Характеристика белковых факторов, связывающихся с регуляторными участками эндогенных ретровирусов человека семейства К тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Трубецкой, Дмитрий Олегович

• Трубецкой, Дмитрий Олегович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Трубецкой, Дмитрий Олегович

Список используемых сокращений

Ключевые слова

1. Обзор литературы

1.1.Введение

1.2.Ретроэлементы

1.3.Структура эндогенных ретровирусов.

1.4.Типы эндогенных ретровирусов

1.5.Семейства эндогенных ретровирусов 12 1 .б.Эндогенные ретровирусы семейства HERV-H 12 1.7.Эндогенные ретровирусы семейства HERV-K(CUU)

1.8.Продукты трансляции эндогенных ретровирусных последовательностей и их роль в функционировании организма человека

1.9.Роль эндогенных ретровирусов и их LTR в регуляции транскрипции клеточных генов

1.10. Белковые факторы-регуляторы транскрипции, способные связываться с LTR

1.11. Свиные эндогенные ретровирусы, PERVs

1.12. Белки теплового шока (HSP, БТШ)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика белковых факторов, связывающихся с регуляторными участками эндогенных ретровирусов человека семейства К»

Эндогенные ретровирусы человека и их фрагменты, представленные несколькими семействами и составляющие до 8 % всей ДНК человеческого генома, обладают потенциальной способностью регулировать экспрессию близко расположенных генов. Благодаря их способности к перемещению по геному и к амплификации они могут быть важными инструментами эволюции и видообразования. Некоторые из них могут также обладать и способностью образовывать вирусные частицы, что свидетельствует об их участии в патогенных процессах, включая опухолевую трансформацию. Одиночные LTR некоторых семейств эндогенных ретровирусов человека, образующиеся, по всей видимости, по механизму гомологичной рекомбинации, присутствуют в геноме в количествах в десятки раз больших, чем соответствующие провирусы, что многократно умножает их регуляторный потенциал. Показано, что одиночные LTR HERV могут служить промоторами и терминаторами транскрипции клеточных генов как in vitro, так и in vivo, а также обладать другими функциями. Таким образом, изучение эндогенных ретровирусов человека позволило получить ряд важных новых данных о механизмах регуляции и эволюции на уровне полного генома человека.

1.2. Ретроэлементы

В геноме позвоночных существует большое количество различных семейств и типов ретроэлементов, способных играть важную роль в эволюции (1). Их активное перемещение по геному является одним из основных источников изменчивости генома. Без участия ретроэлементов и кодируемых ими ферментов темпы эволюции животного мира могли бы значительно замедлиться. По доминирующей на сегодня точке зрения все ретроэлементы тесно взаимосвязаны между собой. Роль ретровирусов и других кодирующих обратную транскриптазу (RT) последовательностей является ключевой в эволюции других ретроэлементов, таких как псевдогены, короткие диспергированные повторы, Alu-повторы и т.д. Согласно этому, другие ретроэлементы либо являются продуктами обратной транскрипции, т.е. ДНК-копиями (кДНК) клеточных РНК-транскриптов, либо бывшими ретровирусами, давно внедрившимися в геном позвоночных (2-4) и потерявшими в ходе рекомбинаций и замен часть своих генов (7).

Эндогенные ретровирусы человека (HERVs - human endogenous retroviruses) представляют собой один из классов ретроэлементов, появившиеся в результате давнего заражения ретровирусами клеток зародышевого пути. Эндогенные ретровирусы и их элементы представлены в геноме высших приматов десятками тысяч копий, при этом число представителей различных классов НЕЮ/ сильно различается (Табл. 1), составляя в сумме приблизительно 8% всего наследственного материала (15). Кроме полноразмерных элементов, для ряда классов НЕЮ/ обнаружено большое число одиночных длинных концевых повторов (ЬТЯ), являющихся скоре всего продуктами рекомбинации целого ретровируса, содержащего два длинных концевых повтора в своём составе. Их число может значительно превышать количество полноразмерных НЕЮ/ (Табл.1). Естественно, что столь значительный объём вирусной генетической информации в геноме может оказывать существенное влияние на функционирование организма.

Таблица 1. Характеристики ретроэлементов

Геномная структура Название элемента Пример Число копий на гаплоидный геном Доля генома

Ретроэлемент без ЮГ с клеточным промотором Ретроген (псевдоген) Фосфоглицерат-киназа человека 1-10

Ретроэлемент без ЮГ с внутренним промотором SINE (Short interspersed element) Alu SENE-R 1090000 400000 10,6 % 2,6 %

Ретроэлемент с ЮГ и внутренним промотором Ретропозон LINE (Long interspersed element) 850000 21%

Ретроэлемент с ЮГ и ига Ретротранспозон Ту 1 100-1000 1%

Ретроэлемент с ЮГ, ЬТ11 и Епу Эндогенный ретровирус HERV-H, HERV-R, ERV-9, HERV-K 8000-112000 8% ига Одиночный длинный концевой повтор (LTR) LTR HERV-K 10-1000 5%

По широко распространённой на сегодня точке зрения ретровирусы инфицировали геном неоднократно. В пользу этого говорит наличие их в геноме как беспозвоночных, так и высокоразвитых позвоночных животных (4). Ретровирусы внедрились в геном приматов примерно 10-60 млн. лет назад (15) путём инфицирования экзогенными ретровирусами и с того времени существуют как стабильно интегрированные вертикально наследуемые провирусы.

В ходе эволюции хозяина их геном видоизменялся, в нём происходили нарушения открытых рамок считывания. Процессы транскрипции и трансляции их белков сопрягались с процессами, происходящими в геноме хозяина (см. ниже). Рекомбинация со встроившимися ранее ретроэлементами повлекла изменения кодируемых ретровирусами белков, а продуцируемые ими ферменты вызвали появление большого количества ДНК-копий (кДНК) РНК-транскриптов многих клеточных генов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Трубецкой, Дмитрий Олегович

4. ВЫВОДЫ

1. Состав комплекса 5'-области ЬТ11НЕЮ/-К с клеточными белками изменяется при воздействии на клетку теплового шока и митогенных факторов.

2. Центральная и 3'-концевая области ЬТЯ НЕЯУ-К, в частности, область негативного регуляторного элемента, способны специфически связываться с клеточными белковыми факторами.

3. В клетках Тега-1, где ЬТЯ НЕЯУ-К обладает энхансерной активностью, с центральной областью ЬТЯ связывается дополнительный клеточный фактор.

4. Разработан новый метод выделения ДНК-связывающих белков, и с его помощью очищены практически до гомогенности три белка, образующих специфический комплекс с 5'-областью 1ЛИ НЕЛУ-К.

5. При помощи метода масс-спектрометрии (МАЬВЬТОР-МБ) один из белков, образующих комплекс с 5'-областью ЬТЯ НЕЛУ-К, был идентифицирован как сходный с белком теплового шока конститутивно экспрессирующийся белок Нзс70.

6. Присутствие Нзс70 в составе комплекса с 5'-концом области Ш ЬТЛ НЕЯУ-К было подтверждено иммунохимическими методами с использованием поликлональных и моноклональных антител.

Заключение

Из обзора литературы становится понятным, что связывающиеся с 1ЛИ эндогенных ретровирусов белковые факторы способны играть важную роль в регуляции активности и эволюции генома человека. В то же время, существует лишь несколько работ, посвященных их характеристике, и ни в одном случае связывающийся с ЬТЯ белок не был выделен и полностью охарактеризован. Выделение таких белков и их функциональная характеристика, таким образом, представляет собой актуальную задачу.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

Акриламид, хлорид калия, хлорид магния - производства фирмы "Merck" (ФРГ). Глицерин, Ы-2-гидроксиэтилпиперазин->Г-2-этилсульфоновая кислота (HEPES), гепарин-агароза, фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ) - фирмы "Sigma" (США). Бромфеноловый синий, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол, спермин, спермидин - фирмы "Serva" (ФРГ)' Дезоксирибонуклеотид-5'-трифосфаты - фирмы "Pharmacia" (Швеция). Леупептин (Leupeptin hemisulfate) - acetyl-leu-leu-arg-ala - фирмы ICN (США).

2.2. Буферные растворы

Буфер ТЕ -10 мМ Трис-НС1, 0,5 мМ ЭДТА (рН 8,0).

Буфер ТВЕ - 50 мМ Трис, 50 мМ Н3В03,0,5 мМ ЭДТА (рН 8,3).

Буфер для ПИР реакции (10х) - 500 мМ КС1,100 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 1% Triton Х-100. Буфер А (для получения ядерного экстракта) - 10 мМ HEPES-KOH (рН 7,9), 25 мМ КС1, 0,15 мМ спермин, 0,5 мМ спермидин, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерин. Перед использованием добавляли ДТТ до 0,5 мМ, ФМСФ до 0,5 мМ, леупептин до 5 мкМ. Буфер В (для получения ядерного экстракта) - 20 мМ HEPES-KOH (рН 7,9), 100 мМ КС1, 0,2 мМ ЭДТА, 20% глицерин. Перед использованием добавляли ДТТ до 0,5 мМ, ФМСФ до 0,5 мМ, леупептин до 5 мкМ.

Буфер С (для аффинной колонки) -12 мМ HEPES-KOH (рН 7,9), 60 мМ КС1, 0,12 мМ ЭДТА, 12% глицерин. Перед использованием добавляли ДТТ до 0,3 мМ, ФМСФ до 0,3 мМ, леупептин до 3 мкМ.

Анодный буфер I - 300 мМ Трис-HCl, рН 10,4,10% метанол. Анодный буфер II - 25 мМ Трис-HCl, рН 10,4,10% метанол.

Катодный буфер — 25 мМ Трис-HCl, рН 9,4, 10% метанол, 40чмМ е-аминокапроновая кислота.

Буфер PBS - 0,137 М NaCl, 2,68 мМ КС1, 8,06 мМ Na2HP04,1,47 мМ КН2Р04 (рН 7,4). Буфер ТМ 10х- 100 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 100 мМ MgCl2.

Буфер для Фрагмента Клёнова 10х - 500 мМ Tris-HCl рН 7,5,100 мМ MgCl2,10 мМ ДТТ, 0,5 мг/мл БСА.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов для мечения (-А) - 0,33 мМ dGTP, 0,33 мМ dCTP, 0,33 мМ dTTP.

Буфер для нанесения на неденатурирующий ПААГ — 0,1х TBE, 50% глицерин, бромфеноловый синий, ксиленцианол.

Буфер для нанесения на ДДС-ПААГ (5х) - 20% ДЦС, 100 мМ Tris-HCl pH 6,8,20% глицерин, 10 мМ ЭДТА, 3% 2-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий. Буферные растворы готовили из максимально чистых реагентов и фильтровали через 0,45 мкм нитроцелюллозный фильтр.

Методы

2.3. Клеточные культуры

Клетки линий Jurkat и СНО (Chinese Hamster Ovary) были выращены в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (0,1 мг/мл). Клетки линий 293 (CRL-1573; первичная человеческая эмбриональная почка, трансформированная ДНК человеческого аденовируса типа 5), СНО-К1 (CCL-61; яичник китайского хомячка), HeLa (CCL-2; аденокарцинома шейки матки), HL-60 (CRL-1964; острый промиелоцитный лейкоз), Jurkat (TIB-152; острый Т-клеточный лейкоз), NT2/D1 (CRL-1973; полипотентная человеческая тестикулярная эмбриональная карцинома), PANC-1 (CRL-1469; панкреатическая аденокарцинома), и Тега-1 (НТВ-105; человеческая тестикулярная злокачественная эмбриональная карцинома) выращивали в условиях, рекомендованных АТСС (http://www.lgcpromochem.com/atccA)-Клетки линии NGP-127 (нейробластома), любезно предоставленные Paul S. Meitzer, выращивали, как описано ранее (Elkahloum et al., 1996). Клетки линии GS (человеческая почечная клеточная карцинома) (104) были получены из коллекции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия) и выращивали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки всех линий выращивали при 37°С и 5% СО2.

2.4. Получение клеток асцитной карциномы мышей Krebs-II

Для работы использовали линии мышей BALB/C. В каждую мышь вводили внутрибрюшинно 200 мкл асцитной жидкости из эпителиальной асцитной карциномы мышей Krebs-II. Через 1-1,5 недели, по мере созревания опухолей, из них выделяли асцитную жидкость, содержащую опухолевые клетки.

2.5. Получение ядерных экстрактов

Клетки асцитной жидкости собирали центрифугированием в течение 5 мин при 800xg, промывали несколько раз холодным фосфатно-солевым раствором (PBS) и взвешивали осадок. 1 г осадка клеток суспендировали в 10 мл буфера А (см. выше), инкубировали 10 минут в ледяной бане и разрушали в гомогенизаторе Даунса. Степень гомогенизации (уровень разрушения клеток) проверяли под световым микроскопом с применением окрашивания Trypan Blue после каждых 10 проходов пестика гомогенизатора. Гомогенизацию проводили до разрушения более чем 80% клеток. Ядра собирали в течение 5 мин при 3000 об/мин и 4°С. Полученные ядра суспендировали в 1 мл буфера А и определяли объём полученной суспензии по весу, считая ее плотность равной 1 г/мл. Далее к суспензии ядер по каплям добавляли 3 М KCl до концентрации 0,3 М, инкубировали 30 мин при 4°С или на льду при медленном перемешивании и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин и 4°С. Супернатант диализовали в течение 2 часов против 100-кратного избытка буфера В. После диализа смесь центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин и 4°С. Концентрацию белка в экстракте определяли по методу Брэдфорд, ядерный экстракт расфасовывали и хранили при -70°С. Ядерные экстракты из других типов клеток были приготовлены тем же методом.

2.6. Радиоактивное мечение ДНК 2.6.1. Мечение в ходе ПЦР

Фрагменты LTR для мечения были амплифицированы с использованием в качестве матрицы космиды F23280 (номер по GenBank L47334), любезно предоставленной А. Olsen, Ливерморская национальная лаборатория, США. ПЦР проводили в реакционной смеси (30 мкл), содержащей: 1х буфер для ПЦР, 2,5 мМ MgCh, 0,125 мМ dNTPs, по 0,4 мкМ праймеров (таблица 3), 1-1,5 ед. Taq-полимеразы (Biotaq) и космиду F23280 в количестве 2-4 нг.

Сверху на реакционную смесь наслаивали 25 мкл минерального масла и проводили ПЦР в режиме: денатурация, 94°С-20 с; отжиг праймеров, 60°С-30 с; достройка, 72°С-90 с в течение 10-15 циклов амплификации.

После определенного числа циклов из реакционной смеси отбирали аликвоты по 10 мкл для анализа методом электрофореза в агарозном геле, для чего аликвоту препарата ДНК смешивали с 2 мкл буфера для нанесения на электрофорез. Гель-электрофорез проводили в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий и приготовленном на

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Трубецкой, Дмитрий Олегович, 2005 год

1. Baltimore D., Retroviruses and retrotransposons: the role of reverse transcription in shaping the eukaryotic genome., Cell. 1985 Mar;40(3):481-482. Review

2. Wilkinson DA, Mager DL and Leong, J.A.C. Endogenous human retroviruses. The Retroviridae, 1994,3:465-535, in J.A. Levy (ed.), Plenum Press, New York.

3. Larsson E, Kato N, Cohen M., Human endogenous proviruses. Curr Top Microbiol Immunol. 1989; 148:115-132. Review.

4. Leib-Mosch C, Brack-Werner R, Werner T, Bachmann M, Faff O, Erfle V, Hehlmann R., Endogenous retroviral elements in human DNA., Cancer Res. 1990 Sep 1;50(17 Suppl):5636S-5642S. Review.

5. Cohen M, Larsson E., Human endogenous retroviruses., Bioessays. 1988 Dec;9(6):191-196. Review.

6. Kim A, Terzian C, Santamaria P, Pelisson A, Purd'homme N, Bucheton A., Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster., Proc Natl Acad Sei USA. 1994 Feb 15;91(4):1285-1289.

7. Lower R, Lower J, Kurth R., The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences., Proc Natl Acad Sei USA. 1996 May 28;93(11):5177-5184. Review.

8. Patience C, Wilkinson DA, Weiss RA., Our retroviral heritage., Trends Genet. 1997 Mar;13(3):l 16-120. Review.

9. Kroger B, Horak I., Isolation of novel human retrovirus-related sequences by hybridization to synthetic oligonucleotides complementary to the tRNA(Pro) primer-binding site., J Virol. 1987 Jul;61(7):2071-2075.

10. Harada F, Tsukada N, Kato N., Isolation of three kinds of human endogenous retro virus-like sequences using tRNA(Pro) as a probe., Nucleic Acids Res. 1987 Nov 25;15(22):9153-9162.

11. Maeda N., Nucleotide sequence of the haptoglobin and haptoglobin-related gene pair. The haptoglobin-related gene contains a retrovirus-like element., J Biol Chem. 1985 Jun 10;260(11):6698-6709.

12. May FE, Westley BR., Structure of a human retroviral sequence related to mouse mammary tumor virus., J Virol. 1986 Nov;60(2):743-749.

13. Ono M, Yasunaga T, Miyata T, Ushikubo H., Nucleotide sequence of human endogenous retrovirus genome related to the mouse mammary tumor virus genome., J Virol. 1986 Nov;60(2):589-598.

14. Cordonnier A, Casella JF, Heidmann T., Isolation of novel human endogenous retrovirus-like elements with foamy virus-related pol sequence., J Virol. 1995 Sep;69(9):5890-5897.

15. Leib-Mosch C, Haltmeier M, Werner T, Geigl EM, Brack-Werner R, Francke U, Erfle V, Hehlmann R., Genomic distribution and transcription of solitary HERV-K LTRs., Genomics. 1993 Nov; 18(2):261-269.

16. Rabson AB, Hamagishi Y, Steele PE, Tykocinski M, Martin MA., Characterization of human endogenous retroviral envelope RNA transcripts., J Virol. 1985 Oct;56(l): 176-182.

17. Tomita N, Horii A, Doi S, Yokouchi H, Ogawa M, Mori T, Matsubara K., Transcription of human endogenous retroviral long terminal repeat (LTR) sequence in a lung cancer cell line., Biochem Biophys Res Commun. 1990 Jan 15;166(1):1-10.

18. Cohen M, Powers M, O'Connell C, Kato N., The nucleotide sequence of the env gene from the human provirus ERV3 and isolation and characterization of an ERV3-specific cDNA., Virology. 1985 Dec;147(2):449-458.

19. Kato N, Shimotohno K, VanLeeuwen D, Cohen M., Human proviral mRNAs down regulated in choriocarcinoma encode a zinc finger protein related to Kruppel., Mol Cell Biol. 1990 Aug; 10(8) :4401 -4405.

20. Venables PJ, Brookes SM, Griffiths D, Weiss RA, Boyd MT., Abundance of an endogenous retroviral envelope protein in placental trophoblasts suggests a biological function., Virology. 1995 Aug 20;211(2):589-592.

21. Wilkinson DA, Freeman JD, Goodchild NL, Kelleher CA, Mager DL., Autonomous expression of RTVL-H endogenous retroviruslike elements in human cells., J Virol. 1990 May;64(5):2157-2167.

22. Mager DL., Polyadenylation function and sequence variability of the long terminal repeats of the human endogenous retrovirus-like family RTVL-H., Virology. 1989 Dec;173(2):591-599.

23. Goodchild NL, Wilkinson DA, Mager DL., A human endogenous long terminal repeat provides a polyadenylation signal to a novel, alternatively spliced transcript in normal placenta., Gene. 1992 Nov 16;121(2):287-294.

24. Shih A, Misra R, Rush MG., Detection of multiple, novel reverse transcriptase coding sequences in human nucleic acids: relation to primate retroviruses., J Virol. 1989 Jan;63(l):64-75.

25. Bohannon RC, Donehower LA, Ford RJ., Isolation of a type D retrovirus from B-cell lymphomas of a patient with AIDS., J Virol. 1991 Nov;65(l l):5663-5672.

26. Callahan R, Chiu IM, Wong JF, Tronick SR, Roe BA, Aaronson SA, Schlom J., A new class of endogenous human retroviral genomes., Science. 1985 Jun 7;228(4704):1208-1211.

27. Deen KC, Sweet RW., Murine mammary tumor virus pol-related sequences in human DNA: characterization and sequence comparison with the complete murine mammary tumor virus pol gene., J Virol. 1986 Feb;57(2):422-432.

28. Li MD, Lemke TD, Bronson DL, Faras AJ., Synthesis and analysis of a 640-bp pol region of novel human endogenous retroviral sequences and their evolutionary relationships., Virology. 1996 Mar 1;217(1):1-10.

29. Li MD, Bronson DL, Lemke TD, Faras AJ., Restricted expression of new HERV-K members in human teratocarcinoma cells., Virology. 1995 Apr 20;208(2):733-741.

30. Medstrand P, Lindeskog M, Blomberg J., Expression of human endogenous retroviral sequences in peripheral blood mononuclear cells of healthy individuals., J Gen Virol. 1992 Sep;73 (Pt 9):2463-2466.

31. Brodsky I, Foley B, Gillespie D., Expression of human endogenous retrovirus (HERV-K) in chronic myeloid leukemia., Leuk Lymphoma. 1993; 11 Suppl 1:119-123. Review.

32. Boiler K, Konig H, Sauter M, Mueller-Lantzsch N, Lower R, Lower J, Kurth R., Evidence that HERV-K is the endogenous retrovirus sequence that codes for the human teratocarcinoma-derived retrovirus HTDV., Virology. 1993 Sep;196(l):349-353.

33. Caroll MC, Campbell RD, Bentley DR, Porter R., 1984, Nature, v.307, 237-241.

34. Dirksen ER, Levy JA., Virus-like particles in placentas from normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus., J Natl Cancer Inst. 1977 Oct;59(4):l 187-1192.

35. Bronson DL, Saxinger WC, Ritzi DM, Fraley EE., Production of virions with retrovirus morphology by human embryonal carcinoma cells in vitro., J Gen Virol. 1984 Jun;65 (Pt 6): 1043-1051.

36. Larsson E, Nilsson BO, Sundstrom P, Widehn S., Morphological and microbiological signs of endogenous C-virus in human oocytes., Int J Cancer. 1981 Nov 15;28(5):551-557.

37. Query CC, Keene JD., A human autoimmune protein associated with U1 RNA contains a region of homology that is cross-reactive with retroviral p30gag antigen., Cell. 1987 Oct 23;51(2):211-220.

38. Mellors RC, Mellors JW., Type C RNA virus-specific antibody in human systemic lupus erythematosus demonstrated by enzymoimmunoassay., Proc Natl Acad Sci'U S A. 1978 May;75(5):2463-2467.

39. Rucheton M, Graafland H, Fanton H, Ursule L, Ferrier P, Larsen CJ., Presence of circulating antibodies against gag-gene MuLV proteins in patients with autoimmune connective tissue disorders., Virology. 1985 Jul 30;144(2):468-480.

40. Shih CC, Stoye JP, Coffin JM., Highly preferred targets for retrovirus integration., Cell. 1988 May 20;53(4):531-537.

41. Vijaya S, Steffen DL, Robinson HL., Acceptor sites for retroviral integrations map near DNase I-hypersensitive sites in chromatin., J Virol. 1986 Nov;60(2):683-692.

42. Makalowski W, Mitchell GA, Labuda D., Alu sequences in the coding regions of mRNA: a source of protein variability., Trends Genet. 1994 Jun;10(6):188-193.

43. Banki K, Halladay D, Perl A., Cloning and expression of the human gene for transaldolase. A novel highly repetitive element constitutes an integral part of the coding sequence., J Biol Chem. 1994 Jan 28;269(4):2847-2851.

44. Ting CN, Rosenberg MP, Snow CM, Samuelson LC, Meisler MH., Endogenous retroviral sequences are required for tissue-specific expression of a human salivary amylase gene., Genes Dev. 1992 Aug;6(8): 1457-1465.

45. Madhusudhan KT, Naik SS, Patel MS., Characterization of the promoter regulatory region of the human pyruvate dehydrogenase beta gene., Biochemistry. 1995 Jan 31;34(4):1288-1294.

46. Frech K, Brack-Werner R, Werner T., Common modular structure of lentivirus LTRs., Virology. 1996 Oct l;224(l):256-267.

47. Frech K, Danescu-Mayer J, Werner T., A novel method to develop highly specific models for regulatory units detects a new LTR in GenBank which contains a functional promoter., J Mol Biol. 1997 Aug l;270(5):674-687.

48. Knossl M, Lower R, Lower J., Expression of the human endogenous retrovirus HTDV/HERV-K is enhanced by cellular transcription factor YY1., J Virol. 1999 Feb;73(2):1254-1261.

49. Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei., Nucleic Acids Res. 1983 Mar11;11(5):1475-1489.

50. Fried M, Crothers DM., Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by Polyacrylamide gel electrophoresis., Nucleic Acids Res. 1981 Dec ll;9(23):6505-6525.

51. Nikolaev LG, Glotov BO, Belyavsky AV, Grachev SA, Levin AV., Identification of sequence-specific DNA-binding factors by label transfer: application to the adenovirus-2 major late promoter., Nucleic Acids Res. 1988 Jan 25;16(2):519-535.

52. Akopov SB, Nikolaev LG, Khil PP, Lebedev YB, Sverdlov ED., Long terminal repeats of human endogenous retrovirus K family (HERV-K) specifically bind host cell nuclear proteins., FEBS Lett. 1998 Jan 16;421(3):229-233.

53. Nelson DT, Goodchild NL, Mager DL., Gain of Spl sites and loss of repressor sequences associated with a young, transcriptionally active subset of HERV-H endogenous long terminal repeats., Virology. 1996 Jun 1 ;220(1>:213-218.

54. Smit AF, Toth G, Riggs AD, Jurka J., Ancestral, mammalian-wide subfamilies of LINE-1 repetitive sequences., J Mol Biol. 1995 Feb 24;246(3):401-417.

55. Leib-Mosch C, Seifarth W., Evolution and biological significance of human retroelements., Virus Genes. 1995;11(2-3):133-145. Review.

56. Eisfeld K, Candau R, Truss M, Beato M., Binding of NF1 to the MMTV promoter in nucleosomes: influence of rotational phasing, translational positioning and histone HI., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 15;25(18):3733-3742.

57. Truss M, Bartsch J, Hache RS, Beato M., Chromatin structure modulates transcription factor binding to the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter., J Steroid Biochem Mol Biol. 1993 Dec;47(l-6):1-10.

58. Fragoso G, John S, Roberts MS, Hager GL., Nucleosome positioning on the MMTV LTR results from the frequency-biased occupancy of multiple frames., Genes Dev. 1995 Aug 1;9(15): 1933-1947.

59. Daelemans D, Vandamme AM, De Clercq E., Human immunodeficiency virus gene regulation as a target for antiviral chemotherapy., Antivir Chem Chemother. 1999 Jan;10(l):l-14. Review.

60. Kapitonov VV, Jurka J., The long terminal repeat of an endogenous retrovirus induces alternative splicing and encodes an additional carboxy-terminal sequence in the human leptin receptor., J Mol Evol. 1999 Feb;48(2):248-251.

61. Kjellman C, Sjogren HO, Widegren B., HERV-F, a new group of human endogenous retrovirus sequences., J Gen Virol. 1999 Sep;80 (Pt 9):2383-2392.

62. Mager DL, Freeman JD. HERV-H endogenous retroviruses: presence in the New World branch but amplification in the Old World primate lineage., Virology. 1995 Nov10;213(2):395-404.

63. Barbulescu M, Turner G, Seaman MI, Deinard AS, Kidd KK, Lenz J., Many human endogenous retrovirus K (HERV-K) proviruses are unique to humans., Curr Biol. 1999 Aug 26;9(16):861-868.

64. Medstrand P, Mager DL, Human-specific integrations of the HERV-K endogenous retrovirus family., J Virol. 1998 Dec;72(12):9782-9787.

65. Lebedev YB, Belonovitch OS, Zybrova NV, Khil PP, Kurdyukov SG, Vinogradova TV, Hunsmann G, Sverdlov ED., Differences in HERV-K LTR insertions in orthologous loci of humans and great apes., Gene. 2000 Apr 18;247(l-2):265-277.

66. Lower R, Tonjes RR, Korbmacher C, Kurth R, Lower J., Identification of a Rev-related protein by analysis of spliced transcripts of the human endogenous retroviruses

67. HTDV/HERV-K., J Virol. 1995 Jan;69(l): 141-149.

68. Yang J, Bogerd HP, Peng S, Wiegand H, Truant R, Cullen BR., An ancient family of human endogenous retroviruses encodes a functional homolog of the HIV-1 Rev protein., Proc Natl Acad Sei USA. 1999 Nov 9;96(23):13404-13408.

69. Boese A, Sauter M, Mueller-Lantzsch N., A rev-like NES mediates cytoplasmic localization of HERV-K cORF. FEBS Lett. 2000 Feb 18;468(l):65-67.

70. Magin C, Lower R, Lower J., cORF and RcRE, the Rev/Rex and RRE/RxRE homologues of the human endogenous retrovirus family HTDV/HERV-K., J Virol. 1999 Nov;73(l 1):9496-9507.

71. Domansky AN, Kopantzev EP, Snezhkov EV, Lebedev YB, Leib-Mosch C, Sverdlov ED., Solitary HERV-K LTRs possess bi-directional promoter activity and contain a negative regulatory element in the U5 region., FEBS Lett. 2000 Apr 28;472(2-3):191-195.

72. Kowalski PE, Freeman JD, Mager DL., Intergenic splicing between a HERV-H endogenous retrovirus and two adjacent human genes., Genomics. 1999 May l;57(3):371-379.

73. Knossl M, Lower R, Lower J., Expression of the human endogenous retrovirus HTD V/HERV-K is enhanced by cellular transcription factor YY1., J Virol. 1999 Feb;73(2):1254-1261.

74. Laemmli UK, Favre M., J Mol Biol. 1973 Nov 15;80(4): 601-613.

75. Akopov SB, Nikolaev LG, Khil PP, Lebedev YB, Sverdlov ED., Long terminal repeats of human endogenous retrovirus K family (HERV-K) specifically bind host cell nuclear proteins., FEBS Lett. 1998 Jan 16;421(3):229-233.

76. Nikolaev LG, Glotov BO, Belyavsky AV, Grachev SA, Levin AV., Identification of sequence-specific DNA-binding factors by label transfer: application to the adenovirus-2 major late promoter., Nucleic Acids Res. 1988 Jan 25;16(2):519-535.

77. Dirksen ER, Levy JA., Virus-like particles in placentas from normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus., J Natl Cancer Inst. 1977 Oct;59(4):l 187-1192.

78. Kadonaga JT, Tjian R., Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins., Proc Natl Acad Sei USA. 1986 Aug;83(16):5889-5893.

79. Sverdlov ED., Perpetually mobile footprints of ancient infections in human genome., FEBS Lett. 1998 May 22;428(l-2):l-6. Review.

80. Moggs JG, Orphanides G., Genomic analysis of stress response genes. Toxicol Lett. 2003 Apr 11;140-141:149-153. Review.

81. Tacke SJ, Specke V, Denner J., Differences in release and determination of subtype of porcine endogenous retroviruses produced by stimulated normal pig blood cells., Intervirology. 2003;46(l):17-24.

82. Доманский АН, Акопов СБ, Лебедев ЮБ, Николаев ЛГ, Свердлов ЕД., Энхансерная активность одиночного длинного концевого повтора человеческого эндогенного ретровируса семейства К.,, Биоорг. Хим. 2002;28, номер 4,341-345.

83. Yang Р, Zemba М, Aboud М, Flügel RM, Lochelt М., Deletion analysis of both the long terminal repeat and the internal promoters of the human foamy virus., Virus Genes. 1997;15(l):17-23.

84. Seiki M, Hikikoshi A, Yoshida M., The U5 sequence is a cis-acting repressive element for genomic RNA expression of human T cell leukemia virus type I., Virology. 1990 May;176(l):81-86.

85. Arndt- Jovin DJ, Jovin TM, Bahr W, Frischauf AM, Marquardt M., Covalent attachment of DNA to agarose. Improved synthesis and use in affinity chromatography., Eur J Biochem. 1975 Jun;54(2):411-418.

86. Cheng MC, Wu SP, Chen LF, Chen SC., Identification and purification of a spinach chloroplast DNA-binding protein that interacts specifically with the plastid psaA-psaB-rpsl4 promoter region., Planta. 1997;203(3):373-380.

87. Gadgil H, Jarrett HW., Heparin elution of transcription factors from DNA-Sepharose columns., J Chromatogr A. 1999 Jul 2;848(1-2):131-138.

88. Maniatis T, Frisch EF, Sambrook J, Cold Spring Harbor: Molecular Cloning, 3-rd edition. 1990.

89. Vydra J, Vytasek R, Sainerova H, Mandys V, Sovova V, Hejnar J, Sloncova E, Pouckova P, Bubenik J, Novaak J, et al., A new cell line, GS, derived from a human renal cell carcinoma., Folia Biol (Praha). 1988; 34(5):308-315.

90. Bloom H, Beier H, Gross H., Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in Polyacrylamide gels., Electrophoresis. 1987, 8,93-99.

91. Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M., Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide gels., Anal Chem. 1996 Mar l;68(5):850-858.

92. Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS., Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data., Electrophoresis. 1999 Dec;20(18):3551-3567.

93. Le Tissier P, Stoye JP, Takeuchi Y, Patience C, Weiss RA., Two sets of human-tropic pig retrovirus., Nature. 1997 Oct 16;389(6652):681-682.

94. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA., Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs., Nat Med. 1997 Mar;3(3):282-286.

95. Takeuchi Y, Patience C, Magre S, Weiss RA, Baneijee PT, Le Tissier P, Stoye JP., Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus., J Virol. 1998 Dec;72(12):9986-9991.

96. Lee JH, Webb GC, Allen RD, Moran C., Characterizing and mapping porcine endogenous retroviruses in Westran pigs., J Virol. 2002 Jun;76(l l):5548-5556.

97. Gorbovitskaia M, Liu Z, Bourgeaux N, Li N, Lian Z, Chardon P, Rogel-Gaillard C., Characterization of two porcine endogenous retrovirus integration loci and variability in pigs., Immunogenetics. 2003 Jul;55(4):262-270. Epub 2003 Jun 24.

98. Wilson CA, Laeeq S, Ritzhaupt A, Colon-Moran W, Yoshimura FK., Sequence analysis of porcine endogenous retrovirus long terminal repeats and identification of transcriptional regulatory regions., J Virol. 2003 Jan;77(l): 142-149.

99. Avidan O, Loya S, Tonjes RR, Sevilya Z, Hizi A., Expression and characterization of a recombinant novel reverse transcriptase of a porcine endogenous retrovirus., Virology. 2003 Mar 15;307(2):341-357.

100. Morimoto RL, Cells in stress: transcriptional activation of heat shock genes., Science. 1993 Mar 5;259(5100):1409-1410. Review.

101. Sorger PK, Nelson HC., Trimerization of a yeast transcriptional activator via a coiled-coil motif., Cell. 1989 Dec 1;59(5):807-813.

102. Harrison CJ, Bohm AA, Nelson HC., Crystal structure of the DNA binding domain of the heat shock transcription factor., Science. 1994 Jan 14;263(5144):224-227.

103. Niyaz Y, Frenz I, Petersen G, Gehring U., Transcriptional stimulation by the DNA binding protein Hap46/BAG-1M involves hsp70/hsc70 molecular chaperones., Nucleic Acids Res. 2003 Apr 15;31(8):2209-2216.

104. Harrison CJ, Bohm AA, Nelson HC., Crystal structure of the DNA binding domain of the heat shock transcription factor., Science. 1994 Jan 14;263(5144):224-227.

105. Niyaz Y, Frenz I, Petersen G, Gehring U., Transcriptional stimulation by the DNA binding protein Hap46/BAG-1M involves hsp70/hsc70 molecular chaperones., Nucleic Acids Res. 2003 Apr 15;31(8):2209-2216.

106. Groth CG, Korsgren O, Tibell A, Tollemar J, Moller E, Bolinder J, Ostman J, Reinholt FP, Hellerstrom C, Andersson A., Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients., Lancet. 1994 Nov 19;344(8934): 1402-1404.

107. Fishman JA., Xenosis and xenotransplantation: addressing the infectious risks posed by an emerging technology., Kidney Int Suppl. 1997 Mar;58:S41-45. Review.

108. Holmes GP, Chapman LE, Stewart JA, Straus SE, Hilliard JK, Davenport DS., Guidelines for the prevention and treatment of B-virus infections in exposed persons. The B virus Working Group.

109. Clin Infect Dis. 1995 Feb;20(2):421-439.

110. Gao F, Bailes E, Robertson DL, Chen Y, Rodenburg CM, Michael SF, Cummins LB, Arthur LO, Peeters M, Shaw GM, Sharp PM, Hahn BH., Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes., Nature. 1999 Feb 4;397(6718):436-441.

111. Chapman, LE.,. Folk TM, Salomon DR., Patterson AP., Eggerman TE., Noguchi P. D., Xenotransplantation and xenogeneic infections., N. Engl. J. Med. 1995, 333:1498-1501.

112. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologies Evaluation and Research (CBER), april 1999,http ://www. fda. gov/cber/gdlns/xenoprim.pdf

113. Fishman, JA., Miniature swine as organ donors for man: strategies for prevention of xenotransplant-associated infectiuons. Xenotransplantation, 1994,1: 47-57.

114. Niemann H., Current status and perspectives for the generation of transgenic pigs for xenotransplantation., Ann Transplant. 2001;6(3):6-9. Review.

115. Lieber MM., Scherr CJ., Benveniste RE., Todaro GJ.,. Biologic and immunologic properties of porcine type C viruses. Virology 1975, 66:616-619

116. Akiyoshi DE, Denaro M, Zhu H, Greenstein JL, Baneijee P, Fishman JA., Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine., J Virol. 1998 May;72(5):4503-4507.

117. Czauderna F, Fischer N, Boller K, Kurth R, Tonjes RR., Establishment and characterization of molecular clones of porcine endogenous retroviruses replicating on human cells., J Virol. 2000 May;74(9):4028-4038.

118. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA., Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs., Nat Med. 1997 Mar;3(3):282-286.

119. Wilson CA, Wong S, Muller J, Davidson CE, Rose TM, Burd P., Type C retrovirus released from porcine primary peripheral blood mononuclear cells infects human cells., J Virol. 1998 Apr;72(4):3082-3087.

120. Le Tissier P, Stoye JP, Takeuchi Y, Patience C, Weiss RA., Two sets of human-tropic pig retrovirus., Nature. 1997 Oct 16;389(6652):681-682.

121. Takeuchi Y, Patience C, Magre S, Weiss RA, Banerjee PT, Le Tissier P, Stoye JP., Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus., J Virol. 1998 Dec;72(12):9986-9991.

122. Adler AJ, Scheller A, Robins DM., The stringency and magnitude of androgen-specific gene activation are combinatorial functions of receptor and nonreceptor binding site sequences., Mol Cell Biol. 1993 Oct;13(10):6326-6335.

123. Truss M, Bartsch J, Mows C, Chavez S, Beato M., Chromatin structure of the MMTV promoter and its changes during hormonal induction., Cell Mol Neurobiol. 1996 Apr;16(2):85-101. Review.

124. Boronat S, Richard-Foy H, Pina B., Specific deactivation of the mouse mammary tumor virus long terminal repeat promoter upon continuous hormone treatment., J Biol Chem. 1997 Aug 29;272(35):21803-21810.

125. Miksicek R, Heber A, Schmid W, Danesch U, Posseckert G, Beato M, Schutz G., Glucocorticoid responsiveness of the transcriptional enhancer of Moloney murine sarcoma virus., Cell. 1986 Jul 18;46(2):283-290.

126. Mitra D, Sikder SK, Laurence J., Role of glucocorticoid receptor binding sites in the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat in steroid-mediated suppression of HIV gene expression., Virology. 1995 Dec 20;214(2):512-521.

127. Payvar F, DeFranco D, Firestone GL, Edgar B, Wrange O, Okret S, Gustafsson JA, Yamamoto KR., Sequence-specific binding of glucocorticoid receptor to MTV DNA at sites within and upstream of the transcribed region., Cell. 1983 Dec;35(2 Pt l):381-392.

128. Ramakrishnan C., Robins DM., Steroid hormone responsiveness of a family of closely related mouse proviral elements., Mamm. Genome, 1997, 8, 811-817

129. Tonjes RR, Czauderna F, Kurth R., Genome-wide screening, cloning, chromosomal assignment, and expression of full-length human endogenous retrovirus type K., J Virol. 1999 Nov;73(ll):9187-9195.

130. Venables PJ, Brookes SM, Griffiths D, Weiss RA, Boyd MT., Abundance of an endogenous retroviral envelope protein in placental trophoblasts suggests a biological function., Virology. 1995 Aug 20;211(2):589-592.

131. Meng XJ, Purcell RH, Halbur PG, Lehman JR, Webb DM, Tsareva TS, Haynes JS, Thacker BJ, Emerson SU., A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus., Proc Natl Acad Sei USA. 1997 Sep 2;94(18):9860-9865.