дц50 Летальная доза, оказывающая влияние у 50% животных

мг Миастения Гравис

мпкп Миниатюрный потенциал концевой пластинки

мели Миастенический синдром Ламберта-Итена

мткп Миниатюрный ток концевой пластинки

ПД Потенциал действия

пкп Потенциал концевой пластинки

Соед. №547 Соединение №547

ФОИ Фосфорорганический ингибитор

цне Центральная нервная система

хэ Холинэстераза

ЭАМГ Экспериментальная аутоиммунная миастении Гравис

ЭД50 Эффективная доза, оказывающая влияние у 50%

животных

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное доказательство возможности создания тканеспецифических ингибиторов ацетилхолинэстеразы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

Фермент ацетилхолинэстераза (АХЭ) - один из ключевых элементов, обеспечивающих нормальное функционирование холинергических синапсов за счет ограничения времени действия ацетилхолина, освобождающегося из нервного окончания. Ингибиторы АХЭ широко используются в медицинской практике для фармакологической коррекции синаптических дефектов, лежащих в основе болезни Альцгеймера, миастении Гравис и других форм патологической мышечной слабости (Birks, 2006; Brenner et al., 2008). Показана их эффективность и при лечении глаукомы (Sakamoto et al., 2010), атонии кишечника (Lee et al, 2010), травматических повреждений мозга, алкоголизма, маниакально-депрессивных психозов, шизофрении, аутизма, расстройств сна и др. (Cummings, 2000). Однако использование существующих антиАХЭ препаратов в медицинской практике осложняется одним недостатком, присущим всем без исключения ингибиторам - полным отсутствием избирательности в отношении фермента разных органов и тканей. Поэтому наряду с положительным (терапевтическим) действием, ингибиторы АХЭ всегда оказывают побочные эффекты (диарея, частое мочеиспускание, тошнота, рвота, абдоминальные боли, брадикардия, аритмия, повышенная бронхиальная секреция, повышенное слюноотделение, и т.д.), связанные преимущественно с гиперактивацией холинорецепторов вегетативной нервной системы (в основном, гладкой мускулатуры) (Прозоровский, Саватеев, 1976; Eddieston et al., 2005; Pope et al., 2005). Вышеописанных недостатков были бы лишены ингибиторы АХЭ, способные оказывать целевой эффект в определенных органах и тканях. В частности, для терапии миастений различной этиологии перспективным представляется

Научным консультантом по всем аспектам, связанным с воздействием ингибиторов ацетилхолинэстеразы на синаптическую передачу возбуждения, работы является Петров К.А. (к.б.н., ст. науч. сотр. лаб. химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова)

использование ингибиторов, более эффективных в синапсах скелетных (поперечнополосатых) мышц, по сравнению с гладкой мускулатурой. Однако вещества с подобными свойствами известны не были.

Относительно недавно при исследовании нового класса ингибиторов АХЭ, синтезированных в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова (под руководством проф. Резника B.C.) - алкиламмониевых производных 6-метилурацила - впервые появились предпосылки говорить о том, что селективное ингибирование АХЭ в отдельных органах возможно. Как было установлено, пороговая концентрация одного из наиболее эффективных производных 6-метилурацила (соединение №547), вызывающая изменения амплитудно-временных параметров синаптических ответов, характерные для практически полного ингибирования холинэстеразы, в 20-70 раз больше для синапсов дыхательных мышц (диафрагма, межреберные мышцы), чем для синапсов локомоторных мышц («быстрой» - m. extensor digitorum longus (т. EDL) и «медленной» - т. soleus) (Petrov et ah, 2009; Petrov et ah, 2006). Иначе говоря, синапсы дыхательных мышц более устойчивы к действию данного соединения по сравнению с синапсами мышц конечностей. Описанные выше различия между дыхательной и локомоторной мышцами не проявлялись в присутствии традиционных ингибиторов холинэстераз - карбаматного (неостигмин) и фосфорорганического (армин) (Petrov et ah, 2011).

Таким образом, соединение №547 может быть первым кандидатом на роль тканеспецифичного ингибитора АХЭ.

Анализ механизмов изибирательности действия соединения №547 показал, что частично она объясняется активностью фермента бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), которая компенсирует ингибирование АХЭ (Petrov et ah, 2011). Однако полностью объяснить существующие различия «компенсаторной» ролью БуХЭ не удавалось. Таким образом, появились

основания полагать о наличии иного механизма действия, обеспечивающего устойчивость дыхательной мускулатуры к действию соединения №547 по сравнению с локомоторными мышцами (Ре1.гоу й а1., 2011). Дальнейшее исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе различий чувствительности органов к соединению №547, несомненно позволит увеличить эффективность поиска тканеспецифичных ингибиторов АХЭ.

В связи с тем, что абсолютное большинство побочных эффектов ингибиторов АХЭ связано с гиперактивацией гладкой мускулатуры, ответ на вопрос об эффективности соединения №547 (и других подобных соединений) в отношении гладких мышц представляет большой практический интерес. Если алкиламмониевые производные 6-метилурацила обладают большей эффективностью в отношении поперечнополосатой (скелетной) мускулатуры по сравнению с гладкими мышцами, то есть серьезное основание считать, что по завершении данной работы впервые для доклинических испытаний могут быть предложены потенциальные лекарственные средства для лечения миастений различной этиологии, со сниженными побочными эффектами со стороны гладкой мускулатуры.

Цель и основные задачи исследования:

Цель данной работы - исследование механизмов действия алкиламмониевых производных 6-метилурацила и их специфичности по отношению к АХЭ скелетной и гладкой мускулатуры.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи: 1. На основании анализа амплитудно-временных характеристик спонтанных постсинаптических ответов сравнить антихолинэстеразную эффективность соединения №547 в синапсах локомоторной (длинный разгибатель пальцев) и диафрагмальной мышц мыши.

2. Используя мышей, нокаутированных по разным видам холинэстераз, конкретизировать фермент (бутирилхолинэстераза, АХЭ, отдельные молекулярные формы АХЭ), ответственный за формирование устойчивости диафрагмальной мышцы к соединению №547.

3. Исследовать влияние физической нагрузки, приводящей к изменению соотношения молекулярных форм АХЭ, на эффективность соединения №547 в синапсах локомоторной (длинный разгибатель пальцев) мышцы крысы.

4. Сравнить эффективность пиридостигмина и соединения №547 в препаратах локомоторной (длинный разгибатель пальцев) и гладкой мускулатуры (мочевой пузырь, прямая кишка) крысы в опытах ex vivo.

5. На экспериментальной модели миастении Гравис проверить способность соединения №547 снижать выраженность признаков синаптического дефекта.

6. Провести скрининг новых синтезируемых алкиламмониевых производных с целью выявления наиболее активных ингибиторов ацетилхолинэстеразы. Сравнить эффективность отобранных соединений в препаратах локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев) и гладкой мускулатуры (мочевой пузырь).

Положения, выносимые на защиту:

1. Ацетилхолинэстераза в синапсах диафрагмальной мышцы и в гладкой мускулатуре мочевого пузыря и кишечника крыс более устойчива к действию соединения №547 (ингибитор ацетилхолинэстеразы) по сравнению с ферментом синапсов локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев). Степень устойчивости диафрагмальной мышцы к соединению №547 положительно коррелирует с наличием ацетилхолинэстеразы, заякоренной посредством PRiMA субъединицы.

2. Соединение №547 может рассматриваться как потенциальное лекарственное средство для коррекции синаптического дефекта, лежащего в основе миастении Гравис.

Научная новизна

В работе впервые проанализировано участие различных молекулярных форм АХЭ в формировании устойчивости синапсов дыхательной мускулатуры к алкиламмониевым производным 6-метилурацила. Впервые исследовано влияние производных 6-метилурацила на работу гладкой мускулатуры крысы. В работе показано, что эти соединения проявляют избирательность действия в отношении скелетной мускулатуры, по сравнению с гладкой мускулатурой. Также было впервые показано, что представители данного класса соединений способны устранять признаки мышечной слабости в экспериментальной модели миастении Гравис.

Научно-практическая ценность

Информация об особенностях строения АХЭ разных органов, как основы разной эффективности ингибирования производными 6-метилурацила, также как анализ зависимости «структура-активность» исследуемых соединений могут быть использованы для дальнейшего направленного синтеза органоспецифических ингибиторов АХЭ. Результаты данного исследования позволяют рассматривать алкиламмониевые производные 6-метилурацила как потенциальные лекарственные средства для лечения миастении Гравис и миастеноподобных состояний, лишенных целого ряда побочных эффектов, вызываемых гиперативацией холинорецепторов гладких мышц. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре прикладной экологии Института экологии и географии К(П)ФУ. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов

РФФИ (№ 12-04-32056-мол-а, 11-04-12102-офи-м, 11-04-01188-мол-а-вед, 1204-33296, «Ведущая научная школа» НШ-64631-2010.7.

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных подтверждается использованием достаточного объема экспериментальных исследований, постановкой и решением поставленных задач, статистической обработкой полученных результатов.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих конференциях и съездах: VI международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010, 2011 г.), XXIII международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2011), международной конференции молодых ученых «Биология-наука 21-го века! (Пущино, 2012), международном съезде «The 1 Ith International Meeting on Cholinesterases» (Казань, 2012), Съезде фармакологов России (Казань, 2012), международной конференции «Molecular mechanisms of synaptic transmission regulation» (Киев, 2012), ежегодных научных отчетных конференциях в Казанском Федеральном Университете и Институте органической и физической химии им. А. Е. Арбузова (2010, 2011, 2012).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК).

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 113 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 125 источников, из них 16 - отечественных и 109 -иностранных авторов. Диссертация содержит 15 рисунков и 2 таблицы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функциональная организация нервно-мышечного синапса

У млекопитающих каждое волокно скелетной мышцы, как правило, иннервируется единственным миелинизированным двигательным аксоном. В нервно-мышечном синапсе аксон утрачивает миелиновую оболочку и заканчивается нервными терминалями, которые располагаются в желобках, на поверхности мышечного волокна. Нервная терминаль и мышечное волокно разделены синаптической щелью шириной примерно 50 - 100 нм (Fagerlund, Eriksson, 2009).

1.1.1. Пресинаптические структуры и секреция ацетилхолина Электрофизиологические исследования синаптической передачи показали, что нервный импульс, распространяющийся по нервному волокну, достигая терминали, приводит к входу ионов Са2+ в нервное окончание через потенциалозависимые Са2+ каналы. В цитоплазме нервной терминали находятся кластеры синаптических везикул, заполненных медиатором -ацетилхолином (АХ). Локальное увеличение концентрации свободного Са2+ внутри нервного окончания приводит к экзоцитозу содержимого везикул. Каждая везикула содержит 5000-10000 молекул АХ. Содержимое одной везикулы получило название «кванта» медиатора, хотя его количество и эффект на постсинаптическую мембрану может сильно варьировать. С частотой от нескольких раз в минуту до нескольких раз в секунду, может происходить спонтанный экзоцитоз содержимого отдельных везикул, что вызывает локальную деполяризацию (до 1мВ) мышечного волокна, регистрирующуюся как миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП). Нервный импульс приводит к секреции, в зависимости от вида, от 20 до 200 квантов; вызываемая ими локальная деполяризация мышечного волокна получила название потенциала концевой пластинки (ПКП) (Nicholls et al., 1992).

Секреция медиатора осуществляется в специализированных участках пресинапса - активных зонах— участках утолщения пресинаптической мембраны. Активная зона состоит из «плотной полоски» на пресинаптической мембране и сгруппированных около неё везикул, потенциалозависимых кальциевых каналов, специальных белков экзоцитоза и элементов цитоскелета. Количество активных зон в нервно-мышечном синапсе достигает 30^40. Активные зоны расположены против скоплений рецепторов в постсинаптической мембране, что уменьшает задержку в передаче сигнала, связанную с диффузией медиатора в синаптической щели (Fagerlund, Eriksson, 2009).

1.1.2. Постсинаптические структуры и действие ацетилхолина Постсинаптическая мембрана состоит из многочисленных складок, расположенных напротив пресинаптических «активных зон». Эти первичные и вторичные (глубокие) складки в несколько раз увеличивают поверхность постсинапса. На скатах этих складок сконцентрировано большое количество никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (Н-АХР). Диффундируя в синаптической щели, молекулы АХ достигают постсинаптической мембраны мышечного волокна и взаимодействуют с Н-АХР, активация которых приводит к открытию сопряженных с ними ионных каналов. Ток катионов, преимущественно Na+, по электрохимическому градиенту приводит к кратковременному снижению мембранного потенциала в области постсинаптической мембраны и генерации ПКП. Деполяризация, развивающаяся в ходе ПКП, приводит к открытию потенциалзависимых Na+ каналов и генерации потенциала действия мышцы. Далее следует восстановление исходной проницаемости мембраны для ионов и потенциала покоя мембраны (реполяризация). Скорость возвращения всей системы в исходное состояние характеризует лабильность нервно-мышечного синапса, т.е. способность воспроизводить заданный ритм, и определяется, главным

образом, скоростью ферментативного гидролиза АХ, а также скоростью восстановления потенциала покоя мембраны и скоростью синтеза и мобилизации АХ в нервном окончании (Nicholls et al., 1992).

1.1.3. Синаптическая щель и завершение действия ацетилхолина Действие АХ в синаптической щели прекращается с помощью фермента - ацетилхолинэстеразы (АХЭ), который гидролизует АХ до холина и ацетата. Большая часть холина транспортируется обратно в нервную терминаль и вновь используется для синтеза АХ. АХЭ располагается, в основном, в просвете синаптической щели, где она связана с синаптической базальной мембраной - конденсированным экстраклеточным матриксом, а также на пре- и постсинаптических мембранах. Мембраносвязанная и расположенная на экстраклеточном матриксе АХЭ представлена разными изоформами фермента, которые будут подробно описаны в следующей главе данного обзора литературы. АХЭ высоко активный фермент. Плотность АХЭ в синаптической щели примерно 2600 каталитических центров на квадратный микрометр (Kasprzak, Salpeter, 1985). Это примерно в 5-8 раз меньше, чем плотность АХР на постсинаптической мембране (Nicholls et al., 1992). Эффективность работы АХЭ обеспечивается двумя особенностями:

Высокой скоростью гидролиза - один активный центр АХЭ гидролизует 4000 молекул АХ в секунду.

Стратегически «правильным» расположением каталитических центров АХЭ относительно АХР в зависимости от геометрии синаптической щели, квантового состава и паттерна активности синапса, которое как предполагается, обеспечивается разнообразием изоформ АХЭ и позволяет определять не только временные, но и пространственные пределы действия квантов медиатора.

Низкое соотношение между АХЭ и АХР обеспечивает условия, при котором в течение короткого интервала времени, сопоставимого по

длительности с фазой роста ПКП (100 мкс), около 20% освобожденных молекул АХ взаимодействуют с АХЭ, в то время как остальные 80% оккупируют АХР. Скорость, с которой АХ отделяется от активированного рецептора, меньше скорости гидролиза АХЭ, поэтому, когда молекула АХ освободилась, большинство АХЭ свободно и способно захватить «новую» молекулу медиатора. Таким способом поддерживается низкий уровень концентрации свободного АХ в щели, и фактически исключается возможность повторного взаимодействия АХ с рецептором. Такая динамика работы объясняет, почему ингибирование АХЭ дает более сильный эффект на длительность постсинаптических ответов, а не на амплитуду (Anglister et al., 1994).

Активность АХЭ в процессе жизни может снижаться в результате химических воздействий и генетических изменений. В 1977 году, Engel и его группа сообщили о редком миастеническом синдроме, связанным с полным отсутствием окрашивания АХЭ в нервно-мышечном соединении (Engel et al., 1977). У этих пациентов пресинаптические терминали были аномально малы и часто «обвернуты» Шванновскими клетками. В постсинаптической цитоплазме наблюдались признаки некроза, фрагментации постсинаптической мембраны и вырождение постсинаптических складок. Как будет показано ниже, относительно небольшое снижение активности АХЭ приводит к облегчению синаптической передачи, что позволяет применять ингибиторы АХЭ при лечении ряда заболеваний, тогда как значительное снижение активности АХЭ делает эффективную синаптическую передачу невозможной, что может быть причиной смертельных исходов.

1.2. Холинэстеразы в области синаптического контакта

Холинэстеразы (ХЭ) принадлежат к числу наиболее изученных групп

ферментов. Описанию их свойств посвящено более десятка монографий, а

16

изучение свойств АХЭ (Н.Ф. 3.1.1.7) сыграло важнейшую роль в развитии понимания устройства и работы нервно-мышечного синапса. В связи с ключевой ролью ХЭ нервной ткани в процессе передачи нервного импульса модуляция активности ХЭ под действием различных соединений издавна является предметом исследования токсикологов, фармакологов, физиологов, биохимиков.

Типичной АХЭ считается фермент, содержащийся в нервной ткани и эритроцитах млекопитающих, а также в электрическом органе рыб.

В 1992 г. аминокислотная последовательность АХЭ электрического ската Torpedo californica была принята за эталонную (Massoulie et al., 1992) и именно о ее молекулярной структуре накоплено наибольшее количество информации. Димер АХЭ ската представляет собой глобулу размером 45x60x60 Á.. Активный центр размещен в центре фермента на дне узкого (шириной 8 Á в верхней части и 3 Á - в нижней) ущелья в 20 Á от поверхности молекулы (Botti et al., 1999; Sussman et al., 1991; Taylor et al., 1994) (рис. 1.1.). Активный центр АХЭ ската представлен каталитической триадой аминокислотных остатков - серина (S200), гистидина (Н440), глутаминовой кислоты (Е327), образно называемой «каталитической машиной» (Моралев и др., 2001). Мономер белка АХЭ ската содержит 526 остатков аминокислот (Sussman et al., 1991). Топография активного центра ХЭ в течение долгого времени представлялась в виде 2-х функциональных пунктов - эстеразного пункта, осуществляющего каталитический акт, и анионного пункта, сорбирующего триметиламмониевую головку холина, а также гидрофобных областей, окружающих эти пункты. Предполагается также, что АХЭ имеет «периферический анионный пункт», ответственный за ингибирование активности АХЭ высокими концентрациями субстрата и за неконкурентное ингибирование некоторыми обратимыми ингибиторами.

8 А

х "Периферический анионный пункт" (11Л11). Сайт избирательного саязыюшя оксазила, фасцнкулина (токсин кобры), " В\У284с51, (1-тубокурарина, пропидиума, гелламин;

"Эсюразный пункт": ----

( iiii i избирательного связываний

субстрата, ФОН, карбаматов

4 "Холин-связывающий (анионный) пункт": ' \ Сайт избирательного связывания i субстрата, катионных ингибиторов

Рис. 1.1. Схематическое изображение ущелья активного центра АХЭ (Botti et al., 1999). Показано расположение аминокислотных остатков серина S200, гистидина Н440, глутаминовой кислоты Е327 (триада «каталитической машины»), триптофана W84 («холин-связывающий пункт»; «анионный»), тирозина Y121, фенилаланина F330 (гидрофобный участок, окружающий «холин-связывающий пункт»), аспарагиновой кислоты D72.

Начиная с 50-х годов XX века, развитие синтеза ингибиторов ХЭ позволило выявить очевидную сложность семейства АХЭ (К.Ф. 3.1.1.7), содержащего множество изоформ этого фермента (Басова, Розенгарт, 2005; Моралев, Розенгарт, 2004; Моралев et al., 2001). Было показано, что у позвоночных все субъединицы АХЭ кодируются одним геном (Rotundo et al., 1988), а разнообразие изоформ возникает путем альтернативного сплайсинга (Ekstrom et al., 1993) и посттрансляционной модификации (Chen et al., 2011).

Молекулярные формы АХЭ подразделяются в соответствии с их способностью вступать в гидрофобные взаимодействия на амфифильные и неамфифильные, а также в соответствии с их четвертичной структурой на

гомомерные и гетеромерные. Гомомерные формы АХЭ (они же глобулярные, или G формы) представляют собой амфифильные и неамфифильные мономеры, димеры или тетрамеры каталитической субъединицы, различающиеся коэффициентами седиментации (4S, 6S и 10S). В основном это мембранно-связанные белки с обращенными наружу активными центрами, но они могут существовать и в растворимом виде (рис. 1.2. А).

Гетеромерные формы состоят из тетрамеров каталитической субъединицы, связанных дисульфидной связью со структурными субъединицами разного типа (рис. 1.2. Б).

Среди продуктов альтернативного сплайсинга гена каталитической субъединицы АХЭ выделяют так называемые субъединицы АХЭН и АХЭТ, имеющие идентичные каталитические домены, но разные С-концевые последовательности (варианты альтернативные варианты 5' конца) — Н- и Т-пептиды (по названию соответствующих экзонов). Эти пептиды определяют различную посттранскрипционную модификацию и четвертичную структуру АХЭ, и, в конечном счете - локализацию фермента (Massoulie et al., 1993). С-концевой пептид субъединицы АХЭН содержит один или два цистеина вблизи каталитического домена. Их дисульфидные связи внутри цепи формируют димеры АХЭ (G2). Этот пептид содержит также участок, опосредующий присоединение гликофосфатидилинозитола, что приводит к образованию мономеров или димеров, ассоциированных с наружной поверхностью клеточной мембраны (G1 и G2 на рис. 1.2. А). АХЭН присутствует в нервной и мышечной тканях рыб, рептилий и амфибий, а у млекопитающих экспрессируется только в тканях гематопоэтического происхождения.

Субъединица АХЭТ экспрессируется в нервной и мышечной тканях. Ее С- концевой Т-пептид имеет свободный цистеин вблизи С-конца и амфифильную a-спираль, что определяет образование множества

четвертичных структур - мономеров, димеров и тетрамеров. Дальнейшее разнообразие молекулярных форм определяется способностью Т-пептида связываться со структурными субъединицами, давая начало гетеромерным формам АХЭ. Так, возможно связывание с Col Q - коллагеноподобным хвостом, состоящим из трех переплетенных нитей, или же с гидрофобным белком весом 20 кДа ("РШМА"от «proline-rich membrane anchor»). Структура сопряженных с Col Q изоформ АХЭ изучена более подробно на биохимическом, структурном и функциональном уровнях, поскольку неоднородность этих форм была обнаружена ранее остальных и их раньше связали с нервно-мышечным синапсом, в отличие от форм, сопряженных с PRiMA субъединицей, структуру которой начали изучать относительно недавно.

Коллаген Q прикрепляет АХЭ к базальной пластинке внеклеточного матрикса синаптической щели, по-видимому, за счет его ассоциации с протеогликанами. АХЭ этого типа называют асимметричными, или А формами. В асимметричных формах АХЭ с коллагеновым хвостом могут быть ассоциированы один, два или три тетрамера каталитической субъединицы. Такие формы АХЭ имеют коэффициенты седиментации приблизительно 8S, 12-14S и 16-18S. В каждом тетрамере две каталитические субъединицы соединены между собой дисульфидной связью, остальные две ковалентно прикреплены с помощью дисульфидных связей к одной из нитей хвоста (форма А12 на рис. 1.2. Б).

Коллагеноподобная структурная субъединица АХЭ кодируется одним геном (Krejci et al., 1999). У человека дефицит асимметричной формы синаптической АХЭ приводит к развитию одного из видов миастении, причем заболевание не связано с нарушением экспрессии каталитической субъединицы АХЭ. Как оказалось, в основе лежат мутации гена коллагена Q, влияющие на связь с каталитической субъединицей или с базальной

пластинкой (ОЬпо е1 а1., 2000). Обнаружены продукты альтернативного сплайсинга этого гена, которые кодируют домен, взаимодействующий с каталитической субъединицей АХЭ, но не коллагеновый домен. Возможно, такие структурные субъединицы участвуют в формировании других, еще не описанных молекулярных форм АХЭ, хотя нельзя исключить и совершенно иной роли этих продуктов (Кге]а е1 а1., 1999).

А Б

CQD

Рис. 1.2. Схема строения различных молекулярных форм ацетилхолинэстеразы. А - мономерные, Б - гетеромерные формы. Gl, G2, G4 - глобулярные формы; AI 2 - асимметричная форма (по: Taylor, 1991, с изменениями)

Ген PRIMA субъединицы также был клонирован (Perrier et al., 2002), хотя о строении самой PRiMA субъединицы известно относительно мало. В настоящее время выделяют три области: экстраклеточный домен, содержащий PRAD и сайт гликозилирования, трансмембранный домен и

21

цитоплазматический домен. Для PRiMA также известен альтернативный сплайсинг. Продукты сплайсинга, обозначаемые как PRiMA I и PRiMA II различаются только по цитоплазматическому домену. Оба варианта PRiMA способны формировать комплекс с тетрамером АХЭ. Однако как было показано, во взрослом организме преимущественно экспрессируется PRiMA I, тогда как PRiMA II представляет минорную фракцию (Leung et al., 2009).

Кроме Н- и Т- пептидов у некоторых видов, включая мышей и крыс, описан "read through" транскрипт последнего (4-го) общего экзона. Этот вариант был найден в гематопоэтических клетках мышей и крыс и не экспрессируется в норме в электровозбудимых клетках, а у человека данный вариант в норме не обнаружен, он экспрессируется при стрессе, ингибировании АХЭ и миастении Гравис, хотя и в этом случае остается минорным (около одного процента от общей экспрессии АХЭ) (Kaufer et al., 1998; Perrier et al., 2005).

Для 5'конца описаны четыре альтернативных варианта первого экзона (Atanasova et al., 1999; Meshorer et al., 2004). Все они могут экспрессироваться независимо от выбора варианта сплайсинга на 3'конце. Таким образом, теоретически возможно получение до 15 вариантов транскриптов мРНК. Однако все варианты сплайсинга первого экзона находятся до старт кодона и не представлены в структуре белка АХЭ. Вероятно, эти варианты играют регуляторную роль хотя физиологический смысл этой регуляции не до конца понятен. То же можно сказать и об описанной достаточно недавно энхансеосоме в составе интрона между первым и вторым экзонами. Делеция этого участка приводит к исчезновению АХЭ в нервно-мышечных синапсах и лимфоцитах (Camp et al., 2008).

В ЦНС преимущественно обнаруживается тетрамер, заякоренный на поверхности мембраны с помощью PRiMA субъединицы, где он составляет около 70-90 % от общей активности АХЭ (Grassi et al., 1982; Rakonczay et al.,

1981). Показано, что эта изоформа связана с нейрональной плазматической мембраной и способна формировать кластеры на поверхности культивируемых нейронов (Rotundo, Carbonetto, 1987). Недавно появилась информация, что АХЭ заякоренная посредством PRiMA входит в состав так называемых липидных плотиков (Xie et al., 2010), которые представляют собой богатые холестерином участки плазматической мембраны. Внутри плотиков ко-локолизуются различные белки, образовывая таким образом функциональные субмембранные комплексы (Hicks et al., 2011). В настояшее время описано множество путей регуляции процесса секреции медиатора с участием мускариновых и нейрональных никотиновых холинорецепторов. Для этих типов рецепторов также показана локализация внутри липидных плотиков (Zhu et al., 2006) Таким образом, АХЭ внутри липидных плотиков может и не принимать участия в разрушении основного количества АХ, а лишь контролировать концентрацию АХ в локальном объеме около сенсора регулирующего параметры секреции медиатора. Логично также предположить наличие независимых от основной части АХЭ путей регуляции для АХЭ в составе таких функциональных мембранных субдоменов или кальвеол. Возможно изучение АХЭ в составе липидных плотиков и положет решить задачу поиска физиологического смысла существования множества молекулярных форм АХЭ.

Коллаген Q синтезируется преимущественно в мышце, а формы АХЭ, связанные с Col Q, обнаруживаются, в основном, в области нервно-мышечного контакта. В ЦНС позвоночных также экспрессируется АХЭТ, прикрепляемая к экстраклеточному матриксу с помощью Col Q. Причем уровень их активности выше у примитивных позвоночных, у млекопитающих он составляет только 3 % от общей активности. Способ локализации АХЭ в существенной степени зависит от архитектуры синапса и паттерна активности секреции медиатора. Например, в нервно-мышечном

синапсе, где синаптическая щель относительно широка, основную массу АХЭ составляют изоформы, заякоренные между пост- и пресинаптической мембраной, на экстраклеточном матриксе с помощью Col Q. В ЦНС, где синаптическая щель меньше, фермент локализован преимущественно на плазматической мембране, при помощи PRiMA субъединицы.

Таким образом, в области синаптического контакта млекопитающих присутствует две молекулярных формы АХЭ, различающиеся «якорями», с помощью которых каталитические субъединицы АХЭ прикрепляются в синаптической щели (Col Q и PRiMA). Однако, несмотря на общеизвестный факт существования в области нервно-мышечного контакта двух молекулярных форм АХЭ, физиологическая необходимость существования двух различных форм АХЭ не совсем ясна. Поскольку, в настоящее время считается, что каталитические субъединицы, которые составляют эти формы, не отличаются ничем, кроме места локализации (базальная и плазматическая мембраны). Единственное их функциональное отличие, выявленное на настоящий момент - это разная чувствительность молекулярных форм АХЭ к увеличению физической активности. Как было показано, АХЭ адаптируется к мышечной активности весьма селективно. Так, показано, что при тренировке лабораторных животных на тредбане происходит значительное (на 70%) увеличение количества АХЭ заякореной посредством PRiMA, без изменения количества ColQ АХЭ (Fernandez, Hodges-Savola, 1996). Если «медленные» мышцы почти не реагируют на физическую (функциональную) нагрузку, то «быстрые» мышцы отвечают на тренировку путем модификации мышечного пула PRiMA АХЭ. Компонента PRiMA АХЭ либо увеличивается, либо уменьшается в зависимости от того, динамической или тонической мышечной активностью реагирует мышца на упражнения (Jasmin, Gisiger, 1990). Таким образом, можно предположить, что PRiMA АХЭ является неким «мобильным пулом» посредством которого синапсы адаптируются к

увеличению количества ацетилхолина в синаптической щели. Тогда как Со1 С) АХЭ обеспечивает некий базовый уровень АХЭ и в этом качестве вероятно менее подвержена различным типам регуляции.

Родственное семейство изоформ характерно и для БуХЭ (Н.Ф. 3.1.1.8.). Фермент существует в виде растворимых мономеров, димеров и тетрамеров, преимущественно в крови и электровозбудимых тканях. Хотя физиологическая функция БуХЭ до сих пор не известна, считается, что она важна при очистке и детоксикации крови от кокаина, органофосфорных и карбаматных пестицидов, и от боевых отравляющих веществ (Уисе1 е1 а1., 2008). Также предполагается, что ингибиторы БуХЭ могут помочь в лечении болезни Альцгеймера (ВаЛоНт е1 а1., 2009).

1.3. Ацетилхолинэстераза в гладкой мускулатуре

Сокращение скелетной мышцы регулируется только возбуждающим холинергическим мотонейроном. Тогда как гладкомышечная ткань имеет двойной контроль как со стороны неадренэргических нехолинэргических ингибирующих нейронов, так и со стороны возбуждающих нейронов (На1а й а1., 2000).

Гладкомышечные клетки не имеют высокоспециализированных концевых пластинок или терминалей, наблюдаемых в скелетных мышцах. Постсинаптическая мембрана области контакта гладкомышечной клетки с расширением аксона отличается от остальной части плазматической мембраны увеличенным количеством рецепторов к нейротрансмиттерам. Однако, в отличие от скелетной мышцы, в которой рецепторы группируются в области нервно-мышечного синапса, в гладкой мышце рецепторы могут располагаться далеко за пределами синаптического контакта (Гладкая мышца ..., 2006).

Постганглионарные симпатические и парасимпатические нейроны могут иннервировать одни и те же гладкомышечные клетки. При возбуждении этих отделов вегетативной нервной системы высвобождаются нейротрансмиттеры, обладающие различным и, как правило, антагонистическим эффектом. Аксоны симпатических нейронов высвобождают норадреналин, который взаимодействует с адренорецепторами, а аксоны парасимпатических нейронов - ацетилхолин (АХ), действующий на ХР. Кроме вегетативной нервной системы, сокращение гладких мышц регулируется гормонами, ауто/паракринными агентами и другими местными химическими факторами.

Ацетилхолин является основным медиатором между преганглионарыми и постганглионарными нейронами как в симпатической, так и в парасимпатической отделах вегетативной нервной системы, а так же между постганглионарными парасимпатическими нейронами и эффекторными клетками (Lindh, Hokfelt, 1990). Так, показано, что мышечное тело мочевого пузыря крысы иннервируется практически только холинергическими нервными окончаниями, тогда как адренергические окончания редки (Watanabe, Yamamoto, 1979). Холинергическими же является и основное количество возбуждающих нейронов, иннервирующих продольный мышечный слой кишечника (Cousins et al., 1993).

Наличие ХЭ подтверждено в большинстве типов гладкой мускулатуры. При этом, в гладких мышцах из разных органов и тканей обнаруживается разное соотношение БуХЭ и АХЭ. Так, в мочевом пузыре крысы основную часть функционального фермента составляет АХЭ, тогда как БуХЭ не вносит значимого вклада в процесс гидролиза АХ (Nakahara et al., 2003). В гладких мышцах дыхательных путей и стенках легочных артерий и вен не только АХЭ, но также и БуХЭ играет важную роль в регуляции вызванного АХ ответа (Adler et al., 1991; Kotelevets et al., 2005) Оба эти фермента

обнаруживаются как на аксонах нейронов, так и на поверхности ближайших Шванновских клеток и на мембранах близлежащих гладкомышечных клеток (Robinson, Bell, 1967).

Обнаружено, что АХЭ и БуХЭ присутствуют в гладких мышцах не только в заякоренной форме, но также могут выделяться из нервных окончаний в растворенной форме в процессе стимуляции нерва. Функция такого растворенного фермента до конца не выяснена, существует гипотеза о некаталитической функции ХЭ в этом случае (Appleyard, Smith, 1989).

Показано, что в кишечнике основной молекулярной формой является PRiMA-заякоренная АХЭ. Отсутствие ганглиев, иннервирующих мышечный слой кишечника, (врожденный аганглиоз - болезнь Гиршпрунга) приводит к значительному повышению количества АХЭ за счет PRiMA-ассоциированной формы. Существуют данные, о том, что в этом случае АХЭ выполняет некаталитическую функцию, ускоряя адгезию и дифферентацию клеток, а выявленные при этом заболевании гипертрофия нервов и отростков нейронов могут быть результатом такой повышенной экспрессии АХЭ (Bonham et al., 1988; Moore, Johnson, 2005).

1.4. Ингибиторы холинэстераз

Самые ранние заметки о токсическом действии ингибиторов холинэстераз появились еще в конце XIX века при описании вечнозеленого растения Physostigma venenosum. Впервые алкалоид из бобов был выделен в 1864 году, и стал активно использоваться в клинике для лечения глаукомы.

С тех пор появилось большое количество различных ингибиторов холинэстераз как естественного, так и искусственного происхождения. Существует несколько классификаций ингибиторов: по химическому строению, по обратимости связи с ХЭ, по избирательности к АХЭ или БуХЭ, по способности проникать в мозг через гематоэнцефалический барьер и др.

Наиболее потребляема классификация на основе химического строения. По химическому строению выделяют 4 группы: 1) фосфорорганические соединения (ФОС); 2) сложные эфиры карбаминовой кислоты (уретаны и карбаматы); 3) четвертичные аммониевые (алкиламмониевые) соединения и 4) прочие.

1.4.1. Фосфорорганические соединения

Обширную группу антихолинэстеразных веществ составляют фосфорорганические соединения (ФОС). Представителями этих соединений являются диизопропилфторфосфат, тетраэтилпирофосфат, фосфакол, армин, а также пирофос, хлорофос и многие другие. Уже в течении 50 лет ФОС активно используются в качестве инсектицидов, антигельминтных средств, фунгицидов и гербицидов (УеЫа ег а1., 2007).

Механизм острой токсичности ФОС полностью изучен и рассмотрен и, главным образом, заключается в ингибировании АХЭ. ФОС проявляют свое токсическое действие в результате того, что имеют определенное сходство в строении с естественным субстратом ХЭ - АХ (как стереохимически, так и по реакционной способности) (Общая токсикология, 2002).

В отличие от острой токсичности, механизм хронического повреждения ФОС до сих пор не ясен. Хронические вызванные органофосфатами нейропсихиатрические нарушения (ХНН) - основной вариант хронических повреждений, которые могут быть вызваны не только острым отравлением ФОС, но и воздействием малых доз в отсутствии холинергических симптомов. Основные симптомы ХНН включают когнитивный дефицит: ухудшение памяти, способности к концентрации и обучению; изменение настроения: тревога, депрессия, психотические симптомы; другие: хроническая усталость, автономная дисфункция. Механизмы, приводящие к

ХНН, не установлены, но считается, они не зависят от ингибирования АХЭ (Tan et al., 2009).

Большинство ФОС не ионизируются и обладают значительными липофильными свойствами. В связи с этим, при поступлении в организм через желудок, легкие, кожу они легко всасываются. Из-за легкости проникновения в организм, ФОС чрезвычайно опасны в применении (Общая токсикология, 2002). Опасны они и вследствие низкой избирательности -ингибирование АХЭ мозга, сердца или диафрагмы ведет к смерти от остановки дыхания или сердца. Большинство использующихся на сегодняшний день фосфорорганических инсектицидов ингибируют практически в одинаковых концентрациях как АХЭ насекомых, так и АХЭ человека. Это ведет к возрастанию количества случаев отравления людей. Так, в 2001 году в Шри-Ланке 77% смертей от отравления пришлись на смерти от пестицидов (Brahmi et al., 2006), в мире каждый год от отравления пестицидами умирает 1-3 миллиона людей (Ray et al., 2009).

Лекарства на основе ФОС (использующиеся при лечении болезни Альцгеймера, например) вместе с основным эффектом имеют большое количество побочных действий также вследствие низкой избирательности действия. Поэтому идет активный поиск веществ, способных заменить ФОС.

1.4.2. Производные карбаминовой кислоты

К этой группе ингибиторов относят сложные эфиры N-метилкарбаминовой и N-диметилкарбаминовой кислоты. В течение многих лет считалось, что карбаматы вызывают обратимое ингибирование ХЭ. В дальнейшем было показано, что вещества этого типа реагируют с ХЭ подобно ФОС - в две стадии с установлением ковалентной связи. Однако карбамилированные эстеразы гидролизуются значительно быстрее, чем фосфорилированные. Но и в том и в другом случае первоначальная молекула

ингибитора уже не восстанавливается, так что реакция считается необратимой. Благодаря способности угнетать АХЭ в нервной системе производные карбаминовой кислоты являются высокоэффективными инсектицидами (Общая токсикология, 2002).

1.4.3. Алкиламмониевые соли

Ониевые соли отличаются высокой биоактивностью и чрезвычайным разнообразием избирательности влияния на Н-ХР, АХЭ и иные биомишени, приспособленные к взаимодействию с АХ (Розенгарт е1 а1., 1997). Благодаря имеющимся у них положительно заряженным «ониевым» центрам они притягиваются анионными участками в живых тканях, расположенными на поверхности клеток. Они могут инициировать физиологические реакции, которые имитируют действие АХ или противодействуют ему в результате взаимодействия с участками узнавания АХ на Н-ХР, АХЭ и др.

Алкиламмониевые соли занимают наибольшее место среди ониевых обратимых ингибиторов ХЭ. И по количеству, и по использованию в фармакологии и ветеринарии они значительно превосходят ингибиторы иного строения. Большую роль они сыграли в познании механизма каталитической активности ХЭ (Басова, Розенгарт, 2005), поскольку считаются избирательными ингибиторами ХЭ. Высокая к ним чувствительность является одним из основных признаков принадлежности фермента к ХЭ.

В исследованиях Д.А. Харкевича установлено, что для аммониевых периферических миорелаксантов разного химического строения величина ЛД50/ЭД50 («широта миопаралитического действия», определяемая диапазоном между дозами, вызывающими апноэ и паралич мышц туловища) также разная, и эта разница связана, в основном, со строением межониевой части молекулы. Был сделан вывод о наличии определенных отличий в

морфо-функциональной организации Н-ХР в скелетных мышцах разной локализации и о перспективности поиска миорелаксантов с более высокой широтой миопаралитического действия. Актуальность поиска подкрепляется тем, что современная фармакология и токсикология до сих пор не имеет в громадном арсенале холинотропных средств периферического типа действия лигандов с уровнем фармакологической безопасности ЛД50/ЭД50 более 10,0.

Синтезированная в Институте органической и физической химии имени А.Е.Арбузова группа соединений - алкиламмониевых производных 6-метилурацила и аллоксазина - по результатам биохимических исследований in vitro (Аникиенко, 2001; Резник, 1998) была выделена в новый класс избирательных ингибиторов АХЭ. К этому классу соединений относится и исследуемое нами соединение №547 (соед. №547).

1.4.4. Соединения типа №547

Соединения типа №547 являются фосфорилированными или аммониевыми производными 6-метилурацила. В основу их синтеза было положено предположение, что присутствие в молекуле ингибитора ХЭ одновременно N-гетероциклического нуклеотидного основания (урацила), являющегося структурным аналогом фрагмента некоторых коферментов, и специфической фармакофорной (фосфорной или алкиламмониевой) группировки, может обеспечить повышение комплементарности и избирательности взаимодействия ингибитора с ферментом (Аникиенко, 2001; Резник, 1998). В результате широкого скрининга было обнаружено, что высоким уровнем антиферментной активности обладали соединения, имеющие в своем составе бензилдиэтилпентиламмониевый фрагмент, присоединенный к N3 атому или к обоим атомам азота гетероцикла (рис. 1.З.).

N02 -2 Br

Рис. 1.3. Формула соединения №547 (1,3-бис-[5-(диэтил-о-

нитробензиламмонио)пентил]-6-метилурацилдибромид)

Свойства соединения №547 выгодно отличают его от уже существующих ингибиторов ХЭ (BW284c51, прозерин, эзерин, армин). Так, показано, что соединения в наномолярных концентрациях практически необратимо («неравновесный блок») ингибируют АХЭ теплокровных без образования ковалентных связей с ней. При этом:

комплекс «соединение-АХЭ» устойчив к диализу и гель-фильтрации; ингибирование АХЭ прогрессирует во времени (как при действии VX) (Аникиенко, 2001; Резник, 1998).

На препаратах АХЭ холоднокровных (электрический угорь, яд кобры) соединение показало обратимый тип ингибирования. По сравнению с БуХЭ избирательность ингибирующего действия соединения в отношении АХЭ достигает 5 порядков (100 ООО крат), что позволяет говорить о соединении №547 как о селективном ингибиторе АХЭ.

Ранее в опытах на целых животных in vivo были выявлены определенные видовые различия в их реакции на соединение №547: собаки оказались наиболее уязвимыми к его токсическому действию (ЛД50=0,51 мкмоль/кг), нежели мыши (ЛД50=1,17 мкмоль/кг) и крысы (ЛД50=2,91 мкмоль/кг). При этом именно в опытах на крысах для соединения №547 было получено наиболее оптимальное сочетание параметров токсичности, миорелаксантной активности и фармакологической безопасности: ЛД50=2,91 (2,29-3,57) мкмоль/кг, ЭД50=0,009 (0,008-0,01) мкмоль/кг, ЛД50/ЭД50=323,3

(257,30^-390,05), длительность миорелаксантного действия (7-8 суток), уникальное для класса ингибиторов холинэстераз (Зобов, 2006).

В радиолигандных исследованиях на препаратах синаптических мембран мозга крыс показано низкое сродство соединения №547 к рецепторам бензодиазепина и к М1-ХР (мозг).

В то же время, доказано высокое сродство и избирательность блокирующего действия соединения №547 в отношении М2-ХР (сердце). Этот факт согласуется с отсутствием поражающего анти-ХЭ действия соединения №547 на работу сердца in vivo даже в абсолютно-смертельных дозах (Abramochkin et al., 2009)

В опытах in vivo миорелаксантный эффект наступал в условиях действия доз в 100 и более раз меньших, чем смертельные дозы (т.е., доз, вызывающих остановку дыхания). Максимальный миорелаксантный эффект соединения №547 (процент неспособных к бегу животных) приходился на интервал 4 часа - 1 сутки после введения. Причем у 40% животных эффект сохранялся на 7 сутки (Зобов, 2006).

Отмечено, что периодические (в интервале 1-7-суток после введения соединения) принудительные попытки к пробежке на третбане провоцировали у тарифицированных животных драматическое обострение нарушений нервно-мышечной передачи, которое проявлялось в виде сильного мышечного тремора, переходящего в судорожные подергивания конечностей, исключающие их координированную локомоторную активность даже спустя 7 суток после однократного введения соединения №547. При этом тарифицированные собаки, несмотря на заторможенность и адинамию, сохраняли все основные рефлексы (пищевой, оборонительный, исследовательский), а также способность к медленному перемещению по горизонтальной плоскости пола (Зобов, 2006).

Соединение №547 относится к разряду псевдонеобратимых (или неравновесных) ингибиторов (Аникиенко и др., 2001); время жизни комплекса «лиганд-АХЭ» может превосходить период полуобновления АХЭ (не менее 7 суток; (Guerra et al., 2005)). Важной причиной высокой длительности миорелаксантного действия соединения №547 является его большая молекулярная масса («850) и соответственно большое количество контактных точек в образующемся комплексе. Последнее обстоятельство также ведет к возрастанию времени ориентации лиганда на АХЭ и времени, необходимого для конформационной подстройки взаимодействующих молекул, что также характерно для соединения №547.

Н-холиноблокирующие эффекты соединения №547 обратимы в нервно-мышечных синапсах как лягушки, так и крысы, что указывает на сходство в строении аналогичных участков Н-ХР холоднокровных и теплокровных (Зобов, 2006).

В опытах на изолированных скелетных мышцах разного функционального типа («быстрая», «медленная», «смешанная») было показано, что соединение №547 не влияет на потенциал покоя мышц, но изменяет амплитудно-временные параметры МТКП (Петров и др., 2004). Также соединение №547 снижало интенсивность спонтанной секреции медиатора в m.EDL, причем те же концентрации соединения не вызывали достоверных изменений в диафрагме (Ковязина и др., 2005). В условиях высокочастотной стимуляции нерва соединение №547 вызывало падение амплитуд ГПСП m.EDL, увеличение концентрации соединения приводило к «выпадениям» отдельных ГЖП вплоть до полного исчезновения ПКП при сохранении генерации единичных МПКП на фоне стойкой деполяризации постсинаптической мембраны (Петров и др., 2004).

Несмотря на большой объем данных о воздействии соединения №547 на различные организмы (беспозвоночные, мыши, крысы, собаки; Зобов, 2006),

различные функциональные типы мышц (сердечная, «быстрая», «медленная» мышцы; Ковязина и др., 2004), отсутствуют данные о действии соединения на гладкую мускулатуру. Нет также данных, объясняющих возможный механизм, обеспечивающий избирательность действия данного соединения.

1.5. Ингибиторы ацетилхолинэстеразы в медицинской практике

Нарушение холинергической передачи ведет к многочисленным расстройствам, как на периферии, так и в центральной нервной системе. Ингибирование фермента АХЭ приводит к накоплению медатора ацетилхолина в синаптической щели. Именно поэтому антиАХЭ препараты традиционно применяются в медицинской практике при заболеваниях, лечение которых требует продления времени действия медиатора ацетилхолина в синаптической щели. Недавние исследования показали эффективность лечения ингибиторами деменций, сопровождающих болезнь Альцгеймера и Паркинсона (Poewe et al., 2008; Robles, 2009). Описано успешное применение антиАХЭ препаратов и при других расстройствах, при которых возможны нарушения в холинергической системе, включая гиперкинетическое расстройство с дефицитом внимания, аутизм, расстройства сна, шизофрению, маниакально-депрессивный психоз, алкоголизм (Cummings, 2000; Keefe et al., 2008).

Применяются ингибиторы АХЭ и для снятия паралича мышц, вызванного недеполяризующими мышечными релаксантами, использующимися при операциях (Caldwell, 2009; Shear, Martyn, 2009).

Широкое применение нашли ингибиторы АХЭ для активации работы гладкой мускулатуры. Наиболее часто его применяют при болезни Гиршпрунга (аганглиоз кишечника), атонии кишечника, вызванной воспалением, травмой, инфекцией или химическими, агентами, использующимися при лечении рака (Lee et al., 2010).

Ингибиторы АХЭ также эффективны при лечении миастении Гравис и миастеноподобных расстройств, таких как врожденный миастенический синдром, миастеничный синдром Ламберта-Итена. В условиях отсутствия способов устранения причины болезни, ингибиторы, как симптоматическое лечение, являются одними из наиболее эффективных средств (Brenner et al., 2008; Skeie et al, 2010).

1.6. Миастения Гравис

Миастения Гравис (МГ) - это не наследуемое (вызванное) аутоиммунное заболевание. Болезнь проявляется мышечной слабостью и сильным утомлением после повторных движений. В 85% случаев МГ начинается с появления слабости мышц глаз, представленной птозами и/или диплопией. В большинстве случаев в течение 2 лет болезнь прогрессирует до генерализованной формы с поражением мышц лица, шеи, конечностей. Вовлечение бульбарных и шейных мышц может частично нарушать речь человека, усложнять процесс приема пищи, а поражение дыхательных мышц может быть опасно для жизни (Vincent, 2008)

МГ обычно проявляется у взрослых молодого и среднего возраста, чаще у женщин, чем у мужчин. Детская миастения встречается довольно редко в Европе и Америке, однако в странах Азии составляет около 50% от всех случаев болезни (Meriggioli, Sanders, 2009).

В настоящее время отмечен рост количества больных с вызванной МГ, что связанно как с улучшением качества диагностики, так и с увеличением продолжительности жизни человечества. Количество новых случаев заболевания варьирует от 1.7 до 10.4 на миллион жителей (в зависимости от места исследования), наиболее высокий показатель отмечен в Барселоне, Испания, где частота появления составляет 21 случай на 1 миллион жителей (Casetta et al., 2010).

Не смотря на длительное активное изучение МГ, до сих пор не известны причины развития заболевания. В 30% возможной причиной развития МГ является гиперплазия тимуса (Berrih et al., 1984), в остальных случаях, по видимому, - факторы внешней среды (стресс, инфекционное заболевание) и/или генетическая предрасположенность (Giraud et al., 2001).

На данный момент на основе клинических проявлений и связанных с ними признаков МГ делят на подтипы по области поражения (окулярная или генерализованная), по времени появления (ранняя и поздняя) и длительности развития, участию тимуса и набору аутоантител. Правильное определение этих клинических подтипов дает возможность правильно рассчитать стратегию лечения и прогнозы развития (Meriggioli, Sanders, 2009).

В большинстве случаев симптомы мышечной слабости и быстрого утомления при МГ обсловлены снижением количества активных ацетилхолиновых рецепторов в нервномышечном соединении за счет выработки организмом антиАХР аутоантител. Доказательство того, что АХР являются основной мишенью для антител при МГ, были получены в 1973 году Патриком и Линдстром (Patrick, Lindstrom, 1973). Они показали, что у кроликов, иммунизированных очищенными АХР мышц, развиваются миастеноподобные симптомы, впервые создав модель МГ на животных (экспериментальная аутоиммунная МГ). Позднее было показано, что амплитуда миниатюрных потенциалов концевой пластинки в мышцах крыс с ЭМГ значительно снижена по сравнению с контрольными значениями. Это доказывало снижение количества функционально активных АХР концевой пластинки, так как остальные параметры работы синапса (свойства отдельных каналов, количество выделяемого АХ) не менялись (Alema et al., 1981).

АнтиАХР антитела воздействуют на нервномышечную передачу как минимум тремя способами: ускоряют деградацию молекул АХР, сшивая их

друг с другом, (процесс антигенной модуляции); блокируют функцию рецептора; прикрепляются и активируют комплемент в НМС (Conti-Fine et al., 2006).

Антигенное модулирование - это способность антител сшивать две молекулы антигена, таким образом, запуская клеточный сигнал, вызывающий ускорение эндоцитоза и деградации сшитых молекул. IgG больных МГ вызывает антигенную модуляцию АХР мышц как in vivo, так и in vitro. Если ускорение деградации не компенсируется усилением синтеза АХР, это приводит к уменьшению доступных АХР в НМС и к появлению миастеничных симптомов (Conti-Fine et al., 2006). Недавними исследованими было показано, что в НМС мышей с экспериментальной МГ наблюдается повышенная экспрессия а-субъединиц АХР, однако же большая часть образующихся заново рецепторов функционально не активна, а значит не способна компенсировать функцию. Возможными причинами появления таких «инертных» рецепторов считаются морфологические изменения в эндоплазматическом ретикулуме, мешающие правильному фолдингу молекулы субъединицы рецептора, а также изменение сплайсинга субъединицы (Sheng et al., 2009).

Функциональный блок АХР за счет прикрепления антитела к сайту связывания АХ считается основным механизмом развития мышечной слабости на ранних стадиях болезни, когда еще не происходит морфологических изменений в НМС. Большинство больных МГ имеют низкий уровень антител, распознающих сайт связывания АХ, однако они могут блокировать АХР, несмотря на низкую концентрацию, и вызывать острые миастенические кризы (Conti-Fine et al., 2006).

По некоторым данным фетальные АХР более чувствительны к действию антиАХР антител (Soltys et al., 2008). Возможно, этим и объясняется крайне высокая чувствительность к антиАХР антителам наружных мышц глаза, так

как эти мышцы даже в зрелом состоянии продолжают в течение жизни экспрессировать фетальные АХР (Horton et al., 1993).

На сегодняшний день известно, что большинство высокоафинных антиАХР антител являются иммуноглобулинами G класса. Описано и получено большое количество антиАХР антител, различающихся по сайту связывания с рецептором (Gomez et al., 2010). Так, было обнаружено, что эпитопы для данных аутоантител расположены на всех четырех субъединицах АХР, однако, две трети антител прикрепляются к определенному участку на поверхности а-субъединицы. Этот участок был назван основным иммуногенным участком (Tzartos et al., 1987). Проведение картирования аминокислотной последовательности а-субъединицы позволило определить точное положение основного иммугогенного участка -он располагается между 6-85 или 46-127 аминокислотными остатками а-субъединицы (Lindstrom et al., 2008; Papadouli et al., 1993; Tzartos et al., 1988). Наряду с очищенными АХР из электрического органа Torpedo californica, и АХР из мышц млекопитающих, искусственно полученные последовательности основного иммуногенного участка используются для получения моделей МГ на животных (Baggi et al., 2003; Souroujon et al., 2010).

Более чем у 20% больных МГ отсутствуют антиАХР антитела в сыворотке крови, их соответственно называют серонегативными больными. В 3-70% случаев у таких больных обнаруживаются антитела к мышцеспецифичной тирозинкиназе (МСК). При этом часто наблюдается генерализованная форма МГ с поражением мышц лица, шеи, плеч и дыхательных мышц (Farrugia et al., 2006). Более низкая частота встречаемости больных с антиМСК антителами среди серонегативных больных отмечена в отдельных этнических группах или геграфических

областях (Китай, Норвегия); это может отражать факторы окружающей среды или генетические факторы чувствительности (Conti-Fine et al., 2006).

МСК является важнейшим элементом в системе кластеризации и плотной упаковки АХР в НМС. Сигнал, опосредованный агрин/МСК взаимодействием запускает и повышает рапсин-зависимую кластеризацию АХР и других постсинаптических белков в области синапса (Madhavan et al., 2009). Результатом такой кластеризации является образование на вершинах складок концевой пластинки высокоструктурированной гексагональной решетки из АХР с плотностью расположения рецепторов - 10 тыс. молекул на 1 мкм2 (Geng et al., 2009).

В 2008 году было показано, что введение мышам антител больных с МСК-МГ приводило к уменьшению количества постсинаптических АХР до 22% по отношению к контролю, а также деградации нервной терминали и снижению плотности кластеризации АХР (Cole et al., 2008). У больных с антиМСК антителами не обнаружено изменений в количестве постсинаптических складок и значительного уменьшения плотности АХР. Анти-МСК антитела являются преимущественно IgG4 изотипом. IgG4 антитела функционально отличаются от других подклассов своей антивоспалительной активностью (Gomez et al., 2010). IgG4 не активируют классический путь комплемента и не вызывают зависимую от антител цитотоксичность. Более того, IgG4 подвергаются посттрансляционной модификации, названой обменом Fab участка, которая предотвращает попарное «сшивание» антигенов. Эти открытия дают полагать, что МСК-МГ может отличаться по этиологическим и патологическим механизмам от АХР-МГ (De Baets, 2010).

В плазме больных МГ, кроме двух основных классов, обнаруживаются также и другие аутоантитела. Их наличие усиливает патогенное действие антиАХР и антиМСК антител. Так, было показано, что присутствие антител к

потенциалзависимым кальциевым каналам усиливает тяжесть проявления симптомов МГ и сопутствует появлению миокардитов и/или миозитов (Suzuki et al., 2007). При позднем развитии болезни повышается вероятность появления антител к тайтину и рианодиновым рецепторам (Romi et al., 2007; Wang et al., 2010). У больных, негативных на антиАХР антитела, часто присутствуют антитела к ацетилхолинэстеразе (Wang et al., 2010). Наличие таких минорных антител в сыворотке крови больных МГ в большинстве случаев связано с развитием гиперплазии тимуса или тимомы (Vrolix et al., 2011)

Патогенез заболевания не ограничивается снижением количества активных АХР за счет аутоантител; прикрепление антител к мишеням в НМС запускает широкий спектр иммунологических реакций, приводящих к деградации сиинапса в целом. Одним из главных запускаемых процессов является активация системы комплемента. В 1959 - 1960, Симпсон и Настак независимо друг от друга отметили, что уровень сывороточного комплемента больных МГ коррелирует соответственно с проявлением симптомов заболевания, а в мышцах иногда наблюдается воспалительная инфильтрация (Nastuk et al., 1959), Simpson et al., 1960). По-видимому, классический каскад комплемента является основным механизмом потери АХР в нервномышечном соединении при ЭМГ и МГ, а недостаток выработки регуляторных белков комплемента - генетически-обусловленной предрасположенностью развития МГ (Kusner et al., 2008).

На данный момент опубликовано большое количество работ, посвященных изучению механизмов работы системы комплемента, а также значения других систем иммунологической защиты (клеточный иммунитет) (Chamberlain-Banoub et al., 2006; Lennon et al., 1978; Mu et al., 2009). Следует отметить, что одной из отличительных особенностей МГ является

избирательное поражение отдельных групп мышц. Так чем же обусловлена избирательность поражения миастенией?

Мышечная слабость, вызванная снижением количества функционирующих АХР, обусловлена тем, что формирующийся потенциал концевой пластинки (ПКП) не достигает порогового значения, а значит, не генерируется ПД и мышца не сокращается. ПКП, генерирующийся в нормальном НМС, больше, чем порог, необходимый для генерации ПД. Эта разница может отличаться для отдельных мышц. Фактор надежности нервномышечной передачи считается как разница между ПКП и порогом потенциала, необходимого для генерации ПД мышцы. Снижение этого фактора - электрофизиологический дефект, вызывающий симптомы МГ (Ruff, Lennon, 2008).

На амплитуду ПКП влияет множество факторов - квантовый состав, проводимость и плотность постсинаптических АХР, активность АХЭ в синаптической щели (Hughes et al., 2006). Также, постсинаптические складки направляют местные токи концевой пластинки в сторону натриевых потенциалзависимых каналов, расположенных на дне складок, таким образом, увеличивая фактор надежности. Снижение количества или активности молекул АХР в НМС снижает амплитуду ПКП, однако он может быть все еще нормальным в состоянии покоя; когда квантовый состав снижается после ритмической стимуляции, ПКП может упасть ниже порога генерации ПД, что и происходит при МГ (Conti-Fine et al., 2006). Поэтому одним из основных способом диагностики, наряду с серологическим тестом на антитела, является применение электромиографических тестов. Все они основаны на регистрации и анализе мышечных ответов при стимуляции двигательного нерва. В норме амплитуда сокращения при ритмической стимуляции нерва не отличается в пачке более чем на 10 %, тогда как при патологиях нервно-мышечной передачи наблюдается более значимое

падение (декремент) амплитуды (Mansukhani, Doshi, 2008). Наиболее распространенным тестом является регистрация ответа мышцы при стимуляции нерва с низкой частотой (2 Гц). Однако такой тест обладает крайне низкой чувствительностью (17 % для окулярной и 85 % для генерализованной формы). Более высокая чувствительность у теста с высокочастотной стимуляцией нерва. Регистрация потенциалов отдельных мышечных волокон (электромиография отдельных волокон) позволяет ставить диагноз с еще большей точностью (Meriggioli, Sanders, 2009).

Свойства НМС различаются у разных мышц и могут влиять на чувствительность мышцы к МГ. К таким свойствам можно отнести количество и глубину складок на постсинапсе, количество и плотность АХР и натриевых каналов, наличие защиты от повреждения системой комплемента (см. выше), квантовый состав ПКП, активность холинэстеразы и т.д (Conti-Fine et al., 2006). Это хорошо показано на экстраокулярных мышцах глаза (ЭОМГ), которые особенно чувствительны к развитию миастенической слабости. Нервномышечные синапсы ЭОМГ отличаются от таковых скелетных мышц. У них менее глубокие постсинаптические складки, и поэтому меньшее количество постсинаптических АХР и натриевых каналов, что снижает фактор надежности передачи (Fischer et al., 2005). Также они работаю при очень высоких частотах стимуляции, что делает их подверженными утомлению. Они меньше синтезируют внутренних регуляторов комплемента, что делает их более чувствительными к повреждению комплементом (Soltys et al., 2008). Все это в совокупности приводит к поражению ЭОМГ на самых ранних стадиях развития болезни.

В скелетных мышцах в первую очередь поражаются медленные мышечные волокна. НМС быстрых мышечных волокон обладают очень большим квантовым составом, большой глубиной складок (Wood et al., 1997) и более высокой чувствительностью к АХ (Sterz et al., 1983), чем НМС

медленных мышц, а также у них высокая концентрация натрия в области НМС (Ruff et al, 1996). Эти свойства делают быстрые волокна менее чувствительными к МГ, чем медленные волокна.

1.7. Миастеноподобные расстройства 1.7.1. Врожденный миастенический синдром

Врожденный миастенический синдром (ВМС) представляет собой гетерогенную группу генетически обусловленных расстройств, при которых фактор надежности нервномышечного соединения снижается за счет различных механизмов. Как и большинство генетических заболеваний, ВМС имеет очень редкую частоту встречаемости и носит чаще всего семейных характер. В большинстве случаев ВМС проявляется после рождения или раннем детском возрасте. В отличие от МГ у больных с ВМС тест на антитела к АХР отрицателен. Симптомы большинства видов ВМС сходны и обычно проявляются сильной резкой слабостью мышц головы, шеи, конечностей и дыхательных мышц (Engel et al, 2010).

Все описанные случаи ВМС разделяют на три категории по месту дефекта в синапсе: пресинаптические, синаптические и постсинаптические (таб 1.1.). Насчитывается не менее одиннадцати генов, мутации в которых ведут к нарушению работы НМС. К настоящему времени практически для каждого вида нарушения определены ответственные гены.

Наиболее часто встречающимися мутациями, вызывающими ВМС, являются: мутации холинацетилтрансферазы (Ohno et al, 2001), АХЭ (Engel et al, 1977), а также мутации, затрагивающие строение АХР рецепторов. В последнем случае мутации либо усиливают (синдром медленных каналов), либо снижают реакцию на АХ (синдром быстрых каналов) (Brownlow et al, 2001; Croxen et al, 1997; Engel et al, 2002). Остальные мутации описаны по большей части в единичных случаях (Engel, 2010).

Таблица 1.1. Классификация фрожденных миастенических синдромов (по Engeletal., 2010)

Место Нарушение (* - ген, ответственный за дефект, определен)

поражения

Дефицит холинацетилтрансферазы *

ох ОО Недостаточность синаптических везикул и снижение

О Й И Я о квантового выброса

Врожденный синдром Ламберта-Итена

0) Он С Другие пресинаптические дефекты

Синапс (15%) Недостаточность АХЭ концевой пластинки *

Кинетические дефекты АХР±недостаток АХР *

Основное - недостаток АХР± минорные кинетические

дефекты *

о4-ОО Г~» Отсутствие рапсина *

о К (Я Вок-7 миастения *

д к о н Дефект натриевых каналов *

о о с Отсутствие плектина *

1.7.2. Миастенический синдром Ламберта-Итена

Миастенический синдром Ламберта-Итена - это пресинаптическое расстройство нервномышечной передачи, характеризующееся уменьшением количества выделяющихся квантов АХ, что ведет к развитию проксимальной слабости, депресии сухожильных рефлексов и посттетанической потенциации; кроме того, присутствуют изменения работы автономной вегетативной нервной системы. Заболевание вызывается появлением аутоантител к потенциалзависимым кальциевым каналам (ПКК) Р/С) типа терминали мотонейрона. У примерно 60% больных с МСЛИ обнаружен

мелкоклеточный рак легких. В данных случаях, по-видимому, раковые клетки запускают продукцию данных аутоантител; в случаях, когда рак не обнаружен, тригерный механизм не известен (МаскЙБОп е1 а1., 2001).

1.8. Лечение МГ и ВМС

Современные методы лечения МГ основаны на применении ингибиторов холинэстераз, общей иммуноподавляющей терапии и кортикостероидов, иммуномодулирующей терапии широкого спектра, такой, как замена плазмы и внутривенное введение иммуноглобулинов, а также тимоэктомии для некоторых больных (Вае1з, 2010).

Попытки рационального лечения МГ начались в 193 Ох годах. Большой успех был достигнут в 1934 году, когда врач одного из Лондонских госпиталей, Мэри Уалкер, заметила, что признаки МГ сходны с признаками курарного отравления, которое лечили физостигмином, ингибитором холинэстераз. Она показала, что физостигмин быстро снимает симптомы МГ, что сделало антиАХЭ лекарства основными при лечении МГ. Позднее, в 1954-55 годах, были получены пиридостигмин бромид и амбенониум хлорид, которые действовуют дольше физостигмина, и вызывают меньше побочных действий (Риг^а, 81а1Ье^; 2009).

Эффективность антиАХЭ препаратов в этом случае обусловлена их способностью потенцировать эффекты эндогенного ацетилхолина (АХ) за счет уменьшения скорости его ферментативного гидролиза.

Как уже говорилось выше в главе про миастению, при патологии ПКП не всегда достигает порога, а, значит, мышечное волокно сокращается не на каждый стимул. При ингибировании АХЭ молекулы медиатора, активировавшие холинорецептор, за счет продления времени их существования в синаптической щели, способны активировать больше

холинорецепторов, что приводит к увеличению амплитуды ПКП и восстановлению его способности запускать ПД мышечного волокна.

На сегодняшний день ингибиторы АХЭ являются наиболее распространенным видом симптоматического лечения МГ и МСЛИ. В случаях непрогрессирующей окулярной формы слабой или средней силы применение ингибиторов (чаще всего пиридостигмин бромид) может быть достаточно для адекватного лечения. Больным с бульбарными симптомами ингибиторы назначают для облегчения приема пищи (Meriggioli, Sanders; 2009). Для лечения подбираются такие дозы, чтобы максимально купировались признаки мышечной слабости, и минимально провлялись побочные мускариновые действия (слюноотделение, брадикардия, потливость, диарея). Отмечено, что назначение ингибиторов больным, положительным на МСК антитела, часто не вызывает улучшения клинических проявлений, а в некоторых случаях может вызывать ухудшение состояния и фасцикуляцию мышц (Skeie et al., 2010).

В случае ВМС ингибиторы ацетилхолинэстеразы являются единственными средствами лечения. Исключениями являются синдром медленных каналов, когда назначаются блокаторы АХР (квинидин сульфат или флюоксентин), и синдром недостатка АХЭ, лечения для которого не найдено (Engel, Sine, 2005).

При переходе болезни в стадию генерализованной формы, назначается иммуноподавляющая терапия стероидной и нестероидной природы. Считается, что в некоторых случаях прием низких доз преднизона (кортикостероида) при окулярной форме МГ может снизить вероятность распространения болезни на другие мышцы. Обычно преднизон назначают тогда, когда симптомы МГ не могут купироваться только ингибиторами холинэстераз (Hyun et al., 2011). Эффект кортикостероидов развивается медленно, при заметном улучшении они назначаются для хронического

приема. Такое лечение, не смотря на высокую эффективность, может вызывать серьезные хронические побочные эффектами, а также повышать риск развития инфекции и злокачественных новообразований (Meriggioli et al., 2008).

Эффект нестероидных иммуносупрессоров (азатиоприн) может развиваться в течение года. Обычно в сочетании с преднизоном проявляется максимальный эффект. Высокие дозы азатиоприна, особенно при длительном применении, может приводить к повреждению печени и развитию лейкопении (Meriggioli, Sanders, 2009).

Плазмаферез и введение иммуноглобулина обычно применяется при миастенических кризах - острой мышечной слабости, распространяющейся на дыхательную мускулатуру (Skeie et al., 2010).

В 30% случаев у больных с МГ обнаруживается гиперплазия тимуса или тимома. В данных случаях назначается тимоэктомия, после которой, обычно, наблюдается резкое улучшение состояния больного (Gilboa-Geffen et al., 2007).

Огромная работа проводится сейчас во всем мире по поиску нового эффективного лечения МГ, имеющего минимальные побочные эффекты. К таким разработкам можно отнести клеточную терапию (дендритные клетки) (Meriggioli et al., 2008), создание вакцин против МГ (Berrih-Aknin et al., 2005), поиск избирательных ингибиторов АХЭ, как средство иммуномодуляции (Punga, Stalberg, 2009), получение селективных ингибиторов АХЭ для минимизации побочных эффектов. Все данные разработки находятся на доклинических этапах исследования и не показали эффективности в применении на людях.

1.9. Экспериментальная аутоиммунная миастения Гравис (ЭАМГ)

Миастения Гравис и ЭАМГ являются уникальными среди остальных аутоиммунных заболеваний, так как: мишень аутоиммунной атаки, АХР,

выделены, охарактеризованы и сиквенированы; экспериментальная модель точно повторяет болезнь человека; доступно множество разнообразных лигандов (агонистов и антагонистов) к АХР, а также естественных источников большого количества АХР (например, электрические органы скатов и угрей). Поэтому такая ЭАМГ широко используется для изучения различных аспектов миастении человека, включая действие различных фармакологических препаратов на работу нервно-мышечной передачи (Boneva et al., 2006). Чаще всего ЭАМГ исследуется на крысах и мышах. Как и в случае МГ людей, ЭАМГ чаще и сильнее развивается у животных женского пола, поэтому чаще всего в опытах используются самки.

Существует 4 способа создания модели ЭАМГ: иммунизация АХР, пассивное введение поли- или моноклональных анти-АХР антител, введение сенситизированных к АХР клеток иммунной системы и иммунизация аналогами АХР (анти-АХР лиганды антител). Наиболее распространенным и эффективным способом считается иммунизация АХР, выделенными из электрических органов Torpedo californica, Electrophorus electricus (Pachner,1986). Позднее было показано, что иммунизация животных пептидом, аналогичным последовательности «основного иммуногенного участка» АХР, также приводит к развитию признаков мышечной слабости. Причем ЭАМГ у крыс развивалась только в случае введения пептида-аналога участка крысиного АХР, но не Torpedo californica (Baggi et al., 2003).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Объект исследования

Эксперименты проводили на лабораторных беспородных крысах обоих полов весом 250-300гр., на мутантных мышах, нокаутированных по БуХЭ((-/-)БуХЭ), АХЭ (линия Dell) и отдельным молекулярным формам АХЭ (-/PRiMA; -/-ColQ), весом 25-30 гр. Опыты на мутантных мышах проводились в лаборатории Университета Рене Декарта (Париж), животные были любезно предоставлены Dr. Krejci (Université Paris Descartes, Paris)

Животных умерщвляли перерезкой сонных артерий под эфирным наркозом. Электрофизиологические эксперименты проводили на изолированных мышечных препаратах диафрагмы (т. Diaphragma) и длинного разгибателя пальцев (т. EDL - Extensor Digitorum Longus). Тензометрические исследования проводились на изолированных препаратах гладкой мускулатуры мочевого пузыря и прямой кишки крысы. Изолированные препараты помещали в экспериментальную ванночку, через которую протекал аэрированный карбагеном (02 95%, С02 5%, в течение 45 мин) раствор Рингера-Кребса следующего состава (ммоль/л): NaCl - 120.0, КС1 - 5.0, СаС12 - 2.0, MgCl2 - 1.0, NaHC03 - 11.0, NaH2P04 - 1.0, глюкоза -11.0, рН раствора поддерживали на уровне 7.2-7.4 при температуре 20±2 С0.

Соединение №547, а также другие представители производных 6-метилурацила были синтезированы в лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН. Ингибиторы АХЭ -пиридостигмин бромид и неостигмин (прозерин), а так же все реактивы для биохимических исследований приобретены в «Sigma-Aldrich».

2.2. Методы исследования 2.2.1. Электрофизиологические исследования

Миниатюрные потенциалы/токи концевой пластинки (МПКП/МТКП) регистрировали с помощью стандартной микроэлектродной техники с использованием микроэлектродов из стекла Пирекс, заполненых раствором КС1 (2.5 моль/л) с сопротивлением 10-15 МП. При исследовании влияния соединения №547 на амплитудно-временные параметры МТКП мембранный потенциал фиксировали на уровне -60 мВ. После предварительного усиления сигналы записывали на жесткий диск компьютера и анализировали с помощью оригинальной компьютерной программы. Анализировали следующие параметры МПКП - амплитуду, постоянную времени спада (т). В каждом препарате регистрировали от 64 до 128 МПКП в 5-7 мышечных волокнах в контроле, затем - между 30 и 60 мин действия ингибиторов. Для предотвращения спонтанных мышечных сокращений, вызванных ингибированием АХЭ, в омывающий мышцу раствор добавляли блокатор 1Ча+-каналов тетродотоксин (0.1 цмоль/л).

Достоверность различий параметров до и после воздействия препарата проверяли по t критерию Стьюдента на уровне значимости р<0.05. В таблицах и на рисунках указаны средние значения исследуемых параметров и их средние квадратичные отклонения.

2.2.2. Тензометрические исследования

Выделенный мочевой пузырь разрезали на полоски шириной примерно 2-3 мм и длиной 10 мм. Нужный сегмент кишки выделяли, аккуратно (с минимумом растяжения) очищали от внутреннего содержимого кишки. Затем промывали и разрезали на участки длиной 10 мм. Далее препараты использовали для измерения механического ответа. Один конец препарата прикрепляли нитью из хлопка к изометрическому датчику (Ugo Basile,

модель №7004, средняя чувствительность), другой конец закреплялся держателем. Сокращения регистрировались и измерялись с помощью оригинальной компьютерной программы Virtual Chart Recorder 1024x768. Препараты помещали в ванночку объемом 20 мл, заполненную раствором Рингера-Кребса, аэрирующимся карбагеном. Препараты растягивали с нагрузкой 1 грамм. Следующие 30 минут позволяли ткани стабилизироваться. Раствор в ванночке меняли на «свежий» каждые 15 минут. Сокращения препаратов мочевого пузыря вызывали добавлением в омывающий препарат раствор АХ (100 цмоль/л). Затем препараты «отмывали» раствором без медиатора и дожидались восстановления тонуса гладкой мускулатуры до уровня, предшествующего сокращению. Препараты инкубировались в течение 20 минут в растворе, содержащем различные концентрации ингибитора, а затем определась их реакция на добавление АХ (100 |1Моль/л).

Сокращения препаратов толстой кишки крысы вызывали стимуляцией интрамуральных нейронов электрическим полем. Для этого 2 платиновых электрода помещали в ванночку на расстоянии 10 мм от продольной оси препарата. Препарат стимулировался электрическим сигналом с амплитудой 50 V, длительностью стимула 0,5 мс, частотой 50 Гц в течении 15 сек. (стимулятор ЭСЛ-2 (Россия). Следующий период стимуляции начинали после восстановления уровня напряжения препарата до уровня, предшествовавшего стимуляции (примерно 5 минут). Эксперимент начинали, когда в ответ на стимуляцию препарат отвечал стабильным сокращением, повторяющимся в течение времени. Ингибиторы добавляли в ванночку за 20 минут до стимуляции. Сила сокращения выражалась в граммах. На графиках результаты представлены в процентах, как отношение силы сокращения после добавления ингибитора по отношению к контрольному сокращению в процентах.

2.2.3. Определение активности АХЭ

Биохимическое исследование ингибиторной активности новых синтезированных соединений проводилось на АХЭ эритроцитов человека (Sigma). Фосфатный буфер (100 мМ, рН 8.0), содержащий АХЭ (0.01 мг/мл), инкубировали с различными концентрациями соединений в течение 20 минут. Регистрацию ферментативной реакции осуществляли согласно методу Элмана (Ellman et al, 1961). Зависимость активности АХЭ от концентрации ингибитора оценивали с помощью уравнения Хилла (Hill), рассчитывая среднеэффективную концентрацию - 1С5о

2.2.4. Экспериментальная аутоиммунная модель миастении Гравис

Экспериментальную аутоиммунную модель миастении Гравис (ЭАМГ) создавали по методике, описанной в статье Baggi et al., 2003. Для экспериментов отбирались самки крыс в возрасте 6-8 недель. Животных иммунизировали подкожным введением белка (иммунодоминантный эпитоп Т-клеток, картированный как последовательность 97-116 а-субъединицы АХР), растворенного в CFA (complete Freund's adjuvant - стимулятор иммунного ответа). Введение проводили из рассчета 50 мкг белка на животное. Через 30 дней повторяли иммунизацию введением того же количества белка, растворенного в IFA (incomplete Freund's adjuvant). Еще через 30 дней подтверждали развитие мышечной слабости.

Развитие мышечной слабости диагностировалось по наличию выраженного декремента амплитуды интегрального потенциала действия мышц задних конечностей крысы при высокочастотной стимуляции седалищного нерва (40Гц, 200 стимулов), а, также по уменьшенной, по сравнению с контрольными неиммунизированными животными, амплитудой МТКП m. EDL. Регистрацию М-ответов проводили под эфирным наркозом. Животное фиксировали на брюшной стороне, с задних конечностей удаляли

шерсть, кожу протирали спиртом. Стимуляцию седалищного нерва проводили игольчатыми электродами в бедренной области. Регистрацию ответов мышц задних конечностей проводили накожными электродами, располагая один в области пяточного сухожилия, а второй в области брюшка икроножной мышцы. Электроды вместе с конечностью хорошо фиксировали, чтобы предотвратить сдвигание электродов при сокращении. Регистрацию и обработку ответов проводили оригинальной программой, созданной в нашей лаборатории. Пиридостигмин и соединение №547 разводились в физиологическом растворе и вводились интраперитонеально. Далее делали миографию через 15, 30, 45 и 60 минут после введения.

Электрофизиологические эксперименты, индукция и диагностика экспериментальной миастении Гравис выполнены совместно с К.А. Петровым (к.б.н., ст. науч. сотр. лаб. химико-биологических исследований ИОФХим. А.Е. Арбузова).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Влияние соединения №547 на амплитуду и постоянную времени спада МПКП в диафрагме мышей «дикого типа» и без БуХЭ

Известно, что у млекопитающих в области нервно-мышечного контакта

существует два фермента, способных гидролизовать нейротрансмиттер ацетилхолин - АХЭ и БуХЭ. Поскольку в опытах in vitro было показано, что соединение №547 ингибирует БуХЭ в концентрациях, на 5 порядков больших по сравнению с АХЭ (Anikienko et al., 2008), то можно предположить, что БуХЭ вносит вклад в формирование устойчивости диафрагмы к соединению №547. Действительно в 2011 году Петровым (Petrov et al., 2011) было показано, что добавление iso-OMPA (ингибитор БуХЭ) в омывающий диафрагму раствор повышает чувствительность дыхательной мышцы к действию соединения №547. Однако все коммерчески доступные в настоящее время ингибиторы БуХЭ (включая iso-OMPA) мало избирательны в отношении БуХЭ по-сравнению с АХЭ. Поэтому в рамках данной работы мы использовали мутантных животных без БуХЭ, для проверки гипотезы о вкладе данного фермента в формировании устойчивости дыхательной мускулатуры к алкиламмониевым производным 6-метилурацила.

Для этого предварительно было проверено, обладает ли диафрагма мышей «дикого типа» устойчивостью к действию соединения №547 по сравнению с локомоторной мышцей т. EDL.

Амплитуда МПКП в диафрагме мышей «дикого типа» составляла 0.96±0.03 мВ, а длительность - 2.00±0.07 мс (п=30). Соединение №547 в диапазоне концентраций от 0.1 нмоль/л до 10 нмоль/л не оказывало эффекта ни на амплитуду, ни на длительность ответов (Рис. 3.1 А, Б). Характерные для ингибирования АХЭ признаки (увеличение амплитуды и постоянной времени спада МПКП) наблюдались в концентрации 50 нмоль/л. Амплитуда при этом составляла 1.76±0.03 мВ, постоянная времени спада - 3.24±0.16 мс (Рис. 3.1).

Амплитуда МПКП в т. ЕИЬ мышей «дикого типа» составляла 0.63±0.04 мВ, а постоянная времени спада - 2.15±0.09 мс (п=30). Амплитуда МПКП достоверно увеличивалась уже в присутствии концентрации 0.5 нмоль/л (0.76±0.08 мВ). Максимальный рост амплитуды (на 129%) наблюдался в концентрации соединения №547 5 нмоль/л (Рис. 3.1 А). Постоянная времени спада также максимально увеличивалась в концентрации 5 нмоль/л и составляла 3.92±0.31 мс (Рис. 3.1 Б).

Таким образом, можно сделать вывод, что диафрагма мышей (как и диафрагма крыс) обладает устойчивостью к действию соединения №547.

Далее нами было проведено исследование влияния соединения №547 на амплитудно-временные параметры МПКП (амплитуда, постоянная времени спада) мутантных мышей без БуХЭ (-/- БуХЭ).

Было показано, что отсутствие этого фермента не приводило к драматическим изменениям амплитуды и постоянной времени спада МПКП - амплитуда ответов соответствовал таковой у «дикого типа» (0,99±0,04 мВ), постоянная времени спада также достоверно не отличалась и составляла 1.84±0.07 мс. Достоверное увеличение амплитуды и длительности МПКП в диафрагме мышей без БуХЭ наблюдалось при добавлении концентрации соединения №547 10 нмоль/л (р<0.05; Рис 3.2 А, Б). При добавлении концентраций 50 и 100 нмоль/л амплитуда МПКП в диафрагме мутантов росла аналогично таковой в «диком типе» с максимумом эффекта при 100 нмоль/л. Тогда как максимальный рост (на 122 %) длительности МПКП наблюдался уже в концентрации 50 нмоль/л.

Таким образом, на основе полученных результатов можно сделать вывод, что наличие в диафрагме БуХЭ вносит вклад в формирование устойчивости к соединению №547, однако, не является единственным и основным механизмом такой устойчивости.

со

2,СН 1,8

1.6-1

го -1 4

^г I

С

1,0

0,8 0,6Ц

Р----0

Контроль Ю~10 10"э 10° 10" 1СГ Концентрация соединения № 547, моль/л

%-7

4,5-1

о

4,0

ГОЗ,5^ го

53,о

Оч

ГО

I2'5

о

82,04

1,5

/

5'ь

—1—I 111И1

Контроль Ю

ю

10

10"

10

-7

10

-6

Концентрация соединения № 547, моль/л

Рис. 3.1. Влияние соединения №547 на амплитуду (А) и постоянную времени спада (Б) МПКП в диафрагме (□) и т. ЕЭЬ (и) мышей «дикого

типа», п=30

2,0-1 А

1,8 СО 1,6-1

ГО 1,4-1

>4

Ё 1.2Н

Заключение диссертации по теме «Физиология», Никиташина, Александра Дмитриевна

ВЫВОДЫ:

1. На основании анализа амплитудно-временных характеристик спонтанных постсинаптических ответов было показано, что синаптическая АХЭ диафрагмальной мышцы мыши обладает устойчивостью к действию соединения №-547 по сравнению с ферментом локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев).

2. Активность фермента бутирилхолинэстеразы не вносит значительного вклада в формирование устойчивости синапсов диафрагмальной мышцы мыши к соединению №547.

3. Увеличение амплитуды и постоянной времени спада МПКП диафрагмальной мышцы в присутствии соединения №547 объясняется воздействием на АХЭ, поскольку аналогичные эффекты соединения №547 отсутствуют у мышей, нокаутированных по АХЭ в нервно-мышечных синапсах.

4. Чувствительность синапсов диафрагмальной мышцы к действию соединения №547 значительно выше у мутантных мышей без PRiMA «якорной» субъединицы АХЭ, чем у мышей «дикого типа».

5. Интенсивная физическая нагрузка, приводящая к увеличению количества АХЭ, ассоциированной с PRiMA, приводит к снижению чувствительности локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев) к соединению №547.

6. Соединение №547 проявляет избирательность действия в отношении локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев) по сравнению с гладкой (мочевой пузырь, прямая кишка), тогда как пиридостигмин такой избирательностью не обладает.

7. Соединение №547 в дозе 0.008 мг/кг (1/125 LD50) устраняет электрофизиологические признаки синаптического дефекта в экспериментальной модели миастении Гравис.

8. В результате скрининга выявлено новое производное 6-метилурацила (соединение №7), проявляющее избирательность в отношении локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев) по сравнению с гладкой мускулатурой (мочевой пузырь).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Никиташина, Александра Дмитриевна, 2013 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Аникиенко К.А. Новый класс ингибиторов холинэстераз тетраалкиламмониевые производные 6-метилурацила: особенности взаимодействия с холинэстеразами разных групп животных // Доклады РАН.— 2001,— Т. 376.— С. 818-822.

2. Басова Н.Е, Розенгарт Е.В. Алкиламмониевые эфиры хлорбензойных кислот - новая группа содержащих сложноэфирную связь обратимых ингибиторов холинэстераз разных животных // ДАН.— 2005.— Т. 402.— С. 551-554.

3. Гладкая мышца: особенности строения и функционирования./ Э.Н.Телина, А.Р.Гиниатуллин, А.Л.Зефиров. - Казань. - 2006. - 48 с.

4. Зобов В.В, Петров К.А, Аслямова А.А, Березинский Л.А, Акамсин В.Д, Галяметдинова И.В, Резник B.C. Избирательная блокада локомоторных мышц урацилсодержащими тетраалкиламмониевыми ингибиторами ацетилхолинэстеразы // ДАН. — 2005. — Т. 401, № 1, — С. 120-123.

5. Зобов В.В, Петров К.А, Ланцова A.B., Резник B.C., Акамсин В.Д, Галяметдинова. И.В. Длительность миорелаксантного действия некоторых производных урацила // Токсикологический вестник. — 2006. — № 3. — С. 12-18

6. Зобов В.В. Петров К.А, Семенов В.Э, Гиниятуллин Р.Х, Николаев А.Е, Резник B.C. Миорелаксантная активность ациклических и макроциклических производных урацила // Современные проблемы токсикологии (Modern problems of toxicology, Киев). — 2006 —№ 2. — С. 13-22.

7. Зобов В.В. Алкиламмониевые производные урацила: токсикологическое и нейрофизиологическое исследование // Москва: ГосНИИОХТ, 2006.— Т.1 — С. 260.

8. Ковязина И.В., Петров К.А., Зобов В.В., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. Особенности действия тетраалкиламмониевого производного 6-метилурацила на потенциалы концевой пластинки мышц разного функционального типа // ДАН. - 2004. - Т.399, №5. - С.712-714.

9. Кривой И.И. Кулешов В.И.,. Матюшин Д.Л. Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества // JL: изд-во ЛГУ им. A.A. Жданова, — 1987. —238 с.

Ю.Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Суворов A.A. «Каталитическая машина» холинэстераз разных животных устроена одинаково // ДАН.— 2001.— Т. 381.—С. 123-125.

П.Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Сравнительная чувствительность холинэстераз различного происхождения к некоторым необратимым ингибиторам // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.— 2004.— Т. 40.—С. 3-15.

12.Общая токсикология // Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. Филова. — М.: Медицина. — 2002. — 608 с.

1 З.Петров К.А Ковязина И.В., Зобов В.В., Бухараева Э.А. Действие тетраалкиламмониевого производного 6-метиурацила в синапсах мышц разного функционального профиля / К.А. Петров, // Российский физиол. журнал им. И.М. Сеченова. — 2004. — Т.90, №8. — С.256.

14.Прозоровский В.Б., Саватеев Н.В. Неантихолинэстеразные механизмы действия антихолинэстеразных средств // JI. Медицина— 1976.— 160 с.

15.Резник B.C. Новый класс ингибиторов холинэстераз: тетраалкиламмониевые производные 6-метилурацила и аллоксазина // Доклады РАН.— 1998 — Т. 362.— С. 68-70.

16.Розенгарт Е.В., Басова Н.Е., Хованских А.Е., Ковалев H.H., Эпштейн JI.M. Взаимодействие холинэстеразы особей командорского кальмара berryteuthis magister из разных зон ареала обитания с ониевыми

обратимыми ингибиторами // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.— 1997.— Т. 33.— С. 371-382.

17.Abramochkin D.V., Petrov К.A., Zobov V.V., Iagodina L.O., Nikol'skii Е.Е., Rozenshtraukh L.V. The study of effects of a novel acetylcholinesterase inhibitor on electrical activity of the heart] // Kardiologiia.— 2009.— V. 49.— P. 47-50.

18.Adler M., Petrali J.P., Moore D.H., Filbert M.G. Function and distribution of acetyl- and butyrylcholinesterase in canine tracheal smooth muscle // Arch Int Pharmacodyn Ther.— 1991.—V. 312.—P. 126-139.

19.Alema S., Cull-Candy S.G., Miledi R., Trautmann A. Properties of end-plate channels in rats immunized against acetylcholine receptors // J Physiol.— 1981.—V. 311.—P. 251-266.

20.Andersson K.E., Holmquist F., Fovaeus M., Hedlund H., Sundler R. Muscarinic Receptor Stimulation of Phosphoinositide Hydrolysis in the Human Isolated Urinary Bladder//J Urol.— 1991.—V. 146.—P. 1156-1159.

21.Anglister L., Stiles J.R., Salpeter M.M. Acetylcholinesterase Density and Turnover Number at Frog Neuromuscular Junctions, with Modeling of Their Role in Synaptic Function // Neuron.— 1994.— V. 12.— P. 783-794.

22.Anikienko K.A., Bychikhin E.A., Reznik V.S., Akamsin D., Galyametdinova I.V. Compounds with the Dioxopyrimidine Cycle Inhibit Cholinesterases from Different Groups of Animals // Chem Biol Interact.— 2008.— V. 175.— P. 286-292.

23.Appleyard M.E., Smith A.D. Secretion of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase from the Guinea-Pig Isolated Ileum // Br J Pharmacol.— 1989.—V. 97.—P. 490-498.

24.Atanasova E., Chiappa S., Wieben E., Brimijoin S. Novel Messenger Rna and Alternative Promoter for Murine Acetylcholinesterase // J Biol Chem.— 1999.—V. 274.—P. 21078-21084.

25.Baggi F., Annoni A., Ubiali F., Longhi R., Milani M., Mantegazza R., Cornelio F., Antozzi C. Immunization with Rat-, but Not Torpedo-Derived 97-116 Peptide of the Achr Alpha-Subunit Induces Experimental Myasthenia Gravis in Lewis Rat // Ann N Y Acad Sei.— 2003.— V. 998.— P. 391-394.

26.Bartolini M., Greig N.H., Yu Q.S., Andrisano V. Immobilized Butyrylcholinesterase in the Characterization of New Inhibitors That Could Ease Alzheimer's Disease // J Chromatogr A.— 2009.— V. 1216.— P. 27302738.

27.Bennett M.R. Autonomic Neuromuscular Transmission at a Varicosity // Prog Neurobiol.— 1996.—V. 50.—P. 505-532.

28.Berrih S., Morel E., Gaud C., Raimond F., Le Brigand H., Bach J.F. Anti-Achr Antibodies, Thymic Histology, and T Cell Subsets in Myasthenia Gravis // Neurology.— 1984.—V. 34,—P. 66-71.

29.Birks J. Cholinesterase Inhibitors for Alzheimer's Disease // Cochrane Database Syst Rev.— 2006.— P. CD005593.

30.Boneva N., Hamra-Amitay Y., Wirguin I., Brenner T. Stimulated-Single Fiber Electromyography Monitoring of Anti-Sense Induced Changes in Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis // Neurosci Res.— 2006.— V. 55.— P. 40-44.

31.Bonham J.R., Dale G., Scott D.J., Wagget J., Atack J.R. The Characterisation of Molecular Forms of Acetylcholinesterase in Hirschsprung's Disease // Clin Chim Acta.— 1988.—V. 171.—P. 263-269.

32.Botti S.A., Felder C.E., Lifson S., Sussman J.L., Silman I. A Modular Treatment of Molecular Traffic through the Active Site of Cholinesterase // Biophys J.— 1999,— V. 77.— P. 2430-2450.

33.Brahmi N., Mokline A., Kouraichi N., Ghorbel H., Blei Y., Thabet H., Hedhili A., Amamou M. Prognostic Value of Human Erythrocyte Acetyl Cholinesterase in Acute Organophosphate Poisoning // Am J Emerg Med.— 2006.— V. 24.— P. 822-827.

34.Brenner T., Nizri E., Irony-Tur-Sinai M., Hamra-Amitay Y., Wirguin I. Acetylcholinesterase Inhibitors and Cholinergic Modulation in Myasthenia Gravis and Neuroinflammation // J Neuroimmunol.— 2008.— V. 201-202.— P. 121-127.

35.Caldwell J.E. Clinical Limitations of Acetylcholinesterase Antagonists // J Crit Care.— 2009,— V. 24.— P. 21-28.

36.Camp S., De Jaco A., Zhang L., Marquez M., De La Torre B., Taylor P. Acetylcholinesterase Expression in Muscle Is Specifically Controlled by a Promoter-Selective Enhancesome in the First Intron // J Neurosci.— 2008.— V. 28.— P. 2459-2470.

37.Casetta I., Groppo E., De Gennaro R., Cesnik E., Piccolo L., Volpato S., Granieri E. Myasthenia Gravis: A Changing Pattern of Incidence // J Neurol.— 2010.— V. 257.— P. 2015-2019.

38.Chamberlain-Banoub J., Neal J.W., Mizuno M., Harris C.L., Morgan B.P. Complement Membrane Attack Is Required for Endplate Damage and Clinical Disease in Passive Experimental Myasthenia Gravis in Lewis Rats // Clin Exp Immunol.—2006.—V. 146.—P. 278-286.

39.Chen V.P., Choi R.C., Chan W.K., Leung K.W., Guo A.J., Chan G.K., Luk W.K., Tsim K.W. The Assembly of Proline-Rich Membrane Anchor (Prima)-Linked Acetylcholinesterase Enzyme: Glycosylation Is Required for Enzymatic Activity but Not for Oligomerization // J Biol Chem.— 2011.— V. 286 — P. 32948-32961.

40.Cole R.N., Reddel S.W., Gervasio O.L., Phillips W.D. Anti-Musk Patient Antibodies Disrupt the Mouse Neuromuscular Junction // Ann Neurol.— 2008.—V. 63.—P. 782-789.

41.Conti-Fine B.M., Milani M., Kaminski H.J. Myasthenia Gravis: Past, Present, and Future // J Clin Invest.— 2006.— V. 116.— P. 2843-2854.

42.Cousins H.M., Edwards F.R., Hirst G.D., Wendt I.R. Cholinergic Neuromuscular Transmission in the Longitudinal Muscle of the Guinea-Pig Ileum // J Physiol.— 1993.— V. 471.— P. 61-86.

43.Cummings J.L. Cholinesterase Inhibitors: A New Class of Psychotropic Compounds // Am J Psychiatry.— 2000.— V. 157.— P. 4-15.

44.Cummings J.L. Cholinesterase Inhibitors: Expanding Applications // Lancet.— 2000.— V. 356.— P. 2024-2025.

45.De Baets M.H. Insights in the Autoimmunity of Myasthenia Gravis // Autoimmunity.— 2010.— V. 43.— P. 341-343.

46.Eddleston M., Singh S., Buckley N. Organophosphorus Poisoning (Acute) // ClinEvid.— 2005,— P. 1744-1755.

47.Ekstrom T.J., Klump W.M., Getman D., Karin M., Taylor P. Promoter Elements and Transcriptional Regulation of the Acetylcholinesterase Gene // DNA Cell Biol.— 1993.— V. 12.— P. 63-72.

48.Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V., Jr., Feather-Stone R.M. A New and Rapid Colorimetric Determination of Acetylcholinesterase Activity // Biochem Pharmacol.— 1961.—V. 7.—P. 88-95.

49.Engel A.G., Lambert E.H., Gomez M.R. A New Myasthenic Syndrome with End-Plate Acetylcholinesterase Deficiency, Small Nerve Terminals, and Reduced Acetylcholine Release // Ann Neurol.— 1977.— V. 1.— P. 315-330.

50.Fagerlund M.J., Eriksson L.I. Current Concepts in Neuromuscular Transmission // Br J Anaesth.— 2009.— V. 103.— P. 108-114.

51.Farrugia M.E., Robson M.D., Clover L., Anslow P., Newsom-Davis J., Kennett R., Hilton-Jones D., Matthews P.M., Vincent A. Mri and Clinical Studies of Facial and Bulbar Muscle Involvement in Musk Antibody-Associated Myasthenia Gravis//Brain.—2006.—V. 129.—P. 1481-1492.

52.Fernandez H.L, Hodges-Savola C.A. Physiological Regulation of G4 Ache in Fast-Twitch Muscle: Effects of Exercise and Cgrp // J Appl Physiol.— 1996.— V. 80.—P. 357-362.

53.Fischer M.D, Budak M.T, Bakay M, Gorospe J.R, Kjellgren D, Pedrosa-Domellof F, Hoffman E.P, Khurana T.S. Definition of the Unique Human Extraocular Muscle Allotype by Expression Profiling // Physiol Genomics.— 2005.— V. 22.—P. 283-291.

54.Geng L, Zhang H.L, Peng H.B. The Formation of Acetylcholine Receptor Clusters Visualized with Quantum Dots // BMC Neurosci — 2009.— V. 10.— P. 80.

55.Gilboa-Geffen A, Lacoste P.P., Soreq L, Cizeron-Clairac G, Le Panse R, Truffault F, Shaked I, Soreq H, Berrih-Aknin S. The Thymic Theme of Acetylcholinesterase Splice Variants in Myasthenia Gravis // Blood.— 2007.— V. 109.—P. 4383-4391.

56.Giraud M, Beaurain G, Yamamoto A.M., Eymard B, Tranchant C, Gajdos P, Garchon H.J. Linkage of Hla to Myasthenia Gravis and Genetic Heterogeneity Depending on Anti-Titin Antibodies // Neurology.— 2001.— V. 57.— P. 15551560.

57.Gomez A.M., Van Den Broeck J, Vrolix K, Janssen S.P, Lemmens M.A, Van Der Esch E, Duimel H, Frederik P, Molenaar P.C, Martinez-Martinez P, De Baets M.H, Losen M. Antibody Effector Mechanisms in Myasthenia Gravis-Pathogenesis at the Neuromuscular Junction // Autoimmunity.— 2010.— V. 43.—P. 353-370.

58.Grassi J, Vigny M, Massoulie J. Molecular Forms of Acetylcholinesterase in Bovine Caudate Nucleus and Superior Cervical Ganglion: Solubility Properties and Hydrophobic Character // J Neurochem.— 1982.— V. 38.— P. 457-469.

59.Guerra M., Cartaud A., Cartaud J., Legay C. Acetylcholinesterase and Molecular Interactions at the Neuromuscular Junction // Chem Biol Interact.— 2005.—V. 157-158.—P. 57-61.

öO.Hicks D., John D., Makova N.Z., Henderson Z., Nalivaeva N.N., Turner A.J. Membrane Targeting, Shedding and Protein Interactions of Brain Acetylcholinesterase // J Neurochem.— 2011.— V. 116.— P. 742-746.

61.Horton R.M., Manfredi A.A., Conti-Tronconi B.M. The 'Embryonic' Gamma Subunit of the Nicotinic Acetylcholine Receptor Is Expressed in Adult Extraocular Muscle // Neurology.— 1993.— V. 43.— P. 983-986.

62.Jasmin B.J., Gisiger V. Regulation by Exercise of the Pool of G4 Acetylcholinesterase Characterizing Fast Muscles: Opposite Effect of Running Training in Antagonist Muscles // J Neurosci.— 1990.— V. 10.— P. 14441454.

63.Kaminski H. Myasthenia Gravis and Related Disorders // New Jersey: Humana Press Inc., 2003.—.

64.Kasprzak H., Salpeter M.M. Recovery of Acetylcholinesterase at Intact Neuromuscular Junctions after in Vivo Inactivation with Di-Isopropylfluorophosphate // J Neurosci.— 1985.— V. 5.— P. 951-955.

65.Kaufer D., Friedman A., Seidman S., Soreq H. Acute Stress Facilitates Long-Lasting Changes in Cholinergic Gene Expression // Nature.— 1998.— V. 393.—P. 373-377.

66.Keefe R.S., Malhotra A.K., Meitzer H.Y., Kane J.M., Buchanan R.W., Murthy A., Sovel M., Li C., Goldman R. Efficacy and Safety of Donepezil in Patients with Schizophrenia or Schizoaffective Disorder: Significant Placebo/Practice Effects in a 12-Week, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial // Neuropsychopharmacology.— 2008.— V. 33.—P. 1217-1228.

67.Kotelevets L., Walch L., Chastre E., Chatonnet A., Dulmet E., Brink C., Norel X. Cholinesterase Activity in Human Pulmonary Arteries and Veins: Correlation with Mrna Levels // Life Sci.— 2005.— V. 76.— P. 2211-2220.

68.Krejci E., Legay C., Thomine S., Sketelj J., Massoulie J. Differences in expression of acetylcholinesterase and collagen q control the distribution and oligomerization of the collagen-tailed forms in fast and slow muscles // J Neurosci.— 1999.—V. 19.—P. 10672-10679.

69.Kusner L.L., Kaminski H.J., Soltys J. Effect of Complement and Its Regulation on Myasthenia Gravis Pathogenesis // Expert Rev Clin Immunol.— 2008.— V. 4.—P. 43-52.

70.Lee J.W., Bang K.W., Jang P.S., Chung N.G., Cho B., Jeong D.C., Kim H.K., Im S.A., Lim G.Y. Neostigmine for the Treatment of Acute Colonic PseudoObstruction (Acpo) in Pediatric Hematologic Malignancies // Korean J Hematol.— 2010.— V. 45.— P. 62-65.

71.Lennon V.A., Seybold M.E., Lindstrom J.M., Cochrane C., Ulevitch R. Role of Complement in the Pathogenesis of Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis // J Exp Med.— 1978.— V. 147.— P. 973-983.

72.Leung K.W., Xie H.Q., Chen V.P., Mok M.K., Chu G.K., Choi R.C., Tsim K.W. Restricted Localization of Proline-Rich Membrane Anchor (Prima) of Globular Form Acetylcholinesterase at the Neuromuscular Junctions-Contribution and Expression from Motor Neurons // FEBS J.— 2009.— V. 276.—P. 3031-3042.

73.Lindh B., Hokfelt T. Structural and Functional Aspects of Acetylcholine Peptide Coexistence in the Autonomic Nervous System // Prog Brain Res.— 1990.—V. 84.—P. 175-191.

74.Lindstrom J., Luo J., Kuryatov A. Myasthenia Gravis and the Tops and Bottoms of Achrs: Antigenic Structure of the Mir and Specific

Immunosuppression of Eamg Using Achr Cytoplasmic Domains // Ann N Y Acad Sci.— 2008.— V. 1132.— P. 29-41.

75.Madhavan R., Gong Z.L., Ma J.J., Chan A.W., Peng H.B. The Function of Cortactin in the Clustering of Acetylcholine Receptors at the Vertebrate Neuromuscular Junction // PLoS One.— 2009.— V. 4.— P. e8478.

76.Mansukhani K.A., Doshi B.H. Interpretation of Electroneuromyographic Studies in Diseases of Neuromuscular Junction and Myopathies // Neurol India.—2008.—V. 56.—P. 339-347.

77.Massoulie J., Pezzementi L., Bon S., Krejci E., Vallette F.M. Molecular and Cellular Biology of Cholinesterases // Prog Neurobiol.— 1993.— V. 41.— P. 31-91.

78.Massoulie J., Sussman J., Doctor B. Recommendations for Nomenclature in Cholinesterases // New York: Plenum Press, 1992.— 285-288 p.

79.Meriggioli M.N., Sanders D.B. Autoimmune Myasthenia Gravis: Emerging Clinical and Biological Heterogeneity // Lancet Neurol.— 2009.— V. 8.— P. 475-490.

80.Meshorer E., Toiber D., Zurel D., Sahly I., Dori A., Cagnano E., Schreiber L., Grisaru D., Tronche F., Soreq H. Combinatorial Complexity of 5' Alternative Acetylcholinesterase Transcripts and Protein Products // J Biol Chem.— 2004.—V. 279,—P. 29740-29751.

81.Moore S.W., Johnson G. Acetylcholinesterase in Hirschsprung's Disease // Pediatr Surg Int.— 2005.— V. 21.— P. 255-263.

82.Mu L., Sun B., Kong Q., Wang J., Wang G., Zhang S., Wang D., Liu Y., An H., Li H. Disequilibrium of T Helper Type 1, 2 and 17 Cells and Regulatory T Cells During the Development of Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis // Immunology.— 2009.— V. 128.— P. e826-836.

83.Nakahara T., Kubota Y., Sakamoto K., Ishii K. The Role of Cholinesterases in Rat Urinary Bladder Contractility // Urol Res.— 2003.— V. 31.— P. 223-226.

84.Nastuk W.L., Strauss A.J., Osserman K.E. Search for a Neuromuscular Blocking Agent in the Blood of Patients with Myasthenia Gravis // Am J Med.— 1959,— V. 26.—P. 394-409.

85.Nicholls J.G., Martin A.R., Wallace B.G., Fuchs P.A. From Neuron to Brain // 1992.—.

86.0hno K., Engel A.G., Brengman J.M., Shen X.M., Heidenreich F., Vincent A., Milone M., Tan E., Demirci M., Walsh P., Nakano S., Akiguchi I. The Spectrum of Mutations Causing End-Plate Acetylcholinesterase Deficiency // Ann Neurol.— 2000.— V. 47.— P. 162-170.

87.Pachner A.R. Experimental Models of Myasthenia Gravis: Lessons in Autoimmunity and Progress toward Better Forms of Treatment // Yale J Biol Med.— 1987.—V. 60.—P. 169-177.

88.Papadouli I., Sakarellos C., Tzartos S.J. High-Resolution Epitope Mapping and Fine Antigenic Characterization of the Main Immunogenic Region of the Acetylcholine Receptor. Improving the Binding Activity of Synthetic Analogues of the Region // Eur J Biochem.— 1993.— V. 211.— P. 227-234.

89.Patrick J., Lindstrom J. Autoimmune Response to Acetylcholine Receptor // Science.— 1973.—V. 180.—P. 871-872.

90.Perrier A.L., Massoulie J., Krejci E. Prima: The Membrane Anchor of Acetylcholinesterase in the Brain // Neuron.— 2002.— V. 33.— P. 275-285.

91.Perrier N.A., Salani M., Falasca C., Bon S., Augusti-Tocco G., Massoulie J. The Readthrough Variant of Acetylcholinesterase Remains Very Minor after Heat Shock, Organophosphate Inhibition and Stress, in Cell Culture and in Vivo // J Neurochem.— 2005.— V. 94.— P. 629-638.

92.Petrov K., Kovyazina I., Zobov V., Bukharaeva E., Nikolsky E.E., Vyskocil F. Different Sensitivity of Miniature Endplate Currents in Rat External and Internal Intercostal Muscles to the Acetylcholinesterase Inhibitor C-547 as

Compared with Diaphragm and Extensor Digitorum Longus // Physiol Res.— 2009.—V. 58 — P. 149-153.

93.Petrov K.A., Kovyazina L.V., Zobov V.V., Bukharaeva E.A., Nikolsky E.E., Vyskocil F. Different Sensitivity of Miniature Endplate Currents of the Rat Extensor Digitorum Longus, Soleus and Diaphragm Muscles to a Novel Acetylcholinesterase Inhibitor C-547 // Physiol Res.— 2006.— V. 55.— P. 585-589.

94.Petrov K.A., Yagodina L.O., Valeeva G.R., Lannik N.I., Nikitashina A.D., Rizvanov A.A., Zobov V.V., Bukharaeva E.A., Reznik V.S., Nikolsky E.E., Vyskocil F. Different Sensitivities of Rat Skeletal Muscles and Brain to Novel Anti-Cholinesterase Agents, Alkylammonium Derivatives of 6-Methyluracil (Adems) // Br J Pharmacol.— 2011.— V. 163.— P. 732-744.

95.Poewe W., Gauthier S., Aarsland D., Leverenz J.B., Barone P., Weintraub D., Tolosa E., Dubois B. Diagnosis and Management of Parkinson's Disease Dementia // Int J Clin Pract.— 2008.— V. 62.— P. 1581-1587.

96.Pope C., Karanth S., Liu J. Pharmacology and Toxicology of Cholinesterase Inhibitors: Uses and Misuses of a Common Mechanism of Action // Environ Toxicol Pharmacol.— 2005.— V. 19.— P. 433-446.

97.Punga A.R., Sawada M., Stalberg E.V. Electrophysiological Signs and the Prevalence of Adverse Effects of Acetylcholinesterase Inhibitors in Patients with Myasthenia Gravis // Muscle Nerve.— 2008.— V. 37.— P. 300-307.

98.Rakonczay Z., Vincendon G., Zanetta J.P. Heterogeneity of Rat Brain Acetylcholinesterase: A Study by Gel Filtration and Gradient Centrifugation // J Neurochem.— 1981.— V. 37.—P. 662-669.

99.Ray A., Liu J., Karanth S., Gao Y., Brimijoin S., Pope C. Cholinesterase Inhibition and Acetylcholine Accumulation Following Intracerebral Administration of Paraoxon in Rats // Toxicol Appl Pharmacol.— 2009.— V. 236.—P. 341-347.

100.Robinson P.M., Bell C. The Localization of Acetylcholinesterase at the Autonomic Neuromuscular Junction // J Cell Biol.— 1967.— V. 33.— P. 93102.

101.Robles A. Pharmacological Treatment of Alzheimer's Disease: Is It Progressing Adequately? // Open Neurol J.— 2009.— V. 3.— P. 27-44.

102.Romi F., Aarli J.A., Gilhus N.E. Myasthenia Gravis Patients with Ryanodine Receptor Antibodies Have Distinctive Clinical Features // Eur J Neurol.— 2007 —V. 14 —P. 617-620.

103.Rotundo R.L., Carbonetto S.T. Neurons Segregate Clusters of Membrane-Bound Acetylcholinesterase Along Their Neurites // Proc Natl Acad Sci U S A.— 1987.—V. 84.—P. 2063-2067.

104.Rotundo R.L., Gomez A.M., Fernandez-Valle C., Randall W.R. Allelic Variants of Acetylcholinesterase: Genetic Evidence That All Acetylcholinesterase Forms in Avian Nerves and Muscles Are Encoded by a Single Gene // Proc Natl Acad Sci U S A.— 1988.— V. 85.— P. 7805-7809.

105.Ruff R.L., Lennon V.A. How Myasthenia Gravis Alters the Safety Factor for Neuromuscular Transmission // J Neuroimmunol.— 2008.— V. 201-202.— P. 13-20.

106.Sakamoto K., Ohki K., Saito M., Nakahara T., Ishii K. Histological Protection by Donepezil against Neurodegeneration Induced by Ischemia-Reperfusion in the Rat Retina // J Pharmacol Sci.— 2010.— V. 112.— P. 327-335.

107.Shear T.D., Martyn J.A. Physiology and Biology of Neuromuscular Transmission in Health and Disease // J Crit Care — 2009.— V. 24.— P. 5-10.

108.Sheng J.R., Li L.C., Prabhakar B.S., Meriggioli M.N. Acetylcholine Receptor-Alpha Subunit Expression in Myasthenia Gravis: A Role for the Autoantigen in Pathogenesis? // Muscle Nerve.— 2009.— V. 40.— P. 279-286.

109.Skeie G.O., Apostolski S., Evoli A., Gilhus N.E., Ilia I., Harms L., Hilton-Jones D., Melms A., Verschuuren J., Horge H.W. Guidelines for Treatment of

Autoimmune Neuromuscular Transmission Disorders // Eur J Neurol.— 2010.—V. 17 —P. 893-902.

11 O.Soltys J, Gong B, Kaminski H.J, Zhou Y, Kusner L.L. Extraocular Muscle Susceptibility to Myasthenia Gravis: Unique Immunological Environment? // Ann N Y Acad Sci.— 2008.— V. 1132.— P. 220-224.

lll.Souroujon M.C, Brenner T, Fuchs S. Development of Novel Therapies for Mg: Studies in Animal Models // Autoimmunity.— 2010.— V. 43.— P. 446460.

112.Sussman J.L, Harel M, Frolow F, Oefner C, Goldman A, Toker L, Silman I. Atomic Structure of Acetylcholinesterase from Torpedo Californica: A Prototypic Acetylcholine-Binding Protein // Science.— 1991.— V. 253.— P. 872-879.

113.Suzuki S, Utsugisawa K, Nagane Y, Satoh T, Terayama Y, Suzuki N, Kuwana M. Classification of Myasthenia Gravis Based on Autoantibody Status // Arch Neurol.— 2007.— V. 64.— P. 1121-1124.

114.Tan D.H, Peng S.Q, Wu Y.L, Wang Y.M, Lu C.F, Yan C.H. Chronic Organophosphate (Op)-Induced Neuropsychiatric Disorder Is a Withdrawal Syndrome // Med Hypotheses.— 2009.— V. 72.— P. 405-406.

115.Taylor J.L, Mayer R.T, Himel C.M. Conformers of Acetylcholinesterase: A Mechanism of Allosteric Control // Mol Pharmacol.— 1994.— V. 45.— P. 7483.

116.Tzartos S, Hochschwender S, Vasquez P, Lindstrom J. Passive Transfer of Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis by Monoclonal Antibodies to the Main Immunogenic Region of the Acetylcholine Receptor // J Neuroimmunol.— 1987.—V. 15.—P. 185-194.

117.Tzartos S.J, Kokla A, Walgrave S.L, Conti-Tronconi B.M. Localization of the Main Immunogenic Region of Human Muscle Acetylcholine Receptor to

Residues 67-76 of the Alpha Subunit // Proc Natl Acad Sci U S A — 1988.— V. 85,— P. 2899-2903.

118.Vincent A. Autoimmune Disorders of the Neuromuscular Junction // Neurol India.— 2008.—V. 56.—P. 305-313.

119.Vrolix K., Niks E.H., Le Panse R., Van Ostaijen-Ten Dam M.M., Muris A.H., Jol-Van Der Zijde C.M., Van Tol MJ., Losen M., Molenaar P.C., Van Zoelen E.J., Berrih-Aknin S., De Baets M.H., Verschuuren J.J., Martinez-Martinez P. Reduced Thymic Expression of Erbb Receptors without Auto-Antibodies against Synaptic Erbb in Myasthenia Gravis // J Neuroimmunol.— 2011.— V. 232 —P. 158-165.

120.Wang W.W., Hao H.J., Gao F. Detection of Multiple Antibodies in Myasthenia Gravis and Its Clinical Significance // Chin Med J (Engl).— 2010 —V. 123.—P. 2555-2558.

121.Watanabe H., Yamamoto T.Y. Autonomic Innervation of the Muscles in the Wall of the Bladder and Proximal Urethra of Male Rats // J Anat.— 1979.— V. 128.—P. 873-886.

122.Xie H.Q., Liang D., Leung K.W., Chen V.P., Zhu K.Y., Chan W.K., Choi R.C., Massoulie J., Tsim K.W. Targeting Acetylcholinesterase to Membrane Rafts: A Function Mediated by the Proline-Rich Membrane Anchor (Prima) in Neurons // J Biol Chem.— 2010.— V. 285.— P. 11537-11546.

123.Yehia M.A., El-Banna S.G., Okab A.B. Diazinon Toxicity Affects Histophysiological and Biochemical Parameters in Rabbits // Exp Toxicol Pathol.— 2007.— V. 59.— P. 215-225.

124.Yucel Y.Y., Tacal O., Ozer I. Comparative Effects of Cationic Triarylmethane, Phenoxazine and Phenothiazine Dyes on Horse Serum Butyrylcholinesterase // Arch Biochem Biophys — 2008.— V. 478.— P. 201205.

125.Zhu D., Xiong W.C., Mei L. Lipid Rafts Serve as a Signaling Platform for Nicotinic Acetylcholine Receptor Clustering // J Neurosci.— 2006.— V. 26.— P. 4841-4851.

Выражаю искреннюю благодарность к.б.н, с.н.с. лаб. химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова Петрову К.А., д.б.н., профессору Бухараевой Э.А., а также заведующему лаборатории биофизики синаптических процессов КИББ КазНЦ РАН, академику Никольскому Е.Е. за оказанное содействие при выполнении данного исследования .