Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Гоголева, Ольга Александровна

• Гоголева, Ольга Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гоголева, Ольга Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ОЧИСТКЕ ЭКОСИСТЕМ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Нефтяное загрязнение экосистем и факторы влияющие на углеводородокисляющую активность микроорганизмов

1.2. Экология и таксономическая характеристика углево-дородокисляющих бактерий

1.3. Физиологические особенности углеводородоксляю-

щих микроорганизмов

1.4. Потребление углеводородов микроорганизмами

1.5. Механизмы деградации углеводородов микроорганизмами

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Физико-географическая и гидрохимическая характеристики исследуемых водоемов

2.2. Методы выделения и оценки биологического разнообразия углеводородокисляющего бактериопланктона

2.3. Методы культивирования бактерий

2.4. Методы определения биологических свойств бактерий

2.5. Методы сокультивирования углеводородокисляю-

щих бактерий

2.6 Методы сокультивирования водорослей и бактерий

2.7 Методы статистической обработки полученных ре-

зультатов

ГЛАВА 3. ВИДОВАЯ СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕГО БАКТЕРИО-ПЛАНКТОНА ПРИРОДНЫХ ВОДОЕМОВ

3.1. Характеристика углеводородокисляющего бактерио-планктона озера Беленовское

3.2. Характеристика углеводородокисляющего бактерио-

планктона озера Рудничное

3.3 Характеристика углеводородокисляющего бактерио-планктона реки Илек

3.4. Характеристика бактерий-симбионтов зеленой одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardlii Dang

3.5. Значение каталазной активности микроорганизмов в биоценозах

ГЛАВА 4. КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДОРОДО-КИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ ПОТРЕБЛЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

4.1. Потребление нефтепродукта грампозитивными бактериями Gordona terrae ИКВС № 19, Rhodococcus rubropertinctus ИКВС № 15, Rhodococcus erythropolis

ИКВС № 11

4.2 Потребление нефтепродукта грамнегативными бактериями Acinetobacter sp.HKBC № 2122, Pseudomonas alcaligenes ИКВС № 20121

4.3. Потребление нефти Сорочинского месторождения штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter sp.HKBC №2122

4.4. Потребление нефти Бугурусланского месторождения

штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter

sp.HKBC № 2122

ГЛАВА 5 ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ,УГЛЕ-

ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

5.1. Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов

5.2. Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ОСНОВНОЙ ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Проблема поиска микроорганизмов-деструкторов актуальна, поскольку загрязнение окружающей среды сырой нефтью и продуктами ее переработки носит глобальный характер. Самоочищение водоемов от нефтяного загрязнения - сложный, многоступенчатый процесс, включающий микробную трансформацию нефти и нефтепродуктов (Миронов О.Г., 2000; Куликова И.Ю., 2005; Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B. 2006; Buckley et al., 1976).

Основным источником углеводородокисляющих микроорганизмов являются пресноводные и морские экосистемы, как загрязненных, так и незагрязненных территорий (Израэль Ю.А., Цыбань A.B., 1989; Бердичев-ская М.М., 1991; Коронелли Т.В., 1994). В плане поиска активных деструкторов, наряду с исследованием биологических свойств монокультур и ассоциаций бактерий, оценивается их способность к деструкции нефти и нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М.В., 1995; Куюкина М.С. и др., 1999; Звягинцева И.С., 2001; Плотникова Е.Г., 2001; Сопрунова О.Б., 2005; Atlas R.M. et al., 1992; Kaledine L., 1997).

В аэробных условиях разные группы микроорганизмов способны к биодеградации углеводородов, входящих в состав нефти. При этом важнейшим фактором окисления является достаточное количество кислорода, расход которого достигает 3300 г на 1 л сырой нефти (Миронов О.Г., 2002; Перетрухин И.В. и др., 2006). Несмотря на то, что для каждого микроорганизма характерен свой специфический набор ферментов и особый путь окисления углеводородов, этот процесс катализируется системами оксиге-наз и оксидаз (Готтшалк Г., 1982). Кроме того в природной среде наряду с биоокислением протекают и процессы самоокисления нефти и нефтепродуктов, которые проходят по свободно-радикальному механизму и связаны с образованием пероксидов (Петров A.A., 1984; Мочалова О.С., Антонова K.M., Гурвич Л.М., 2002; Rojo F., 2009). При этом окислительный стресс,

спровоцированный действием внешних факторов и формированием кислородных радикалов, сопровождается сильными изменениями в метаболизме бактерий, что может приводить, с течением времени, к гибели клетки (Современная микробиология ..., 2005; Белозерская Т.А., Гесслер H.H., 2006). Поэтому в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты, основанные на детоксикации активных форм кислорода с участием каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (Чеснокова Н.П., Пону-калина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006). Исходя из этого, реакция ферментных систем является важным показателем активности процесса нефтедеструк-ции.

Также известна реакция ферментных систем почв на нефтяное загрязнение. По данным Киреевой с соавторами (2001), наиболее чутко на загрязнение реагирует каталазная активность почв. Степень обогащенно-сти почв ферментами зависит, в том числе, и от микробной составляющей, однако, данные о каталазной активности микроорганизмов, входящих в состав почвенного биоценоза отсутствуют. Недостаточно изучена роль ферментов окислительного стресса в процессе микробной деструкции нефти.

Все вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования.

Цель работы. Определить значение каталазной активности углево-дородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

Основные задачи:

1. Выделить углеводородокисляющие бактерии из микробных ассоциаций водоемов с различным уровнем антропогенной нагрузки и определить их видовой состав.

2. Определить биологические свойства углеводородокисляющих бактерий выделенных из водоемов.

3. В эксперименте оценить динамику каталазной активности чистых культур и ассоциаций углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

4. Разработать способ отбора активных деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Каталазная активность способствует адаптации и выживанию бактерий, а также является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов.

2. Каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов, обладая диапазоном реакции, чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов-деструкторов.

Научная новизна. В результате исследования изучена распространенность и видовой состав углеводородокисляющих бактерий в эвтрофных и мезотрофных водоемах в зависимости от сезонной динамики и антропогенной нагрузки на них. Определены доминирующие виды планктонных углеводородокисляющих бактерий. Показано, что значительную долю в общей численности углеводородокисляющих микроорганизмов эвтрофных озерных экосистемах занимали грампозитивные бактерии (включая группу нокардиоформных актиномицет, а также роды Bacillus, Micrococcus), тогда как в мезотрофных - грамотрицательные бактерии, представленные видами рода Pseudomonas. В реке Илек, испытывающей высокую антропогенную нагрузку, видовой состав верхнего и среднего течения представлен видами группы нокардиоформных актиномицет, тогда как в нижнем течении доминировали виды Pseudomonas и Alcaligenes.

Распространенность и выраженность каталазной активности зависела от таксономической принадлежности выделенных бактерий и антропогенной нагрузки испытываемой водоемами. В мезотрофных водоемах числен-

но доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности (более 4,6 усл.ед.), по сравнению с эвтрофными (от 3,1 до 4,5 усл.ед.). Наиболее высокие значения каталазной активности были отмечены среди грамнегативных штаммов рода Pseudomonas, а среди грампози-тивных - у Xanthobacter sp.

На основании изучения биологических свойств показано, что доля углеводородокисляющих бактерий с уровнем антилизоцимной активности от 6 до 10 мкг/мл была ниже в мезотрофных водоемах и составила 20 %, по сравнению с эвтрофными (более 30%), свидетельствуя об их экологическом неблагополучии.

На модели альго-бактериальной ассоциации показано, что каталазная активность бактерий симбионтов способствовала их сохранению и выживанию.

Впервые выявлено изменение каталазной активности штаммов-деструкторов в процессе потребления углеводородов. Установлена тесная корреляционная связь между степенью снижения каталазной активности штамма-деструктора и эффективностью потребления нефти или нефтепродуктов. Разработан новый подход к отбору штаммов активных деструкторов нефти и нефтепродуктов (патент РФ № 2396340 (2010); патент РФ № 2426781 (2011)).

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения, имеющие теоретическое значение для понимания процессов биодеструкции углеводородов. Выявлено, что каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является отражением интенсивности процесса деструкции нефти микроорганизмами.

Прикладным аспектом работы является использование разработанных подходов для выбора штаммов-деструкторов нефти и нефтепродукта. Изолированы из объектов внешней среды и поддерживаются в чистой культуре 40 штаммов углеводородокисляющих бактерий. Штамм Gordona

terrae - активный деструктор нефти и нефтепродуктов, размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики (ВКПМ, г. Москва) под номером Ас-174.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006); IX Съезде Гидробиологического общества при РАН (Тольятти, 2006); 2-ом Байкальском Микробиологическом симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007); X Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009); XI Всероссийской конференции «Персистенция микрорганизмов 2009» (Оренбург, 2009); Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); школе-конференции молодых ученых «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011).

Инновационные разработки отмечены дипломами на Международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех» (Москва, 2010); Международном научно-промышленном форуме «Единая Россия» (Нижний Новгород, 2010); «Региональном молодежном инновационном конверте» (Оренбург, 2011); золотой медалью X Московского международного салона инноваций и инвестиций ( Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 работы - в изданиях рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретение: «Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов» (№ 2396340, 2010) и «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (№ 2426781,2011).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы соб-

ственных исследований, заключение, выводы, приложения. Библиографический указатель содержит 146 источников литературы, из них 114 отечественных и 32 зарубежных. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 36 рисунками, включая оригинальные микрофотографии.

Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование является фрагментом работы, проводимой в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКВС УрО РАН «Механизмы взаимодействий симбионтов в природных ассоциациях водных микроорганизмов» (№ гос. регистрации 01.20.02 16537); Ассоциативный симбиоз водных микроорганизмов и его значение в санитарной и экологической практике (№ гос. регистрации 01201067428); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» (проект № БР-9-040); Госконтракта № 9 (276/06-000874.1) с Комитетом по охране окружающей среды и природных ресурсов Оренбургской области «Экспериментальное изучение и обоснование использования факторов микробной персистенции в экологической практике».

ГЛАВА 1. УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ОЧИСТКЕ ЭКОСИСТЕМ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Развитие нефтедобывающей промышленности приводит к возрастающему поступлению в экосистемы, как сырой нефти, так и продуктов ее переработки. Нефть представляет собой сложную смесь алифатических, ароматических, сернистых, кислородных и азотистых соединений (Егоров H.H., Шипулин Ю.К., 1998; Хабиров И.К., Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х., 2001; Шамраев A.B., Шорина Т.С., 2009). Попадая в окружающую среду нефть, подвергается влиянию химических, физических и биологических факторов, изменяя при этом свои первоначальные свойства. В результате взаимодействия с окружающей средой образуются продукты окисления, которые могут быть токсичнее исходных соединений. Поэтому нефть следует рассматривать как групповой токсикант, изменяющий свою токсичность во времени (Миронов О.Г., 2000). Основные компоненты нефти по токсичности распределяются в таком порядке: к наиболее токсичным относятся ароматические углеводороды, менее токсичны циклопарафины, еще менее - олефины и на последнем месте находятся парафины (Квасников Е.И., Клюшникова Т.М., 1981; Hammel К.Е., et al., 1992). ,

1.1 Нефтяное загрязнение экосистем и факторы, влияющие на углеводородокисляющую активность микроорганизмов.

Одной из важных экологических проблем, является проблема нефтяного загрязнения пресных водоемов, которые имеют не только рыбохо-зяйственное назначение, но и служат источниками питьевой воды для населения. Требования к качеству такой воды высоки, а нефтяные углеводороды способны оказывать неблагоприятное влияние, поскольку даже при малых их концентрациях вода приобретает неприятный запах и вкус и становится непригодной для использования (Пелешенко В.И. и др., 1991; Наливайко Н.Г. и др. 2007; Шамраев A.B., Шорина Т.С., 2009).

Попавшая в водоемы нефть может переноситься течениями на сотни и тысячи километров, проникать в толщу воды, накапливаться в донных осадках и таким образом, воздействует на все группы организмов: ней-стон, планктон, нектон и бентос. Существенное влияние на доступность нефти к биодеструкции оказывает физическое состояние нефтяных углеводородов в водной экосистеме. Большинство углеводородов нефти являются плохо растворимыми соединениями и при попадании в воду образуют тонкую пленку. После растекания нефти легкие углеводороды быстро испаряются, а небольшая часть растворяется в воде. Дальнейшая трансформация, биохимическое и химическое окисление нефти и нефтепродуктов в окружающей среде зависит от степени их дисперсности. Эмульгирование углеводородов существенно изменяет их свойства (Мочалова О.С. и др., 2002; Кураков A.B. и др., 2006). При эмульгировании нефти и нефтепродуктов образуется два типа эмульсий - прямые и обратные. Прямые эмульсии типа нефть в воде более доступны для биодеградации, чем обратные эмульсии, по типу вода в нефти (Петров A.A., 1984; Миронов О.Г., 2000). Диспергированная нефть адсорбируется на взвешенных частицах и опускается на дно, где подвергается бактериальной деградации.

Способность микроорганизмов потреблять нефтяные углеводороды зависит не только от формы нахождения нефти в воде, но и от ряда других факторов, таких как температура, наличие биогенных веществ, кислорода, света. Микроорганизмы способны к потреблению углеводородов в диапазоне температур от 0° до +70°С (Логинова Л.Г. и др., 1981; Коронелли Т.В. и др., 1989). Однако скорость деградации значительна в диапазоне от 20° до 25° (Коронелли Т.В. и др., 1989; Minas W., 1986), в условиях низких температур к активному метаболизму способны бактерии, имеющие ми-коловые кислоты в составе клеточных стенок (Коронелли Т.В. и др., 1977). По данным ряда авторов, большое значение для биодеструкции имеют азот и фосфор, концентрация этих веществ является фактором ли-

митирующим скорость деструкции (Atlas R. M., Bartha R., 1972; Ladousse A., 1990). Разрушение нефтяных углеводородов на поверхности и в толще воды происходит с участием аэробных микроорганизмов с помощью ок-сигеназ и молекулярного кислорода (Готтшалк Г., 1982; Миронов О. Г., 1985; Современная микробиология ..., 2005). По данным Миронова О.Г. (2000) и Перетрухина И.В. (2006) для окисления 1л нефти в море расходуется до 3300 г кислорода. Чаще всего недостаток кислорода лимитирует биодеградацию углеводородов в придонных слоях, а анаэробное потребление нефти происходит медленно (Ward D.M. et al., 1980).

При разливах нефти на поверхности почв и грунтов происходит испарение легких фракций и просачивание жидких фракций вглубь. Дальнейшее загрязнение почв и грунтов зависит от их проницаемости и состава, а так же насыщенности водой (Логинов О.Н., 2000; Шамраев A.B., Шорина Т.С. 2009). В ненасыщенных водой почвах нефть перемещается медленнее, у нефтепродуктов скорость миграции выше. Наиболее глубоко нефть и нефтепродукты передвигаются в легких грунтах и почвах: песке, гравии, суспесях (Солнцева Н.П., 1998; Салангинас JI.A., 2003). Нефтяное загрязнение вызывает изменение почв: трансформируется структура почв, вследствие этого нарушается аэрация и возникают анаэробные условия, что в свою очередь снижает доступность углеводородов для микробной деструкции (Савкина Т. и др., 1979; Пиковский Ю.И., 1993; Колесников С.И. и др. 2006). Подавление процессов деструкции нефти наблюдается при сдерживании процесса аммонификации и нитрификации, возникающее при снижении содержания подвижного фосфора в почвах (Исмаилов Н.М., 1988; Алексеева Т.П. и др., 2000).

Таким образом, в процессе самоочищения окружающей среды от нефти и нефтепродуктов большую роль играют физико-химические процессы, именно они способствуют изменениям нефтяных углеводородов в

среде и определяют их доступность для микроорганизмов, что делает возможной дальнейшую биодеструкцию.

1.2. Экология и таксономическая характеристика углеводородо-

кисляющих бактерий

Большинство микроорганизмов способно в той или иной мере к потреблению углеводородов, это связано с наличием у них ферментов группы оксидаз. Однако основной вклад в процесс микробиологического разрушения углеводородов нефтяного происхождения вносят микроорганизмы, способные использовать нефть и нефтепродукты в качестве источника углерода и энергии. Такие микроорганизмы встречаются, главным образом, среди аэробных форм, они получили название «углеводородокисляю-щие микроорганизмы» (Израэль Ю.А., Цыбань A.B. 1989; Патин С.А. 1997; Современная микробиология ..., 2005; Кураков A.B. и др., 2006). Уг-леводородокисляющие микроорганизмы не являются узкоспециализированной группой, они используют и другие органические вещества, и присутствуют как в загрязненных, так и в незагрязненных водах и почвах. От других членов гетеротрофного сообщества они отличаются наличием комплекса ферментов, окисляющих углеводороды и способностью к поглощению гидрофобного субстрата. К ним относят около 70 родов микроорганизмов, включающих 28 родов бактерий (свыше 100 видов), 30 видов грибов и 12 видов дрожжей, окисляющих один или несколько углеводородов (Нестеренко О. А. и др., 1985; Коронелли Т.В. 1996а; Иванов В.П., Сокольский А.Ф. 2000).

Способность углеводородокисляющих бактерий использовать помимо углеводородов, широкий спектр органических субстратов, обуславливает их широкое распространение в природных микробиоценозах (Милько Е.С., Егоров Н.С., 1991; Барышникова JIM. и др., 1994; Зайцева Т.А. и др. 2010; Buckley et al., 1976). Загрязнение биоценоза нефтяными углеводородами вносит дополнительный источник углерода в экосистему, что стиму-

лирует развитие группы углеводородокисляющих бактерий, а именно способствует увеличению их численности, чем и обусловлен эффект очищения биотопа (Рубцова С.И., 2002; Шамраев A.B., Шорина Т.С., 2009). Именно этим объясняется тот факт, что в хронически загрязненных нефтяными углеводородами экосистемах, численность углеводородокисляющих бактерий всегда выше по сравнению с не загрязненными. Соответственно, меняется и доля данной группы от численности гетеротрофных бактерий, варьируя от 0,1 до 100% (Atlas R.M., 1981). Ряд исследователей (Ward D.M. et al., 1980; Brock T.D., 1966) указывает, что при аварийных разливах нефти в акваториях низкая исходная численность углеводородокисляющих бактерий может выступать в качестве фактора, лимитирующего скорость биодеградации. Распространение данной группы бактерий, равно как и других гетеротрофных микроорганизмов, обеспечивается одними теми же факторами, а именно температурой, доступностью источников углерода, биогенных веществ, кислорода, а также кислотностью среды и подвержено широтно-географической и сезонной изменчивости. Для акваторий наиболее значимы первые два фактора, тогда как для почвы значимы все (Кура-ков A.B. и др., 2006; Коронелли Т.В. и др., 1989).

Таксономический состав водных углеводородокисляющих бактерий очень разнообразен, описано 28 родов бактерий и 14 родов грибов (Бутаев A.M., Кабыш Н.Ф., 2002; Bartha R., Atlas R.M., 1977). В составе углеводо-родокисляющей микрофлоры чаще всего встречаются: Rhodococcus, No-cardia, Corynebacterium, Frankia, Nocardiopsis, Brevibacterium, Actino-madura, Mycobacterium, Pseudonocardia, Pseudomonas, Acinetobacter, дрожжи рода Candida, Rhodotorula, Trichosporom, мицелиальные грибы Aspergillus, Penicillum, Gunninghamella, Cladosporum (Миронов О.Г., 1999; Павлова O.H. и др., 2008).

В почвах углеводородокисляющие микроорганизмы представлены, в основном, бактериями и грибами. Описано 22 рода бактерий, 19 родов

дрожжей и 24 рода микроскопических мицелиальных грибов (Мурзакова Г.Б. и др. 1992; Хомякова Д.В. и др. 2002; Atlas R.M. et al., 1992). Типичными обитателями почв являются виды родов Pseudomonas, Arthrobacter, Mycobacterium, Brevibacterium, Rhodococcus, Bacillus, Nocardia, Achromo-bacter, Micrococcus, Klebsiella, Enterobacteriaceae, Mycobacterium, Beier-inckia, Alcaligenes, Corynebacterium, Xanthomonas и др. (Квасников Е.И., Кривицкий И.П. 1968; Сидоров Д.Г. и др., 1997; Киреева Н.А., Ямалетди-нова Г.Ф., 2000; Ткебучаева Л.Ф. и др., 2004; Сопрунова О.Б., 2005). Таксономический состав углеводородокисляющих почвенных бактерий зависит не только от типа почв, но и от характера природной растительности. Например, для северных, высокогорных и примитивных почв характерно преобладание Rhodococcus (Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., '1982; Коро-нелли Т.В. и др., 1997), в тундровых почвах Крайнего Севера доминируют представители родов Cytophaga, Rhodococcus, Arthrobacter (Хомякова Д.В., 2003), в арктических почвах, песках и горных породах доминирует род Arthrobacter (Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., 1986). Из почв, загрязненных нефтяными углеводородами, также выделяются спорообразующие бактерии рода Bacillus, аспорогенные дрожжи родов Rhodotorula и Candida, микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillum, Mucor и другие (Квасников Е.И., Клюшникова Т.М., 1981; Киреева Н.А. и др., 2001; Плотникова Е.Г. и др., 2001; Kaledine L., 1997).

Несмотря на то, что по данным Ильинского В.В. (2000), Куракова А.В. и др. (2006), Atlas R.M. (1991) количественная связь между численностью углеводородокисляющих бактерий и количеством нефтяных углеводородов в среде отсутствует, представлены сведения, что состав доминирующих родов углеводородокисляющих бактерий в биоценозах зависит от природы нефтепродукта. Так, Коронелли Т. В. (1996а) указывает, что для загрязненных экосистем характерно доминирование видов рода Rhodococcus, Pseudomonas, Acinetobacter и Arthrobacter. В хронически загрязненных

экосистемах безусловным доминантом являются Rhodococcus, а остальные виды занимают второстепенное положение (Бердичевская М.В. и др., 1984; Belyaev S.S. et al.,1993).

При загрязнении биотопа нефтью или нефтепродуктами происходит постепенная смена доминантов микробного сообщества. Например, по данным Sorkhoh N.A. с соавторами (1990) в пробах почвы, взятых на территории Кувейта и Саудовской Аравии, в первые недели доминируют микроорганизмы вида Rhodococcus sp., затем Bacillus sp. и Arthrobacter sp., в конце третьей недели появляются Pseudomonas sp. и Streptomyces sp.

Ильинский B.B. с соавторами (1998) на примере углеводородокис-ляющих бактерий Можайского водохранилища показал, что при загрязнении водоема дизельным топливом на начальных этапах деструкции доминировали виды Acinetobacter sp., Arthrobacter sp., затем их сменяли микроорганизмы вида Rhodococcus sp., через четыре недели к ним присоединялись псевдомонады {Pseudomonas sp.), которые сохраняли свое доминантное положение к концу эксперимента (через два месяца). Эти же исследователи наблюдали некоторые отличия доминирующих комплексов при внесении в природную воду нефти. В данном случае, на первой неделе доминировали виды Rhodococcus sp. и Arthrobacter sp., затем в сообществе преобладал вид Pseudomonas sp.. К концу эксперимента (через полтора месяца) в углеводородокисляющем сообществе доминировали виды Acinetobacter sp. и Arthrobacter sp.

Таким образом, можно отметить, что в загрязненных экосистемах ведущая роль по деструкции углеводородов нефтяного происхождения, главным образом, принадлежит бактериям, в частности грампозитивной группе нокардиоформиных бактерий, а также грамнегативным бактериям родов Pseudomonas, Acinetobacter. Это связано, в первую очередь, с физиологическими особенностями данных групп бактерий.

1.3 Физиологические особенности углеводородокисляющих бактерий

Способность к поглощению углеводородных субстратов связана с особенностями строения и метаболитической организации бактерий. Поскольку в процессе окисления углеводородов важную роль играет прямой контакт клеток с субстратом, мнение большинства исследователей сходится на том, что способность или неспособность микроорганизмов поглощать углеводороды зависит от состава и строения клеточной стенки и, в первую очередь, определяется присутствием гидрофобной клеточной поверхности (Красильников H.A. и др., 1973; Нестеренко O.A. и др., 1985; Коронелли Т.В., 1996; Кукжина М.С. и др., 2000). Строение клеточной стенки и физиологические особенности углеводородокисляющих бактерий рассматривается на примере группы нокардиоформных актиномицет, которая, по мнению ряда исследователей, является перспективной для поиска новых штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, а также для био-ремедиации почв и водоемов, очистки сточных вод загрязненных нефтью и нефтепродуктами (Сидоров Д.Г. и др., 1997; Сопрунова О.Б., 2005; Коновалова Е.И.и др., 2009; Ленева H.A. и др., 2009; Шумкова Е.С. и др., 2009). Это определяется тем, что нокардиоформные микроорганизмы широко распространены в природе и характеризуются биохимической пластичностью (Ившина И.Б. и др., 1995; Звягинцева И.С. и др., 2001). Они играют важную роль в процессах почвообразования, обогащая биоценоз витаминами и различными другими физиологически активными соединениями (Нестеренко O.A., Квасников E.H., Ногина Т.М., 1985). Нокардиоформные бактерии способны эмульгировать и деградировать различные углеводороды, что в значительной степени обусловлено особенностями строения их клеточной оболочки (Волченко H.H. и др., 2007). Клеточная стенка бактерий данной группы в силу своей липофильности имеет высокое сродство к гидрофобным субстратам (Коронелли Т.В., 1996; Серебрякова Е.В. и др., 2002). Нестеренко O.A. (1985) предложено классифицировать клеточные

стенки нокардиоформных актиномицет в зависимости от химического состава на IX типов (табл. 1).

Табл. 1 - Типы клеточных стенок нокардиоформных бактерий по Нестеренко O.A. (1985)

Тип клеточной стенки Диагностический компонент Представители

I тип ЬЬ-диаминопимелиновая кислота (ДПК), глицин Arachnid sp., Nocardioides sp. и др.

II тип Мезо-ДПК иногда окси-ДПК, глицин Micromonospora sp.

III тип Мезо-ДПК Frankia sp. , Nocardiopsis sp., Brevibacterium sp., Actinomadura sp.

IV тип Мезо-ДПК, арабиноза, галактоза Mycobacterium sp., No-cardia sp., Pseudonocar-dia sp, Rhodococcus sp. и др.

V тип Лизин, орнитин Actinomyces israelii

VI тип Лизин (иногда и аспараги-новая кислота, галактоза) Actinomyces bovis, некоторые Oerskovia sp., Ar-throbacter sp. и др.

VII тип 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК), глицин иногда лизин Agromyces sp., Coryne-bacterium aquaticum, C. nebraskense, Microbacte-rium sp.

VIII тип Орнитин Cellulomonas sp., Curto-bacterium sp.

IX тип Мезо-ДПК и другие АМК Mycoplana sp.

В группе нокардиоформных актиномицет, содержащих в наружной части клеточной оболочки пептидолипиды, выделяется подгруппа бактерий, клеточная стенка которых содержит миколовые кислоты (I - IV тип клеточной стенки).

Клеточная стенка этих бактерий гетерогенна и включает как насыщенные, moho-, ди-, три- и тетраеновые соединения с различной молекулярной массой, так и свободные миколовые кислоты (Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Ногина Т.М., 1985; Определитель бактерий Берджи ...,

1997). Ранее Lechevalier М.Р. с соавторами (1971) было показано, что с возрастом количество миколовых кислот увеличивается и их состав меняется в зависимости от среды на которой выращивались бактерии. Позднее было установлено, что перенос миколовых кислот от места их биосинтеза в клеточную стенку осуществляется через образование моно- и диэфиров с трегалозой (Милько Е.С., Егоров Н.С., 1991; Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В., 1995; Takayama К., Armstrong E.L., 1977). Кроме того, клеточные стенки нокардиоформных актиномицет содержат простые жирные кислоты, гликолипиды, корд-фактор и его аналоги, фосфолипиды, нейтральные липиды.

Отмечается высокое функциональное назначение миколовых кислот, являющихся специфическими и обязательными структурными компонентами клеточных стенок I - IV типов. Как правило, подавление их синтеза ведет к потере клетками способности к окислению углеводородов, поскольку они непосредственно обеспечивают транспорт молекул углеводородов внутрь клетки (Коронелли Т.В., Калюжная Т.В., 1983).

У большинства нокардиоформных бактерий клеточная ртенка представляет собой мощное липофильное образование, подобного которому нет у других бактерий (Коронелли и др., 1986). Большое значение имеет содержание в ней липидов, которые играют ведущую роль в процессе потребления углеводородов. Благодаря липидам обеспечивается прямой контакт клетки с субстратом, а также солюбилизация и поглощение углеводородов (Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М., 1985; Коронелли Т.В., Калюжная Т.В., 1983; Коронелли Т.В., 1996; Сопрунова О.Б., Клюя-нова М.А., 2007). Ряд авторов отмечает, что количество клеточных липидов способно увеличиваться при культивировании клеток на углеводородном субстрате (Коронелли Т.В. и др., 1995; Куюкина М.С. и др., 2000).

Кроме того, известно, что при выращивании нокардиоформных бактерий на углеводородном субстрате происходят не только химические, но

и морфологические изменения клеток: они укрупняются, в клеточной стенке образуются специфические каналы, через которые проникают углеводороды. Изменяется структура клеточной мембраны - увеличивается толщина фосфолипидного бислоя, его текучесть и активность локализованных в мембране ферментов и транспортных белков (Sikkema J., De Bont J.A.M., Poolman В., 1995; Елькин A.A., 2011). У отдельных видов обнаружены фибриллы и шишковидные выросты (Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М., 1985; Коронелли Т.В., 1996; ИвшинаИ.Б. и др., 1982).

Таким образом, способность к поглощению углеводородов нефти тесно связана с морфологическими и физиологическими особенностями бактерий. Клеточная стенка углеводородокисляющих бактерий имеет высокое сродство к углеводородным субстратам, что обеспечивается высоким содержанием липидов, количество которых увеличивается по мере потребления нефти и нефтепродуктов, а также миколовых кислот.

1.4 Потребление углеводородов микроорганизмами

Углеводородокисляющая активность бактерий напрямую зависит от их способности поглощать гидрофобный субстрат. Бактерии, способные использовать углеводороды в качестве источника углерода и энергии, в ходе эволюции выработали особые приспособления для поглощения нерастворимых в воде соединений. К ним относятся: образование гидрофобной клеточной стенки, формирование в клеточной стенке липофильных каналов, выделение в среду биоэмульгатора (Коронелли Т.В., 1996а; Со-прунова О.Б., Клюянова М.А., 2007).

Образование гидрофобной клеточной стенки характерно для бактерий, осуществляющих поглощение углеводородов путем пассивного переноса (Коронелли Т.В., 1996). К таким бактериям относятся нокардиоформ-ные бактерии, в клеточных стенках которых содержатся миколовые кислоты, такие как Rhodococcus, Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium,

Caseobacter, Gor dona. Гидрофобизация клеточных стенок этих бактерий достигается путем синтеза специфических соединений. Основной липид-

V/ w u ^

нои единицеи этих соединении являются миколовые кислоты, которые образуют сложные эфиры с гидроксогруппами углеводов и пептидов, в результате образуются липофильные глико-, пептидо- и пептидогликолипи-ды. Углеводороды проникают в клетку таких микроорганизмов путем пассивной диффузии, постепенно пропитывая клеточную стенку достигая, таким образом, участков мембраны с расположенными на ней ферментами, окисляющими углеводороды (Коронелли Т.В., 1996; Кураков A.B. и др., 2006).

Наряду с пассивной диффузией углеводорода, возможно его проникновение через особые ультрамикроскопические поры. Такие каналы, заполненные электроноплотным веществом, были впервые обнаружены у дрожжей (Козлова Т.М. и др., 1973). Позднее подобные образования были замечены также у видов рода Arthrobacter, растущих на средах содержащих углеводороды (Коронелли Т.В., 1984). Описано, что виды рода Arthrobacter наряду с формированием каналов осуществляют и гидрофоби-зацию клеточной стенки. Они не имеют специфических клеточных липи-дов, как группа нокардиоформных актиномицет, но при росте на среде с н-алканами образуют большое количество нейтральных липидов — триглице-ридов и восков, которые синтезируются одновременно с нарастанием клеточной массы и откладываются во внешних слоях клетки (Коронелли Т.В., 1996а). Одновременно с этим, при росте на нефти или нефтепродукте у видов рода Arthrobacter клеточная стенка заполняется липополисахаридом, который частично выходит наружу и способствует растворению углеводородов, что облегчает их проникновение в клетку (Коронелли Т.В., 1984).

Выделение в среду биоэмульгатора характерно для бактерий родов Pseudomonas и Acinetobacter (Коронелли Т.В., 1996; Сопрунова О.Б., Клюянова М.А., 2007). Эти микроорганизмы не имеют толстой гидрофоб-

ной клеточной стенки подобно Rhodococcus и родственным ему видам, имеющим в составе клетки миколовые кислоты. Гидрофильная клеточная стенка Pseudomonas и Acinetobacter бедна липидами, гидрофобные углеводороды не могут проникнуть через этот барьер. Выделяя во внешнюю среду биоэмульгатор, эти микроорганизмы снижают гидрофобность углеводородов и способствуют их солюбилизации. Эмульгатор Pseudomonas представляет собой пептидогликолипид, в состав которого входят нормальные жирные кислоты, рамноза и аминокислоты. Напротив, эмульгатор Acinetobacter состоит из D-галактозамина, аминоуроновой кислоты и жирных кислот, присоединенных к гетерополисахаридному скелету (Hisatsuka К. and el., 1977).

Таким образом, на этапе поглощения углеводородов микроорганизмы, имеющие в составе клеточной стенки миколовые кислоты (Rhodococcus, Corynebacterium, Nocardia и др.) имеют преимущество, так как поглощают субстрат всей поверхностью клетки и этот процесс не требует затрат энергии.

1.5. Механизмы деградации углеводородов микроорганизмами

Существует мнение, что наиболее интенсивно биотрансформация углеводородов протекает в аэробных условиях (Готтшалк Г., 1982; Миронов О.Г., 2000; Кураков A.B. и др., 2006). В этих условиях важнейшим фактором бактериального окисления нефти является достаточное количество кислорода. Например, известно, что для окисления 1л нефти в море расходуется до 3300 г кислорода (Миронов О.Г., 2002; Перетрухин И.В. и др., 2006). Так же скорость биодеградации нефти и нефтепродуктов зависит от степени их дисперсии в воде, так как при этом увеличивается поверхность контакта бактерий с нефтью, что создает благоприятные условия для ее окисления. Кроме того, микробная трансформация углеводородов зависит от их физико-химических свойств - растворимости, способно-

сти к эмульгированию, величине поверхностного натяжения, а так же и от биологических факторов, таких как ферментативная активность микроорганизмов, реакционная способность субстрата (Миронов О.Г., 1985, 2002; Кураков A.B. и др., 2006).

Окисление углеводородов катализируется системами оксигеназ и ок-сидаз, при этом для каждого микроорганизма характерен свой специфический набор ферментов и особый путь окисления углеводородов (Готтшалк Г., 1982). Скорость биодеградации углеводородов, зависящая от их строения, уменьшается в ряду: нормальные алканы —» простые ароматические углеводороды (бензол, толуол и т.д.) —► разветвленные алканы —> циклоал-каны —> изопреноиды —> конденсированные полиароматические соединения (Жуков Д.В. и др., 2006; Hammel К.Е et ei., 1992).

Наиболее легко микробной деструкции подвергаются углеводороды алифатического ряда. Большое значение для использования алифатических углеводородов имеет длина цепи: чем длиннее цепь, тем больше микроорганизмов способны использовать эти соединения (Современная микробиология ..., 2005; Шамраев A.B., Шорина Т.С., 2009). В большинстве случаев их деградация начинается с окисления терминальной метильной группы. Различают моно-, дитерминальный и субтерминальный путь окисления углеводородов данной группы.

В случае монотерминального пути деградация алифатических углеводородов начинается с окисления концевой метильной группы в первичную спиртовую группу, окисление катализируется монооксигеназой (гид-ролазой), полученный первичный спирт затем окисляется до альдегида, а в последующем, до соответствующих жирных кислот, которые затем разлагаются путем ß-окисления или непосредственно используются клеткой в качестве строительного материала (Готтшалк Г., 1982).

Известен другой, так называемый «дитерминальный путь или путь Финнерти», при котором алканы окисляются до альдегидов через образо-

вание гидропероксидов, минуя стадию образования спиртов и кислородных радикалов, как это наблюдается при действии монооксигеназ. По такому пути могут окислятся н-алканы с длиной цепи Сю-Сзо и алкены с длиной цепи С12-С20 (Maeng J.H. et el., 1996; Rojo F., 2009).

Существует субтерминальное окисление алканов, которое происходит с помощью монооксигеназ с образованием вторичного спирта (Современная микробиология..., 2005).

К аэробной деструкции алифатических углеводородов способны микроорганизмы родов Pseudomonas, Rhodococcus, Arthrobacter, Acineto-bacter, Mycobacterium и многие другие (Нестеренко О.В. и др., 1985; Espuny et el., 1996).

Долгое время считалось, что окисление углеводородов возможно только в исключительно аэробных условиях (Готтшалк Г., 1982). В настоящее время открыты микроорганизмы, способные к анаэробной деструкции углеводородов. Анаэробная деградация н-алканов, главным образом, происходит в условиях нитратредукции, сульфатредукции и метано-генеза (Rueter et ai., 1994; So C.M., Yong L.Y., 1999; Zenger et al., 1999; Anderson R. Т., Lovley D. R. 2000; Ehrenreich et al., 2000).

Наиболее трудно окисляемыми являются циклические соединения, большей частью они окисляются микроорганизмами путем соокисления или кометаболизма. Например, к утилизации циклоалканов сцособны некоторые микроорганизмы родов Gordona, Xanthobacter и др. Они имеют специфические ферментные системы, отличные от ферментных систем, использующихся микроорганизмами для окисления других алканов (Cheng Q. et el., 2000; Tadashi F. et el, 2004).

Рис. 1 - Основные пути окисления углеводородов аэробными и анаэробными микроорганизмами.

Структура ароматических соединений очень устойчива к разрыву кольца. Аэробные и анаэробные микроорганизмы выработали две стратегии для разрушения ароматической структуры. Аэробные микроорганизмы окисляют ароматическое кольцо до гидрооксиароматических соединений (катехолов или гидрохинонов) с последующим разрывом кольца по пути орто- или метарасщепления (Современная микробиология ..., 2005; Жуков Д.В. и др., 2006). Анаэробные микроорганизмы восстанавливают ароматическое кольцо с его дальнейшим разрывом (Rabus R. et el., 2002; Young L.Y., Phelps C.D., 2005).

Наиболее опасными при попадании в природную среду являются полиароматические соединения, это обусловлено их токсическим, канцерогенным и мутагенным действием на организмы, а так же они очень медленно подвергаются микробной деструкции (Leahy J.L., Colwell R.R., 1990; Heath DJ. et el, 1997).

Несмотря на подробное изучение возможных путей метаболизма углеводородов различными бактериями (Жуков Д.В. и др., 2006; Rojo F., 2009; Плешакова Е.В., Голубев С.Н., Турковская О.В., 2007), очень мало сведений об изменениях ферментной активности углеводородокисляющих бактерий, участвующих в этом процессе. Из литературы известно, что процесс деструкции на начальном этапе невозможен без оксигеназ, в дальнейшей деструкции принимают участие различные дегидрогеназы (Моча-лова О.С., Антонова Н.М., Гурвич Л.М., 2002; Современная микробиология ..., 2005; Жуков Д.В. и др., 2006). В процессе бактериальной деструкции углеводородов образуются кислородные радикалы, в частности, пе-роксиды (Готтшалк Г., 1982; Жуков Д.В. и др., 2006; Rojo F., 2009). Ряд авторов отмечает, что в природной среде наряду с биоокислением протекают и процессы самоокисления нефти и нефтепродуктов (Солнцева Н.П., 1988; Миронов О.Г., 2002). Процессы самоокисления связаны с образованием пероксидов, так как протекают по свободно-радикальному механизму и

являются цепной реакцией, при этом накопление пероксидов в среде ускоряет процесс окисления (Петров A.A., 1984; Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич JI.M., 2002; Rojo F., 2009). Пероксид водорода является одной из разновидностей активных форм кислорода и может стать причинои развития окислительного стресса (Чистяков В.А., 2008; Полесская О.Г., 2007). Окислительный стресс, спровоцированный действием внешних факторов и формированием кислородных радикалов, сопровождается сильными изменениями в метаболизме бактерий, что с течением времени может привести к гибели клетки (Современная микробиология ..., 2005; Белозерская Т.А., Гесслер H.H., 2006). Защита клетки от повреждающего действия активных форм кислорода осуществляется с помощью ферментов. В ферментативной детоксикации перекисей принимают участие каталазы (Современная микробиология ..., 2005; Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Би-зенкова М.Н., 2006). Однако в литературе отсутствуют данные об изменении каталазной активности углеводородокисляющих бактерий при потреблении нефти и нефтепродуктов, что и явилось побудительным мотивом

для проведения настоящего научного исследования.

* *

*

Таким образом, биодеструкция нефти и нефтепродуктов в природной среде протекает с участием микроорганизмов. Видовой состав микроорганизмов-деструкторов очень разнообразен, но наиболее широко распространены в различных экосистемах бактерии, способные к потреблению нефтяных углеводородов в качестве единственного источника углерода и энергии. Углеводородокисляющие бактерии имеют комплекс ферментов, окисляющих углеводороды и способны к поглощению гидрофобного субстрата, все это определяет эффективность деструкции углеводородов нефти. Различные виды нефти и нефтепродуктов существенно различаются по

устойчивости к микробной атаке, и разные микроорганизмы имеют различные ферментные системы и метаболитические пути потребления углеводородов. Наибольшее значение в природных экосистемах имеет аэробное потребление углеводородов. При аэробной трансформации углеводородов на начальном этапе происходит превращение субстрата с участием оксигеназ и кислорода, при этом происходит образование кислородных радикалов (Жуков Д.В. и др., 2006; Maeng ег е1., 1996). Процессы бактериального окисления углеводородов протекают одновременно с физико-химическим окислением нефти или нефтепродукта, при котором также образуются активные формы кислорода и, в частности, перекиси, которые, накапливаясь, ускоряют процессы самоокисления.

Углеводородокисляющие бактерии в процессе потребления углеводородов в природной среде находятся в условиях взаимодействия с активными формами кислорода и, в частности, с перекисью водорода. Однако в литературе отсутствуют данные о защите углеводородокисляющих бактерий от активных форм кислорода в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов и, в частности от перекиси водорода. Это и явилось предпосылкой для проведения данного исследования.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Гоголева, Ольга Александровна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из подходов к решению проблемы широкомаштабного загрязнения окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки является использование микроорганизмов-деструкторов для очистки загрязненных экосистем (Израэль Ю.А., Цыбань A.B. 1989; Патин С.А. 1997).

Углеводородокисляющие микроорганизмы это постоянный компонент природного биоценоза, не являясь узкоспециализированной группой, они участвуют в разложении органического вещества в процессе естественного самоочищения экосистемы, и присутствуют как в загрязненных, так и в незагрязненных водах и почвах. От других компонентов гетеротрофного сообщества они отличаются наличием комплекса ферментов окисляющих углеводороды и способностью к поглощению гидрофобного субстрата (Коронелли Т.В. и др., 1989; Кураков A.B., и др., 2006; Павлова О.Н. и др., 2008; Зайцева Т.А. и др., 2010). Все это обеспечивает им преимущество над остальными группами микроорганизмов при загрязнении среды нефтью и нефтепродуктами.

Исходя из этого, углеводородокисляющие сообщества наземных экосистем являются источником новых аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти или нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М.В. 1995; Звягинцева И.С. 2001, Плотникова Е.Г. 2001; Куликова И.Ю. 2005, Сопрунова О.Б. 2005).

В изучаемых водоемах присутствовали как грампозитивные, так и грамнегативные углеводородокисляющие бактерии. За период исследования нами было обнаружено 34 вида углеводородокисляющих бактерий. Наибольшее разнообразие в составе углеводородокисляющего бактерио-планктона среди исследованных лентических водоемов было характерно для озера Беленовское, а наименьшее - для озера Рудничное. Среди углеводородокисляющих бактерий как загрязненных так и не загрязненных озерных экосистем, доминировали грамотрицательные микроорганизмы, представленные видами рода Pseudomonas (Бердичевская М.В. и др., 1984; Коронелли Т.В., 1996; Миронов О.Г., 1999, 2000; Кураков A.B. и др., 2006; Belyaev S.S. et al., 1993). В озере Беленовское отмечена высокая доля угле-водородокисляющих бактерий в общей численности гетеротрофного бак-териопланктона и большая доля грампозитивных бактерий, среди которых присутствует группа нокардиоформных актиномицет.

На разных участках реки Илек отмечено присутсвие в бактерио-планктоне углеводородокисляющих бактерий. В верхнем и среднем течении реки доминировали бактерии группы нокардиоформных актиномицет, а в нижнем течении - виды рода Pseudomonas. Присутствие в гетеротрофном бактериопланктоне группы нокардиотрофных актиномицет свидетельствует о поступлении в водоем нефтепродуктов. Индикаторная значимость этой группы углеводородокисляющих бактерий подтверждается рядом исследователей (Рубцова С.И. 2002; Коронелли Т.В., 1996а; Миронов О.Г., 1970), показавших, что присутствие в воде этих микроорганизмов позволяет судить о наличии в воде нефти или нефтепродуктов. Кроме того, по берегам р. Илек в верхнем течении располагаются крупные населенные пункты и промышленные предприятия, являющиеся по официальным данным, источниками загрязнения вод, в том числе и нефтепродуктами (Государственный доклад ., 2010), что напрямую подтверждают'результаты микробиологических исследований.

Численность и разнообразие углеводородокисляющих бактерий в пресноводных экосистемах подвержено сезонной изменчивости, под влиянием смены температурного режима, а также динамики содержания биогенных веществ, что согласуется с данными других исследователей (Мар-цинкевич С.Я., 1983; Кураков A.B. и др., 2006; Delille D., Valliant N., 1990).

Тем не менее, наиболее показательным периодом, свидетельствующим о загрязнении водоема нефтью и нефтепродуктами, является зима. Установлено, что в зимний период в эвтрофном оз. Беленовское, доминировал штамм Pseudomonas putida. Одновременно в бактериопланктоне ме-зотрофного водоема (оз. Рудничное) углеводородокисляющие бактерии не выявлены. В реке Илек, подверженной антропогенной нагрузке, в зимний период преобладали грамнегативные бактерии с доминированием по численности видов рода Pseudomonas. Высокая численность углеводородо-кисляющих бактерий в зимний период косвенно свидетельствует о присутствии углеводородов в экосистеме (Миронов О.Г. и др., 1985; Atlas R.M. et al., 1978).

Ранее для пресноводных экосистем были описаны функциональные взаимодействия «лизоцим-антилизоцим» и «перекись водорода-каталаза бактерий» (Бухарин О.В., Немцева Н.В. 2002; 2003; Игнатенко М.Е., 2008), которые не изучены применительно к углеводородокисляющим микроорганизмам. Среди выделенных углеводородокисляющих бактерий антили-зоцимная активность встречалась только у грамнегативных изолятов, тогда как каталазная активность была характерна для всех изученных культур микроорганизмов. По нашим данным, распространенность и выраженность антилизоцимной активности углеводородокисляющих бактерий была выше в эвтрофных водоемах (озеро Беленовское, река Илек), чем в мезо-трофном (озеро Рудничное). Учитывая, что по данным ряда авторов анти-лизоцимная активность служит диагностическим признаком для оценки санитарного состояния водоемов (Немцева Н.В., 1998; Бухарин О.В., Немцева Н.В., 2008), то присутствие видов с антилизоцимной активностью в углеводородокисляющем бактериоценозе, может также указывать на не благополучное экологическое состоянии водоемов.

При изучении каталазной активности выявлено, что в эвтрофных экосистемах (озеро Беленовское, река Илек) численно преобладали углеводородокисляющие штаммы со значениями каталазной активности от 3,0 до 4,5 усл.ед., а в мезотрофном оз. Рудничное численно доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности от 4,5 до 6,0 усл.ед.

В альго-бактериальной ассоциации зеленой водоросли Chlamydomo-nas reinhardtii выявлены бактерии симбионты с уровнем каталазной активности от 3,4 до 4,0 усл.ед., оказывающие на водорослевые клетки рост стимулирующее влияние, выражающееся в увеличении скорости роста более чем в два раза и более длительном сохранении культуры водоросли. Показано, что высокий уровень каталазной активности бактерий-симбионтов обеспечивает их сохранение в альгосообществе. Аналогичные данные, подтверждающие значение высокого и среднего уровня каталазной активности бактерийных симбионтов для выживания и поддержания симбиотических связей с различными водорослями были получены Игна-тенко М.Е. (2008).

Известно, что в процессе окисления углеводородов образуются пе-роксиды (Петров A.A., 1984; Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B., 2006), в детоксикации которых участвует каталаза (Полесская О.Г., 2007). В результате проведенных исследований было установлено, что для бактерий активных деструкторов в присутствии нефти и нефтепродуктов характерно увеличение численности и снижение каталазной активности. В то же время, у бактерий не способных использовать нефтяные углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии, численность и ка-талазная активность практически не изменяются, оставаясь на уровне близком к исходному. Аналогичные данные получены и при исследовании ассоциации углеводородокисляющих бактерий Acinetobacter sp. и G. terrae, имеющих разные подходы к потреблению углеводородов. Было показано, что при совместном потреблении нефти Сорочинского и Бугурусланского месторождений на начальном этапе доминировал грамнегативный штамм {Acinetobacter sp.), тогда как грампозитивный штамм (G. terrae) доминировал после 12 суток. Наблюдаемое явление, вероятно, связано с разной стратегией потребления углеводородов. Известно, что особенности строения клеточной стенки G. terrae обеспечивают поглощение углеводородов путем пассивной диффузии и окисление углеводородов начинается после полного пропитывания клеточной стенки бактерий. Acinetobacter sp. в силу особенностей строения не имеет толстой гидрофобной клеточной стенки подобно G. terrae, поэтому для этих микроорганизмов присущ другой тип стратегии. Они выделяют во внешнюю среду биоэмульгатор, для снижения гидрофобности углеводородов и способствуя их солюбилизации (Коронел-ли Т.В., 1996; Кураков A.B. и др., 2006; Hisatsuka К. and el., 1977).

Обнаруженное нами последовательное доминирование микроорганизмов при деструкции нефти и нефтепродуктов согласуется с данными Ильинского В.В. с соавторами (1998), полученными при исследовании уг-леводородокисляющего сообщества Можайского водохранилища.

В результате проведенного исследования была установлена прямая зависимость между уровнем каталазной активности бактерий-деструкторов и содержанием нефти или нефтепродукта в субстрате. Ранее подобная зависимость была найдена между уровнем каталазной активности почвы и содержанием в ней нефтепродуктов. При этом нефтяное загрязнение почв приводило к снижению их ферментативной активности. (Киреева H.A., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M., 2001; Киреева Н.В. и др., 2006; Киреева H.A., Кабиров Т.Р., Дубовик И.Е. 2007; Сулейманов P.P. с соавторами, 2008). Представленные данные касаются суммарной каталазной активности почв без учета активности микробной компоненты. Выявленная нами роль каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти вносит существенный вклад в понимание формирования суммарной каталазной активности почв при нефтедест-рукции, что имеет существенное значение для развития теории самоочищения почв.

В работе выявлен эффект снижения каталазной активности бактерий на фоне одновременного увеличения их численности, наблюдаемый в условиях накопления активных форм кислорода. Учитывая, что в условиях окислительного стресса наблюдается быстрая инактивация ферментов и для их повторного накопления требуется значительный промежуток времени, ферментная защита бактериальной клетки с помощью каталазы становится менее эффективной (Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П.,1993; Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006). Исходя из этого, следует предположить наличие альтернативных механизмов клеточной защиты от активных форм кислорода.

В нашем исследовании удалось обнаружить эффект снижения каталазной активности углеводородокисляющими бактериями в процессе неф-тедеструкции, что, вероятно, связано с внутрипопуляционными процессами. Можно предположить, что в определенные периоды деструкции углеводородов бактериями неферментные антиоксиданты (трегалоза, гликоген, полисахариды и миколаты трегалозы) осуществляют эффективную защиту от активных форм кислорода, позволяя бактериям не расходовать энергию на синтез антиоксидантных ферментов, в частности каталазы (Феофилова Е.П., 1992).

Полученные результаты позволили выделить в процессе 'бактериальной деструкции углеводородов две фазы.

В первую фазу происходило взаимодействие бактерий с субстратом и окисление углеводородов с участием растворенного кислорода и оксиге-наз бактерий. Этот период сопровождался увеличением численности угле-водородокисляющих бактерий, а также регистрировалась высокая светимость культуральной среды в реакции хемилюминесценции, свидетельствуя о присутствии активных форм кислорода. Это сопровождадось снижением каталазной активности бактерий, а также убылью углеводородов в среде. Как правило, эта фаза длилась от 12 до 23 суток. высокая интенсивность хемилюминесценции

С ^ низкая интенсивность хемилюминесценции

V',У увеличение численности бактерий снижение численности бактерий снижение каталазной активности увеличение каталазной активности

Рис. 36 - Схема бактериального процесса деструкции углеводородов

Во вторую фазу происходила утилизация продуктов окисления нефтепродуктов, сопровождавшаяся постепенным снижением концентрации углеводородов в среде. Одновременно наблюдалось снижение светимости среды в реакции хемилюминесценции, численности бактерий и увеличение их каталазной активности. Продолжительность фазы составляла от 23 до 35 суток (рис. 36).

Практическим аспектом работы является разработка способа выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. В основе способа лежит способность бактерий снижать каталазную активность при потреблении углеводородов. К активным деструкторам нефти и нефтепродуктов предложено относить бактерии, каталазная активность которых в течение первых 12 суток культивирования снизилась на 30% и более. Исходя из этого, каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов может служить индикатором процесса деструкции, что позволяет использовать ее для отбора эффективных деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Продуктом инновации является новый штамм углеводородокисляющих бактерий Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 пригодный для высокоэффективной очистки загрязненных объектов внешней среды от нефти и нефтепродуктов. Его эффективность потребления нефти и нефтепродуктов составляет от 70% до 90%, в зависимости от вида углеводородов. Штамм размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и ему присвоен номер ВКПМ Ас-1741), получен патент РФ № 239640 на «Штамм Gor dona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов.

Подводя итог, следует выделить два основных момента:

• Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов, а также способствует их адаптации и выживанию в природной среде.

• Обладая диапазоном реакции, каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов - деструкторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гоголева, Ольга Александровна, 2012 год

СПИСОК ОСНОВНОЙ ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.П., Терещенко H.H., Стахина Л.Д., Панова И.И. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2000. № 1. С. 58-64.

2. Барышникова Л.М., Черемис H.A., Головлев Е.Л. Глюкозный эффект в регуляции транспорта глюкозы клетками Rhodococcus minimus // Микробиология. 1994. Т. 63. № 3. С. 405-410.

3. Белозерская Т.А., Гесслер H.H. Окислительный ' стресс и дифференцировка у Neurospora grassa // Микробиология. 2006. Т.75. №4. с. 497-501.

4. Бердичевская М.В., Ившинв И.Б., Нестеренко O.A., Шеховцев В.П. Свойства и видовой состав родококков пластовых вод Пермского Прикамья, окисляющих углеводороды // Микробиология. 1984. Т. 54. Вып. 4. С. 681-685.

5. Бутаев A.M., Кабыш Н.Ф. О роли углеводородркисляющих микроорганизмов в процессах самоочищения прибрежных вод дагестанского побережья Каспийского моря от нефтяного загрязнения. // Вестник Дагестанского научного центра. Махачкала. 2002. № 13. С. 6977.

6. Бухарин О.В., Васильев Н.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов. Томск: Томский ун-т. 1985. 215 с.

7. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Жур. микробиологии. 1984. №2. С. 27-28.

8. Бухарин О.В., Немцева Н.В. Микробиология природных водоемов. -Екатеринбург: УрО РАН, 2008. 156 с.

9. Бухарин О.В., Немцева Н.В. Система «лизоцим-антилизоцим» и ее роль в обеспечении симбиотических связей гидробионтов // Успехи современной биологии. 2002. Т. 122. № 4. С. 326-333.

10. Бухарин О.В., Немцева Н.В. Фермент-субстратные механизмы выживания бактерий в водных биоценозах // ЖМЭИ. 2003. № 4. С. 2731.

11. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В., Забирова Т.М., Иванов Ю.Б. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 P. // Бюлл. эксп. биол. 2000. Т. 130. № 7. С. 80 -82.

12. Вейант Р., Мосс У., Уивер Р., Холлис Д., Джордан Дж., Кук Э., Дейншвар М. Определитель нетривиальных патогенных граматрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. - М.: Мир, 1999. 791 с.

13. Волченко Н.Н., Карасев С.Г., Нимченко Д.В., Карасева Э.В. Гидрофобность клеток как критерий отбора бактерий - продуцентов биосурфактантов // Микробиология. 2007. Т. 76. № 1. с. 126-128.

14. Гидрология СССР. Т. XLIII. Оренбургская область. / Под ред. Е.И. Токмачева. - М.: Недра, 1972. 272 с.

15. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. - М., Практика, 1998. 459 с.

16. Горобец О.Б., Блинкова Л.П., Батуро А.П. Влияние микроводорослей на жизнеспособность микроорганизмов в естественной и искуственной среде обитания // ЖМЭИ. 2001. №1. С. 104-108.

17. Государственный доклад о состоянии и об охране окружающей среды Оренбургской области в 2009 году. - Бузулук, 2010. 276 с.

18. Государственный комитет Российской Федерации по охране окружающей среды Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природной, питьевой и сточной воды флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02» ПНД Ф 14.1:2:4.35-95. - М., 1998. 17 с.

19. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. - М.: Мир, 1982. 310 с.

20. Добровольская Т.Г., Лысак JI.B. Коринеподобные бактерии в бактериальных ценозах ряда почв сухих субтропиков // Почвоведение. 1986. №2. С. 81-87.

21. Егоров H.H., Шипулин Ю. К. Особенности загрязнения подземных вод и грунтов нефтепродуктами // Водные ресурсы. 1998. Т. 25. № 5. С. 598602.

22. Елькин A.A. Биокаталитическое окисление тиоанизола свободными и иммобилизованными клетками родококков. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Пермь. 2011. 27 с.

23. Еремин М.Н. Оценка риска и управление безопасностью территорий региона. - Екатеринбург: УрО РАН, 2003. 269 с.

24. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами // Успехи современной микробиологии. 2006. Т. 126. № 3. С. 285-296.

25. Зайцева Т.А., Рудакова JI.B., Комбарова М.М., Баранова К.С. Микроорганизмы - деструкторы нефти // Научные исследования и инновации. 2010. Т.4. №4. С. 59-63.

26. Звягинцева И.С., Суворцева Э.Г., Поглазова М.Н., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями // Микробиология. 2001. Т. 70. № 3. С. 321-328.

27. Иванов В.П., Сокольский А.Ф. Научные основы стратегии защиты биологических ресурсов Каспийского моря от нефтяного загрязнения. -Астрахань: Изд-во КаспНИРХа, 2000. 181 с.

28. Ившина И.Б., Бердичевская М.В., Зверева JI.B., Рыбалка JI.B., Еловикова Е.А. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем // Микробиология. 1995. Т. 64. № 4. С. 507-513.

29. Ившина И.Б., Нестеренко O.A., Глазачева JI.E., Шеховцев В.П. Электронно-микроскопическое изучение факультативных

газоиспользующих Rhodococcus rhodochrous // Микробиология. 1982. № 3. С. 477-481.

30. Игнатенко М.Е. Характеристика симбиотических связей микроорганизмов в альгобактериальных сообществах природных водоемов. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Оренбург. 2008. 20 с.

31. Израэль Ю.А., Цыбань A.B. Антропогенная экология океана. - JL: Гидрометеоиздат, 1989. 528 с.

32. Ильинский В.В. Гетеротрофный бактериопланктон: экология и роль в процессах естественного очищения среды от нефтяных загрязнений. Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М. МГУ. 2000. 53 с.

33. Ильинский В.В., Поршнева О.В., Комарова Т.И., Коронелли Т.В. Углеводородокисляющие бактериоценозы незагрязненных пресных вод и их изменения под влиянием нефтяных углеводородов (на примере юго-восточной части Можайского водохранилища) // Микробиология. 1998. Т. 67. №2. С. 267-273.

34. Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // В кн. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем (под ред. М.А. Глазовской). - М.: Наука, 1988. С. 42 - 56.

35. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы - деструкторы нефти в водных бассейнах. - Киев. «Наукова Думка», 1981. 130 с.

36. Квасников Е.И., Кривицкий И.П. Некоторые закономерности распространения микроорганизмов, усваивающих углеводороды, в почвах нефтяных месторождений // Микробиология. 1968. Т. 37. № 2. С. 321-325.

37. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успех современ. биологии, 1993.-Т. 113.- вып. 4,- С. 456-469

38. Киреева H.A., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв - Уфа. «Гилем», 2001. С. 376.

39. Киреева H.A., Кабиров Т.Р., Дубовик И.Е. Комплексное биотестирование нефтезагрязненных почв // Теоретическая и прикладная экология. 2007. №1.

40. Киреева H.A., Ямалетдинова Г.Ф. Фенолоксидазная активность нефтезагрязненных почв // Вестник Башкирского университета. 2000. №1. С. 48-51.

41. Киреева Н.В., Макарова М.Ю., Щемелинина Т.Н., Рафикова Г.Ф. Ферментативная и микробиологическая активность загрязненных нефтью глееподзолистых почв на разных стадиях их восстановления // Вестник Башкирского университета. №4. 2006. С. 56-60.

42. Козлова Т.М., Медведева Г.А., Мейсель М.Н., Рылкин С.С., Шульга A.B. Непосредственное обнаружение прохождения n-парафина через клеточную стенку дрожжей // Микробиология. 1973. Т. 42. № 5. С. 937939.

43. Колесников С.И., Казеев К.Ш., Татосян M.JL, Вальков В.Ф. Влияние загрязнения нефтью и нефтепродуктами на биологическое состояние чернозема обыкновенного // Почвоведение. 2006. № 5. С. 616-620.

44. Комарова Т.Н., Поршнева О.В., Коронелли Т.В. Образование трегалозы клетками R- и S-вариантов Rodococcus erythropolis // Микробиология. 1998. Т. 67. №3. с. 428-431.

45. Коновалова Е.И., Соляникова И.П., Головлева JI.A. Разложение 4-хлорфенола штаммом Rhodococcus opacus 6а // Микробиология. 2009. Т. 78. № 6. С. 847-849.

46. Коронелли Т.В. Липиды миксобактерий и родственных микроорганизмов. - М.: Изд-во МГУ, 1984. 158 с.

47. Коронелли Т.В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1996. Т. 32. № 6, С. 579-585.

48. Коронелли T.B. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1996а. Т.32. №6. с. 579-585.

49. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г, Семененко М.Н. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием // Прикладная биохимия и микробиология.

1988. Т. 24. №2. С. 203-206.

50. Коронелли Т.В., Ильинский В.В., Дермичева С.Г., Комарова Т.И., Беляева А.Н., Филлипова З.О., Розынов Б.В. Углеводородокисляющие микроорганизмы арктических вод и льдов // Изв. АН СССР. Сер. биол.

1989. №4. С. 581-587.

51. Коронелли Т.В., Калюжная Т.В. Изменение ультраструктуры клеток сапротрофных микобактерий под влиянием изониазида // Микробиология. 1983. Т.52. Вып. 2. С. 205-210.

52. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О. В. Липиды R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis // Микробиология. 1995. Т. 64. № 6. С. 769-771.

53. Коронелли Т.В., Комарова Т.Н., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов Н.Б., Яненко A.C. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 2. С. 198-201.

54. Коронелли Т.В., Стоева С., Ушакова H.A., Розынов Б.В. Липидный состав углеводородокисляющей микобактерии, выделенной из вод Арктики // Микробиология. 1977. Т. 46. № 6. С. 10-70.

55. Красильников H.A., Цыбань A.B., Коронелли Т.В. Усвоение нормальных алканов и сырой нефти морскими бактериями // Океанология. 1973. Т. 13. № 5. С. 877-891.

56. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. - М. Наука, 1989. 288 с.

57. Кураков A.B., Ильинский В.В., Котелевцев С.В., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях. -М.: Изд. «Графикон», 2006. 336 с.

58. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Рычкова И.М., Чумаков О.Б. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков // Микробиология. 2000. Т. 69. № 1. С. 62-69.

59. Ленёва H.A., Коломыцева М.П., Баскунов Б.П., Головлёва Л.А. Деградация фенантрена и антрацена бактериями рода Rhodococcus // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. № 2. С. 188-194.

60. Логинов О.Н. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от техногенных загрязнений. - Уфа: «Реактив», 2000. 100 с.

61. Логинова Л.Г., Богданова Т.И., Серегина Л.М. Развитие облигатно-термофильных бактерий на среде с парафином // Микробиология. 1981. Т. 50. № 1.С. 49-54.

62. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г. Бактерии в почвах тундры Западного Таймыра// Почвоведение. 1982. № 9. С. 74-78.

63. Марцинкевич С.Я. Динамика нефтеокисляющих микроорганизмов в районе Рижского залива непротив устьев больших рек // Биоценозы различи, трофич. уровней. Рига. 1983. С. 38-76.

64. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Т. Звягинцева. - М. МГУ, 1991. 303 с.

65. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации (корине- и нокардиоподобные бактерии). - М.: Изд.-во МГУ, 1991. 144 с.

66. Миронов О. Г. Нефтеокисляющие бактерии Севастопольских бухт (итоги 30-летних наблюдений) // Экология моря. 1999. Вып. 57. С. 89-90.

67. Миронов О.Г. Бактериальная трансформация нефтяных углеводородов в прибрежной зоне морей // Морской экологический журнал. 2002. Т. 1. № 1. С. 56-66.

68. Миронов О.Г. Биологические проблемы нефтяного загрязнения морей // Гидробиологический журнал. 2000. Т. 36. № 1. С. 82-96.

69. Миронов О.Г. Биологические ресурсы моря и нефтяное загрязнение. -М.: Пищепромиздат, 1972. 105 с.

70. Миронов О.Г. Взаимодействие морских организмов с нефтяными углеводородами. - Л.: Гидрометеоиздат, 1985. 128 с.

71. Миронов О.Г., Лопухин A.C., Лебедь A.A., Тархова Э.П. Биомониторинг поверхностных вод Центральной Атлантики / Докл. АН УССР. 1985. Б. №5. С. 81-83.

72. Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич Л.М. Роль диспергирующих средств в процессах трансформации и окисления нефти в водной среде // Водные ресурсы. 2002. Т. 29. № 2. с. 221-225.

73. Мурзакова Г.Б., Битеева М.Б., Морщакова Г.Н. Биотехнология очистки нефтезагрязненных территорий: Обзорная информация. Защита окружающей среды, утилизация отходов, очистка сточных вод и выбросов, промышленная санитария и гигиена в медицинской промышленности//Медбиоэкономика. 1992. Т. 3. С. 1-36.

74. Наливайко Н.Г., Сыроватко Ю.С., Дутова Е.М., Покровский Д.С. Характеристика микробной составляющей подземных вод республики Хакасия в условиях углеводородного загрязнения // Вестник ТГУ. 2007. №300-2. С. 190-193.

75. Немцева Н.В. Микробиологическая характеристика биоценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов. Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М. МГУ. 2000. 53 с.

76. Немцева Н.В., Алехина Г.П. Антилизоцимный признак в микробиологической характеристике речных альгобактериальных сообществ // ЖМЭИ. 1996. № 3. С. 93 - 96.

77. Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. - Киев: Наукова Думка, 1985. 334 с.

78. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. - М.: Мир, 1997. 800 с.

79. Павлова О.Н., Земская Т.И., Горшков А.Г., Парфенова В.В., Суслова М.Ю., Хлыстов О.М. Исследование микробного сообщества озера Байкал в районе естественных нефтепроявлений // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. № 3. С. 319-323.

80. Патин С.А. Экологические проблемы освоения нефтегазовых ресурсов морского шельфа. - М.: Изд-во ВНИРО, 1997. 350 с.

81. Пелешенко В.И, Савицкий В.Н., Стецько Н.С., Михайленко В.П. Содержание и динамика нефтепродуктов в водоемах и, водотоках, расположенных в зонах влияния крупных энергетических объектов // Гидробиологический журнал. 1991. Т. 27. № 6. С. 54-59.

82. Перетрухин И.В., Ильинский В.В.. Литвинова М.Ю. Определение скоростей биодеградации нефтяных углеводородов в воде литорали Кольского залива // Вестник МГТУ. Т.9. №5. 2006. с. 828-832

83. Петров A.A. Углеводороды нефти. - М.: Наука, 1984. 264 с.

84. Пивоваров Ю.П., Королик В.В. Санитарно-значимые микроорганизмы (таксономическая характеристика и дифференциация). - М.: Изд-во ИКАР, 2000. 268 с.

85. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. - М.: Изд-во МГУ, 1993. 208 с.

86. Плешакова Е.В., Голубев С.Н., Турковская О.В. Биодеградация нефтяных углеводородов штаммом Dietzia maris, ее генетические

особенности // Известия Саратовского университета. 2007. Т.7. Сер. Химия. Биология. Экология. Вып. 1. С. 54-57.

87. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Кошелева И.А., Пунтус И.Ф., Филоноф А.Е., Гавриш Е.Ю., Демаков В.А., Воронин A.M. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенных из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология. 2001. Т. 70. № 1. С. 61-69.

88. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода / Под ред. Ермакова. - М.: КДУ, 2007. 140 с.

89. Рубцова С.И. Гетеротрофные бактерии - показатели загрязнения и самоочищения морской среды // Экология моря. 2002. Вып. 62. С. 81-84.

90. Савкина Т., Боярский 3., Стынц 3. Повреждение почвы, вызванные загрязнением нефтью // Мат. Всес. Науч.-тех. Конф. «Проблемы разраб. автом. сист. набл. контр, и оценки сост. окр. среды». - Казань, 1979. С. 141-143.

91. Салангинас JI.A. Изменение свойств почв под воздействием нефти и разработка системы мер по их реабилитации. Екатеринбург. 2003. 318 с.

92. Сарангова А.Б., Печуркин Н.С., Сомова Л.А., Письман Т.И. Модель ферментативного процесса «Субстрат - клетка - перекись' водорода -каталаза» в бактериальном звене МЗЭС и в биоценозе активного ила // II съезд биофизиков России: Тез. докладов. М. 1999. С. 143.

93. Серебрякова Е.В., Дармов И.В., Медведев Н.П., Алексеев С.А., Рыбак С.И. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. с. 237-239.

94. Сидоров Д.Г., Борзенко И.А., Ибатуллин P.P., Милехина Е.И., Храмов И.Т., Беляев С.С., Иванов М.В. Полевой эксперимент по очистке почвы от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих

микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 5. С. 497-502.

95. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах.: Пер. с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. - М.: Мир, 2005. 656 с.

96. Солнцева Н.П. Общие закономерности трансформации почв в районах добычи нефти (формы проявления, основные процессы, модели). // В кн. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем (под ред. М.А. Глазовской). - М.: Наука. 1988, С. 23-42

97. Сопрунова О.Б. Особенности функционирования альго-бактериальных сообществ техногенных экосистем. Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М. МГУ. 2005. 45 с.

98. Сопрунова О.Б. Циано-бактериальные сообщества в биодеградации нефтяных углеводородов в почвах // Электронный журнал «Исследовано в России». 2005. № 94. с. 991-998. URL: htth://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2005/094.pdf (дата обращения: 21.07.11)

99. Сопрунова О.Б., Клюянова М.А. Штаммы-деструкторы нефтяных углеводородов // Вестник АГТУ. 2007. № 1. С. 180-183.

100. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под. ред. М.О. Биргера. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982.- 464 с.

101.Сулейманов P.P., Абдрахманов Т.А., Жаббаров З.А., Турсунов Л.Т. Ферментативная активность и агрохимические свойства лугово-аллювиальной почвы в условиях нефтяного загрязнения // Известия Самарского научного центра РАН. Т. 10. №2. 2008. С. 294-298

102.Ткаченко В.Н., Бурковский И.В. Влияние нефтяных углеводородов на микробентос литорали Белого моря // Экология. № 5, 1986, с. 9-15.

ЮЗ.Ткебучаева Л.Ф., Комарова Т.И, Ильинский В.В., Коронелли Т.В. Углеводородокисляющие и сульфатредуцирующие бактерии грунтов

Можайского водохранилища // Водные ресурсы. 2004. Т. 31. № 5. С. 606610.

104.Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. 1992. Т.61.Вып5.с. 741-755.

105.Хабиров И.К., Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х. Усточивость почвенных процессов. - Уфа: БГАУ, 2001. 327 с.

Юб.Хайруллин P.M., Ахметова И.Э. Хемилюминесцентный анализ быстрой продукции перекиси водорода интактными проростками пшеницы под влиянием хитоолигосахаридов // Биохимия. 2001. Т. 66. Вып. 3. С. 349 - 353.

107.Хомякова Д.В. Состав углеводородокисляющих микроорганизмов нефтезагрязненных почв Усинского района Республики Коми. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М. МГУ. 2003. 23 с.

108.Хомякова Д.В., Ботвиненко И.В., Нетрусов А.И. Углеводородокисляющая микробиота нефтезагрязненных почв Крайнего Севера // В кн. Биоразнообразие восстанавливаемых территорий. - СПб.: Наука, 2002.

109.Хуснетдинова JI.3., Морозов Н.В. Биодеградация углеводородов нефти природных и сточных вод аборигенными микроорганизмами // Современные наукоемкие технологии. 2005. № 11. С. 24.

ПО.Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах // Успехи современ. естествознания. №7. 2006.С. 29-36.

Ш.Чистяков В. А. Неспецифические механизмы защиты от деструктивного действия активных форм кислорода // Успехи совр. биологии, 2008. Т. 128. №3. с. 300-306

112.Шамраев А.В., Шорина Т.С. Влияние нефти и нефтепродуктов на различные компоненты окружающей среды // Вестник ОГУ, 2009. № 6. С. 642-645.

ПЗ.Шумкова Е.С., Соляникова И.П., Плотникова Е.Г., Головлева JI.A. Разложение пара-толуата бактерией Rhodococcus ruber Р25 // Микробиология. 2009. Т. 78. № 3. С. 421-423.

114. Эммануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. - М.: Высш. шк., 1984. 463 с.

115.Anderson R. Т., Lovley D. R. Hexadecane decay by methanogenesis. // Nature. 2000. V. 404. P. 722-723.

116. Atlas R. M. Microbial Hydrocarbon Degradation / Bioremediation of oil spills J. Chem. Technol - Biotechenol 52. 1991. P. 149-156.

117. Atlas R. M., Bartha R., Degradation and mineralization of petroleum in sea water: limitation by nitrogen and phosphorus // Biotechnol. Bioeng. 1972. V. 14. P. 309-317.

118.Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. Microbiol. Rev. 1981. N 1. P. 180-209.

119.Atlas R.M., Bartha R. Hydrocarbon biodégradation and oil spill bioremediation (ed. By K.C. Marshall) // Adv. Microb. Ecol. 1992. V.12. P. 287-338.

120. Atlas R.M., Horowitz A., Busdosh M. Prudhoe crude oil in Arctic marine ice, water and sediment ecosystem: degradation and interaction with microbial and benthic communities // J. Fish. Res. Board Can. 1978. V. 35. N 5. P. 585-590.

121.Bartha R., Atlas R.M. The microbiology of aguatic oil spills // Advances in Appelied Microbioligy. 1977. V. 22. P. 225-266.

122.Belyaev S.S., Borzenov I.A., Milekhina E.I., Zvyagintseva I.S., Ivanov M.V. Halotolerant and extremely halophilic oil-oxidizing bacteria in oil fields

// Proc. of. Intern. 1992 Conf. on Microbial Oil Recovery / Eds. Premuzic E., Woodhead A. Amsterdam: Elsevier. 1993. P. 79-88.

123.Brock T.D. Principlis of microbial ecology. New Jersey, Prentice - Hall Inc., 1966. P. 306.

124.Buckley E.N., Jonas R.B., Fraender F.K. Characterrization of microbial isolates from an estuarine ecosystem: relationship of hydrocarbon utilization to ambient hydrocarbon concentration // Appl. Environ. Microbiol. 1976. V. 32. P. 232-237.

125.Cheng Q., Thomas S.M., Kostichka K., Valentine J.R., Nagarajan V. Genctic Analysis of a Gene Cluster for Cyclohexanol Oxidation in Acinetobacter sp. Strain SE 19 by In Vitro Transposition // J. Bacteriol. 2000. V. 182. № 17. P. 4744

126.Delille D., Valliant N. The influence of crude oil on the growth of subantarctic marine bacteria // Antarctic Sci. 1990. V. 2. N 2. P. 123-127.

127.Ehrenreich P., Behrends A., 'Harder J., Widdel F. Anaerobic oxidation of alkanes by newly isolated denitrifmg bacteria // Arch. Microbiol. 2000. V. 173. P. 58-64.

128.Hammel K.E., Gai W.Z., Green B., Moen M.A. Oxidative degradation of phenanthrene by the ligninolytic fungus Phanerochaete chrysosporium // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. N. 6. P. 1832-1838.

129. Heath D.J., Lewis C.A., Rowland S.L. The use of high temperature gas chromatography to study the biodégradation of high molecular weight hydrocarbons. // Org. Geochem. 1997. V. 26. N. 11-12. P. 769-785.

130.Hisatsuka, K., T. Nakahara, T. Minoda, and K. Yamada. Formation of protein-like activator for n-alkane oxidation and its properties. // Agric. Biol. Chem. 1977. V. 41. P. 445-450.

131.Kaledine L. Micromycetes in oil pollutend environment // Ecological effects of microorganism action // Materials of Intern. Conf., October 1-4. 1997. Vilnius. Lithuania. P. 28.

132.Ladousse A. Alaska potion magique pour bacteries anti-marees noires // Oceanorema. 1990. № 4. P. 27-31.

133.Leahy J.L., Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment // Microbiol. Rev.1990. V. 54. № 3. P. 305-315.

134.Lechevalier M.P., Horan A.C., Lechevalier H. Lipid composition in the clas sifi cation of nocardiae and mycobacteria. // J. Bacteriol. 1971. 105. № 1. p. 313-318.

135.Maeng J.H., Sakai Y., Tani Y., Kato N. Isolation and characterization of a novel oxygenase that catalyzes the first step of n-alkane oxidation in Acinetobacter sp. strain M-l // J. Bacteriol. 1996. V. 178. №. 13. P. 3695 -3700.

136.Minas W. Temperaturabhangigkeit des Olabbaus in der Nordesee durch naturlich vorkommende mikroorganismenpopulationen am beispeil eines schwerols (Bunker C) // Erdol-Erdgas-Kohle. 1986. V. 102. № 6. P. 301-302.

137.Rabus R., Kube M., Beck A., Widdel F., Reinhardt R. Genes involved in the anaerobic degradation of ethylbenzene in a denitrifying bacterium, strain EbNl // Arch. Microbiol. 2002. V. 178. P. 506-516.

138.Rojo F. Degradation of alkanes by bacteria // Environmental Microbiology. 2009. V. 11(10). P. 2477-2490.

139.Rueter P., Rabus R., Wilkes H., Aeckrsber F., Rainey F.A., Jannasch H.W., Widdel F. Anaerobic oxidation of hydrocarbons in crude oil by new types of sulphate-reducing bacteria//Nature. 1994. V. 372. P. 455-458.

140. Sikkema J., De Bont J.A.M., Poolman B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons // Microbiol.Rev. 1995. V.59. №2. P. 201-222.

141. So C.M., Yong L.Y. Insolation and characterization of a sulfate redacting bacterium that anaerobicall degrades alkanes // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 2969-2976.

142.Sorkhoh N.A., Ghannoum M.A., Ibrahim A., Stretton R.J., Rdaman S.S. Crude oil and hydrocarbon degrading strains of Rhodococcus: Rhodococcus

strains isolated from soil and marine environments in Kuwait // Environ. Pollut. 1990. V. 65. P. 1-18.

143.Tadashi F., Tatsuya N., Koji T., Junichi K. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. V. 68. № 10. P. 2171-2177.

144. Ward D.M., Atlas R.M., Boehm P.D., Calder J.A. Microbial degradation and chemical evolution of from the Amoco Spill // AMBIO. 1980. V. 9, N6. P 277-278.

145.Young L.Y., Phelps C.D. Metabolic biomarkers for monitoring in situ anaerobic hydrocarbon degradation. // Environmental Health Perspectives. 2005. V. 113. № 1. P. 62-67.

146.Zengler K., Richnow H. H., Rossello'-Mora R., Michaelis W., Widdel F. Methane formation from long-chain alkanes by anaerobic microorganisms. // Nature. 1999. V. 401. P. 266-269.