Карбоангидразы алкалофильной строматолитобразующей цианобактерии Microcoleus chthonoplastes: Идентификация и локализация тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Куприянова, Елена Владимировна

• Куприянова, Елена Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куприянова, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Роль прокариот в геосферно-биосферной системе.

1.1.1.У частое цианобактерий в формировании биосферы современного типа

1.1.2. Реликтовые сообщества как аналоги экосистем прошлого.

1.1.3. Взаимосвязь биологического отложения минералов кальция с геохимическими процессами.

1.1.4. Механизмы кальцификации у живых организмов.

1.1.4.1. Различия в механизме осаждения минералов кальция у прокариот и эукариот.

1.1.4.2. Отложение минералов кальция с участием прокариот.

1.1.4.3. Отложение минералов кальция с участием эукариот.

1.2. Фермент карбоангидраза.

1.2.1. История открытия карбоангидраз и их распространение в органическом мире.

1.2.2. Функция и биологическая роль карбоангидраз.

1.2.3. Механизм работы карбоангидраз.

1.2.4. Три класса карбоангидраз.

1.2.5. Филогенез карбоангидраз.

1.2.6. Карбоангидразы прокариот.

1.2.6.1. Карбоангидразы бактерий.

1.2.6.2. Карбоангидразы цианобактерий.

1.2.6.3. Карбоангидразы архебактерий.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Условия культивирования.

2.3. Выделение клеточных фракций М. chthonoplastes.

2.4. Измерение активности карбоангидразы.

2.5. Определение содержания белка и хлорофилла.

2.6. Электрофорез и иммунодетекция.

2.7. Масс-спектроскопия MALDI-TOF.

2.8. Иммуноэлекгронная микроскопия.

2.9. Определение внутриклеточного рН.

2.10. Биоинформатика.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Активность карбоангидразы в клеточных фракциях М. chthonoplastes

3.2. Идентификация карбоангидраз а-типа среди полипептидов

М. chthonoplastes.

3.3. Идентификация карбоангидраз р-типа среди полипептидов

М. chthonoplastes.

3.4. Исследование локализации карбоангидразы а-типа в элементах клеточных оболочек М. chthonoplastes.

3.4.1. Фракционирование клеточных оболочек М. chthonoplastes.

3.4.2. Иммуноэлекгронная микроскопия клеточных срезов и препарата клеточных оболочек М. chthonoplastes.

3.5. Некоторые характеристики а - КА гликокаликса из М. chthonoplastes

3.5.1. Изучение зависимости активности наружной КА М. chthonoplastes от рН внешней среды.

3.5.2. Характеристика изоэлектрической точки а-КА гликокаликса

М. chthonoplastes при помощи двумерного электрофореза.

3.5.3. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ белков гликокаликса

М. chthonoplastes.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Карбоангидразы алкалофильной строматолитобразующей цианобактерии Microcoleus chthonoplastes: Идентификация и локализация»

В литературных источниках, посвященных истории Земли и происхождению жизни, большое внимание уделяется проблемам становления биосферы, и взаимосвязи этого процесса с историей развития растительных организмов. Некоторые вопросы до сих пор остаются спорными, и среди ведущих специалистов в этой области нет единого согласия, что, конечно же, связано с невозможностью моделирования со стопроцентной точностью процессов, происходивших в далеком прошлом. Но, то же время, существует единодушное мнение, что в формировании биосферы в современном виде большую роль сыграли сине-зеленые водоросли, или цианобактерии.

На начальных этапах истории Земли ее атмосфера состояла в основном из газов, образовавшихся в результате вулканической деятельности, и не содержала молекулярного кислорода - агента, необходимого для ряда физиологических процессов огромной группе живых существ - аэробов. Тайна появления жизни на Земле по сей день остается неразгаданной. Однако с появлением на Земле прокариотного сообщества произошла глобальная перестройка всей геосферно-биосферной системы. Цианобактерии радикально изменили газовые соотношения атмосферы в сторону увеличения концентрации кислорода и уменьшения содержания углекислого газа, связав большое количество СОг в карбонаты и выделяя О2 в процессе фотосинтеза. С появлением кислорода в атмосфере возник озоновый слой, преграждающий путь ультрафиолету. Все это дало возможность появления высокоорганизованных эукариот, использующих энергетически более выгодный процесс кислородного дыхания вместо анаэробного брожения, выхода жизни на сушу, и появления всех основных групп известных ныне животных и растений.

Участие циано-бактериального сообщества в связывании атмосферного СОг на ранних этапах истории Земли подтверждается наличием в осадочных породах строматолитов - слоистых известняковых отложений, представляющих собой литифицированные циано-бактериальные сообщества, аналогичные современным бентосным матам. Строматолитобразование продолжается и по сей день. Однако, в настоящее время это довольно незначительный по своим масштабам процесс. Хотя циано-бактериальные маты существуют во многих районах мира, настоящие строматолиты они образуют довольно редко.

Геомикробиологические процессы, имеющие место при образовании современных строматолитов, до сих пор плохо изучены, в связи с чем затруднена интерпретация тех условий на нашей планете, при которых имело место формирование строматолитов докембрия, а, отсюда, и реконструкция древних биогеохимических процессов на нашей планете. До сих пор неясно, принимают ли участие в формировании строматолитов какие-либо физиологические процессы, или мат лишь структурирует естественное осадконакопление. Нами было выдвинуто предположение, что ключевую роль в сгроматолитобразовании может играть фермент карбоангидраза (КА), устанавливающий обратимое карбонатное равновесие. В настоящее время фермент найден практически у всех групп живых организмов, где он участвует в осуществлении ряда физиологических процессов, среди которых есть и идущие с отложением карбоната кальция. У человека это образование атеросклеротических бляшек, у кораллов и протает - построение известкового скелета. Видится вполне вероятным, что КА может участвовать и в сгроматолитобразовании в циано-бактериальных матах. В то же время, организация КА системы у представителей бентосных сообществ до сих пор не изучена. В качестве объекта использовали способную к отложению СаСОз бентосную цианобактерию Microcoleus chthonoplastes — представителя микробных сообществ циано-бактериальных матов, а также алкалофильных сообществ, считающихся реликтом древней микробиоты, сохранившейся в экстремальных условиях содовых озер.

Целью настоящего исследования являлся поиск у реликтовых цианобактерий внеклеточных КА, имеющих доступ к наружному субстрату, и оценка возможности их участия во внеклеточном отложении карбоната кальция.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать активность карбоангидразы в различных клеточных фракциях Microcoleus chthonoplastes.

2. Исследовать локализацию карбоангидраз в элементах клеточных оболочек и на тонких срезах клеток М. chthonoplastes.

3. Определить принадлежность внеклеточных карбоангидраз М chthonoplastes к классам этого фермента.

4. Охарактеризовать некоторые свойства внеклеточных ферментов (рН-зависимость, pi, молекулярную массу, пептидный профиль).

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Куприянова, Елена Владимировна

выводы

1. Показано наличие активности КА во фракции клеточных оболочек, а также в интактных клетках Microcoleus chthonoplastes, что свидетельствует о наличии у него внеклеточного фермента, имеющего доступ к наружным СО2/НСО3" -субстратам.

2. Для наружных КА показана высокая максимальная активность в области высокощелочных рН (около 10), характерных для среды обитания М. chthonoplastes, и пик ферментативной активности в области рН 7.5.

3. С помощью Вестерн блоттинга с афинно очищенными антителами против белка Cah-3 (а - КА), а также антителами против Р - КА из разных организмов, установлено наличие в клеточных оболочках М. chthonoplastes КА а - и р -типов.

4. Внеклеточная КА а - типа М. chthonoplastes локализована в гликокаликсе цианобактерии.

5. Cah-З - подобная КА М chthonoplastes характеризуется молекулярной массой около 34 кДа и изоэлектрической точкой в области pi 3.5.

6. Получен пептидный профиль а - КА с использованием метода MALDI-TOF масс-спектроскопии.

7. Предложена схема участия внеклеточных КА М. chthonoplastes в фотосинтетической ассимиляции углерода и связи этого процесса с отложением СаСОз при минерализации циано-бактериального мата, учитывающая локализацию КА в наружных слоях цианобактерии и градиенты рН в окружающей среде и различных компартментах клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для того, чтобы понять биологическую роль обнаруженных нами в клеточных оболочках М. chthonoplastes КА а- и Р-типа, и оценить их возможное участие в минерализации циано-бактериального мата, необходимо рассмотреть, какие функции могут выполнять КА в клетках цианобактерий.

Участие КА в процессе автотрофной ассимиляции С; у цианобактерий является хорошо установленным фактом. Наиболее хорошо изучена функция Р-КА, которая кодируется имеющими высокую степень гомологии генами icfA у Synechococcus РСС 7942 (Fukuzawa et al., 1992) и ссаА у Synechocystis РСС 6803 (So & Espie, 1998). Предполагается, что IcfA и СсаА вместе с РБФК входят в состав карбоксисом, где участвуют в генерации С02 в месте его фиксации.

Вторая функция КА у цианобактерий может быть связана с транспортом Q из среды в клетку. Полагают, что эту роль выполняют внеклеточные КА цианобактерий ЕсаА и ЕсаВ, которые участвуют в образовании С02 и/или НСОз" -субстратов для переносчиков углерода, локализованных в цитоплазматической мембране. Эти ферменты, выполняющие схожие функции, относятся к разным классам: ЕсаА (Synechococcus РСС 7942, Anabaena sp. РСС7120) отнесена к а-КА (Soltes-Rak et al., 1997), a EcaB (Synechocystis PCC 6803) - к p-KA (So et al., 1998).

Обе функции КА, рассмотренные выше, наиболее часто обсуждаются в литературе и касаются в основном ферментов из фотосинтезирующих организмов -цианобактерий и микроводорослей. Однако в настоящее время, после обнаружения трех негомологичных классов КА, которые могут присутствовать у одного организма (в том числе и у цианобактерий), все чаще отмечается, что биологическая роль этих ферментов может быть значительно шире и разнообразнее (Smith & Ferry, 2000). Потенциальные возможности КА видят, прежде всего, (1) в регулировании процессов удаления или поставки С02/НС0з* во многих энзиматических реакциях, а также (2) в поставке этих продуктов для переносчиков при их транспорте через клеточные мембраны. Выполняя эти функции, фермент принимает участие, в том числе и опосредованное, в самых разнообразных процессах жизнедеятельности.

Для многих эукариотических водорослей, протист, а также животных организмов известны примеры кальцифюсации с участием КА. Эта функция КА хорошо изучена у кораллов (Lucas & Knapp. 1997; Furla et al. 2000) и на примере транскальцификации у коюсолитофориды Emiliania huxleyi (Quiroga & Gonzalez, 1993; Nimer & Merctt. 1996; Sekino et al., 1996). Известковый кокколит формируется во внутриклеточных цистернах Е. huxleyi и затем выходит па поверхность клетки, образуя ее наружный скелет. У кораллов КА Также функционирует во внутриклеточной среде. У цианобактерий. ответственных за внушительную геологическую летопись строматолитов, ситуация иная. Карбонаты кальция и магния отлагаются вне клетки (Заварзин, 2002) и, следовательно, необходимо действие внеклеточной КА. Представляется вполне вероятным, что КА. локализованные в наружных слоях клетки, могут участвовать в минерализации цианобактерий. Таким образом, ферментативная активность КА могла способствовать и образованию строматолитов докембрия. гликокаликс периплазлштическое пространство

1-КА карбоксмсомд цитозаль

Рис. 23. Организация КА системы в клетках алкалофильной цианобактерии М. chthonoplastes.

Установленная нами локализация фермента а - типа в гликокаликсс М chthonoplastes не вызывает сомнения. Обнаруженные, по крайней мере, две КА |5 типа, могут находиться как в гли кокал иксе, так и в периплазматичееком пространстве клеточных оболочек цианобактерии. В пользу этого предположения свидетельствуют также полученные нами данные о зависимости активности внеклеточных КА от рН внешней среды. В соответствие с представленной ранее

100 схемой строения наружных оболочек цианобакгерий (рис. 12), и основываясь на полученных нами экспериментальных данных, можно предложить следующую схему организации КА системы в клетках М. chthonoplastes (рис. 23). Показанное па рисунке присутствие внутриклеточной карбокси сом ал ьной КА р - типа является установленным и описанным в литературе фактом (Kaplan & Reinhold. 1999).

Полученные нами данные об активности наружных КА могут подтверждать важную роль экзогенных ферментов в утилизации бикарбоната для фотосинтетической ассимиляции углерода у алкалофшгов, как это представлено нами на рис. 24. При сильнощелочных значениях рН содовых озер (около 10), весь растворенный в воде Q присутствует виде карбоната и бикарбоната. Для цианобакгерий показано существование нескольких систем переноса НС О/ (Badger & Price. 2003). гл и ко кал икс периплазма рН 9.8 рН-8

СО Ч.

Jfti-KA НСОз'"

• СО-, ||МА

НСО3цитоплазма рН 7

С02

It

НС О"

СО2-*И>фк lt(WA НСОз" карбокси сом а

Рис. 24. Схема фотосинтетической ассимиляции Cj у М. chthonoplastes при участии наружных КА а - и р - типа.

Большая часть бикарбоната, утилизированного клеткой вне зависимости от механизма его транспорта, поступает в карбоксисому, где он при помощи внутриклеточной КА р - типа (рис. 24) превращается в СО; для последующей фиксации РБФК. Однако, часть поступившего в клетку НСОз" может спонтанно превращаться в С02 еще до фиксации при фотосинтезе по уравнению Гендерсона-Хассельбаха. вследствие более низких значений внутриклеточного рН по сравнению с окружающей средой (см. раздел 1.2.2). Ранее нами было показано, что цитоплазматический рН алкалофилов находится в нейтральной области (рис. 17).

Образовавшаяся углекислота должна «вытекать» из клетки по градиенту концентрации. Тогда находящиеся в клеточных оболочках КА а - и р - типа будут препятствовать этой утечке, превращая СО2 обратно в бикарбонат и поставляя его для переносчиков через мембраны цианобактерии (рис. 24).

При рассмотрении связи фотосинтетической ассимиляции С; с отложением кальция необходимо принимать условия обитания, близкие к морским (рН около 8), для которых показаны примеры минерализации М. chthonoplastes (Герасименко, 2002). Как известно, строматолитобразование в содовых озерах не происходит вследствие того, что при сильнощелочных рН кальций исчезает из раствора как макрокомпонент и откладывается на дне в виде химически осажденного СаС03 (Заварзин, Жилина, 2000).

Оба известных для клеток цианобактериЙ механизма утилизации бикарбоната связаны с подщелачиванием околоклеточного пространства (рис. 25). Утилизация бикарбоната может происходить (1) в обмен на выделение гидроксила в окружающую среду (McConnaughey, 1994) (рис. 25, А), и/или (2) быть связанной с симпортом ионов натрия (Badger & Price, 2003) (рис. 25, Б). Последнее приводит к подщелачиванию цитоплазмы и активации вслед за этим №+-АТФазы, важного компонента рН-стата цитозоля алкалофилов, осуществляющего обмен Na+ на протон из окружающей среды (Пагис, 2003). Таким образом, оба механизма утилизации бикарбоната ведут в конечном итоге к увеличению рН околоклеточного пространства.

Достижение рН околоклеточных слоев значений, выше 9, будет приводить к образованию гранул карбоната кальция на гликокаликсе цианобактерии, при условии наличия свободного Са2+ в окружающей среде (рис. 25). Таким образом, фотосинтетическая ассимиляция Q клетками М. chthonoplastes будет сопровождаться их минерализацией. Потребление бикарбоната создает физико-химические условия, способствующие образованию щелочного барьера в околоклеточных слоях цианобактерии, что важно, с позиции геохимиков, для понимания осаждения кальция в так называемых биологически опосредованных реакциях биоминерализации цианобактериями. внешняя среда околоклеточный рН8 слой рН >9 нсо3--^ с*2+1 «ч Са<НС03)2 СаС03 кальцифпкацня (А) ) р—онвнешняя среда околоклеточный рН8 слой рН >9 нсо3--J Са2+| —^ Са(НС03)2 «-- 1 «.-£, СаСОэ кальцпфнкацпя (Б) ) -► Na+? АДФ уА— Na+ / \ f) ч-* АТФ

Рис. 25. Возможные механизмы утилизации Cj клетками М. chthonoplastes и связь этого процесса с минерализацией циано-бактериального мата.

При рассмотрении связи между активностью наружных КА и минерализацией следует также учитывать и т«г факг. что клетка в зависимости от стадии своего рос та не всегда осуществляет фотосинтез с равной интенсивностью. В случае молодой культуры и высокой скорости фотосинтеза, утечка в окружающую среду С02, образовавшегося вследствие перехода в него потребленного клеткой бикарбоната, может идти интенсивнее подщелачивания окружающего пространства и приводить к понижению pi 1 в околоклеточных слоях.

В этом варианте может лаже наблюдаться вынос кальция из уже отложившегося строматолита, находящегося иод слоем циано-бактериального мата (рис. 26, А).

При достижении клетками стационарной стадии роста (рис. 26. Б), процесс потребления бикарбоната идет с намного меньшей интенсивностью, вследствие чего в околоклеточных слоях могут преобладать процессы подщелачивания и выпадения кальция в осадок. Однако, из литературы известно, что процессы минерализации скорее всего связаны с активным фотосинтезом (Некрасова с соавт. 1983; Заварзин, 1989; Thompson & Ferris. 1990), что указывает на большую достоверность схемы кальцификации, предложенной на рис. 25. В то же время, в некоторых работах показано, что отложение минералов кальция скорее всего происходит постморталыю (Крылов с соавт., 1989; Заварзин. 2002). что не исключает и механизма, представленного на рис. 26. Б.

Рис. 26. Зависимость кальцификации циано-бактериального мата и связанного с ним строматолитобразования от стадии роста цианобактериальных клеток.

В заключение можно привести общую схему, отражающую работу наружных КА. их роль к клетке М. chthonoplastes. а также связь этих процессов с отложением карбоната кальция (рис. 27). Роль К А здесь сводится к стабилизации рН в около клеточном пространстве и поддержании концентрации субстрата (НССЬ"), необходимого как для обеспечения фотосинтеза, так и отложения СаС03. внешняя среда околоклеточныи периплазма рН 8 слой рН >9 рН 7.5- 8

СО; <. fa-KA

НСОз" — Са2+ Са(НС03)2 I

СаС03 калышфнкяиин

- СО, jth-KA

-нсо3цитоплазма рН 7 сог it нсо3

С02 > IIM'K

It

ЖА нсо3

- н+

- онкарбоксисома

Рис. 27. Роль наружных К А в фотосинтетической ассимиляции неорганического углерода у М. chthonoplastes и связь этого процесса с внеклеточным отложением карбоната кальция рН внешней среды, равный 8. соответствует морским условия обитания, при которых наблюдается отложение CaCOi на поверхности М. chthonoplastes.

Подобный механизм минерализации циано-бактериальных сообществ мог иметь место и в докембрии при формировании толщ древних строматолитов. Однако остается неясным, происходил ли он при участии наружной а - К А или же обеспечивался работой ферментов других классов. Считается, что а - класс К А является самым молодым, эволюционировавшим из общего родового гена лишь 0.5-0.6 млрд. лет назад, поскольку он обнаруживается главным образом у млекопитающих (Smith & Ferry. 2000). В то же время, наличие а - КА у исследуемой нами реликтового организма - М. chthonoplastes, возраст которого, согласно палеонтологическим исследованиям, может составлять более 3.5 млрд. лет (Сергеев. 1992), предполагает такое же древнее происхождение а - класса КА. как р и у - классов этого фермента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куприянова, Елена Владимировна, 2003 год

1. Герасименко J1.M. (2002) Аюуалистическая палеонтология циано-бактериальных сообществ. Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук. 70 с.

2. Герасименко JI.M., Жегалло Е.А., Жмур С.И., Розанов А.Ю., Хувер Р. (1999) Бактериальная палеонтология и исследования углеродистых хондритов. Папеонтологический журнал 4: 103-125.

3. Герасименко JI.M., Заварзин Г.А., Розанов А.Ю., Ушатинская Г.Т. (1999а) Роль цианобактерий в образовании фосфоритных минералов. Журн. Общ. Биологии. 64: 415-430.

4. Герасименко J1.M., Гончарова И.В., Зайцева JI.B. (1998) Влияние содержания фосфора в среде на рост и минерализацию цианобактерий. Микробиология 67: 254-259.

5. Герасименко JI.M., Гончарова И.В., Жегалло Е.А., Заварзин Г.А., Зайцева JI.B., Орлеанский В.К., Розанов А.Ю., Ушатинская Г.Т. (1996) Процесс минерализации (фосфатизации) нитчатых цианобактерий. Литология и полезн. ископ. 2: 208-214.

6. Герасименко JI.M. , Дубинин А.В., Заварзин Г.А. (1996а) Алкалофильные цианобактерии содовых озер Тувы и их экофизиология. Микробиология 65:844.849.

7. Гончарова И.В. Герасименко JI.M. (1993) Динамика потребления Р мин. культурой Microcoleus chthonoplastes. Микробиология 62: 1048-1055.

8. Голубев С.Н., Герасименко JI.M. (1989) Биоминерализация в культурах цианобактерий. Микробиология 58: 963-968.

9. Дубинин А.В., Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. (1995) Экофизиология и видовое многообразие цианобактерий озера Магади. Микробиология 64:845.849.

10. Заварзин Г.А. (2003) Эволюция геосферно-биосферной системы. Природа 1: 27-35.

11. Заварзин Г.А. (2002) Микробный геохимический цикл кальция. Микробиология 71: 5-22.12