ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ В-ЛИМФОЦИТОВ У ЖЕНЩИН ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ЗАДЕРЖКОЙ РОСТА ПЛОДА тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Фролова Мария Викторовна

• Фролова Мария Викторовна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Фролова Мария Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Организация работы и объем исследований

2.2. Иммунологические методы исследования

2.3. Статистическая обработка данных

Глава 3. ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ В-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ЗАДЕРЖКОЙ РОСТА ПЛОДА

3.1. Особенности содержания, созревания, дифференцировки периферических В-лимфоцитов при беременности, осложненной задержкой роста плода

3.2. Характер дифференцировки периферических В-клеток памяти при беременности, осложненной задержкой роста плода

3.3. Функциональные особенности периферических В-лимфоцитов при беременности, осложненной задержкой роста плода

3.4. Особенности сывороточного содержания BAFF и его рецепция периферическими В-лимфоцитами при беременности, осложненной задержкой роста плода

3.5. Содержание периферических регуляторных В-лимфоцитов и сывороточный уровень интерлейкина 10 при беременности, осложненной задержкой роста плода

Глава 4. ХАРАКТЕР АПОПТОЗА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ В-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ

ЗАДЕРЖКОЙ РОСТА ПЛОДА

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ Актуальность научного исследования

Задержка роста плода (ЗРП) является одной из важнейших проблем современного акушерства и перинатологии и обуславливает высокий уровень смертности в перинатальный период [1, 2, 17, 26, 28, 33, 122, 165, 181, 251]. Несмотря на широкий спектр методов прегравидарной подготовки и ведения беременности, частота возникновения задержки роста плода не снижается и колеблется в диапазоне 3-23% [2, 12, 17, 21, 26, 33, 165, 198]. Внутриутробное развитие задержки роста плода обуславливает формирование хронических форм патологии и инвалидности у детей, а также уровень здоровья и качество жизни взрослого человека [24, 26, 29, 31, 165, 243, 248].

Патогенез ЗРП многогранен и до конца не изучен [1, 5, 8, 9, 13, 14, 15, 17, 19, 23, 24, 26, 33, 35]. Формирование задержки роста плода является универсальной реакцией организма матери в ответ на воздействие различных неблагоприятных факторов. В литературе накапливается все больше данных, что ЗРП при беременности сопровождается нарушением регуляции иммунных реакций, что ведет к дисбалансу адаптивного иммунитета [6, 16, 18, 24, 37]. Данные литературы по изучению особенностей антителозависимых реакций при беременности, осложненной ЗРП, крайне малочисленны и разрозненны [24, 46, 55, 64, 85, 194, 206, 215, 228]. Ряд исследований показали, что при ЗРП наблюдаются существенные изменения со стороны гуморального иммунитета матери, начиная с ранних сроков гестации [24, 85, 215, 228]. Так, в ранние сроки беременности, впоследствии осложненной ЗРП, отмечалось повышенное содержание периферических CD5+ В-лимфоцитов и уровня сывороточных IgG и ^М, содержание ^М в сыворотке крови оставалось повышенным и в конце беременности [24]. Большинство исследований, посвященных антителозависимым реакциям при ЗРП, касаются изучения продукции аутоантител [24, 26]. Однако в литературе практически отсутствуют данные о

характере дифференцировки периферических В-лимфоцитов и их функциональной активности при беременности, осложненной задержкой роста плода.

Общеизвестно, что В-лимфоциты являются главными участниками иммунных реакций, которые в норме обуславливают антителозависимые механизмы защиты от патогена [36]. Данные последних лет свидетельствуют, что фракция периферических В-лимфоцитов неоднородна и включает в себя В-клетки, находящиеся на различных стадиях созревания. Этапы периферической дифференцировки В-лимфоцитов ассоциируются с определенным поверхностным фенотипом и функциональной активностью.

Таким образом, уточнение характера дифференцировки, созревания и функциональной активности В-лимфоцитов у женщин с задержкой роста плода (ЗРП) представляется крайне актуальным, поскольку позволит уточнить иммунологические механизмы патогенеза данной патологии с целью своевременного пересмотра тактики ведения пациенток.

Цель исследования - установить особенности дифференцировки, функциональной активности и апоптоза периферических В-лимфоцитов у женщин при беременности, осложненной задержкой роста плода, и на основании полученных данных разработать критерии прогнозирования эффективности стандартного лечения данной патологии.

Задачи научного исследования

1. Выявить особенности дифференцировки и функциональной активности периферических В-лимфоцитов у женщин при беременности, осложненной задержкой роста плода в зависимости от реализации патологии и степени ее тяжести у новорожденных.

2. Оценить сывороточный уровень BAFF и его рецепцию периферическими В-лимфоцитами у женщин при беременности, осложненной задержкой роста

плода в зависимости от реализации патологии и степени ее тяжести у новорожденных.

3. Охарактеризовать параметры апоптоза периферических В1 и В2-лимфоцитов у женщин при беременности, осложненной задержкой роста плода в зависимости от реализации патологии и степени ее тяжести у новорожденных.

4. Разработать прогностические критерии эффективности стандартного лечения задержки роста плода у беременных женщин.

Научная новизна исследования

Установлено, что при беременности, осложненной ЗРП, происходит активация процессов дифференцировки В-лимфоцитов до конечных этапов, что проявляется накоплением в периферической крови герминативных В-клеток, IgM+ и IgG+ В-лимфоцитов и В2-клеток, плазматических клеток, общей фракции В-клеток памяти и низкоспецифичных «непереключенных» В-лимфоцитов памяти.

Показано, что особенностями функционального состояния В-лимфоцитов при беременности, осложненной задержкой роста плода, являются усиление аутокринного регулирующего действия В-лимфоцитов цитокинами Th2-rarn (IL-4 и IL-6) на фоне накопления в сыворотке крови IL-10 и снижения уровня периферических Breg, а также повышение сывороточного содержания циркулирующих иммунных комплексов.

Установлено, что усиление дифференцировки периферических В-лимфоцитов у женщин с ЗРП ассоциируется с активацией BAFF-BAFFR-зависимого пути, что проявляется в периферической крови повышенным содержанием BAFFR+ В-лимфоцитов, усилением плотности экспрессии BAFF-рецептора на поверхности клетки и сниженным сывороточным содержанием BAFF в случае реализации ЗРП у детей при рождении.

Установлено, что при беременности, осложненной задержкой роста плода, происходит нарушение процессов апоптоза периферических В-лимфоцитов, заключающееся в снижении количества Fas+ В-лимфоцитов и В2-клеток, Аппехт У+ В1 и В2-лимфоцитов при одновременном повышении уровня FasL+ В-лимфоцитов и В2-клеток в случае реализации задержки роста плода у детей при рождении.

Впервые установлено, что при низком содержании CD27+ клеток памяти в популяции CD19+ периферических В-лимфоцитов у беременных женщин прогнозируется эффективность стандартного лечения ЗРП и рождение ребенка без данной патологии.

Методология и методы исследования

Для достижения поставленной цели было проведено однократное обследование 85 беременных женщин в сроке 32-36 недель беременности, из них 24 женщины с неосложненным течением беременности, 61 женщина с ЗРП. Ретроспективно женщины основной группы были разделены в зависимости от наличия и тяжести ЗРП у новорожденных. Обследование беременных женщин проводилось на базе акушерской клиники ФГБУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова» Минздрава России г. Иваново. При обследовании женщин использовался комплекс современных иммунологических методов - многоцветная проточная цитофлюориметрия, твердофазный ИФА.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета современных компьютерных программ прикладного статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту

При беременности, осложненной ЗРП, отмечается существенное нарушение параметров дифференцировки, функциональной активности и апоптоза периферических В-лимфоцитов. Выраженность изменений в организме матери связана с реализацией патологии и степенью ее тяжести у новорожденного. У женщин с ЗРП отмечается изменение соотношения В-клеточных фракций в сторону увеличения уровня высокоэффекторных В-лимфоцитов: плазматических клеток и «непереключенных» В-клеток памяти в основном за счет В2-лимфоцитов. Изменения дифференцировки периферических В-клеток могут быть связаны с активирующим влиянием IL-10, усилением BAFF-BAFFR-зависимого пути созревания, усилением аутокринного регулирующего влияния IL-4 и IL-6 на В-лимфоциты, снижением супрессорной роли Breg, на фоне нарушенных процессов иммунного апоптоза.

Сниженное содержание CD19+CD27+ клеток памяти в популяции В-лимфоцитов у беременных женщин с задержкой роста плода в сроке гестации 3236 недель позволяет прогнозировать эффективность стандартного лечения данной патологии и рождение ребенка без ЗРП.

Практическая значимость научного исследования

Разработан новый способ прогнозирования эффективности стандартного лечения задержки роста плода при беременности, который может быть использован в акушерской практике.

Предложен дополнительный критерий прогнозирования степени тяжести ЗРП у новорожденных от женщин с задержкой роста плода во время беременности по содержанию BAFF сыворотке крови.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанный «Способ прогнозирования эффективности лечения задержки роста плода» (приоритетная справка № 2016106711 получена от 26.02.2016) прошел предрегистрационное испытание в акушерской клинике Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Дополнительный критерий прогнозирования степени тяжести ЗРП у новорожденных от женщин с ЗРП используется врачами акушерами-гинекологами в акушерской клинике Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Показатели содержания периферических В-клеток при беременности, осложненной ЗРП: наивных, герминативных, регуляторных, памяти, плазматических; сывороточного уровня BAFF используются в учебной программе кафедры патофизиологии и иммунологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным количеством клинических наблюдений. Обследованы 85 беременных женщин в сроке гестации 32-36 недель, из них 24 женщины с неосложненным течением беременности, 61 женщина с ЗРП.

Личное участие автора

Автор самостоятельно проводил отбор пациенток на основании заключений врачей акушеров-гинекологов. Автором лично осуществлялись все этапы иммунологических исследований, систематизация, статистико-математическая обработка данных, анализ и описание полученных результатов; сформулированы выводы и практические рекомендации.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ В-ЛИМФОЦИТОВ У ЖЕНЩИН ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ЗАДЕРЖКОЙ РОСТА ПЛОДА»

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на научно-практической конференции молодых ученых ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России (Иваново, 2010 г., 2015 г., 2016 г.); ежегодной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых ФГБОУ ВО ИвГМА Минздрава России (Иваново, 2010 г.); II Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Медико-биологические, клинические и социальные вопросы здоровья и патологии человека» (Иваново, 2015 г.); XV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2015 г.); VII всероссийской научно-практической конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Ростов-на-Дону, 2015 г.); Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Городковские чтения» (Иваново, 2015 г.); Международной конференции «Репродуктивная медицина: взгляд молодых - 2016» (Санкт-Петербург, 2016 г.), IX Междисциплинарной всероссийской конференции с международным участием по акушерству, перинатологии, неонтологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный» (Санкт-Петербург, 2016 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 6 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикаций научных результатов диссертаций.

Объём и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 160 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, главы «Обсуждение результатов исследования», заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 301 источник, в том числе 36 отечественных и 265 иностранных. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 14 рисунками.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Задержка роста плода является одной из важнейших проблем современного акушерства и перинатологии, обуславливая высокий уровень заболеваемости и смертности в перинатальный период [1, 2, 17, 26, 28, 33, 122, 165, 181, 251]. ЗРП -это патологическое состояние, которое появляется во внутриутробном периоде и характеризуется замедлением, остановкой или отрицательной динамикой размеров плода и проявляется у новорожденного снижением массо-ростовых показателей [1, 17, 165]. Несмотря на широкий спектр методов прегравидарной подготовки и ведения беременности, частота возникновения задержки роста плода не снижается и составляет по данным разных авторов 3-23% [2, 12, 17, 21, 26, 33, 165, 198]. ЗРП обуславливает снижение адаптационных резервов плода, что часто приводит к нарушению родового процесса и перинатальным проблемам у маловесных новорожденных - асфиксия в родах, аспирация околоплодных вод и мекония, нарушение мозгового кровообращения, легочная гипертензия, энтероколит и другие [122, 129, 165]. ЗРП характеризуется уменьшением размеров внутренних органов, их морфофункциональной незрелостью, особенностями показателей крови и метаболизма, снижением иммунологической реактивности [1, 24, 165].

Известно, что дети, имевшие ЗРП при рождении, в дальнейшем чаще имеют признаки нарушений параметров физического развития, патологические особенности нервной системы, высокую инфекционную заболеваемость [122, 165]. Ранний неонатальный период характеризуется нарушением становления тонических и рефлекторных реакций; в последующем такие дети чаще имеют различные неврологические отклонения: от минимальных мозговых дисфункций до значительных психомоторных расстройств [165]. ЗРП обуславливает развитие хронических форм патологии и инвалидности у детей [24, 26, 29, 31]. ЗРП ведет к нарушению общего развития ребенка и обуславливает сниженный уровень здоровья и качество жизни взрослого человека [165, 243, 248]. Доказана связь ЗРП

с повышенным риском метаболического синдрома, сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения, диабета типа II в зрелом возрасте, астмы [41, 71, 122, 154, 165, 253, 254]. Имеются данные, что ЗРП во внутриутробном периоде впоследствии связана с ранней менопаузой у женщин [67].

ЗРП - универсальная реакция плода на внутреннее неблагополучие, и зависит от нарушений в плаценте, состояния самого плода и акушерской патологии у матери [1, 26, 29, 75, 198]. Выделяют ряд факторов, приводящих к развитию ЗРП: социально-бытовые, соматическая патология матери, акушерско-гинекологические заболевания, неблагоприятное течение данной беременности, а также другие факторы риска (воздействие радиации, лекарственных средств и другие) [1, 5, 13, 29, 75, 198]. Современные данные литературы свидетельствуют, что более низкий уровень образования женщины, сниженный семейный доход, меньший прирост веса и отсутствие приема витаминов во время беременности также являются важными факторами риска [75]. У 23,2% беременных имеет место сочетание 2 и более факторов риска развития ЗРП [28]. Патогенез ЗРП многогранен и до конца не изучен [1, 5, 8, 9, 13, 14, 15, 17, 19, 23, 24, 26, 33, 35]. Большая роль в формировании данной патологии принадлежит иммунноопосредованным механизмам [9, 24, 41, 44, 50, 63, 124, 151, 159, 172, 283, 290].

Физиологическая беременность характеризуется особым состоянием иммунной системы женщины, в которой существует баланс между про- и противовоспалительными цитокинами, что во многом и обуславливает нормальное развитие процессов эмбриональной имплантации, роста плаценты, дифференцировки трофобласта, плацентарного ангиогенеза [9, 159, 172, 230]. Во время физиологической беременности иммунная система матери распознает отцовские аллоантигены плода, однако, как правило, не развивает антифетальный иммунный ответ [24, 29, 42, 128]. Ранее считалось, что нормальное течение беременности связано с реализацией ^2-зависимого пути развития иммунного ответа при участии В-лимфоцитов с преобладанием цитокинов ГЬ-4, ГЬ-10 и TGFP [159]. Смещение иммунного ответа в сторону ТЫ-зависимых реакций, участие

цитокинов ГЬ-2, ^N7 и TNFa ассоциировалось с развитием осложнений при беременности, в том числе, и ЗРП [24, 40]. Ряд исследований показали, что в первом триместре физиологической беременности повышалась активность ^2-лимфоцитов и синтез противовоспалительных цитокинов, а к концу беременности возрастала роль ТЫ-зависимых реакций и синтез провоспалительных факторов [115, 157]. В то же время существует ряд работ, которые свидетельствуют о том, что преобладание ^2-зависимых механизмов при беременности обуславливает развитие привычного невынашивания [102, 106, 231, 247, 267]. В литературе накапливается все больше данных, свидетельствующих, что концепция ТЫ/^2-зависимых иммунных реакций не отражает полную картину иммунных взаимодействий, обуславливающих физиологическое развитие беременности [41, 44, 93, 98, 121, 130, 136, 159, 267, 283, 290]. Многими авторами эта классическая концепция дополняется участием Treg и ТЫ7-лимфоцитов при беременности [44, 41, 93, 159, 163, 267, 283, 290]. ТЫ7 - еще один вид CD4+ Т-хелперов, который был недавно идентифицирован [95, 216]. ТЫ7-лимфоциты способны продуцировать цитокин ГЬ-17, который обладает провоспалительной активностью [95, 159, 216]. Известно, что ГЬ-17 играет важную роль в защите от внеклеточных бактерий и грибов [268], способствует развитию воспалительной реакции при аутоиммунных заболеваниях и остром отторжении трасплантата [95, 159]. При беременности ГЬ-17 принимает участие в индукции воспаления, которое необходимо для успешной имплантации бластоцисты при децидуализации эндометрия в начале гестационного процесса [9, 41]. Как показывают литературные данные, полученные на мышах, после завершения процесса имплантации роль ГЬ-17 уменьшается, а на первый план выходят ^2-зависимые механизмы [176]. Успех беременности, скорее всего, обусловлен балансом ТЫ-, ТИ2-, ТЫ7-, Т^-зависимых реакций [156, 267, 269, 283]. В литературе имеются данные, что Treg во многом обуславливают необходимый уровень иммуносупрессии во время беременности за счет синтеза ГЬ-10 [269]. Роль Treg клеток - иммунорегуляция и индукция толерантности путем подавления пролиферации и продукции цитокинов CD4+ и CD8+ клетками, продукции

иммуноглобулинов В-лимфоцитами, цитотоксической активности природных клеток - киллеров и созревания дендритных клеток [159, 248, 274]. Первоначально было установлено, что IL-10 вырабатывается CD4+ ^2-лимфоцитами у грызунов [159]. Однако современные данные свидетельствуют, что IL-10 вырабатывается многими клетками иммунной системы [176, 199, 209, 269]. Основными источниками IL-10 у человека являются Th2, Th1, Th17, Treg-лимфоциты [176, 209, 233, 267, 269], CD8+ Т-клетки также обладают способностью синтезировать IL-10 [233]. Кроме того, продуцентами IL-10 выступают стимулированные моноциты и макрофаги, некоторые виды дендритных клеток, эозинофилы, тучные клетки [199, 233]. Неиммунными источниками IL-10 являются кератиноциты, клетки эпителия, и даже опухолевые клетки [199].

В литературе накапливается все больше данных, что важнейшим источником IL-10 являются В-лимфоциты [77, 113, 127, 188, 217, 224, 238]. При этом IL-10 является важным фактором созревания В-лимфоцитов: усиливает пролиферацию В-клеток, повышает их выживаемость, участвует в процессе переключения изотипов иммуноглобулинов, способствует процессу созревания плазматических клеток, предотвращает апоптоз В-лимфоцитов [69, 74, 81, 119, 214]. IL-10+ В-лимфоциты - особая фракция клеток, которые были выявлены по способности регулировать развитие как Th1-, так и ^2-зависимых иммунных реакций и подавлять воспаление [74, 77, 189, 224, 238, 260, 295]. В литературных источниках не существует единого мнения о происхождении и фенотипической принадлежности данного пула В-клеток, однако известна основная их роль: осуществлять негативную регуляцию иммунного ответа in vitro или в естественных условиях за счет выработки IL-10, а в некоторых случаях и TGF0, поэтому для удобства эти клетки стали называть B10 или Вreg [39, 113, 127, 188, 189, 195, 201, 236, 242, 260, 266]. В^ подавляют воспаление, регулируя внутриклеточные каскады, связанные с IL-1 и STAT3-механизмами [189]. В литературе имеются данные, что Breg лимфоциты у человека характеризуются повышенным уровнем поверхностной экспрессии CD19 и IgD [87]. Некоторые авторы считают, что характерный фенотип для Breg лимфоцитов человека -

CD 19+CD24+CD38hi [79]. Другие высказывали мнение, что В10 фенотипически сходны с таковыми у мышей: CD24CD27+ [87] и несут на своей поверхности маркеры памяти и активации: CD27, CD48, CD148 [87]. Некоторые исследователи высказывают противоположное мнение, поскольку относят В10-клетки к наивным В-лимфоцитам, которые характеризуются отсутствием поверхностной экспрессии маркеров памяти CD27 [114]. В литературе имеются данные, что часть Breg клеток имеют признаки В1а лимфоцитов, поскольку на их поверхности присутствует CD5 молекулы [195]. Другая фракция В^

клеток характеризуется фенотипом CD21+CD23-, высоким уровнем CD1d и способностью активироваться через TLR, тем самым демонстрируя максимальное сходство с М7-клетками [189]. В-клетки этих двух видов условно отнесли к Breg лимфоцитам «врожденного» типа [189, 195, 273]. Другие В-лимфоциты с регуляторной функцией характеризовались фенотипом предшественников как Т2, так и М7В-клеток (Т2-М7В): CD1d+CD21+CD23+ [189, 195, 273]. Часть В10 клеток, которые проходят процессы активации через BCR при участии CD40-CD40L взаимодействия и берут начало от фолликулярных В-клеток, условно относят к «приобретенному» типу В^ клеток (CD11b-CD5-IgD+) [195, 273].

Данные по содержанию Breg лимфоцитов при беременности немногочисленны [99, 201, 238, 239, 282]. Первые исследования В^ клеток при беременности, проведенные на мышах, показали, что содержание Breg лимфоцитов снижалось в мышиной модели потери беременности [152]. А перенос ГЬ-10 продуцирующих В-лимфоцитов мышам с угрозой выкидыша предотвращал его развитие [239]. Другие исследования на мышах показали повышенное содержание В10 клеток в селезенке у мышей при нормальном развитии беременности, и отсутствие такового как у небеременных мышей, так и на модели выкидыша [56]. При изучении физиологической беременности человека было показано, что содержание регуляторных В-клеток в периферической крови повышалось в первом триместре гестации [99]. Этими же авторами было установлено, что у женщин с привычным невынашиванием ранних сроков уровень регуляторных В-клеток в периферической крови был ниже параметров

женщин с неосложненной беременностью и соответствовал таковому группы небеременных доноров [99]. Кроме того, было показано, что ГЬ-10-продуцирующие В-клетки женщин с неосложненной беременностью ранних сроков были способны подавлять выработку TNFa CD4+ Т-лимфоцитами [99]. Вероятно, формирование пула ГЬ-10+ В-клеток при беременности -гормонозависимый процесс, и адекватная выработка ХГЧ при физиологическом течении гестационного процесса способствует повышению уровня В10 лимфоцитов, которые запускают несколько механизмов развития толерантности [99]. Имеются исследования по изучению содержания периферических CD24hiCD38hi и CD24hlCD27+ В^ клеток у женщин на поздних сроках физиологической беременности [88]. Было установлено, что абсолютное и относительное содержание В^ лимфоцитов с фенотипом CD24 CD38hi было существенно сниженным в третьем триместре беременности и в день родов в сравнении с таковым у женщин после родов и небеременных доноров [88]. В то же время авторами было отмечено, что относительное содержание CD24CD38 периферических В-регуляторных клеток было существенно повышенным у женщин в отдаленном периоде после родов по сравнению с таковым у небеременных женщин [88]. Предполагается, что на фоне снижения уровня гормонов после родов происходит нормализация сниженных процессов В-лимфопоэза и активация В-клеток [88]. При этом содержание периферических Breg с фенотипом CD24hiCD27+ не имело достоверных различий между группами беременных и небеременных женщин как в процентном соотношении, так и в абсолютных числах [88].

Поскольку свою регуляторную функцию Breg осуществляют, преимущественно, за счет выработки ГЬ-10 [77, 238, 295], в настоящее время широко постулируется уникальная роль ГЬ-10 при беременности [162, 252, 291]. Действие ГЬ-10 многогранно [168, 214]. Обсуждается несколько основных эффектов ГЬ-10 при беременности: как мощного иммуносупрессорного фактора, который способствует развитию толерантности матери к антигенам плодового происхождения, фактора плацентарного ангиогенеза и фактора

трансплацентарной регуляции толерантности плода по отношению к материнским антигенам [89, 126, 269, 270, 291]. Супрессорная роль в модуляции иммунного ответа ГЬ-10-продуцирующими Breg клетками была широко описана на различных животных в экспериментальных моделях воспаления, рака и аутоиммунных заболеваний [88]. В литературе отмечается несколько биологических эффектов, обеспечивающих противовоспалительное действие ГЬ-10 [89, 173, 199, 214, 269]. ГЬ-10 подавляет дифференцировку дендритных клеток из предшественников и их дальнейшее созревание [199]. ГЬ-10 ингибирует способность моноцитов и макрофагов представлять антиген Т-клеткам посредством ингибирующего действия на экспрессию главного комплекса гистосовместимости II типа [199, 214, 269]. ГЬ-10 ингибирует активацию костимуляторных молекул CD80 и CD86 [199, 214], подавляет синтез основных провоспалительных цитокинов ГЬ-1, ГЬ-6, ГЬ-8, ГЬ-12 и ТОТа [89, 199, 214] и, как следствие, препятствует развитию ТЫ-, ^2- и ТЫ7-зависимых иммунных реакций [173, 199]. Это подтверждается рядом авторов, которые утверждают, что ГЬ-10 способствует развитию толерантности на уровне плаценты путем подавления синтеза провоспалительных цитокинов: ГЬ-6, TNFа и ^N7 [159]. Известно, что в течение первого и второго триместра беременности содержание ГЬ-10 в плацентарной ткани выше в сравнении с показателями третьего триместра, что, по мнению авторов, также подтверждает роль ГЬ-10 в качестве супрессорного фактора при беременности для обеспечения толерантности организма матери к семиаллогенному плоду [269, 270, 291]. Третий триместр нормально-протекающей беременности характеризуется сниженным содержанием ГЬ-10 и повышенным содержанием провоспалительных цитокинов в плаценте, что необходимо для индукции спонтанных родов [159, 291]. Толерогенное действие ГЬ-10 подтверждается и другими исследованиями, которые говорят о повышенном содержании ГЬ-10 в амниотической жидкости на ранних сроках физиологической беременности [158, 295]. При патологии беременности, например, при раннем самопроизвольном выкидыше, привычном невынашивании, преэклампсии, преждевременных родах содержание ГЬ-10 в плаценте было сниженным [107,

291]. Имеются данные о снижении плацентарного ГЬ-10 на уровне децидуальной оболочки и трофобласта при беременности, осложненной задержкой роста плода на мышиных моделях [161, 176] и у человека [24, 101]. Механизмы, приводящие к недостаточной продукции ГЬ-10 в плаценте, до конца не изучены [269]. ГЬ-10 активность опосредуется через его специфический рецептор - IL-10R, который состоит из двух субъединиц (IL-10R1 и IL-10R2) и является членом семейства рецепторов цитокинов класса интерферонов [269]. Известно, что IL-10R1 принимает участие в непосредственном связывании ГЬ-10, а IL-10R2 необходим для инициации каскада реакций, который осуществляется преимущественно по Jak/STAT сигнальному пути [89, 269]. Имеются данные, что IL-10R1 молекула конститутивно экспрессируется на клетках синцитиотрофобласта [269]. Получены данные, которые доказывают роль ГЬ-10 в качестве мощного противовоспалительного цитокина, действующего на системном уровне [160, 186, 269]. Некоторыми авторами высказывалось мнение, что снижение интенсивности воспалительных процессов у женщин с ревматоидным артритом при беременности связано с действием ГЬ-10 [160, 269]. Это подтверждается данными о том, что у женщин с ревматоидным артритом повышенный уровень сывороточного ГЬ-10 был связан с более высокой массой плода при рождении, а повышение содержания ГЬ-6 сочеталось с более низким весом детей при рождении [186]. Литературные данные по содержанию ГЬ-10 в сыворотке крови при беременности, осложненной преэклампсией, противоречивы [82, 269, 292]. Показано, что при беременности, осложненной преэклампсией, отмечалось сниженное содержание ГЬ-10 [269, 292]. По данным других авторов, сывороточный уровень ГЬ-10 при беременности, осложненной преэклампсией, был повышен [82, 284]. Исследования Кудряшовой А. В. и соавторов (2009) показали, что в первом триместре неосложненной беременности отмечалось повышение сывороточного уровня ГЬ-10 в крови беременных женщин по сравнению с параметрами небеременных доноров [24]. Содержание ГЬ-10 в сыворотке крови женщин первого триместра было практически одинаковым как в случае физиологического ее течения, так и при развитии в дальнейшем ЗРП [24].

В третьем триместре беременности, осложненной ЗРП, содержание сывороточного IL-10 было существенно выше по сравнению с параметрами неосложненной беременности [24]. Имеются данные, что в эксперименте периферические лимфоциты беременных женщин с ЗРП, стимулированные антигенами трофобласта плода, синтезировали повышенное количество IL-8, IFNy и TNFa, а содержание продуцируемого IL-10 было недостаточным [230].

Наряду с толерогенным эффектом IL-10 при беременности многими авторами была описана роль плацентарного IL-10, как важнейшего регулятора процессов роста и ремоделирования сосудов плаценты при беременности [89, 269, 291]. Предполагается, что с изменением содержания IL-10 может быть связано развитие гипоксических/ишемических сосудистых нарушений в плаценте и, как следствие, осложнений беременности [89, 269, 291]. По мнению Thaxton J. E. и Sharma S. (2010), IL-10 инициирует выработку сосудистого эндотелиального фактора роста С (VEGF C) и аквопорина (AQP1) клетками трофобласта, что приводит к стимуляции плацентарного ангиогенеза [269]. Предполагается важная роль IL-10 совместно с IL-4 и IL-13 в процессах инвазии трофобласта [117, 269].

Кроме того, в современной литературе обсуждается участие IL-10 не только в индукции материнской иммунной толерантности по отношению к плоду, но и особая роль IL-10 при активном участии Treg в трансплацентарной регуляции толерантности плода по отношению к материнским аллоантигенам [183]. На мышиных моделях беременности авторами было показано наличие сильных положительных корреляционных связей между содержанием периферических Treg клеток и уровнем сывороточного IL-10 матери и плода [126]. Авторами было установлено, что Treg материнского происхождения способны мигрировать в лимфатические узлы плода и заселять их и, впоследствии, при участии IL-10 индуцировать механизмы плодовой толерантности к антигенам матери [126].

Помимо важнейшей роли IL-10 как на системном, так и на локальном уровне для физиологического течения беременности обсуждается значение IL-6 для нормального течения гестационного процесса [24, 158, 175, 283, 284]. Отмечалось, что TNF-a, IL-1ß и IL-6 участвуют в процессах имплантации

бластоцисты в ранние сроки гестации [159]. Данные по содержанию ГЬ-6 при физиологической беременности противоречивы: ряд авторов говорит о повышении уровня ГЬ-6 в конце беременности [175, 250], а другие утверждают, что сывороточное содержание ГЬ-6 в динамике беременности не менялось [63, 158]. Было обнаружено, что в плацентарных лизатах уровень ГЬ-6 был значительно выше при рождении детей с ЗРП [83, 182], что подтверждалось данными о повышенной продукции ГЬ-6 клетками трофобласта при гипоксии [83]. Известно о повышенном содержании ГЬ-6 в сыворотке крови новорожденных с ЗРП [49]. По данным Кудряшовой А. В. и соавторов (2009), повышение сывороточного содержания ГЬ-6 отмечалось в ранние сроки беременности, и его уровни были практически одинаковы как при физиологическом течении беременности, так и при развитии ЗРП в дальнейшем [24]. По данным этих же авторов в третьем триместре беременности уровни сывороточного ГЬ-6 были ниже порогового значения как при неосложненной беременности, так и при ЗРП [24]. В то же время в эксперименте было показано, что при ЗРП периферические лимфоциты и моноциты в значительно большей степени секретировали в культуральную среду ГЬ-6 [24]. Авторами предполагалось, что уровень ГЬ-6 не повышался в периферической крови женщин с ЗРП за счет его быстрой реализации в иммунных реакциях для стимуляции выработки антител В-лимфоцитами [24]. В литературе имеются данные, что активированные антигеном В-лимфоциты сами являются источником ГЬ-6 [296]. ГЬ-6 является плейотропным цитокином, который влияет на антиген-специфические и воспалительные реакции [264]. Основными биологическими эффектами ГЬ-6 являются: активация пролиферации активированных антигеном В-лимфоцитов, стимуляция переключения изотипов иммуноглобулинов и синтеза антител, активация функциональной активности Т-лимфоцитов [11, 27, 30, 81, 264, 300]. ГЬ-6 называют ростовым фактором для активированных В-клеток [11, 27]. Кроме того, ГЬ-6 играет ключевую роль в воспалении, является основным индуктором синтеза острофазовых белков: С-реактивного белка, фибриногена, сывороточного амилоидного белка, гаптоглобина, а1-антихимотрипсина [264, 296]. Рядом

авторов было высказано мнение, что нарушение синтеза IL-6 при беременности, осложненной ЗРП, может индуцировать резистентность к инсулину, обуславливая высокий риск развития диабета II типа во взрослом состоянии [76, 103, 155, 182].

Другим цитокином, который играет важную роль для физиологического течения беременности, является IL-4 [225, 234, 284]. Основными клетками, которые продуцируют IL-4, являются активированные ^2-лимфоциты, базофилы, тучные клетки, в меньшей степени - цитотоксические Т-лимфоциты, у5 Т-лимфоциты, эозинофилы [11, 27, 36]. В литературе имеются данные, что В-лимфоциты также способны продуцировать IL-4 [232]. IL-4 является плейотропным цитокином [11, 27, 30, 36]. IL-4 способствует поляризации иммунного ответа в сторону ^2-реакций, ингибирует активность макрофагов, подавляет IFNy-зависимые реакции, усиливает экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности антигенпредставляющих клеток, усиливает экспрессию рецепторов IgE на тучных клетках, способствует противогельминтной защите [11, 27, 30, 36]. Но к основным биологическим эффектам IL-4 относят активацию пролиферации и усиление функциональной активности В-лимфоцитов [11, 27, 30, 36]. IL-4 оказывает действие на покоящиеся лимфоциты, приводя к усилению экспрессии IgM, CD23, MHC II класса на поверхности В-клеток [11, 27, 30, 36]. IL-4 способствует переключению изотипов иммуноглобулинов IgM на IgG4, IgE [124, 178], стимулирует пролиферацию активированных антигеном В-лимфоцитов и синтез ими антител [11, 30, 36]. Harris D. P. с соавторами (2000) выделил два типа эффекторных В-лимфоцитов по их способности синтезировать различные цитокины: Ве1-лимфоциты, которые производят IFNy и поляризуют иммунный ответ в сторону ТЫ-реакций, и Be2-клетки, которые продуцируют IL-4 и способствуют развитию ^2-зависимых реакций [232]. По мнению авторов, дихотомия в производстве интерлейкинов В-эффекторными лимфоцитами определялась цитокиновым профилем при первичной встрече В-лимфоцитов с антигеном и Т-лимфоцитами [232]. Ряд исследований свидетельствуют, что физиологическое течение беременности связано с повышением уровня IL-4 [225, 234]. Известно, что основной гормон

беременности - прогестерон является индуктором синтеза ГЬ-4 [234]. Было показано, что развитие осложнений беременности: самопроизвольных абортов, привычного невынашивания, ЗРП, а также бесплодия было связано со сниженной продукцией ГЬ-4 и ГЬ-10 КК, Т-лимфоцитами, регуляторными В-клетками [234]. Литературные данные свидетельствуют, что при беременности ГЬ-4 синтезируется не только иммунными клетками плаценты, но и клетками децидуальной оболочки, эндотелиальными клетками матери и плода [234]. По данным Кудряшовой А. В. и соавторов (2009), в первом триметре физиологической беременности происходило достоверное повышение уровня ГЬ-4 в периферической крови [24]. В то же время в начале беременности, впоследствии осложненной ЗРП, повышение уровня ГЬ-4 не было столь значительным и не достигало уровня параметров женщин с неосложненной беременностью [24]. В третьем триместре беременности у женщин с ЗРП уровень ГЬ-4 в периферической крови был достоверно выше параметров физиологической беременности [24]. По данным этих же авторов содержание периферических ГЬ-4+ лимфоцитов было сопоставимо в начале неосложненной беременности и при ЗРП, а в третьем триместре содержание ГЬ-4+ лимфоцитов было достоверно выше при беременности, осложненной ЗРП [24]. Авторы предполагают, что нормальное содержание ГЬ-4 на ранних сроках беременности обусловлено его быстрой реализацией в иммунных процессах [24]. Повышенное содержание ГЬ-4 в сыворотке крови беременных с ЗРП в III триместре обусловлено не его интенсивной продукцией, а ростом пула лимфоцитов, продуцирующих его [24]. В то же время особенности внутриклеточной экспрессии ГЬ-4 и ГЬ-6 периферическими В-лимфоцитами при беременности, осложненной ЗРП, практически не изучены.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Фролова Мария Викторовна, 2017 год

- / /

■ -------------------

- / /

- -------------------7

/ / / /

■ 1 1 , , , г , , , , , , 1 , , , г

1 0 0 20 40 60 80 100

Specificity

Рис. 3.2.2. ROC-кривая чувствительности и специфичности показателя уровня CD19+CD27+ В-лимфоцитов в периферической крови беременных женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель гестации при рождении детей с ЗРП (1) и без ЗРП (0).

0

Таким образом, дифференцировка периферических В-лимфоцитов памяти у женщин с ЗРП, характеризовалась высоким уровнем общей фракции СD19+CD27+IgD± В-клеток памяти за счет повышенного содержания «непереключенных» CD19+CD27+IgD+ В-лимфоцитов памяти. У женщин с ЗРП при рождении детей с ЗРП вне зависимости от степени ее тяжести у новорожденных - изменения соответствовали таковым в общей группе; при рождении детей без ЗРП отмечалось сниженное содержание CD19+CD27+IgD±

лимфоцитов, за счет сниженного уровня CD19+CD27+IgD- «переключенных» В-клеток. Содержание CD27+ клеток в популяции CD19+ В-лимфоцитов в периферической крови беременных женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель равное или менее 19,4% позволяет с точностью 93% прогнозировать эффективность лечения задержки роста плода у беременных женщин и рождение детей без ЗРП.

3.3. Функциональные особенности периферических В-лимфоцитов при беременности, осложненной задержкой роста плода

Показанные нами ранее изменения параметров дифференцировки В-лимфоцитов свидетельствуют об изменении функциональной активности периферических В-клеток при ЗРП. Отражением функциональной активности гуморального звена иммунитета является внутриклеточная экспрессия цитокинов В-лимфоцитами [11, 20, 27, 34, 36, 232, 296] и секреция иммуноглобулинов плазматическими клетками [30, 34, 36, 53, 222]. Важнейшими цитокинами В-звена иммунитета являются ГЬ-4 и ГЬ-6 [11, 20, 27, 34, 36, 232, 296]. Литературные данные свидетельствуют, что В-лимфоциты сами способны продуцировать ГЬ-4 и ГЬ-6 [232, 296]. Мы оценивали функциональную активность В-лимфоцитов у беременных женщин с ЗРП по уровню внутриклеточной спонтанной экспрессии ГЬ-4 и ГЬ-6 CD20+ периферическими В-клетками.

Особенности содержания периферических CD20+ В-лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих ГЬ4 и ГЬ-6, у женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель беременности представлены в таблице 3.3.1 и на рисунке 3.3.1.

Таблица 3.3.1

Содержание CD20+IL4+ и CD20+IL6+ периферических В-лимфоцитов у

беременных женщин с ЗРП

Показатель, % (М±т) Контрольная группа (п=21) Общая группа ЗРП (п=46) ЗРП^ЗРП (п=32) ЗРП^ без ЗРП (п=14)

СБ20+1Ь-4+ 7,88±0,46 10,71±0,75 р=0,002 11,09±0,92 р=0,003 9,63±1,19

СБ20+!Ь-6+ 15,84±0,62 21,44±1,21 р=0,000 22,33±1,51 р=0,000 18,85±1,51

п - число обследованных.

р - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля.

Проведенные исследования показали, что в группе женщин с ЗРП, уровень CD20+ В-лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих ГЬ-4 был достоверно выше, чем в контрольной группе (р=0,002). В основной группе женщин, с реализовавшейся ЗРП у новорожденных, отмечался повышенный уровень CD20+IL-4+ периферических В-клеток по сравнению с показателем контрольной группы (р=0,003). В группе женщин с ЗРП, родивших детей без нее, отмечалась лишь тенденция к повышению уровня CD20+IL-4+ периферических В-лимфоцитов по сравнению с показателями контроля (р>0,05). Уровень CD20+IL-4+ периферических В-клеток у женщин с ЗРП, родивших детей с данной патологией, хотя и имел тенденцию к повышению по сравнению с таковым основной группы, родивших детей без ЗРП, достоверно не отличался (р>0,05).

Из представленных в таблице 3.3.1 данных видно, что уровень CD20+IL-6+ В-лимфоцитов в периферической крови женщин с ЗРП был достоверно выше аналогичного параметра группы контроля (р=0,000). Содержание периферических CD20+IL-6+ В-клеток в группе женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, было существенно выше, чем в контрольной группе (р=0,000). В основной группе женщин с нереализовавшейся ЗРП у новорожденных отмечалась лишь тенденция

к повышению содержания CD20+IL-6+ периферических В-лимфоцитов по сравнению с таковым контрольной группы (р>0,05). Содержание CD20+IL-6+ В-клеток в периферической крови женщин с ЗРП было несколько выше, в случае рождения детей с ЗРП, по сравнению с таковым у женщин, родивших детей без ЗРП, однако, существенной разницы исследуемого параметра не наблюдалось (р>0,05).

Рис. 3.3.1. Особенности содержания CD20+IL-4+ и CD20+IL-6+ CD20+В-лимфоцитов в периферической крови беременных женщин с ЗРП в зависимости от тяжести ЗРП у новорожденных. р - коэффициент достоверности разности результатов.

В группе женщин с ЗРП, родивших детей с легкой степенью патологии, была выявлена выраженная тенденция к повышению содержания периферических CD20+IL-4+ В-лимфоцитов по сравнению с параметрами контрольной группы (7,88±0,46% - контрольная группа, 10,05±1,76% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, р>0,05). В случае рождения детей с умеренной или тяжелой ЗРП, у женщин с ЗРП отмечался достоверно более высокий уровень периферических CD20+IL-4+ В-лимфоцитов, по сравнению с показателями

контрольной группы (7,88±0,46% - контрольная группа, 11,56±1,09% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p=0,004). Хотя нами и была отмечена тенденция к повышению уровня периферических CD20+IL-4+ В-лимфоцитов в основной группе женщин с ЗРП II-III у новорожденных, достоверных различий с показателями группы женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП I, выявлено не было (10,05±1,76% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, 11,56±1,09% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p>0,05).

Для группы женщин с ЗРП, родивших детей с легкой ЗРП, отмечалась выраженная тенденция к повышению уровня CD20+IL-6+ периферических В-лимфоцитов, хотя существенных изменений по сравнению с параметрами группы контроля не наблюдалось (15,84±0,62% - контрольная группа, 20,50±2,55% -основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, p>0,05). Для женщин основной группы, родивших детей с умеренной или тяжелой степенью ЗРП, было характерно повышенное содержание периферических CD20+IL-6+ В-клеток, по сравнению с таковым контрольной группы (15,84±0,62% - контрольная группа, 22,67±1,69% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p=0,001). Хотя нами и отмечалась тенденция к повышению уровня CD20+IL-6+ В-лимфоцитов в периферической крови женщин с ЗРП с повышением степени тяжести ЗРП у детей при рождении, достоверных различий выявлено не было (20,50±2,55% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, 22,67±1,69% -основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p>0,05).

Поскольку нами было отмечено повышенное содержание плазматических клеток в периферической крови женщин с ЗРП, на следующем этапе нашего исследования мы решили оценить сывороточное содержание иммуноглобулинов A, M, G у этих женщин. Особенности сывороточного содержания основных классов иммуноглобулинов у женщин с ЗРП в 32-36 недель беременности представлены в таблицах 3.3.2 и 3.3.3.

Таблица 3.3.2

Особенности сывороточного содержания ^А, ^М, IgG у женщин с ЗРП

Показатель, г/л (М±т) Контрольная группа (п=24) Общая группа ЗРП (п=57) ЗРП^ЗРП (п=41) ЗРП^ без ЗРП (п=16)

1§А 3,48±0,20 3,02±0,17 3,25±0,20 р2=0,015 2,43±0,25 р1=0,003

1§М 2,62±0,09 2,52±0,06 2,62±0,06 р2=0,031 2,26±0,15 р1=0,045

19,42±1,13 16,90±1,30 18,59±1,66 р2=0,008 12,57±1,40 р1=0,001

п - число обследованных.

р1 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля;

р2 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, по сравнению с показателями группы женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП.

Проведенные исследования показали, что в общей группе женщин, имевших при беременности ЗРП уровень ^А практически не отличался от показателей группы контроля (р>0,05). Содержание ^А в сыворотке крови женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, достоверно не менялось по сравнению с контрольными значениями (р>0,05), но было существенно выше такового в основной группе женщин, родивших детей без ЗРП (р=0,015). Сывороточный уровень ^А у женщин с ЗРП, не имевших ЗРП у новорожденных, был достоверно сниженным по сравнению с исследуемым параметром контрольной группы (р=0,003).

Содержание ^М в сыворотке крови женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, достоверно не менялось в сравнении с аналогичным параметром группы контроля (р>0,05). В группе женщин с ЗРП, с реализованной ЗРП у новорожденных, сывороточный уровень ^М также существенно не отличался от контрольных значений (р>0,05), и был достоверно выше такового в

группе женщин с ЗРП, но родивших детей без ЗРП (р=0,031). В основной группе женщин, имевших при беременности ЗРП, которая не реализовалась у новорожденных, сывороточный уровень ^М был снижен в сравнении с контрольными параметрами (р=0,045).

Достоверных изменений в содержании иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови у женщин с ЗРП в сравнении с контрольными значениями выявлено не было (р>0,05). В группе женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, с подтвержденной ЗРП у новорожденных, сывороточный уровень IgG не отличался от контрольных параметров (р>0,05), при этом он был выше параметра основной группы женщин, родивших детей без ЗРП (р=0,008). Группу женщин с ЗРП, которая не реализовалась у детей при рождении, отличал сниженный уровень IgG в сыворотке крови, по сравнению с таковым контрольной группы (р=0,001).

Таблица 3.3.3

Содержание иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови беременных

женщин, в зависимости от тяжести ЗРП у новорожденных

Показатель, Контрольная ЗРП^ЗРП

г/л группа (п=40)

ЗРП^ЗРП I ЗРП^ЗРП п-ш

(М±т) (п=24) (п=14) (п=26)

1§А 3,48±0,20 3,19±0,34 3,28±0,23

1еМ 2,62±0,09 2,61±0,11 2,62±0,07

19,42±1,13 17,65±3,08 18,29±1,90

п - число обследованных.

Как видно из представленных в таблице 3.3.3 данных, сывороточный уровень IgG, ^А и ^М у женщин с ЗРП, родивших детей с легкой ЗРП и ЗРП умеренной или тяжелой степени практически не отличался от контрольных значений и между собой (р>0,05 во всех случаях).

Одним из основных фактором активации эффекторных механизмов гуморального звена иммунитета является связывание антител с антигенами с

формированием иммунных комплексов [30, 34, 36]. Мы провели оценку ЦИК в периферической крови женщин с ЗРП в зависимости от реализации данной патологии у новорожденных. Данные представлены в таблице 3.3.4.

Таблица 3.3.4

Содержание циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови

беременных женщин с ЗРП

Показатель, Контрольная Общая группа ЗРП^ЗРП ЗРП^

% группа ЗРП без ЗРП

(М±т) (п=9) (п=18) (п=12) (п=6)

ЦИК 2,83±1,04 6,39±0,76 р1=0,010 7,96±0,83 р1=0,001 р2=0,046 4,92±1,07

п - число обследованных.

р1 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля;

р2 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, по сравнению с показателями группы женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП.

Уровень ЦИК в периферической крови женщин с ЗРП был достоверно повышен в сравнении с контрольными значениями (р=0,010). Женщины с ЗРП, родившие детей с подтвержденной ЗРП, также характеризовались повышенным содержанием ЦИК в периферической крови, по сравнению с таковым группы контроля (р=0,001), и основной группы женщин родивших детей без ЗРП (р=0,046). У женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, но родивших детей без ЗРП, уровень ЦИК в сыворотке крови хотя и имел тенденцию к повышению, но существенно не менялся по сравнению с контрольными значениями (р>0,05).

Таким образом, женщины в сроке 32-36 недель гестации с ЗРП, отличались от женщин без ЗРП, повышенным уровнем периферических CD20+ В-лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих ГЬ-4, ГЬ-6 и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови. У женщин с ЗРП, при рождении детей

с ЗРП, изменения соответствовали таковым в общей группе, без ЗРП отмечалось только сниженное сывороточное содержание IgA, IgM, IgG. В случае рождения детей с умеренной или тяжелой ЗРП отмечался только повышенный уровень IL-4+ и IL-6+ В-клеток в популяции CD20+ В-лимфоцитов, при рождении детей с легкой степенью ЗРП - изменения отсутствовали.

3.4. Особенности сывороточного содержания BAFF и его рецепция периферическими В-лимфоцитами при беременности, осложненной ЗРП

Исследования последних лет свидетельствуют, что критическим для ранних этапов иммунного созревания периферических В-лимфоцитов [34, 36, 61, 92, 132, 271], выживания плазматических клеток [132, 134, 271] и клеток памяти [100, 132, 174, 271] является реализации BAFF - зависимого пути дифференцировки В-клеток. [100, 174]. Поскольку нами был отмечен шифт дифференцировки периферических В-клеток до конечных эффекторных этапов, мы провели анализ содержания сывороточного BAFF, периферических BAFFR+ В-лимфоцитов и плотность экспрессии BAFFR В-клетками у женщин с ЗРП.

Результаты оценки содержания BAFF в сыворотке крови, и особенности экспрессии его специфического рецептора BAFFR периферическими CD 19+ В-лимфоцитами у беременных женщин с ЗРП представлены в таблицах 3.4.1, 3.4.2 и на рисунке 3.4.1.

Таблица 3.4.1

Особенности сывороточного содержания и рецепции BAFF периферическими CD19+ В-лимфоцитами у женщин с задержкой роста плода

Показатель (M±m) Контрольная группа (n=25) Общая группа ЗРП (n=54) ЗРП^ЗРП (n=38) ЗРП^ без ЗРП (n=16)

BAFF, нг/мл 0,54±0,06 0,47±0,03 0,41±0,03 p1=0,049 p2=0,004 0,61±0,06

CD19+BAFFR+, % 63,55±2,26 75,97±1,48 p1=0,000 75,40±1,86 p1=0,000 76,98±1,08 p1=0,000

MFI BAFFR, ед. 4239,21±236,77 5030,86±213,55 p1=0,019 5096,59±254,06 p1=0,020 4752,90±242,46

n - число обследованных.

p1 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля;

p2 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, по сравнению с показателями группы женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП.

Как видно из представленных в таблице 3.4.1 данных, в группе женщин, беременность которых осложнилась задержкой роста плода, отмечалась лишь тенденция к снижению уровня BAFF в сыворотке крови, но существенных изменений по сравнению с контрольными значениями не наблюдалось (p>0,05). Только в основной группе женщин, родивших детей с ЗРП, сывороточное содержания BAFF было существенно ниже, чем в группе контроля (p=0,049) и группе женщин, родивших детей без ЗРП (p=0,004). Сывороточное содержание BAFF существенно не менялось по сравнению с аналогичным параметром группы контроля у женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, но родивших детей без ЗРП (p>0,05).

Было установлено, что содержание CD19+BAFFR+ В-лимфоцитов было существенно выше в группе женщин, беременность которых осложнилась ЗРП,

чем в контрольной группе (p=0,000). В группе женщин с ЗРП, с реализовавшейся ЗРП у новорожденных, уровень CD19+BAFFR+ В-клеток был существенно выше аналогичного параметра группы контроля (p=0,000), и не отличался от такового в группе женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП (p>0,05). Уровень периферических CD19+ BAFFR+ В-клеток в основной группе женщин, родивших детей без ЗРП, был также существенно выше контрольных значений (p=0,000).

Уровень средней интенсивности флюоресценции (MFI) BAFF рецептора на периферических CD19+ В-лимфоцитах был выше у женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, чем в контрольной группе (p=0,019). У женщин с ЗРП, которая реализовалась у новорожденных, уровень средней интенсивности флюоресценции BAFFR периферическими CD19+ В-лимфоцитами был также повышенным в сравнении с аналогичным параметром группы контроля (p=0,020), но существенно не отличался от такового у женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП (p>0,05). У женщин основной группы, родивших детей без ЗРП, уровень MFI BAFF-рецептора на CD19+ В-клетках, хотя и имел тенденцию к повышению, достоверно не отличался от такового группы контроля (p>0,05).

Таблица 3.4.2

Особенности сывороточного содержания и рецепции BAFF периферическими CD19+ В-лимфоцитами у женщин с задержкой роста плода в зависимости от тяжести ЗРП у новорожденных

Показатель (M±m) Контрольная группа (n=25) ЗРП^ЗРП (n=32)

ЗРП^ЗРП I (n=11) ЗРП^ЗРП II-III (n=21)

BAFF, нг/мл 0,54±0,06 0,41±0,04 0,36±0,05 p=0,021

CD19+BAFFR+, % 63,55±2,26 72,07±3,14 p=0,043 76,59±2,29 p=0,000

MFI BAFFR, ед. 4239,21±236,77 4823,00±335,24 5220,00±323,07 p=0,025

n - число обследованных.

p - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля.

Данные, представленные в таблице 3.4.2, свидетельствуют, что сывороточный уровень BAFF был достоверно ниже, чем в контрольной группе, только в группе женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП II-III (p=0,021). В основной группе женщин, родивших детей с легкой степенью ЗРП, отмечалась лишь тенденция к снижению сывороточного уровня BAFF (p>0,05). Выявлена выраженная тенденция к снижению сывороточного уровня BAFF у беременных женщин с ЗРП с усилением тяжести патологии у новорожденных, однако, достоверного снижения уровня данного показателя выявлено не было (p>0,05).

Содержание периферических CD19+BAFFR+ лимфоцитов было существенно выше у женщин с ЗРП, как при рождении детей ЗРП I, так и ЗРП II-III, по сравнению с показателями группы контроля (p=0,043, p=0,000 соответственно). Хотя нами и была отмечена тенденция к повышению содержания CD19+ BAFFR+ В-лимфоцитов в периферической крови женщин с

ЗРП с утяжелением ЗРП у детей при рождении, но, существенных различий по уровню данного параметра выявлено не было (p>0,05).

При оценке средней интенсивности флюоресценции BAFF-рецептора на CD19+ В-лимфоцитах при ЗРП, было установлено существенное повышение уровня данного параметра по сравнению с таковым группы контроля в группе женщин с ЗРП, только в случае рождения детей с ЗРП II-III (p=0,025). У женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП легкой степени тяжести, уровень MFI BAFF-рецептора существенно не менялся и соответствовал таковому в группе контроля (p>0,05). Достоверных различий между группами женщин с ЗРП, родивших детей с легкой ЗРП и ЗРП умеренной или тяжелой по уровню средней интенсивности флюоресценции CD19+ BAFFR+ В-клеток выявлено не было (p>0,05).

Для оценки возможности использования иммунологических показателей для прогнозирования степени тяжести задержки внутриутробного роста у детей, родившихся от женщин с ЗРП, мы провели ретроспективный анализ сывороточного содержания BAFF у женщин в сроке 32-36 недель беременности с ЗРП и в контрольной группе. По результатам проведенного анализа был разработан дополнительный прогностический критерий, который основан на оценке сывороточного содержания BAFF у женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель беременности. При его значении равном или менее 0,48 нг/мл прогнозировали рождении детей с умеренной или тяжелой степенью ЗРП. Метод отличается высокой точностью - 74%, чувствительностью - 90%, специфичностью - 54%, AUC=0,698. Полученные данные представлены на рисунке 3.2.2.

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

100 80 <0,48 60 Sens.:90% 40 Spec.:54% 20 0

1

. : □ ! □□

■ | □□ г г

? у

:_i_t_ - ф й --------------------- ------------------------------ф--------------------- J г

- ы □а " в ■ 4P Q : ? ^ F-- I

20 40 60 80 10С

0,0 1 0 Specificity Рис. 3.4.1. ROC - кривая чувствительности и специфичности показателя сывороточного уровня BAFF у беременных женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель гестации при рождении детей с умеренной или тяжелой ЗРП (1) и в контрольной группе женщин (0).

Таким образом, у беременных женщин с ЗРП, по сравнению с беременными без ЗРП, было выявлено повышенное содержание периферических CD19+BAFFR+ В-лимфоцитов вне зависимости от наличия ЗРП и ее степени тяжести у детей при рождении. Отличительной чертой женщин с ЗРП, в случае рождения детей с умеренной и тяжелой ЗРП, явилась усиленная экспрессия BAFFR периферическими В-лимфоцитами и сниженный сывороточный уровень BAFF.

3.5. Содержание периферических регуляторных В-лимфоцитов и сывороточный уровень интерлейкина 10 при беременности, осложненной

задержкой роста плода

Согласно современным представлениям, важнейшим фактором, сдерживающим развитие иммунных реакций В-лимфоцитами, являются Breg клетки, продуцирующие ГЬ-10 [74, 77, 189, 238, 260, 295]. Ранее представленные данные свидетельствуют, что при ЗРП отмечалось усиление дифференцировки периферических В-лимфоцитов до конечных этапов: плазматических клеток и клеток памяти. Шифт дифференцировки периферических В-лимфоцитов может быть связан, как с повышенной продукцией факторов, усиливающих дифференцировку, так и с недостаточной продукцией факторов, ограничивающих ее. Мы оценили содержание периферических Breg, а также уровень ГЬ-10 в сыворотке крови у женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель беременности.

Особенности содержания CD20+IL10+ В-лимфоцитов (В^) в периферической крови женщин с ЗРП представлены в таблице 3.5.1 и на рисунке 3.5.1.

Таблица 3.5.1

Особенности содержания Breg в популяции CD20+ периферических лимфоцитов

у женщин с ЗРП

Показатель, % (М±т) Контрольная группа (п=21) Общая группа ЗРП (п=43) ЗРП^ЗРП (п=32) ЗРП^ без ЗРП (п=11)

СБ20+!Ь-10+ 25,30±1,31 18,49±0,74 р=0,000 18,54±0,92 р=0,000 18,35±1,21 р=0,001

п - число обследованных.

р - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля.

Было выявлено, что уровень периферических CD20+ Breg клеток у женщин с ЗРП был существенно ниже, чем в контрольной группе (р=0,000). Для группы женщин с ЗРП, родивших детей с реализовавшейся патологией, было также характерно существенно более низкое содержание CD20+IL10+ В-клеток в сравнении с контрольными значениями (р=0,000), и отсутствие отличий от такового у женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП (р>0,05). Содержание периферических CD20+IL-10+ В-клеток было также существенно ниже, чем в контроле, в группе женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП (р=0,001).

Рис. 3.5.1. Характер содержания периферических CD20+Breg лимфоцитов в крови женщин с ЗРП в зависимости от степени тяжести ЗРП у детей при рождении. р - коэффициент достоверности разности результатов.

Из данных, представленных на рисунке 3.5.1, видно, что в группе женщин с ЗРП, уровень периферических CD20+ Breg клеток был ниже, чем в контрольной группе, как в случае рождения детей с легкой ЗРП, так и с умеренной и тяжелой ЗРП (25,30±1,31% - контрольная группа, 16,87±1,23% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, p=0,000, 19,30±1,20% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p=0,002). Существенной разницы по уровню CD20+

Breg клеток в периферической крови женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП I и ЗРП II-III выявлено не было (p>0,05).

Особенности сывороточного уровня IL-10 у женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, представлены в таблице 3.5.2 и на рисунке 3.5.2.

Таблица 3.5.2

Содержание IL-10 в сыворотке крови у женщин при беременности, осложненной

ЗРП

Показатель, пг/мл Me (Q25; Q75) Контрольная группа (n=20) Общая группа ЗРП (n=45) ЗРП^ЗРП (n=31) ЗРП^ без ЗРП (n=14)

IL-10 0,00 (0,00-5,80) 2,40 (0,00-7,50) p<0,001 0,90 (0,00-7,30) p<0,01 4,94 (0,53-9,79) p<0,05

п - число обследованных.

р - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля.

У женщин с ЗРП сывороточное содержание ГЬ-10 было существенно повышенным в сравнении с контрольными параметрами (р<0,001). Содержание ГЬ-10 в сыворотке крови основной группы женщин, родивших детей с ЗРП, также было достоверно выше, чем в группе контроля (р<0,01), и оно существенно не отличалось от такового у женщин, родивших детей без ЗРП (р>0,05). Группа женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП, также характеризовалась достоверно повышенным уровнем ГЬ-10 в сыворотке крови, по сравнению с контрольным показателем (р<0,05).

Рис. 3.5.2. Характеристика сывороточного содержания IL-10 у беременных женщин с ЗРП, в зависимости от тяжести ЗРП у новорожденных. К - Контрольная группа,

Л ЗРП - основная группа женщин, родивших детей с легкой ЗРП,

У-Т ЗРП - основная группа женщин, родивших детей с умеренной или тяжелой

ЗРП,

p - коэффициент достоверности разности результатов. □Medrar I ]2Ь% /b%XM¡n Мая

Сывороточный уровень IL-10, хотя и имел тенденцию к повышению, существенно не менялся в группе женщин с ЗРП, родивших детей с легкой ЗРП, по сравнению с контрольными значениями (0,00 (0,00 - 5,80) пг/мл - контрольная группа, 0,05 (0,00 - 2,00) пг/мл - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, p=0,05). Содержание IL-10 в сыворотке крови беременных женщин с ЗРП, родивших детей с умеренной или тяжелой ЗРП было достоверно повышенным, по сравнению с контрольными значениями (0,00 (0,00 - 5,80) пг/мл - контрольная группа, 3,90 (0,00 - 7,50) пг/мл - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП П-Ш, p<0,01). Сравнение двух исследуемых групп беременных женщин с ЗРП,

родивших детей с легкой ЗРП и ЗРП умеренной или тяжелой степени не выявило достоверных различий по уровню сывороточного ГЬ-10 (0,05 (0,00 - 2,00) пг/мл -основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, 3,90 (0,00 - 7,50) пг/мл -основная группа женщин, родивших детей с ЗРП П-Ш, р>0,05).

Таким образом, в крови женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель, по сравнению с беременными женщинами без ЗРП, отмечалось сниженное содержание CD20+ Breg вне зависимости от наличия и тяжести ЗРП у детей при рождении. У беременных с ЗРП, отмечался повышенный уровень ГЬ-10 в сыворотке крови независимо от наличия ЗРП у новорожденных, но содержание ГЬ-10 зависело от степени тяжести ЗРП, повышаясь только в случае рождения детей с умеренной и тяжелой ЗРП.

Глава 4. ХАРАКТЕР АПОПТОЗА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ В-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ЗАДЕРЖКОЙ РОСТА ПЛОДА

Естественным механизмом завершения жизни любой клетки многоклеточного организма является иммунный апоптоз [11, 169, 180, 257]. Известно несколько механизмов запуска апоптоза, но наиболее изученным и значимым из них является Fas-зависимый путь [11, 169, 180, 257]. Мы оценили особенности экспрессии рецептора - Fas и его лиганда - FasL периферическими В-лимфоцитами при беременности, осложненной ЗРП.

Особенности содержания периферических Fas-позитивных В-лимфоцитов в популяции CD20+ клеток у женщин с диагнозом ЗРП представлены в таблице 4.1 и на рисунке 4.1.

Таблица 4.1

Особенности содержания периферических В-лимфоцитов, экспрессирующих

CD95+ у женщин с ЗРП

Показатель, % (M±m) Контрольная группа (n=19) Общая группа ЗРП (n=36) ЗРП^ЗРП (n=28) ЗРП^ без ЗРП (n=8)

CD20+CD95+ 6,57±1,03 3,67±0,51 p=0,018 3,14±0,50 p=0,006 5,53±1,32

CD20+CD5-CD95+ 5,30±0,92 3,02±0,45 p=0,035 2,47±0,46 p=0,011 4,66±1,00

CD20+CD5+CD95+ 1,27±0,22 1,05±0,21 1,10±0,22 0,88±0,59

п - число обследованных.

р - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля.

Проведенные исследования показали, что в периферической крови общей группы женщин с ЗРП, уровень CD20+CD95+ В-лимфоцитов был достоверно сниженным, по сравнению с таковым в группе контроля (р=0,018). В группе

женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, уровень периферических CD20+CD95+ В-клеток также был достоверно сниженным по сравнению с контрольными значениями (р=0,006), и существенно не отличался от такового у женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП (р>0,05). У женщин с ЗРП, с не реализовавшейся ЗРП у новорожденных, уровень периферических CD20+CD95+ лимфоцитов, хотя и имел незначительную тенденцию к снижению, достоверно не отличался от такового группы контроля (р>0,05).

Уровень периферических В2-лимфоцитов, с фенотипом CD20+CD5-CD95+ был достоверно сниженным в общей группе женщин с ЗРП, по сравнению с показателем группы контроля (р=0,035). Содержание CD20+CD5-CD95+ В-клеток в периферической крови женщин с ЗРП, с подтвержденной ЗРП у новорожденных, также было существенно сниженным, в сравнении аналогичным параметром контрольной группы (р=0,011), и имело выраженную тенденцию к снижению по сравнению с таковым в группе женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП (р>0,05). В основной группе женщин, родивших детей без ЗРП, уровень CD20+CD5-CD95+ лимфоцитов достоверно не менялся, и соответствовал таковому в контрольной группе (р>0,05).

Уровень периферических В1-лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5+CD95+ достоверно не менялся во всех исследуемых группах женщин с ЗРП вне зависимости от наличия ЗРП у новорожденных (р>0,05 во всех случаях).

Рис. 4.1. Содержание CD20+CD95+ В-клеток в периферической крови беременных женщин с ЗРП в зависимости от тяжести ЗРП у детей при рождении. р - коэффициент достоверности разности результатов.

Анализ особенности содержания Fas-позитивных В-лимфоцитов в периферической крови беременных женщин с ЗРП в зависимости от тяжести ЗРП у детей при рождении позволил выявить, что общий уровень CD20+CD95+ В-клеток был практически одинаковым как при рождении детей с ЗРП I, так и ЗРП II-III, и был существенно ниже такового группы контроля в обоих случаях (6,57±1,03% - контрольная группа, 3,38±0,65% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, p=0,014; 2,82±0,58% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p=0,004; p>0,05 - достоверность разности результатов между группами женщин с ЗРП, родивших детей с легкой и умеренной или тяжелой ЗРП).

Содержание периферических В2-лимфоцитов с фенотипом CD20+CD95+ у женщин с ЗРП было практически одинаковым как при рождении детей с легкой, так умеренной или тяжелой ЗРП, и достоверно сниженным по сравнению с таковыми в группе контроля в обоих случаях (5,30±0,92% - группа контроля, 2,56±0,69% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, p=0,025; 2,42±0,63% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p=0,015;

p>0,05 - достоверность разности результатов между группами женщин с ЗРП, родивших детей с легкой и умеренной или тяжелой ЗРП).

В исследуемых группах женщин с ЗРП с различной степенью тяжести ЗРП у новорожденных, содержание периферических CD20+CD5+CD95+ В1-клеток не менялось, и соответствовало таковому в группе контроля (1,27±0,22% -контрольная группа, 1,58±0,51% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, 0,84±0,18% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p>0,05 во всех случаях).

Особенности содержания периферических FasL-позитивных В-лимфоцитов в популяции CD20+ клеток у женщин с ЗРП представлены в таблице 4.2 и на рисунке 4.2.

Таблица 4.2

Характеристика содержания CD20+CD95L+ В-лимфоцитов в периферической

крови женщин с ЗРП

Показатель, % (M±m) Контрольная группа (n=19) Общая группа ЗРП (n=42) ЗРП^ЗРП (n=32) ЗРП^ без ЗРП (n=10)

CD20+CD95L+ 2,46±0,27 3,80±0,49 p=0,020 3,93±0,63 p=0,038 3,40±0,48

CD20+CD5-CD95L+ 1,56±0,22 2,86±0,48 p=0,017 3,00±0,63 p=0,037 2,44±0,39

CD20+CD5+CD95L+ 0,90±0,12 1,06±0,13 1,09±0,15 0,97±0,25

п - число обследованных.

р - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля.

Как видно из приведенных в таблице 4.2 данных, в общей группе женщин с ЗРП общий уровень периферических CD20+CD95L+ В-лимфоцитов был существенно выше, чем в контрольной группе (р=0,020). Содержание CD20+ В-лимфоцитов, экспрессирующих FasL, в группе женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, также было существенно повышенным, по сравнению с контрольными

значениями (р=0,038), но достоверно не отличалось от такового в группе женщин с ЗРП с нереализованной ЗРП у новорожденных (р>0,05). Женщины с ЗРП, беременность которых закончилась рождением детей без ЗРП, отмечалась лишь тенденция к повышению уровня CD20+CD95L+ В - лимфоцитов, но существенных изменений в сравнении с показателями группы контроля не наблюдалось (р>0,05).

В группе женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, содержание периферических CD20+CD5-FasL+ В2-клеток было существенно выше по сравнению с исследуемым параметром группы контроля (р=0,017). В основной группе женщин, родивших детей с ЗРП, содержание периферических CD20+ В2-лимфоцитов, экспрессирующих CD95L на своей поверхности, также было достоверно повышенным в сравнении с контрольными значениями (р=0,037). В группе женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП, отмечалась тенденция к повышению уровня CD20+CD5-CD95L+ В-клеток в периферической крови, но существенных изменений по сравнению с показателями группы контроля не наблюдалось (р>0,05). Между группами женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП и без нее, достоверной разницы по уровню периферических CD20+CD5-CD95L+ В-клеток нами выявлено не было (р>0,05).

Содержание CD20+CD5+CD95L+ периферических В1-лимфоцитов во всех исследуемых группах женщин с ЗРП, с различной степенью тяжести ЗРП у новорожденных, достоверно не различалось, и, соответствовало таковому в группе контроля (р>0,05 во всех случаях).

Рис. 4.2. Содержание CD20+CD95L+ периферических В-лимфоцитов у беременных женщин с ЗРП, в зависимости от тяжести ЗРП у новорожденных. р - коэффициент достоверности разности результатов.

В основной группе женщин, родивших детей с легкой степенью ЗРП, общий уровень CD20+CD95L+ В-клеток достоверно не менялся, однако имел тенденцию к повышению в сравнении с показателями группы контроля (2,46±0,27% -контрольная группа, 3,14±0,35% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, p>0,05). Лишь в группе беременных с ЗРП, родивших детей с умеренной и тяжелой ЗРП, было отмечено достоверное повышение уровня CD20+FasL+ В-лимфоцитов (2,46±0,27% - контрольная группа, 4,43±0,88% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p=0,043). Достоверных различий по уровню CD20+CD95L+ В-лимфоцитов между группами беременных женщин с ЗРП, родивших детей с легкой ЗРП и ЗРП умеренной или тяжелой выявлено не было (3,14±0,35% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, 4,43±0,88% -основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p>0,05).

В основной группе женщин, родивших детей с легкой ЗРП, достоверного изменения содержания периферических В2-лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5-CD95L+ по сравнению с контрольными значениями выявлено не было (1,56±0,22% - контрольная группа, 1,88±0,26% - основная группа женщин,

родивших детей с ЗРП I, p>0,05). Лишь в случае рождения детей с умеренной или тяжелой ЗРП, в периферической крови женщин с ЗРП, отмечался существенно повышенный уровень CD20+CD5-FasL+ B-лимфоцитов по сравнению с таковым в группе контроля (1,56±0,22% - контрольная группа, 3,53±0,90% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p=0,045). Содержание CD20+CD5-CD95L+ периферических В-лимфоцитов в группе женщин с ЗРП, с умеренной и тяжелой ЗРП у новорожденных имело выраженную тенденцию к повышению в сравнении с аналогичным параметром группы женщин с ЗРП, родивших детей с легкой ЗРП, однако достоверных различий выявлено не было (1,88±0,26% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, 3,53±0,90% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p>0,05).

Уровень периферических CD20+CD5+CD95L+ В1-лимфоцитов достоверно не различался между группами женщин с ЗРП с легкой ЗРП и ЗРП умеренной и тяжелой у новорожденных, и, соответствовал таковому группы контроля (0,90±0,12% - контрольная группа, 1,26±0,24% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП I, 1,00±0,19% - основная группа женщин, родивших детей с ЗРП II-III, p>0,05 во всех случаях).

Кроме оценки особенностей Fas-FasL-зависимого пути инициации апоптоза, мы оценили и содержание периферических В-клеток, вступивших в аптоптоз по параметрам аннексинового теста [9, 11, 36]. Содержание апоптирующих клеток определяли в субпопуляциях CD20+CD5- и CD20+CD5+ В-лимфоцитов.

Особенности содержания периферических В2 и В1-лимфоцитов, вступивших в апоптоз при ЗРП, представлены в таблице 4.3.

Таблица 4.3

Параметры иммунного апоптоза периферических CD20+ В-лимфоцитов у женщин с ЗРП по результатам аннексинового теста

Показатель, % (М±т) Контрольная группа (п=10) Общая группа ЗРП (п=19) ЗРП^ЗРП (п=10) ЗРП^ без ЗРП (п=9)

CD20+CD5-AnnexinV+ 20,08±1,86 11,86±1,31 р1=0,002 8,03±1,49 р1=0,000 р2=0,000 16,11±1,03

CD20+CD5+AnnexinV+ 3,57±0,76 1,91±0,30 1,19±0,09 р1=0,012 р2=0,019 2,70±0,51

п - число обследованных

р1 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП по сравнению с показателями группы контроля;

р2 - достоверность различий показателей женщин с ЗРП, родивших детей с ЗРП, по сравнению с показателями группы женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП.

Проведенные исследования показали, что в группе женщин с ЗРП уровень периферических CD20+CD5-AnnexinV+ В2-лимфоцитов, был достоверно ниже параметров группы контроля (р=0,002). Для группы женщин с ЗРП, с подтвержденной ЗРП у новорожденных, также было характерно достоверно сниженное содержание периферических CD20+CD5-AnnexinV+ В-клеток в сравнении с таковым группы контроля (р=0,000) и основной группы женщин, родивших детей без ЗРП (р=0,000). В группе женщин с ЗРП, с не реализовавшейся ЗРП у новорожденных, отмечалась лишь тенденция к снижению уровня периферических CD20+CD5-AnnexinV+ В-лимфоцитов, но существенных изменений по сравнению с показателями контрольной группы не наблюдалось (р>0,05).

Из результатов, представленных в таблице 4.3 видно, что уровень периферических CD20+CD5+AnnexinV+ В1-клеток, в общей группе женщин с

ЗРП, по сравнению с контрольными параметрами достоверно не менялся (р>0,05). Содержание CD20+CD5+AnnexinV+ В-клеток в группе женщин с ЗРП, с реализованной ЗРП у новорожденных, было ниже, чем в группе контроля и у женщин с ЗРП, родивших детей без ЗРП (р=0,012, р=0,019 соответственно). В группе женщин с ЗРП, с нереализованной ЗРП у новорожденных, изменений уровня CD20+CD5+AnnexinV+ периферических В-клеток по сравнению с аналогичным параметром группы контроля выявлено не было (р>0,05).

Таким образом, при беременности, осложненной ЗРП в 32-36 недель гестации, отмечалось выраженное нарушения иммунного апоптоза периферических В-лимфоцитов, что проявлялось сниженным уровнем В2-лимфоцитов, вступивших в апоптоз, CD95+ и CD5-CD95+ В-лимфоцитов на фоне повышенного содержания CD95L+ и CD5-CD95L+ В-клеток. У женщин с ЗРП при рождении детей с ЗРП дополнительно отмечалось снижение уровня В1-клеток, вступивших в апоптоз; при легкой ЗРП у новорожденных отмечался сниженный уровень CD95+ и CD5-CD95+ В-лимфоцитов; при умеренной или тяжелой ЗРП у детей при рождении выявлено сниженное содержание CD95+ и CD5-CD95+ В-лимфоцитов и повышенный уровень CD95L+ и CD5-CD95L+ В-клеток.

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Задержка роста плода является наиболее частым осложнением беременности [2, 3, 12, 17, 21, 26, 28, 33, 68, 165, 198, 276] и представляет собой многофакториальную патологию [1, 2, 3, 5, 8, 9, 13, 14, 15, 17, 19, 23, 24, 26, 28, 33, 35, 276] Формирование ЗРП при беременности связывают с нарушением продукции различных гормонов: соматотропного, соматомедина С, инсулиноподобных факторов роста и других [4, 15]. Но, по мнению большинства авторов, основная причина формирования ЗРП - плацентарная недостаточность [1, 3, 26, 29, 276]. Выделяют несколько механизмов формирования плацентарной недостаточности и ее крайней степени - ЗРП: недостаточность инвазии цитотрофобласта в спиральные артерии плацентарного ложа, патологическая незрелость ворсин, нарушение перфузии ворсин, эндотелиальная дисфункция, реологические нарушения [4]. Недостаточность первой или второй волны инвазии цитотрофобласта обуславливает неполноценность маточно-плацентарного кровообращения, гипоплазию плаценты и развитие ЗРП [26]. Обсуждается важная роль вазоактивных соединений, синтезируемых локально [4, 26]. Имеются данные, что во втором триместре беременности, осложненной ЗРП, на уровне плаценты отмечается сниженное содержание оксида азота (N0) и Е-селектина (которые имеют вазодилятационный эффект) на фоне повышенного содержания эндотелина-1, обладающего вазоконстрикторными свойствами, что обуславливает нарушение фетоплацентарного кровотока [4]. Особая роль в процессе формирования полноценного трофобласта и сосудистой сети плаценты принадлежит ростовым факторам [4, 26]. Наиболее изученные из них: сосудисто-эндотелиальный фактор роста, фактор роста плаценты, инсулиноподобный фактор роста, фактор роста фибробластов [4, 26]. По данным разных авторов содержание фактора роста плаценты при ЗРП снижено на протяжении всего периода гестации [4, 26]. Другим важным аспектом патогенеза ЗРП являются наследственные и приобретенные гемофилии [4, 8, 26]. Развитие тромбофилий

сопровождается формированием тромбов в микроциркуляторном русле плаценты, что может приводить к ЗРП и антенатальной гибели плода [8, 26]. Однако в последнее время появляется все больше работ, свидетельствующих о существенной роли иммунных механизмов в патогенезе ЗРП [9, 16, 18, 24, 35, 46, 85, 164, 206, 215, 228]. Развитие синдрома задержки роста плода сопровождается нарушением адаптивного иммунитета [9, 16, 18, 24, 46, 64, 194, 206]. По данным Кудряшовой А. В. и соавторов (2009) в ранние сроки беременности, впоследствии осложненной ЗРП, количество HLA-DR+ периферических лимфоцитов было недостаточным и не достигало уровня неосложненной беременности [24]. В третьем триместре картина была обратная: уровень HLA-DR+ лимфоцитов был существенно повышенным по сравнению с параметрами группы контроля [24]. Таким образом, авторами было показано, что при ЗРП отмечалось нарушение активации лимфоцитов: недостаточный ее уровень в начале беременности и ее чрезмерное повышение в конце гестационного процесса [24]. Как показал анализ литературы, данные о процессе созревания и дифференцировки наивных лимфоцитов и клеток памяти при ЗРП крайне немногочисленны [9, 16, 18, 24, 187, 206]. В отдельных работах в 3 триместре беременности отмечалось повышение уровня наивных CD4+ и CD8+ лимфоцитов относительно показателей небеременных женщин, максимально выраженное при ЗРП, и достоверное повышение уровня наивных цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с показателями женщин с неосложненным течением беременности [16]. Наряду с этим в периферической крови беременных с ЗРП в 30-38 недель гестации отмечено снижение содержания центральных клеток памяти в популяции CD4+ Т-лимфоцитов и претерминально-дифференцированных клеток памяти в популяции CD8+ клеток по сравнению с показателями при неосложненной беременности [16]. Авторы связывали эти изменения с нарушением процесса негативной селекции Т-лимфоцитов в тимусе при избыточном уровне плодовых АГ и формированием наивных Т-лимфоцитов, способных распознавать АГ плода как «чужие» [16]. Все эти факты свидетельствуют о том, что нарушения реакций

адаптивного иммунитета при ЗРП определяются дисбалансом в регуляции иммунного ответа [6, 16, 18, 24, 37].

В литературе имеются работы, посвященные изучению В-звена иммунитета при неосложненной беременности. Предполагается, что при нормально протекающем гестационном процессе происходит подавление антителозависимых реакций в организме матери, что проявляется снижением уровня CD19+ и CD20+ В-клеток [85, 171, 190, 215, 228], CD5+ В-лимфоцитов [24, 84, 146, 206]. При этом выявленные изменения сохранялись до 1 месяца в послеродовом периоде [84, 206].

Исследования, касающиеся В-звена иммунитета при беременности, осложненной ЗРП, немногочисленны [24, 46, 55, 64, 85, 194, 206, 215, 228]. Однако даже немногочисленные литературные данные свидетельствуют, что развитие ЗРП при беременности сопровождается активацией В-клеточного звена иммунитета [24, 46, 64, 194, 203, 206]. При этом изменения В-зависимых реакций при ЗРП происходят, начиная с ранних сроков гестации [24, 85, 215, 228]. Исследования Кудряшовой А. В. и соавторов (2009) показали значительное повышение содержания периферических CD5+ В-лимфоцитов и уровня сывороточных IgG и ^М в ранние сроки беременности, впоследствии осложненной ЗРП [24]. Этими же авторами был выявлен повышенный уровень ^М в сыворотке крови беременных женщин с ЗРП в III триместре [24]. Selvaggi L. с соавторами (1983) на малой выборке беременных женщин с ЗРП, которая реализовалась у новорожденных, установили, что уровень плазматических клеток в периферической крови был многократно повышен по сравнению с контрольными параметрами [46]. В исследованиях ряда авторов было показано повышение уровня сывороточных аутоантител при ЗРП: антитела к фосфатидилсерину, фосфатидилглицеролу, фосфатидилэтоламину, кардиолипину, в2-гликопротеину I и другие [24, 26]. У новорожденных детей с ЗРП отмечалось повышенное содержание CD20+ В-лимфоцитов в пуповинной крови, которое возвращалось к нормальным значениям к 5-м суткам жизни [10]. Все эти данные подтверждают особую роль В-зависимых реакций в патогенезе ЗРП [10, 24, 26, 46,

64, 85, 146, 194, 206, 215, 228]. Однако особенности созревания и апоптоза В-лимфоцитов при беременности, осложненной ЗРП, изучены не были.

В связи с этим целью нашего исследования было установить особенности дифференцировки, функциональной активности и апоптоза периферических В-лимфоцитов при ЗРП и на основании полученных данных разработать критерии прогнозирования эффективности лечения данного осложнения беременности.

В ходе нашего исследования было установлено, что относительное содержание общей популяции периферических В-лимфоцитов, экспрессирующих CD19 и CD20 на своей поверхности, не менялось у беременных женщин с ЗРП. Однако в группе женщин, родивших детей с умеренной или тяжелой ЗРП, уровень периферических В2-лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5- был существенно ниже, чем у женщин контрольной группы. Наши исследования выявили у женщин, родивших детей с ЗРП, лишь тенденцию к повышению уровня периферических В1-лимфоцитов с фенотипом CD20+CD5+. Таким образом, наши данные по содержанию В1-лимфоцитов в периферической крови женщин с ЗРП не совпали с исследованием ряда авторов, свидетельствующих о повышенном их содержании [24, 146, 206]. Можно предположить, что в патогенезе ЗРП роль В1-клеток не является основной, а в большей степени обусловлена проявлением функциональной активности В2-клеток.

Известно, что общепринятые маркеры В-лимфоцитов CD19 и CD20 приобретаются клетками еще на стадии костномозгового развития [47, 74, 219, 289]. Последующие изменения фенотипа определяются степенью зрелости клеток и их локализацией во вторичных лимфоидных органах, крови и тканях [36, 47, 72, 74, 141, 145, 170, 191, 208, 219, 222, 289]. Поэтому на следующих стадиях нашего исследования мы рассмотрели этапы периферического созревания В-клеток и проявления их функциональной активности при неосложненной беременности и при беременности, осложненной ЗРП.

Оценку процесса дифференцировки В-клеток при ЗРП мы начали с анализа содержания незрелых В-лимфоцитов в периферической крови, для которых (по литературным данным) характерен фенотип CD20+CD27-CD10+ [208, 259].

Незрелые В-клетки - та часть лимфоцитов, которые закончили этап костномозгового развития и мигрировали на периферию для дальнейшего созревания [34, 208]. Их отличительной чертой является экспрессия на клеточной мембране маркера CD10 [34, 208]. Нами не было отмечено изменений в содержании уровня незрелых В-лимфоцитов у женщин с ЗРП. Следующий этап развития В-лимфоцитов характеризуется началом экспрессии IgD на поверхности клеток [34, 72, 208]. Экспрессия IgD является показателем зрелости В-лимфоцитов [34, 72, 208]. В-лимфоциты, несущие на своей поверхности молекулу IgD, но негативные по маркеру CD27, получили название наивных В-клеток [116, 208, 259]. Количество наивных В-клеток отражает способность к нормальной гомеостатической пролиферации В-лимфоцитов, которая в дальнейшем обуславливает антиген-зависимое развитие клеток зародышевых центров и маргинальной зоны [67]. Нами было отмечено существенное снижение уровня наивных В-клеток с фенотипом IgD+CD27- в периферической крови женщин, родивших детей с подтвержденной ЗРП, вне зависимости от тяжести ее проявления у новорожденных. Фракция наивных В-клеток является неоднородной и объединяет ряд последовательных стадий созревания от транзиторных лимфоцитов до наивных зрелых В-клеток (Т1^Т2^Т3^наивные зрелые В-лимфоциты) [34, 43, 47, 72, 208]. Уровень наивных зрелых В-клеток, отличительной чертой которых была потеря поверхностного маркера CD10 [208], был существенно снижен в периферической крови беременных, родивших детей с умеренной или тяжелой ЗРП; в случае рождения детей с легкой ЗРП имел выраженную тенденцию к снижению. Следующим этапом периферической дифференцировки В-клеток является этап герминативного созревания лимфоцитов [208]. Именно В-лимфоциты, прошедшие созревание в герминативных центрах, впоследствии формируют пул высокоспецифичных эффекторных В-клеток: долгоживущих плазматических В-клеток и «переключенных» В-лимфоцитов памяти [74, 143, 170, 219]. Герминативное созревание В-клеток сопровождается повторной экспрессией CD10 и началом экспрессии антигенов CD27 на поверхности клетки [208]. Следовательно,

фенотип CD10+CD27+ является уникальным для фракции герминативных В-лимфоцитов [208]. Мы отмечали существенное повышение уровня герминативных В-клеток в периферической крови беременных женщин с ЗРП в случае ее реализации у новорожденных в равной степени как при легкой ЗРП, так и умеренной и тяжелой ЗРП. Отмеченное нами снижение уровня наивных и наивных зрелых В-клеток на фоне накопления герминативных В-клеток в периферической крови беременных женщин, вероятно, свидетельствует о смещении вектора дифференцировки в сторону эффекторных В-лимфоцитов в случае реализации ЗРП при рождении вне зависимости от степени ее тяжести.

Общеизвестный факт, что в динамике иммунного созревания в герминативных центрах в В-лимфоцитах происходят процесс переключения изотипов иммуноглобулинов с ^М на IgG [30, 34, 36, 47, 170, 208, 242]. На следующем этапе нашего исследования мы проанализировали содержание В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности иммуноглобулиновые рецепторы класса М и G в субпопуляциях В2(CD20+CD5-) и В1(CD20+CD5+) клеток. По нашим данным в общей группе женщин, имевших при беременности диагноз ЗРП, а также при реализации его у новорожденных отмечалось существенное повышение уровня ^М- и IgG-позитивных В-лимфоцитов в периферической крови. По-видимому, эти изменения были обусловлены достоверно повышенным уровнем и IgG+ периферических В-клеток в

группе женщин с умеренной и тяжелой ЗРП при рождении. В группе женщин с легкой ЗРП у новорожденных повышение уровня и IgG+ В-клеток носило

лишь характер тенденции. Уровень и IgG+ периферических В2-лимфоцитов был существенно повышенным как в общей группе женщин с ЗРП, так и при реализации ее у новорожденных. При этом только в основной группе женщин, родивших детей с умеренной или тяжелой ЗРП, отмечалось достоверно повышенное содержание и IgG+ периферических В2-лимфоцитов. У

женщин, родивших детей с легкой степенью ЗРП, было достоверно повышенным только содержание IgG+ В2-лимфоцитов, а уровень В2-клеток лишь имел

тенденцию к повышению по сравнению с контрольными значениями. Содержание

и IgG+ В1-клеток не менялось во всех исследуемых группах. Полученные данные еще раз подтверждают предположение о более важной роли периферических В2-клеток в патогенезе ЗРП и меньшей роли В1-клеток.

Процесс дальнейшей дифференцировки В-клеток сопровождается дихотомическим разделением путей созревания на фракцию плазматических В-клеток - активных антителопродуцентов, и пул В-лимфоцитов памяти, обеспечивающих иммунную защиту при повторном поступлении антигена [36, 74, 170, 219]. Известно, что плазматические клетки отличает поверхностная экспрессия молекул CD38 и отсутствие экспрессии CD20 [53, 222]. При оценке содержания В-лимфоцитов с поверхностным фенотипом CD19+CD38+CD20- в периферической крови беременных женщин с ЗРП было установлено, что количество циркулирующих плазматических клеток было повышенным у женщин в случае рождения детей с ЗРП. При рождении детей с легкой ЗРП повышение уровня плазматических клеток в периферической крови женщин носило лишь характер тенденции; а достоверное повышение отмечалось лишь в случае рождения детей с умеренной или тяжелой ЗРП. Вероятно, ранее отмеченное нами существенное снижение уровня В2-лимфоцитов в периферической крови женщин с ЗРП, родивших детей с умеренной или тяжелой степенью тяжести патологии, может быть связано с их усиленной дифференцировкой до плазматических клеток.

Пул В-клеток памяти можно идентифицировать по облигатной экспрессии общепринятого маркера памяти - CD27 и по дифференциальной экспрессии рецептора IgD на клеточной поверхности [67, 74, 80, 143, 207, 218, 219, 265, 294]. Известно, что фенотип CD27+IgD+ характеризует класс, так называемых, «непереключенных» В-лимфоцитов памяти, а фенотип CD27+IgD- характерен для «переключенных» высокоспецифичных В-клеток памяти [67, 74, 94, 131, 135, 143, 219, 223, 263, 265, 277, 294]. «Непереключенные» В-лимфоциты созревают экстрафолликулярно и экспрессируют иммуноглобулиновые рецепторы преимущественно класса М [67, 80, 94, 131, 135, 223, 263, 265, 277, 294]. «Переключенные» В-клетки памяти формируются в герминативных центрах из

клеток-предшественников, которые проходят этапы переключения изотипов иммуноглобулинов и созревание афинности антител [67, 74, 143, 219, 265]. Нами было исследовано количество «переключенных» и «непереключенных» В-лимфоцитов в периферической крови беременных женщин с ЗРП в зависимости реализации и степени тяжести ЗРП у детей при рождении. Установлено, что выявленные изменения были разнонаправленными в зависимости от реализации диагноза ЗРП у новорожденных. Для беременных женщин с реализованной ЗРП у детей при рождении было характерно повышенное содержание общей фракции CD19+CD27+IgD± В-клеток памяти в периферической крови. Это повышение было обусловлено повышенным содержанием «непереключенных» CD19+CD27+IgD+ периферических В-лимфоцитов в равной степени у женщин с легкой степенью ЗРП и ЗРП умеренной или тяжелой степени у новорожденных. Содержание CD19+CD27+IgD- В-лимфоцитов в основной группе беременных, родивших детей с ЗРП, вне зависимости от степени ее тяжести у новорожденных существенно не менялось, хотя и имело тенденцию к повышению.

Таким образом, при рождении детей с умеренной или тяжелой ЗРП в периферической крови беременных женщин нами отмечалось повышенное содержание уровня плазматических клеток, общей фракции В-лимфоцитов памяти и «непереключенных» В-клеток памяти, а содержание «переключенных» В-клеток имело лишь тенденцию к повышению. В основной группе женщин, родивших детей с легкой степенью ЗРП, нами также было установлено достоверное повышение уровня общей фракции В-лимфоцитов памяти и «непереключенных» В-клеток памяти, а повышение уровня «переключенных» В-лимфоцитов памяти и плазматических клеток отмечалось только на уровне тенденции.

На основании полученных данных вполне вероятной представляется следующая модель событий антителозависимого иммунного ответа при беременности, осложненной ЗРП. У беременных женщин в случае реализации ЗРП у новорожденных были затронуты наиболее ранние этапы периферического созревания В-лимфоцитов, которые не зависели от степени тяжести ЗРП у детей

при рождении, поскольку они были выражены практически в равной степени как в случае легкой ЗРП у новорожденных, так и умеренной и тяжелой степени ЗРП. Вероятно, пусковой механизм, обуславливающий реализацию ЗРП у новорожденных, одинаков. Однако параметры дальнейших этапов иммунной дифференцировки В-лимфоцитов различаются у женщин в зависимости от степени тяжести ЗРП у новорожденных: при рождении детей с умеренной и тяжелой ЗРП отмеченные изменения выражены в максимальной степени. Можно предположить, что при рождении детей с легкой ЗРП у беременных женщин на фоне проводимой терапии происходит срабатывание компенсаторных механизмов и, как следствие, запущенный патогенез реализуется не полностью. Отличительной чертой женщин, родивших детей с ЗРП, является накопление в периферической крови В-лимфоцитов, находящихся на этапе герминативного созревания. Вероятно, этим можно объяснить отмеченное нами повышение содержания IgG+ В2-лимфоцитов в материнской крови в случае реализации ЗРП у новорожденных, поскольку именно в герминативных центрах происходит переключение изотипов иммуноглобулинов с ^М на IgG и созревание аффинности антител [30, 34, 36, 47, 170, 208, 242]. Можно предположить, что в случае рождения детей с легкой степенью ЗРП на фоне проводимой терапии у женщин поступление антигенов уменьшалось. Вследствие этого отмечалась преимущественная реализация уже запущенных механизмов вторичного иммунного ответа в результате срабатывания процессов переключения изотипов иммуноглобулинов с формированием IgG позитивных высокоэффекторных В2-клеток. Отражением данного процесса было накопление в периферической крови данной категории женщин IgG+ В2-лимфоцитов. В случае рождения детей с умеренной или тяжелой степенью ЗРП проводимое лечение было, скорее всего, малоэффективно, и антигенная нагрузка на организм матери не снижалась, что приводило к реализации иммунных реакций как по типу первичного, так и вторичного ответа, а отражением этих процессов в периферической крови женщин являлось повышение содержания и IgG+ В2-клеток.

Герминативное В-клеточное созревание обуславливает формирование высокоспецифичных эффекторных клеток: долгоживущих плазматических клеток и «переключенных» В-клеток памяти [141, 170, 191, 219]. Литературные источники свидетельствуют, что при повторном поступлении антигена «переключенные» В-клетки памяти способны напрямую быстро дифференцироваться в эффекторные плазматические клетки, продуцирующие высокоспецифичные антитела преимущественно класса G [104, 131, 140]. Можно предположить, что в группе женщин, родивших детей с ЗРП, содержание периферических CD19+CD27+IgD- В-клеток существенно не повышалось, поскольку фракция «переключенных» В-лимфоцитов была активно вовлечена в процесс дальнейшей дифференцировки до конечных ее этапов - формирования клеток-антителопродуцентов. Иной путь развития проходят «непереключенные» В-клетки памяти, которые в динамике вторичного иммунного ответа мигрируют в герминативные центры, где они проходят процессы досозревания [21, 195], что, вероятно, приводит к формированию de novo «долгоживущих» плазматических клеток и высокоспецифичных «переключенных» В-клеток памяти.

Известно, что при ЗРП отмечается повышенное поступление в периферический кровоток матери антигенов плодового происхождения, таких, как лейкоциты плода, ДНК плода, микровезикулы синцитиотрофобласта и т.д. [25, 29, 42, 86, 125, 211, 261]. При неосложненной беременности антигенный материал плодового происхождения отмечается в периферической крови в незначительных концентрациях, что не приводит к развитию полноценного иммунного ответа, а определяет состояние микрохимеризма, активацию материнской иммунной системы или явление антигенспецифической невосприимчивости [42, 128, 286]. Усиление потока плодовых антигенов может способствовать чрезмерной стимуляции В-звена иммунитета и усилению процессов дифференцировки В-клеток до конечных его этапов - плазматических клеток и В-лимфоцитов памяти. Основной причиной повышения уровня материала, несущего АГ плода, в периферическом кровотоке матери предполагают неполноценность плацентарных барьеров, возникающую при

различной акушерской патологии, в том числе и при ЗРП [26, 29, 86, 125, 221, 249, 258, 261]. Так, при ЗРП по данным патоморфологических исследований в плаценте были выявлены афункциональные зоны, инфаркты, сужение и тромбоз межворсинчатого пространства [26, 221, 249]. Другим триггерным фактором, обуславливающим повышенную антигенную нагрузку на организм матери при ЗРП, может выступать инфекционный процесс [24, 167]. Однако наше собственное исследование показало, что женщины основной и контрольной групп были сопоставимы по частоте выявления маркеров методом иммуноферментного анализа к наиболее распространенным возбудителям вирусных и бактериальных инфекций.

Представляется вполне вероятным, что отмеченные нами изменения в группе женщин, родивших детей с ЗРП, обусловлены патологической активацией В-звена иммунитета в результате непосредственного влияния антигенов плодового происхождения. Возможно, что при рождении детей с умеренной и тяжелой ЗРП накопление плазматических клеток в крови матери обусловлено совокупностью процессов их образования в результате первичного иммунного ответа под действием постоянно поступающих антигенов плодового происхождения и вторичного иммунного ответа из «переключенных» В-лимфоцитов памяти напрямую и в результате процессов досозревания «непереключенных» В-лимфоцитов в герминативных центрах с формированием «долгоживущих» плазматических клеток. В случае рождения детей с легкой степенью ЗРП, вероятно, вышеописанные механизмы в организме матери реализуются в меньшей степени, а также происходят процессы компенсации, направленные на восстановление нарушенного иммунного гомеостаза. Кроме того, отсутствие достоверного повышения содержания плазматических клеток в периферической крови у этой категории женщин могло быть связано с их возможной интернализацией из кровотока и миграцией в органы и ткани. Это предположение согласуется с данными ряда авторов о том, что местом существования плазматических клеток, в целом, является красный костный мозг и периферические лимфоидные органы [34, 36, 74, 145, 219, 222]. Кроме того, наше

исследование показало, что при беременности, осложненной ЗРП, существенные изменения параметров дифференцировки касались преимущественно В2-субпопуляции периферических лимфоцитов. Полученные данные подтверждают наше предположение о более важной роли периферических В2-клеток в патогенезе ЗРП и минорной роли В1-клеток.

Совершенно иной характер дифференцировки периферических В-лимфоцитов наблюдался в организме матери при беременности, осложненной ЗРП, которая не реализовалась у детей при рождении. Наше исследование показало, что изменения параметров дифференцировки периферических В-лимфоцитов не касались ранних ее этапов, поскольку содержание наивных, наивных зрелых и герминативных клеток достоверно не менялось в данной категории женщин. Можно предположить, что у этих пациенток отсутствие вовлечения В-клеток ранних стадий периферического созревания может быть связано с более поздним возникновением патологического процесса и/или меньшей суммарной антигенной нагрузкой на организм матери за счет менее выраженной плацентарной недостаточности. Меньшие последствия могут также быть обусловлены включением определенных механизмов компенсации. Изучение дальнейших этапов периферического созревания В-лимфоцитов у женщин, имевших при беременности ЗРП, но родивших детей без нее, показало лишь тенденцию к повышению общего уровня В-клеток и ^М-позитивных В2-лимфоцитов, а уровень IgG+ В-лимфоцитов в субпопуляциях В1 и В2-клеток не менялся. Достоверные изменения были отмечены в содержании В-лимфоцитов, находящихся на конечных этапах дифференцировки. В периферической крови данной группы женщин было выявлено достоверно сниженное содержание общей фракции CD19+CD27+IgD± В-лимфоцитов памяти за счет сниженного содержания «переключенных» CD19+CD27+IgD- В-клеток, а уровень «непереключенных» CD19+CD27+IgD+ В-лимфоцитов памяти хотя и имел тенденцию к снижению, достоверно не менялся. При этом отмеченные изменения сопровождались накоплением плазматических клеток в периферической крови беременных женщин. Поскольку у этих пациенток не были затронуты

герминативные этапы созревания В-лимфоцитов, можно предположить, что накопление плазматических клеток было обусловлено их формированием из «переключенных» В-лимфоцитов памяти напрямую. По-видимому, этим объясняется сниженное содержание «переключенных» CD27+IgD- В-лимфоцитов в периферической крови, повторное образование которых не происходит по механизму аттрикции. Эти процессы, вероятно, носят компенсаторный характер. Представляется вполне возможным, что полученные нами изменения в этой группе женщин связаны с восстановлением барьерной и трофической функции плаценты на фоне лечения, снижением антигенной нагрузки на материнскую иммунную систему, что обуславливает возможность рождения детей без ЗРП.

На основании проведенных исследований по содержанию В-клеток памяти с фенотипом CD19+CD27+ в периферической крови беременных женщин в сроке 32-36 недель беременности был разработан способ прогнозирования эффективности лечения задержки роста плода. Было установлено, что при содержании В-клеток памяти равном или менее 19,4% в периферической крови прогнозируют эффективность стандартного лечения данной патологии с точностью 93%, чувствительностью 90%, специфичностью 94%. Была оформлена заявка на изобретение «Способ прогнозирования эффективности лечения задержки роста плода» (приоритетная справка № 2016106711 от 26.02.2016).

Данный параметр может быть использован в практическом здравоохранении для определения тактики ведения беременных женщин с задержкой роста плода, исследование которого позволяет своевременно провести дополнительные лечебные мероприятия в группе женщин при данной патологии беременности.

Таким образом, при ЗРП дифференцировка эффекторных клеток в популяции периферических В-лимфоцитов коренным образом отличается от их дифференцировки у женщин с неосложненным течением беременности.

Полученные нами данные о повышении уровня плазматических клеток в периферической крови женщин с ЗРП позволили нам предположить активацию антитело-продуцирующей функции данных клеток. Мы исследовали

сывороточный уровень основных классов иммуноглобулинов (^А, ^М, IgG) и циркулирующих иммунных комплексов при беременности, осложненной ЗРП. Наше исследование показало, что сывороточное содержание иммуноглобулинов основных классов также существенно различалось в сыворотке крови женщин с ЗРП в зависимости от реализации данной патологии у новорожденных. Содержание всех трех исследуемых классов ^А, ^М, IgG в сыворотке крови в группе женщин с ЗРП, как и при реализации ее у детей при рождении, не отличалось от такового в группе контроля. Можно предположить, что отсутствие повышения уровня сывороточных иммуноглобулинов у женщин с ЗРП может быть связано с их частичной трансплацентарной миграцией и/или переходом их в связанное состояние с формированием иммунных комплексов. Общеизвестный факт, что плацента способствует формированию пассивного иммунитета плода путем транспорта иммуноглобулинов G от матери к плоду при беременности [285]. Механизм данного процесса до конца не изучен, однако известно, что трансплацентарный перенос иммуноглобулинов осуществляется при участии особого специфического «неонатального» Fc-рецептора - FcRn [285]. В литературе накапливается все больше данных, свидетельствующих, что материнские антитела при беременности могут оказывать не только положительное влияние на плод, но и приносить вред [52, 65, 184, 187, 244, 255, 278]. Наиболее известным примером является развитие гемолитической болезни новорожденных при резус-конфликте [65]. Ттсаш А. и соавторы (2006) установили, что у женщин с системной красной волчанкой признаки данного заболевания отмечались у детей при рождении и были связаны с влиянием материнских анти-Ro/SS-A- и анти-La/SS-антител [52]. Предполагается, что связывание антител материнского происхождения с антигенами сердечной мышцы плода приводит к развитию воспалительной реакции, фиброза и, как следствие, врожденной сердечной блокады у ребенка [52]. Имеются данные о проявлениях антифосфолипидного синдрома у детей, рожденных от матерей с диагностированным первичным антифосфолипидным синдромом [255]. Развитие врожденного гипотиреоза у детей от женщин с тиреоидитом Хашимото было

обусловлено патологическим влиянием материнских антител [244]. И, наконец, имеются ряд работ, связывающих развитие аутизма у детей с трансплацентарной передачей материнских антител к антигенным структурам мозга плода [184, 187]. Можно предположить, что материнские антитела при ЗРП могут также оказывать непосредственное негативное влияние на плод. Кроме того, мы провели оценку содержания циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке женщин с ЗРП. Наши исследования показали, что в случае рождения детей с ЗРП уровень ЦИК был существенно повышенным в крови беременных женщин. По-видимому, отсутствие изменений в содержании сывороточных иммуноглобулинов объясняется их активной реализацией за счет связывания с антигеном и образованием ЦИК в данной группе женщин. В литературных источниках мы встретили несколько работ, которые также свидетельствуют о повышенном содержании иммунных комплексов в периферической крови женщин с ЗРП [19, 35, 203]. Известно, что в патогенезе ряда заболеваний лежит иммунокомплексный тип воспаления [30, 36]. Существует мнение, что с патологическим влиянием иммунных комплексов связано возникновение некоторых осложнений беременности: преэклапсия [22, 32, 90, 91, 110, 210, 256, 280], патологическое течение беременности у женщин с бронхиальной астмой [220]. Считается, что повышенное содержание иммунных комплексов может приводить к их отложению на сосудистых стенках, результатом этого процесса является сужение просвета капилляров, микротромбообразование, высвобождение вазоактивных веществ и, как следствие, иммунное воспаление и ишемизация тканей [30, 32, 36]. При этом отмечается, что первоначально вышеописанные сосудистые нарушения при беременности развиваются на уровне плаценты, и только потом происходит генерализация процесса [7]. Встречаются единичные работы, свидетельствующие о наличии иммунных комплексов в тканях плаценты на уровне синцитиотрофобласта [280, 285]. Предполагается, что в состав таких иммунных комплексов входят антитела к антигенам эмбриональных и плацентарных структур отцовского происхождения, таких, как Rh, ABO и MHC [280, 285]. Кроме того, в литературе имеются данные о возможном трансплацентарном

переносе самих циркулирующих комплексов от матери к плоду [90, 109, 166, 240]. Представляется вполне вероятным, что все перечисленные механизмы могут быть реализованы в патогенезе ЗРП при беременности в той или иной степени.

Иная картина наблюдалась у женщин, имевших при беременности ЗРП, но родивших детей без нее. На фоне повышенного содержания плазматических клеток в периферической крови женщин сывороточный уровень иммуноглобулинов исследуемых классов: IgA, IgM, IgG был существенно сниженным, а уровень ЦИК в этой группе женщин, хотя и имел тенденцию к повышению, существенно не менялся. Вероятно, отмеченные нами изменения были обусловлены более высокой эффективностью иммунных реакций у этой категории женщин с быстрой элиминацией иммунных комплексов. По-видимому, отмеченные изменения носят компенсаторный характер и обуславливают возможность рождения детей без ЗРП.

Важнейшим фактором выживаемости и дифференцировки периферических В-лимфоцитов является BAFF [34, 59, 60, 62, 66, 92, 97, 112, 235, 275]. Известно, что основная его биологическая функция состоит в обеспечении выживаемости периферических В-лимфоцитов, находящихся на наиболее ранних этапах созревания [34, 237]. BAFF-BAFFR взаимодействие является ключевым в процессах перехода В-клеток со стадии Т1 до Т2 периферического созревания [34, 237]. При дефекте гена BAFF у мышей содержание T2 клеток, В-лимфоцитов маргинальной зоны, фолликулярных В-клеток существенно снижено [34, 59, 62, 92, 237]. Поскольку считается, что рецепторы к BAFF экспрессируются всеми типами периферических В-лимфоцитов, широко постулируется важная роль BAFF в выживании и созревании В-клеток [47, 61, 92, 170, 174, 219, 228, 235, 242, 272].

Мы оценили особенности содержания BAFFR+ периферических В-лимфоцитов, интенсивность экспрессии рецептора на клетке по уровню средней интенсивности флюоресценции (MFI) и сывороточное содержание BAFF у женщин с ЗРП. Нами было установлено, что содержание BAFF было существенно сниженным в основной группе беременных женщин, родивших детей с умеренной

или тяжелой ЗРП. Женщины с легкой степенью ЗРП у новорожденных имели тенденцию к снижению сывороточного содержания BAFF. При этом уровень CD19+BAFFR+ В-клеток в периферической крови женщин с ЗРП был существенно повышен уже при легкой степени патологии у новорожденных и достигал максимальных значений у женщин с умеренной или тяжелой ЗРП у детей при рождении. Данные по уровню средней интенсивности флюоресценции (MFI) BAFF рецептора согласуются с этими результатами и свидетельствуют о повышении интенсивности экспрессии BAFFR периферическими В-лимфоцитами у беременных женщин только в случае рождения детей с умеренной или тяжелой ЗРП. Группа женщин, имевших при беременности ЗРП, но родивших детей с нормальными массо-ростовыми показателями, характеризовалась лишь повышенным содержанием BAFFR+ В-клеток в периферической крови, что не сопровождалось существенным повышением экспрессии рецепторов на клетках; сывороточный уровень BAFF в этой категории женщин также не отличался от такового при физиологической беременности. Можно сделать вывод, что для ЗРП характерна повышенная готовность В-лимфоцитов матери к дифференцировке по BAFF-BAFFR зависимому пути, что подтверждается повышенным содержанием периферических BAFFR+ В-лимфоцитов у всех беременных женщин, вне зависимости от наличия и тяжести ЗРП у новорожденных. Однако только в случае рождения детей с умеренной или тяжелой ЗРП женщины при беременности имели не только повышенный уровень В-лимфоцитов, экспрессирующих BAFFR, но и более высокую плотность экспрессии самого рецептора на клетке. Вероятно, установленное нами выраженное снижение содержания BAFF в сыворотке крови у женщин с умеренной и тяжелой ЗРП у новорожденных можно объяснить быстрой его интернализацией из кровотока за счет связывания со специфическим рецептором на В-клетках. Возможно, усиление BAFF-BAFFR зависимого пути созревания В-клеток может способствовать развитию хронической активации антителозависимого иммунного ответа при ЗРП. Наше предположение хорошо согласуется с уже ранее описанным фактом повышенного содержания плазматических клеток в периферической крови основной группы женщин в

случае рождения детей с умеренной или тяжелой ЗРП. По-видимому, отмеченное нами повышенное содержание плазматических клеток в периферической крови женщин с ЗРП, которая не реализовалась при ЗРП, может быть обусловлена влиянием других факторов.

По результатам проведенного анализа был разработан дополнительный прогностический критерий степени тяжести задержки внутриутробного роста у детей, родившихся от женщин с ЗРП, который основан на оценке сывороточного содержания BAFF у женщин с ЗРП в сроке 32-36 недель беременности. При его значении равном или менее 0,48 нг/мл можно прогнозировать рождение детей с умеренной или тяжелой степенью ЗРП. Метод отличается высокой точностью -74%, чувствительностью - 90%, специфичностью - 54%. Предложенный критерий позволяет своевременно подобрать акушерскую тактику ведения пациенток с ЗРП.

Одной из важнейших функциональных характеристик клеточного развития является цитокиновая регуляция [11, 27, 30, 34, 36, 83, 124, 178]. Общеизвестный факт, что физиологическое течение беременности во многом обусловлено балансом активирующих и тормозных влияний со стороны цитокинов [9, 24, 40, 82, 138, 147, 157, 161, 172, 177, 179, 212, 225, 230, 234, 245, 283, 287]. Важнейшими цитокинами, которые поляризуют иммунный ответ в сторону Th2-типа, одновременно способствуют созреванию и полноценному функционированию В-лимфоцитов, являются IL-4 и IL-6 [11, 27, 30, 81, 225, 234, 264]. Согласно существующим представлениям, IL-10 может оказывать иммунносупрессорное влияние, осуществляя негативную регуляцию иммунного ответа [77, 89, 173, 199, 214, 238, 269, 295]. Но он также может способствовать дифференцировке В-клеток до плазматических клеток [69, 74, 81, 199, 214].

В связи с этим мы провели оценку содержания в периферической крови В-лимфоцитов, спонтанно внутриклеточно продуцирующих цитокины IL-4 и IL-6, уровень IL-10+ регуляторных В-лимфоцитов и сывороточное содержание IL-10 у женщин с ЗРП. Уровень IL-4+ и IL-6+ периферических В-клеток был достоверно выше в крови беременных женщин с ЗРП в случае рождения детей с умеренной

или тяжелой степенью данной патологии, чем у беременных с неосложненным гестационным течением. При рождении детей с легкой степенью ЗРП уровень как ГЬ-4+, так и ГЬ-6+ В-лимфоцитов, хотя и имел выраженную тенденцию к повышению, достоверно не менялся. Анализ сывороточного содержания ГЬ-10 показал его достоверное повышение у беременных женщин при рождении детей с умеренной или тяжелой степенью ЗРП. В случае легкой ЗРП у детей при рождении отмечалась лишь незначительная тенденция к повышению уровня 1Ь-10 в сыворотке крови беременных женщин.

Содержание Breg в периферической крови женщин с реализованной ЗРП у детей при рождении было одинаково достоверно сниженным вне зависимости от степени ее тяжести у новорожденных. Группа женщин, родивших детей без ЗРП, характеризовалась существенным повышением сывороточного уровня ГЬ-10 на фоне сниженного содержания периферических Breg по сравнению с контрольной группой. Таким образом, отличительной чертой всех женщин с ЗРП, вне зависимости от тяжести и наличия ЗРП у новорожденных, был существенно сниженный уровень Breg.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что у беременных женщин при реализации ЗРП у детей при рождении, особенно при крайней степени ее выраженности, усиление процессов дифференцировки и функциональной активности В-лимфоцитов могло определяться аутокринным регулирующим действием периферических В-лимфоцитов, продуцирующих ГЬ-4 и 1Ъ-6.

Известно, что основные процессы дифференцировки и созревания В-лимфоцитов происходят в селезенке и в лимфоузлах [36, 43, 47, 72, 74, 208, 219, 281, 300]. Литературные данные свидетельствуют, что Breg оказывают супрессорный эффект как путем продукции цитокинов ГЬ-10 и TGF-P, так и при непосредственном контакте клетка-клетка, инициируя апоптоз [113, 127, 188, 189, 195, 237, 242, 260, 301]. По нашим данным при ЗРП отмечается несоответствие между сниженным уровнем периферических ГЬ-10+ В-лимфоцитов и повышенным содержанием ГЬ-10 в сыворотке крови. По-видимому, сывороточное

содержание IL-10 не отражает функциональной активности Breg. Вероятно, повышенное сывороточное содержание IL-10 обусловлено его усиленной продукцией другими типами клеток: регуляторными Т-лимфоцитами и/или моноцитами, так как в литературе имеются данные о повышении уровня Treg и IL-10+ моноцитов в периферической крови женщин с ЗРП в 3 триместре гестации [24, 213]. Кроме того, общеизвестно, что IL-10 может выступать не только в качестве иммуносупрессорного фактора, но и играть важную роль в процессах дифференцировки В-клеток, в частности, способствуя созреванию В-лимфоцитов в плазматические клетки [69, 74, 81, 199, 214]. Вероятно, при беременности, осложненной ЗРП, повышенное содержание IL-10 определяет усиление дифференцировки В-лимфоцитов до конечных стадий - плазматических клеток. Это предположение хорошо согласуется с ранее описанными нами данными о достоверном повышении уровня плазматических клеток в периферической крови только у женщин, имеющих достоверно повышенное сывороточное содержание IL-10. Эти изменения были характерны для основной группы женщин, родивших детей с умеренными и тяжелыми проявлениями ЗРП и при рождении детей без ЗРП.

Можно предположить, что при ЗРП снижение уровня Breg в периферической крови происходит за счет апоптоза, ограничивая их супрессорное воздействие на процессы дифференцировки эффекторных В-лимфоцитов. Процессы элиминации клеток по механизму апоптоза имеют важное значение в функционировании иммунной системы [213, 293]. Данные литературы свидетельствуют, что нарушение апоптоза играет важную роль в патогенезе задержки роста плода [9]. Одним из механизмов апоптоза клеток многоклеточного организма является Fas-FasL-зависимый путь [169, 180, 257]. Поверхностная экспрессия молекул Fas или CD95 свидетельствует о готовности клеток к вступлению в апоптоз [169, 180, 257]. При взаимодействии рецептора с его специфическим лигандом - FasL (CD95L) происходит запуск каскада реакций, ведущих к гибели клетки [48, 78, 169, 258]. Также известно, что CD95L может

выступать в качестве негативного регулятора апоптоза, препятствуя естественному процессу Fas-индуцированной элиминации клеток [9].

Мы оценили особенности Fas-FasL-зависимого апоптоза периферических В-лимфоцитов беременных женщин с ЗРП. Содержание В-лимфоцитов, вступивших в апоптоз, определялось по результатам аннексинового теста. Нами было выявлено, что уровень CD95+ и CD5-CD95+ В-клеток был существенно снижен в периферической крови беременных женщин, родивших детей с ЗРП. Уровень CD95L+ и CD5-CD95L+ В-лимфоцитов был достоверно повышенным по сравнению с контрольными значениями у женщин с реализованной у детей ЗРП за счет существенного повышения исследуемых параметров группы с умеренной и тяжелой степенью патологии. В группе женщин, родивших детей с ЗРП, достоверно снижался уровень как В2, так и В1-лимфоцитов, вступивших в апоптоз. Содержание Fas- и FasL-позитивных лимфоцитов в популяции периферических В1-клеток не имело существенных изменений во всех исследуемых группах женщин с ЗРП.

Полученные данные свидетельствуют, что при беременности у женщин, родивших детей с ЗРП, отмечалось выраженное нарушение апоптоза периферических В2 и В1-лимфоцитов, что могло вести к накоплению активированных клонов В-клеток. Основные изменения параметров апоптоза по Fas-FasL-зависимому пути были характерны для CD20+CD5- субпопуляции периферических В-клеток. При этом выраженность изменений положительно коррелировала со степенью тяжести патологии новорожденного и была максимальной в группе пациенток, родивших детей с умеренной или тяжелой степенью ЗРП. В случае рождения детей с легкой степенью ЗРП было характерно снижение готовности В-клеток к апоптозу, что определялось по снижению уровня CD95+ В-лимфоцитов за счет выраженного снижения уровня CD95+ В2-клеток. При рождении детей с умеренной или тяжелой ЗРП угнетение апоптоза у беременных матерей было обусловлено как снижением готовности к апоптозу, так и усилением антиапопототических свойств В-лимфоцитов. Это выражалось не только снижением уровня CD95+ и CD95+ В2-лимфоцитов, но и существенным

повышением содержания CD95L+ В-клеток за счет повышенного уровня CD95L+ В2-лимфоцитов. Можно предположить, что отмеченное нами ранее накопление «непереключенных» В-лимфоцитов памяти в периферической крови женщин с ЗРП могло быть связано с нарушением процессов их апоптоза. Нарушение апоптоза В1-лимфоцитов при ЗРП, по-видимому, не было связано с реализацией Fas-FasL зависимого пути, а определялось другими механизмами. У беременных женщин с ЗРП, родивших детей без нее, процессы иммунного апоптоза периферических В-клеток существенно не менялись.

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что при беременности, осложненной ЗРП, отмечается существенное нарушение параметров дифференцировки, функциональной активности и апоптоза периферических В-лимфоцитов. Причем выраженность изменений в организме матери связана с реализацией патологии и ее тяжестью у новорожденного. У всех женщин с ЗРП общее содержание В-клеток не менялось в периферической крови, но отмечалось изменение соотношения В-клеточных фракций. Характер дифференцировки был смещен в сторону высокоэффекторных В-лимфоцитов: плазматических клеток и «непереключенных» В-клеток памяти. При этом выявленные нарушения были обусловлены преимущественно изменениями в субпопуляции В2-лимфоцитов. По-видимому, вектор дифференцировки периферических В-клеток определялся активирующим влиянием ГЬ-10, усилением BAFF-BAFFR-зависимого пути созревания, повышением аутокринного регулирующего влияния ГЬ-4 и ГЬ-6 на В-лимфоциты, снижением супрессорной роли Breg на фоне нарушенных процессов иммунного апоптоза. Отражением усиления функциональной активности В-лимфоцитов у женщин с ЗРП явилось накопление в сыворотке крови циркулирующих иммунных комплексов.

Установлено, что при рождении детей с нормальными массо-ростовыми показателями у матерей патогенез ЗРП реализуется не полностью и связан только с накоплением плазматических клеток в периферической крови на фоне стимулирующего действия ГЬ-10 и недостаточной супрессии со стороны Breg.

Таким образом, ЗРП при беременности характеризуется усилением дифференцировки и функциональной активности периферических В-лимфоцитов, нарушением их апоптоза. Для беременных женщин, родивших детей с наиболее тяжелыми проявлениями ЗРП, характерна максимальная выраженность нарушений со стороны В-звена иммунитета. Вероятно, наибольшая роль в патогенезе ЗРП принадлежит В2-субпопуляции клеток, поскольку отмеченные нами изменения касались преимущественно данной фракции клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные данные, можно заключить, что задержка роста плода при беременности сопровождается существенными изменениями характера дифференцировки материнских периферических В-лимфоцитов, их функциональной активности и апоптоза, выраженность которых ассоциируется с наличием и тяжестью данной патологии у новорожденных. Проведенные исследования свидетельствуют, что наиболее значительные изменения в организме матери отмечаются при рождении детей с ЗРП и выражены в максимальной степени при умеренной или тяжелой степени патологии у новорожденных. Нарушение маточно-плацентарного барьера при плацентарной недостаточности приводит к массивному поступлению антигенов плодового происхождения в организм матери, что, по-видимому, является триггерным фактором для патогенеза ЗРП. Установлено, что у беременных женщин при реализации ЗРП при рождении шифт созревания периферических В-лимфоцитов направлен в сторону накопления высокоэффекторных В-лимфоцитов: плазматических и клеток памяти. Отмеченные процессы сопровождаются усилением герминативного В-клеточного созревания, которое обусловлено дисбалансом активирующих и тормозных влияний. Полученные нами данные свидетельствуют об усилении процессов дифференцировки В-лимфоцитов за счет повышенного аутокринного влияния ГЬ-4 и ГЬ-6 со стороны самих В-лимфоцитов и стимулирующего действия ГЬ-10 на фоне сниженного супрессорного влияния со стороны Breg. Накопление плазматических клеток в периферической крови, вероятно, связано как с их дифференцировкой напрямую на фоне активации BAFF-BAFFR-зависимого пути, так и с включением В-клеток памяти. Накопление В-лимфоцитов памяти в периферической крови обусловлено нарушением процессов их естественной элиминации. Совокупность этих механизмов приводит к активации антителозависимых механизмов иммунитета на уровне плаценты, дополнительному повреждению ее тканей, усугублению плацентарной

недостаточности и развитию ЗРП. У беременных женщин с ЗРП, не реализовавшейся у детей при рождении, характер дифференцировки периферических В-лимфоцитов имеет существенные отличия. В периферической крови этих женщин отмечается накопление плазматических клеток, которое обусловлено стимулирующим влиянием ГЬ-10 и недостаточной негативной регуляцией со стороны Breg. Антигенная нагрузка на организм женщины не столь значительна, что обуславливает возможность реализации компенсаторных возможностей плаценты на фоне лечения и рождения ребенка без ЗРП (рисунок 1).

Рис. 1. Схема предполагаемого участия В-лимфоцитов в патогенезе ЗРП при беременности

126

ВЫВОДЫ

1. Для женщин с задержкой роста плода в 32-36 недель гестации в отличие от женщин с неосложненным течением беременности характерно повышенное содержание периферических IgM+ и IgG+ В-лимфоцитов, IgM+ и IgG+ В2-клеток, герминативных, плазматических клеток, В-лимфоцитов памяти и «непереключенных» В-клеток памяти на фоне сниженного содержания наивных В-лимфоцитов. Наиболее выраженные отклонения от наблюдаемых в норме в содержании В-лимфоцитов, находящихся на разных этапах дифференцировки, выявляются при реализации патологии у новорожденных и тяжелой и умеренной степени задержки роста при рождении.

2. Функциональная активность В-лимфоцитов у беременных женщин с задержкой роста плода в 32-36 недель гестации в отличие от женщин с неосложненным течением беременности характеризуется сниженным уровнем Breg и повышенным уровнем В-лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих IL-4 и IL-6; при реализации патологии у детей при рождении изменения соответствуют таковым в общей группе, а при рождении детей без нее наблюдается только снижение Breg; у матерей, родивших детей с легкой степенью патологии, отмечается только снижение Breg, с умеренной и тяжелой степенью - изменения соответствуют таковым в общей группе.

3. У женщин с задержкой роста плода в 32-36 недель беременности в отличие от женщин контрольной группы отмечается повышенное содержание ЦИК в сыворотке крови; при реализации патологии у новорожденных изменения соответствуют таковым в общей группе, при рождении детей с нормальными массо-ростовыми показателями отмечается снижение сывороточного уровня IgA, IgM, IgG.

4. У женщин с задержкой роста плода в 32-36 недель гестации в отличие от женщин с неосложненным течением беременности, повышается содержание IL-10 в сыворотке крови независимо от реализации патологии у новорожденных, но только при рождении детей с умеренной или тяжелой степенью патологии.

5. У беременных женщин с задержкой роста плода в сроке 32-36 недель гестации в отличие от женщин контрольной группы независимо от исхода беременности в периферической крови отмечается повышенное содержание BAFFR+ В-клеток; усиление плотности экспрессии BAFFR на В-лимфоцитах, снижение сывороточного уровня BAFF отмечается только в случае рождения детей с умеренной или тяжелой степенью патологии.

6. Для беременных женщин с задержкой роста плода в 32-36 недель гестации в отличие от женщин контрольной группы характерно в периферической крови снижение содержания Annexin V+ В2-лимфоцитов, CD95+ В-лимфоцитов и В2-клеток на фоне повышенного уровня CD95L+ В-лимфоцитов и В2-клеток; при реализации патологии у новорожденных -сниженное содержание Annexin V+ В1-лимфоцитов. У женщин при рождении детей с легкой степенью патологии отмечается сниженное содержание CD95+ В-лимфоцитов и В2-клеток, с умеренной или тяжелой -дополнительно повышенный уровень CD95L+ В-лимфоцитов и В2-клеток.

7. Содержание CD27+ клеток в популяции CD19+ В-лимфоцитов в периферической крови равное или менее 19,4% позволяет с точностью 93% прогнозировать эффективность лечения задержки роста плода у беременных женщин в сроке 32-36 недель.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется в 32-36 недель беременности, осложненной задержкой роста плода определять в периферической крови относительное содержание CD27+ клеток в популяции CD19+ В-лимфоцитов для прогнозирования эффективности стандартного лечения данной патологии, и при значении показателя равном или менее 19,4% прогнозировать эффективность стандартного лечения с точностью 93%.

В качестве дополнительного прогностического критерия степени тяжести патологии у новорожденных, родившихся от беременных женщин с задержкой роста плода, рекомендуется определять в 32-36 недель гестации сывороточное содержание BAFF и при его значении равном или менее 0,48 нг/мл с точностью 74% прогнозировать рождение детей с умеренной и тяжелой степенью задержки роста.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аг - антиген

АПК - антигенпредставляющие клетки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЗРП - задержка роста плода

ККМ - красный костный мозг

мАТ - моноклональное антитело

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

CD - кластер дифференцировки

BAFF - фактор активации В-лимфоцитов

BAFFR -рецептор фактора активации В-лимфоцитов

BCR - В-клеточный рецептор

Breg - регуляторные В-лимфоциты

CXCL - хемокин

Fab - фрагмент, связывающий антиген в составе антитела

FDC-фолликулярные дендритные клетки

FoB - фолликулярные В-лимфоциты

IFN - интерферон

Ig - иммуноглобулин

IL - интерлейкин

MFI - средняя интенсивность флюоресценции MHC - главный комплекс гистосовместимости MZB - В-клетки маргинальной зоны NF-Kß - ядерный транскрипционный фактор Kß NK-клетки - естественные киллерные клетки Th - Т-хелпер

TLR - Toll-подобные рецепторы TNF -фактор некроза опухолей

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акушерство: учебник / Г. М. Савельева [и др.]. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 656 с.

2. Бикметова, Е. С. Задержка роста плода. Частота, факторы риска / Е. С. Бикметова, А. Г. Тришкин, Н. В. Артымук // Мать и дитя в Кузбассе. -2012. - № 1. - С. 27-31.

3. Борисова, Л. Г. Синдром задержки внутриутробного роста плода как фактор риска формирования кардиоваскулярной патологии у детей (обзор литературы) / Л. Г. Борисова, С. Ю. Захарова, О. А. Краева // Уральский медицинский журнал. - 2014. - № 2. - С. 57-60.

4. Будюхина, О. А. Синдром задержки развития плода - современный взгляд на проблему / О. А. Будюхина // Проблемы здоровья и экологии. -2009. - № 1(19). - С. 83-89.

5. Бунин, А. Т. Задержка внутриутробного развития плода: дис. ... д-ра мед. наук: 14.00.01 / Бунин Анатолий Тимофеевич. - М., 1993. - 305 с.

6. Действие клеток трофобласта плаценты человека на миграционные свойства дендритных клеток in vitro / В. Ю. Талаев [и др.] // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2012. - № 2-3. С. 289-294.

7. Диагностическая ценность некоторых показателей иммунитета в клинике гестозов / А. В. Тягунова, З. В. Васильева, О. П. Сластен, И. Н. Баранова // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - № 4. - С. 38-40.

8. Зарудская, О. М. Роль наследственной тромбофилии в развитии хронической фето-плацентарной недостаточности и синдрома внутриутробной задержки роста плода / О. М. Зарудская, М. И. Чурносов // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2012. - Т. 18, № 10. - С. 132-136.

9. Иммунологическая загадка беременности / Н. Ю. Сотникова [и др.]; под ред. Н. Ю. Сотниковой. - Иваново: Изд-во МИК, 2005. - 276 с.

10.Кадырова, Л. В. Особенности иммунного статуса детей, рожденных с синдромом задержки развития плода, в динамике первого года жизни / Л. В. Кадырова // Репродуктивное здоровье нового поколения: сборник научных трудов / под ред. А. И. Малышкиной. - Иваново: ОАО «Изд-во «Иваново», 2010. - С. 354-357.

11.Кетлинский, С. А. Цитокины / С. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев. -СПб.: ООО «Издательство Фолиант», 2008. - 552 с.

12.Кириллова, Е. А. Взаимосвязь темпов физического развития и особенностей вскармливания недоношенных детей с задержкой внутриутробного роста / Е. А. Кириллова, И. В. Орловская, И. И. Рюмина // Мать и дитя: материалы VIII Регионального научного форума. - Сочи, 2015. - С. 144-146.

13.Клычева, О. И. Взаимосвязь соматических и гинекологических заболеваний матери с развитием синдрома задержки развития плода / О. И. Клычева, Г. А. Лазарева, А. Б. Хурасева // Мать и дитя: материалы XV Всероссийского научного форума. - М., 2014. - С. 83-84.

14.Ковалев, Е. В. Факторы риска задержки роста плода, связанные с состоянием здоровья и образом жизни беременной женщины / Е. В. Ковалев, Ю. В. Занько, Т. Ю. Трубкина // Мать и дитя в Кузбассе. - 2014. - № 4. - С. 24-28.

15.Кочерова, В.В. Соматотропный гормон и инсулиноподобные факторы роста в патогенезе задержки роста плода / В. В. Кочерова, В. А. Щербак // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2016. - № 1(61). - С. 5-8.

16.Кудряшова, А. В. Дифференцировка клеток памяти в популяции периферических лимфоцитов при синдроме задержки развития плода / А. В. Кудряшова // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6, № 2(1). - С. 92-94.

17.Макаров, И. О. Задержка роста плода. Врачебная тактика: учебное пособие / И. О. Макаров, Е. В. Юдина, Е. И. Боровкова. - 2-е изд. - М.: «МЕДпресс-информ», 2014. - 56 с.

18.Мишарина, Л. В. Особенности дифференцировки периферических Т-лимфоцитов при развитии ЗРП // Л. В. Мишарина, Н. И. Иваненкова // Российский иммунологический журнал. - 2016. - Т. 10(19), № 2(1). - С. 225-227.

19.Назаренко, Н. А. Об иммунологических аспектах синдрома задержки развития плода / Н. А. Назаренко, Н. В. Антипенская // Акушерство и гинекология. - 1992. - № 2. - С. 28-32.

20.Назаров, П. Г. Реактанты острой фазы воспаления / П. Г. Назаров. -СПб.: Наука, 2001. - 423 с.

21.Основные показатели здоровья матери и ребенка, деятельность службы охраны детства и родовспоможения в Российской Федерации / Г. А. Александрова [и др.]. - М., 2014. - 162 с.

22.Патогенез гестоза как проявление иммунокомплексной патологии эндотелия (острый иммунный эндотелиоз) / И. С. Сидорова [и др.] // Акушерство и гинекология. - 2008. - № 6. - С. 13-17.

23.Роль антифосфолипидных антител в развитии синдрома задержки развития плода / А. В. Чурилов [и др.] // Материалы X Юбилейного Международного конгресса по репродуктивной медицине. - М., 2016. -С. 193-195.

24.Роль иммунной системы в формировании задержки внутриутробного развития плода / А. В. Кудряшова [и др.]. - Иваново: ОАО «Издательство «Иваново», 2009. - 240 с.

25.Сельков, С. А. Иммунологические механизмы контроля развития плаценты / С. А. Сельков, Д. И. Соколов // Журнал акушерства и женских болезней. - 2010. - Т. ИХ, Вып. 1. - С. 6-10.

26.Синдром задержки роста плода: патогенез, диагностика, лечение, акушерская тактика / А. Н. Стрижаков, И. В. Игнатко, Е. В. Тимохина, Л. Д. Белоцерковцева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 120 с.

27.Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа / Л. В. Ковальчук [и др.]. - М., 2001. - 158 с.

28.Стрижаков, А. Н. Современные подходы к прогнозированию синдрома задержки роста плода / А. Н. Стрижаков, И. В. Игнатко, М. А. Карданова // Мать и дитя: материалы XIV Всероссийского научного форума. - М., 2013. -С. 195-196.

29.Тимохина, Е. В. Патогенетические механизмы развития синдрома задержки роста плода и проблемы лечения / Е. В. Тимохина // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 1720.

30.Фрейдлин, И. С. Клетки иммунной системы. Т. 3, Т. 4, Т. 5 / И. С. Фрейдлин, А. А. Тотолян. - СПб.: Наука, 2001. - 390 с.

31.Фримель, Г. Иммунологические методы / Г. Фримель. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.

32.ЦИК как один из механизмов развития эндотелиоза при артериальной гипертензии у беременных / Л. Л. Алексеева [и др.] // Вестник Бурятского государственного университета. - 2008. - № 12. - С. 86-89.

33.Частота и факторы риска возникновения хронической плацентарной недостаточности и гипотрофии плода / В. В. Горячев [и др.] // Мать и дитя: материалы XV Всероссийского научного форума. - М., 2014. - С. 127-128.

34.Черешнев, В. А. Иммунология: учебник / В. А. Черешнев, К. В. Шмагель. - 4-е изд., перераб. и доп. - М.: НП «Центр стратегического партнерства», 2014. - 520 с.

35.Шарашидзе, К. З. Клинико-иммунологические особенности задержки роста плода у беременных / К. З. Шарашидзе, В. В. Лазуренко, О. В.

Мерцалова // Проблеми еколопчно! та медично! генетики i кишчно! шунологи. - 2010. - № 5(101). - С. 166-172.

36.Ярилин, А. А. Иммунология: учебник / А. А. Ярилин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.

37.Ярилин А. А. Регуляторные Т-клетки, зависимые от фактора Foxp3,и перспективы их изучения при беременности / А. А. Ярилин, А. Д. Донецкова // Российский иммунологический журнал. - 2005. - № 9(2). -С. 149-152.

38.A human equivalent of mouse B-1 cells? / M. Descatoire, J.-C. Weill, C.-A. Reynaud, S. Weller // J Exp Med. - 2011. - Vol. 208, № 13. - P. 2563-2564.

39.A lower proportion of regulatory B cells in patients with Henoch-Schoenlein purpura nephritis / X. Hu [et al.] // PLoS One. - 2016. - Vol. 11, № 3. -doi: 10.1371/journal.pone.0152368.

40.Aberrations in placental cytokine mRNA related to intrauterine growth retardation / H. M. Zoric [et al.] // Pediatr. Res. - 2002. -Vol. 51, № 2. - P. 201-206.

41.Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy induced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection in a murine abortion model / A. S. Zenclussen [et al.] // Am J Pathol. - 2005. - Vol. 166. - P. 811-822.

42.Adams Waldorf, K. M. Autoimmune disease during pregnancy and the microchimerism legacy of pregnancy / K. M. Adams Waldorf, J. L. Nelson // Immunol invest. - 2008. - Vol. 37. - Р. 631-644.

43.Allman, D. Peripheral B cell subsets / D. Allman, S. Pillai // Curr Opin Immunol. - 2008. - Vol. 20, № 2. - P. 149-157.

44.Alteration of Th17 and Treg cells in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion before and after lymphocyte immunization therapy / Li Wu [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. - 2014. - Vol. 12. -doi: 10.1186/1477-7827-12-74.

45.Altered distribution of peripheral blood memory B cells in humans chronically infected with Trypanosoma cruzi / E. R. Fernandez [et al.] // PLoS One. -2014. - Vol. 9. - P. 8.

46.Analysis of mononuclear cell subsets in pregnancies with intrauterine growth retardation. Evidence of chronic B-lymphocyte activation / L. Selvaggi [et al.] // Journal of perinatal medicine - 1983. - Vol. 11, № 4. - P. 213-217.

47.Andre, M. V. Clinical consequences of defects in B cell development / M. V. Andre, W. Harry, J. Schroeder // J Allergy Clin Immunol. - 2010. - Vol. 125, № 4. - P. 778-787.

48.Apoptosis in immune-mediated diseases / S. L. Sankari [et al.] // J Pharm Bioallied Sci. - 2015. - Vol. 7, № 1. - P. 200-202.

49.Assessment of interleukin-6, interleukin-8 and interleukin-18 count in the serum of IUGR newborns / P. Krajewski [et al.] // J Matern Fetal Neonatal Med. - 2014. - Vol. 27, № 11. - P. 1142-1145.

50.Asymmetric antibodies and pregnancy / A. C. Zenclussen [et al.] // Am J Reprod Immunol. - 2001. - Vol. 45, № 5. - P. 289-294.

51.Asymmetric antibodies: a protective arm in pregnancy / G. Gutierrez [et al.] // Chem. Immunol Allergy. - 2005. - № 89. - P. 158-168.

52.Autoimmunity and pregnancy: autoantibodies and pregnancy in rheumatic diseases / A. Tincani [et al.] // Ann N Y Acad Sci. - 2006. - Vol. 1069. - P. 346-352.

53.Autoreactive CD19+CD20- Plasma Cells Contribute to Disease Severity of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis / D. Chen [et al.] // J. Immunol. - 2016. - Vol. 196, № 4. - P. 1541-1549.

54.B- and T-cells in the follicular fluid and peripheral blood of patients undergoing IVF/ET procedures / S. Vujisic [et al.] // Am J Reprod Immunol. -2004. - Vol. 52, № 6. - P. 379-385.

55.B cell development undergoes profound modifications and adaptations during pregnancy in mice / D. O. Muzzio [et al.] // Biol Reprod. - 2014. - Vol. 91, № 5. - doi: 10.1095/biolreprod. 114.122366.

56.B cells: the old new players in reproductive immunology / F. Fettke, A. Schumacher, S.-D. Costa, A. C. Zenclussen // Front Immunol. - 2014. - Vol. 5. - doi: 10.3389/fimmu.2014.00285.

57.B1a lymphocytes in the rectal mucosa of ulcerative colitis patients / L. Polese [et al.] // World J Gastroenterol. - 2012. - Vol. 18, № 2. - P. 144-149.

58.B1b cells recognize protective antigens after natural infection and vaccination / A. F. Cunningham, A. Flores-Langarica, S. Bobat, C. Carmen // Front Immunol. - 2014. - Vol. 5. - doi: 10.3389/fimmu.2014.00535.

59.BAFF activation of the ERK5 MAP kinase pathway regulates B cell survival / E. Jacque [et al.] // J Exp Med. - 2015. - Vol. 212, № 6. - P. 883-892.

60.BAFF Over expression promotes anti-dsDNA B cell maturation and antibody secretion / M. Thorn [et al.] // Cell Immunol. - 2010. - Vol. 261, № 1. - P. 922.

61.BAFF receptor and TACI in B-1b cell maintenance and antibacterial responses / N. Y. Ann [et al.] // Acad Sci. - 2015. - № 1362. - P. 53-57.

62.BAFF-R signaling aids the differentiation of immature B cells into transitional B cells following tonic BCR signaling / S. L. Rowland [et al.] // J Immunol. -2010. - Vol. 185, № 8. - P. 4570-4581.

63.Bartha, J. L. Inflammatory cytokines in intrauterine growth retardation / J. L. Bartha, R. Romero-Carmona, R. Comino-Delgado // Acta Obstet Gynecol Scand. - 2003. - Vol. 82, № 12. - P. 1099-1102.

64.Bartha, J. L. Lymphocyte subpopulations in intrauterine growth retardation in women with or without previous pregnancies / J. L. Bartha, R. Comino-Delgado // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 1999. - Vol. 82, № 1. - P. 23-27.

65.Basu, S. Hemolytic disease of the fetus and newborn: Current trends and perspectives / S. Basu, R. Kaur, G. Kaur // Asian J Transfus Sci. - 2011. -Vol. 5, № 1. - P. 3-7.

66.B-cell activating factor (BAFF) and BAFF-R levels correlate with B-cell subset activation and redistribution in controlled human malaria infection / A. Scholzen [et al.] // J Immunol. - 2014. - Vol. 192, № 8. - P. 3719-3729.

67.B-cell subpopulations in children: national reference values / M. Duchamp [et al.] // Immun Inflamm Dis. - Vol. 2, № 3. - P. 131-140.

68.Billingham, R. E. Actively acquired tolerance' of foreign cells / R. E. Billingham, L. Brent, P. B. Medawar // Journal of immunology. - 2010. - Vol. 184, № 1. - P. 5-8.

69.Biology of interleukin-10 / R. Sabat [et al.] // Cytokine Growth Factor Rev. -2010. - Vol. 21, № 5. - P. 331-344.

70.Birkeland, S. A. Lymphocyte transformation with mitogens and antigens during normal human pregnancy: a longitudinal study / S. A. Birkeland, K. Kristoffersen // Scand J Immunol. - 1980. - № 11. - P. 321-325.

71.Birth weight and subsequent risk of asthma: a systematic review and metaanalysis / M. Mu [et al.] // Heart Lung Circ. - 2014. - Vol. 23, № 6. - P. 511519.

72.B-lymphocyte tolerance and effector functionin immunity and autoimmunity / W. N. Khan [et al.] // Immunol Res. - 2013. - № 57. - P. 335-353.

73.B-lymphocytes as key players in chemical-induced asthma / V. De Vooght [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, № 12. -doi: 10.1371/journal.pone.0083228.

74.Borhis, G. Subversion of the B-cell compartment during parasitic, bacterial, and viral infections / G. Borhis, Y. Richard // BMC Immunol. - 2015. - Vol. 16. - doi: 10.1186/s12865-015-0079-y.

75.Boyum, A. A one-stage procedure for isolation of granulocytes and lymphocytes from human blood. General sedimentation properties of white blood cells in a 1g gravity field / A. Boyum // Scand J Clin Lab Invest Suppl. - 1968. - Vol. 97. - P. 51-76.

76.Briana, D. D. Intrauterine growth restriction and adult disease: the role of adipocytokines / D. D. Briana, A. Malamitsi-Puchner // Eur J Endocrinol. -2009. - Vol. 160, № 3. - P. 337-347.

77.Candando, K. M. B10 cell regulation of health and disease / K. M. Candando, J. M. Lykken, T. F. Tedder // Immunol Rev. - 2014. - Vol. 259, № 1. - P. 259-272.

78.Caulfield, A. J. Disruption of Fas-Fas Ligand Signaling, Apoptosis, and Innate Immunity by Bacterial Pathogens / A. J. Caulfield, W. W. Lathem // PLoS Pathog. - 2014. - Vol. 10, № 8. - doi: 10.1371/journal.ppat.1004252.

79. CD 19(+)CD24(hi)CD38(hi) B cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic lupus erythematosus patients / P. A. Blair [et al.] // Immunity. - 2010. - Vol. 32, № 1. - P. 129140.

80.CD27-IgD- memory B cells are modulated by in vivo interleukin-6 receptor (IL-6R) blockade in rheumatoid arthritis / Z. Mahmood [et al.] // Arthritis Res Ther. - 2015. - Vol. 17, № 1. - doi: 10.1186/s13075-015-0580-y.

81.CD40 Ligand and Appropriate Cytokines Induce Switching to IgG, IgA, and IgE and Coordinated Germinal Center and Plasmacytoid Phenotypic Differentiation in a Human Monoclonal IgM+IgD+ B Cell Line / A. Cerutti [et al.] // J Immunol. - 1998. - Vol. 160, № 5. - P. 2145-2157.

82.Celik, H. Comparison of maternal serum levels of interleukin-10, interleukin-12, and interleukin-2 in normal and preeclamptic pregnancies / H. Celik, B. Avci, T. Alper // Pregnancy Hypertens. - 2012. - Vol. 2, № 1. - P. 39-42.

83.Changes in interleukin-6 and IGF system and their relationships in placenta and cord blood in newborns withfetal growth restriction compared with controls / M. E. Street [et al.] // Eur J Endocrinol. - 2006. - Vol. 155, № 4. -P. 567-574.

84.Changes in T, B, and NK lymphocyte subsets during and after normal pregnancy / M. Watanabe [et al.] // Am J Reprod Immunol. - 1997. - № 37. -P. 368-377.

85.Changes of lymphocyte subset in normal pregnant and post-partum women: post-partum increase in NK/K (Leu 7) cells / Y. Iwatani [et al.] // Am J Reprod Immunol Microbiol. - 1988. - № 18. - P. 52-55.

86.Characterisation of syncytiotrophoblast vesicles in normal pregnancy and preeclampsia: expression of Flt-1 and endoglin / D. S. Tannetta [et al.] // Plos one. - 2013. - Vol. 8, № 2. - e 56754.

87.Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells / Y. Iwata [et al.] // Blood. - 2011. - Vol. 117, № 2. - P. 530-541.

88.Characterization of B cells in healthy pregnant women from late pregnancy to post-partum: a prospective observational study / J. Lima [et al.] // BMC Pregnancy Childbirth. - 2016. - Vol. 16. - doi: 10.1186/s12884-016-0927-7.

89.Cheng, S. B. Interleukin-10: a pleiotropic regulator in pregnancy / S. B. Cheng, S. Sharma // Am J Reprod Immunol. - 2015. - Vol. 73, № 6. - P. 487500.

90.Circulating immune complexes and immunoglobulins A, M and G in the mother-fetus system in normal pregnancy and gestosis / T. A. Starostina [et al.] // Akush Ginekol. - 1992. - № 1. - P. 19-22.

91.Circulating immune complexes in pre-eclampsia / A. Jain, P. Rohatgi, V. K. Singh, M. K. Sharma // J Indian Med Assoc. - 1991. - Vol. 89, № 9. - P. 251253.

92.Context-specific BAFF-R signaling by the NF-kB and PI3K pathways / J. Jellusova [et al.] // Cell Rep. - 2013. - Vol. 5, № 4. - P. 1022-1035.

93.Cornelius, D. C. TH17- and IL-17- mediated autoantibodies and placental oxidative stress play a role in the pathophysiology of pre-eclampsia / D. C. Cornelius, B. Lamarca // Minerva Ginecol. - 2014. - Vol. 66, № 3. - P. 243249.

94.CRM197-conjugated serogroup C meningococcal capsular polysaccharide, but not the native polysaccharide, induces persistent antigen-specific memory B cells / D. F. Kelly [et al.] // Blood. - 2006. - Vol. 108. - P. 2642-2647.

95.Crome, S. Q. Translational mini-review series on Th17 cells: function and regulation of human T helper 17 cells in health and disease / S. Q. Crome, A.Y. Wang, M. K. Levings // Clinical and Experimental Immunology. - 2010. - Vol. 159, № 2. - P. 109-119.

96.Crotty, S. Effectors and memories: Bcl-6 and Blimp-1 in T and B lymphocyte differentiation / S. Crotty, R. J. Johnston, S. P. Schoenberger // Nat Immunol. -2010. - Vol. 11, № 2. - P. 114-120.

97.Crucial role for BAFF-BAFF-R signaling in the survival and maintenance of mature B cells / M. Rauch [et al.] // PLoS One. - 2009. - Vol. 4, № 5. -doi: 10.1371/journal.pone.0005456.

98. Current status of IL-10 and regulatory T-cells in cancer / K. L. Dennis [et al.] // Curr Opin Oncol. - 2013. - Vol. 25, № 6. - P. 637-645.

99. Cutting edge: IL-10-producing regulatory B cells in early human pregnancy / L. Rolle [et al.] // Am J Reprod Immunol. - 2013. - Vol. 70, № 6. - P. 448453.

100. Cutting edge: the dependence of plasma cells and independence of memory B cells on BAFF and APRIL / M. Benson [et al.] // J. Immunol. - 2008. - Vol. 180. - P. 3655-3659.

101. Cytokines in the placenta of Pakistani newborns with and without intrauterine growth retardation / S. Amu [et al.] // Pediatr Res. - 2006. - Vol. 59, № 2. -P. 254-258.