Изучение структуры и функции митохондриальной АТФазы с помощью методов ЭПР тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Имедидзе, Эльдар Адамович

• Имедидзе, Эльдар Адамович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Имедидзе, Эльдар Адамович

Введение.

Глава I. Структура растворимой АТФазы и функции ее субъединиц

1. Субъединичный состав растворимой АТФазы -.

2. Нуклеотидсвязывающие центры АТФазы и их функции

3. Функциональные группы нуклеотидсвязывающих центров митохондриальной АТФазы

4. Конформационные изменения АТФазы

Глава П. Структура и функции АТФазного комплекса митохондрий.

1. Мембранные компоненты АТФазного комплекса митохондрий и их функции.

2. Локализация фактора Fj в митохондриальной мембране.

Глава Ш. Методы измерения мембранного потенциала

§ I. Методы измерения электрического потенциала

1. Прямые методы измерения электрического потенциала.

2. Методы определения A4f , основанные на измерении равновесного распределения пробных зарядов

3. Метод липидорастворимых проникающих ионов

4. Измерение трансмембранного электрического потенциала с помощью флуоресцентных зондов

§ 2. Методы измерения градиента рН на сопрягающих мембранах

I. Титрометрический метод

2. Распределение проникающих кислот

3. Измерение ДрН с помощью флуоресцентных и спиновых зондов

Глава 1У. Материалы и методы.

Препаративные методы.

1. Выделение митохондрий из сердца быка

2. Выделение субмитохондриальных частиц /СМЧ/

3. Выделение марганцевых субмитохондриальных частиц.

4. Выделение субмитохондриальных частиц, лишенных фактора Fj.

5. Выделение водорастворимой АТФазы /фактор Fj/

6. Реконструкция фактора Fj с мембраной СМЧ.

7. Модификация фактора Fj с профлавином

8. Модификация фактора Fj спиновыми метками

Аналитические методы

1. Определение концентрации белка

2. Определение АТФазной активности фактора Fj и субмитохондриальных частиц

3. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих реагентов

4. Измерение спектров флуоресценции профлавина

5. Измерение электрического потенциала Д4* с помощью проникающих анионов

6. Измерение спектров Электронного Парамагнитного Резонанса'/ЭПР/

Глава У. Модификация митохондриального фактора спиновыми метками и разделение модифицированного фермента на субъединицы

Глава У1. Локализация фактора Fj в митохондриальной мембране.

Глава УП. Измерение градиента рН на мембране субмитохондриальных частиц

Выводы .III

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение структуры и функции митохондриальной АТФазы с помощью методов ЭПР»

К настоящему времени установлено, что трансформация энергии основных энергетических ресурсов биосферы - солнечного света и органических веществ в биологических системах осуществляется по хемио-смотической схеме энергетического сопряжения /м I tcKei 1, 1961; Mitchell, 1966/. Согласно этой схеме, перенос электронов по дыхательным и фотосинтетическим ферментам приводит к генерации трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода /Д^1^/.

Важнейшим постулатом гипотезы Митчела является принцип хеми-осмотического сопряжения окисления и фосфорилирования, согласно которому трансмембранное электрическое поле / и градиент рН используются АТФ-синтетазой для образования АТФ. Этот процесс обратим, гидролиз АТФ приводит к генерации

Таким образом, обратимая протонная АТФаза /Н+-АТФаза/ в биологических системах осуществляет взаимопревращение двух унифицированных форм энергии: АТФ иД^. Фермент функционируя, как протонная помпа, осуществляет трансмембранный перенос протонов по электрохимическому градиенту /синтез АТФ/ или против электрохимического градиента /генерация /•

Исследование механизма функционирования АТФазного комплекса требует создания новых методов, позволяющих регистрировать протоно-форную функцию фермента. Важное значение для решения этой проблемы имеет также определение топографии функциональных групп и других реакционноспособных группировок в факторе Fj.

Первая часть настоящей работы посвящена выяснению локализации фактора Fj в митохондриальной мембране. Разработан простой метод

разделения фермента на крупные & и р субъединицы. Метод позволяет разделить на субъединицы как нативный, так и ковалентно модифицированный спиновыми метками фермент. В основе разработанного метода лежит способность о( субъединиц фактора Fj выпадать в осадок при низких значениях рН. Этот метод позволил определить стехиометрию связывания спиновых меток с субъединицами фермента.

Результаты, полученные при изучении фактора fj, ковалентно модифицированного спиновыми метками показали, что реконструкция с мембраной субмитохондриальных частиц приводит к экранированию от водной фазы значительных частей поверхности фермента. При этом в контакт с мембраной входят как оС , так и р субъединицы. Полученные результаты указывают на достаточно глубокое погружение фактора Fj в митохондриальную мембрану. Этот вывод подтверждается также восстановлением спинмеченного фермента посредством электрон-транспортной цепи дыхания.

Вторая часть работы посвящена разработке нового метода изме -рения трансмембранного градиента рН, генерируемого АТФазным комплексом митохондрий. Метод основан на эффекте появления сигнала р,

ЭПР свободного Мп внутри субмитохондриальных частиц в ответ на генерацию ДрН.

Разработанный метод позволяет измерять ДрН на мембране субмитохондриальных частиц без предварительного определения внутреннего объема /последнее представляет собой довольно сложную задачу и ограничивает применение других известных методов измерения ДрН/. Кроме того, предложенная система Мп-СМЧ /субмитохондриальные частицы с высоким содержанием ионов марганца во внутреннем объеме/ может быть использована для изучения механизма транслокации различных анионов и катионов через митохондриальную мембрану.

Полученные данные существенно расширяют имеющиеся представления о структуре АТФазного комплекса и должны быть учтены при формулировании принципов функционирования АТФазного комплекса.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Имедидзе, Эльдар Адамович

выводы

1. Разработан простой метод разделения крупных субъединиц митохондриального фактора Fj.

2. Осуществлена ковалентная модификация фактора Fj тремя типами спиновых меток. Спинмеченный амин модифицирует в присутствии водорастворимого карбодиимида карбоксильную группу, локализованную на

-субъединице в активном центре АТШазы. Спинмеченный изотиоционат модифицирует пять аминокислотных остатков, расположенных как на d , так и на р-субъединицах АТФазы. Спинмеченный малеимид модифицирует фактор Fj в стехиометрии 0,5 моля метки на моль фермента. Первые два типа спиновых меток локализуются на поверхности фактора Fj, доступны феррицианиду и имеют свободное вращение. Третья метка сильно иммобилизована и недоступна действию феррицианида.

3. Проведена реконструкция фактора Fj, модифицированного спиновыми метками, с мембраной субмитохондриальных частиц. Во всех трех случаях спиновые метки становились в результате такой реконструкции недоступными феррицианиду, однако восстанавливались дыхательной цепью митохондрий. Из полученных результатов следует, что значительная часть поверхности как а , так и р -субъединиц митохондриальной АТФазы находится в непосредственном контакте с мембраной.

4. Разработан новый метод измерения рН внутри субмитохондриаль1 ных частиц с использованием мп в качестве рН-чувствительного ЭПР-зонда. Предложенный метод позволяет без определения внутреннего объема частиц измерить ДрН на мембране. Этот метод может также быть использован при изучении транспорта других заряженных частиц, анионов и катионов через мембрану.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Имедидзе, Эльдар Адамович, 1984 год

1. Имедидзе Э.А., Козлов И.А., Метельская В.А., Мильгром Я.М. Инги-бирование митохондриальной АТФазы водорастворимым карбодиимидом. Биохимия, 1978, т. 43, вып. 7, с. 1.04-I4I2.

2. Капрельянц А.С., Бинюсов В.И., Григорян Г.Л., Островский Д.И. подвижность белковых молекул в мембранах бактерий Micrococcus 1isodeicticus. Биохимия, 1974, т. 39, вып. б, с. II03-II09.

3. Керимов Т.М., Мильгром Я.М., Козлов И.А., Рууге Э.К. Изучение конформационных изменений в растворимой митохондриальной АТФазе методом спиновых меток. Биохимия, 1978, т. 43, вып. 8, с. 15251531.

4. Козлов И.А. Механизм функционирования митохондриальной аденозин-трифосфатазы в системе окислительного фосфорилирования. Биоорг. химия, 1975, т. I, № II, с. 1545-1569.

5. Козлов И.А., Черняк Б.В. Локализация каталитического центра Н+-АТФазы в митохондриальной мембране. Докл. АН СССР, 1976, т. 231, № I, с. 222-225.

6. Козлов И.А., Шаламберидзе М.В., Новикова И.Ю., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Смешанные ангидриды нукл'еотидов и мезитиленкарбоновой кислоты ингибиторы митохондриальной АТФазы. Биохимия, 1977, т. 42, вып. 9, с. 1704-1710.

7. Козлов И.А., Цыбовский И.С. Различная доступность фактора fj в растворе и митохондриальной мембране для тринитробензооульфоновой кислоты. 1У Всесоюзный биохимический съезд /Ленинград/,1978. Тезисы научных сообщений, т. I, М., Наука, 1979, с. 51-52.- из

8. Кулене В.В., Скулачев В.П., Ясайтис А.А. Обнаружение мембранного потенциала митохондрий по изменению флуоресценции анилинонафталин-сульфоната. Биохимия, 1971, т. 36, вып. 3, с. 649-651.

9. Либерман Е.А., Топалы В.П. Проницаемость бимолекулярных фосфоли-пидных мембран для жирорастворимых ионов. Биофизика, 1969, т. 14, вып. 3, с. 452-461.

10. Либерман Е.А., Топалы В.П., Цофина Л.М., Ясайтис А.А., Скулачев В.П. Транспорт ионов и электрический потенциал митохондриальных мембран. Биохимия, 1969, т. 34, вып. 5, с. 1083-1087.

11. Либерман Е.А. Биоэнергетика и протонно-электронные системы мембран. Биофизика, 1977, ХХП, вып. 6, с. III5-II28.

12. Метельский С.Т., Козлов И.А. Изучение механизма действия митохондриальной АТФазы. ДАН СССР, 1974, т. 219, № 4, с. I0I0-I0I3.

13. Мильгром Я.М. Локализация и свойства нуклеотидсвязывающих центров митохондриальной АТФазы. Дисс. канд. биол. наук., Москва, 1980, с. 103-107.

14. Печатников В.А., Ризванов Ф.Ф. Турчина С.Л. Исследования трансмембранного потенциала митохондрий с помощью цианиновых красителей. Биофизика, 1979, ХХ1У, вып. I, с. 178-179.

15. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М.: "Наука", 1972.

16. Скулачев В.П. Козлов И.А. Протонные аденозинтрифосфатазы. М.: "Наука", 1977, с. 51.

17. Топалы В.П., Кожахару А.Ф., Ракул А.Д., Топалы Э.Е. Мембранная разность потенциалов в митохондриях, 1981, В сб.: Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции, с. 54, Пущино-1981.

18. Цупрун В.Л., Бикетов С.Ф., Милейковская Е.И., Тихонова Г.В., Козлов И.А. Модель четвертичной структуры Fj-АТФазы из мембранбактерий Lactobacillus casei. ДАН СССР, 1982, т. 265, № I, с. 246-247.

19. Abram D, Electron microscope observations on intact cells, protoplasms and the cytoplasmic membrane of Bacillus stearo-thermophilus. J. Bacterid., 1965, 89, 4, 855-873.

20. Amzel L.M., McKinney M., Narayanan P., Pedersen P.L. Structureоof the mitochondrial F^-ATPase of 9 A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1982, v. 79, N 19, p. 5852-5856.

21. Azzi A., Fabbro A., Santato M., Gherardini P. Energy transduction in mitochondrial fragments. Interaction of the membrane with acridine dyes. Eur. J. Biochem., 1971b, v. 21, N 3,p. 404-410.

22. Azzi A., Gherardini P., Santato M. Fluorochrome interaction with the mitochondrial membrane. J. Biol. Chem., 1971a, v. 246, N 7, p. 2035-2042.

23. Azzi A., Santato M. Potential changes and conformational changes in the mitochondrial membrane. Federation Proceedings, 1970,v. 29, N 2, p. 733.

24. Azzone G.F., Massari S. Thermodynamic and kinetic aspects of the interconversion of chemical and osmotic energies in mitochondria. Eur. J. Biochem., 1971, v. 19, N 1, p. 97-107.

25. Azzone G.F., Pozzan Т., Massari S., Bragadin M., Pregnolato M.L. Proton electrochemical gradient and rate of controlled respiration in mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 501,1. N 2, p. 296-306.

26. Beechey R.B., Cattell K.J. Mitochondrial coupling factors. In: "Current Topics in Bioenergetics". London. Acad.Press, 1973, v. 5, XV, p. 305-357.

27. Binder A., Jagendorf A., Ngo E. Isolation and composition of the subunits of spinach chloroplast coupling factor protein. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, N 9, p. 3094-3100.

28. Bitar K.G. Modification of F^-ATPase from yeast Saccharomyces3cerevisiae with 5'-P- H.-fluorosulfonylbenzoyl adenosine. Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 109, N 1, p. 30-35.

29. Bowman C., Maloff В., Tedeschi H. Further studies on the membrane potential of mitochondria. In "Frontiers of Biological Energetics: from electrons to tissues (ed. Dutton P.L., Leigh I.S., Scarpa A., p. 413-421. Academic Press, N.Y., 1978).

30. Boyer P.D., Kohlbrenner W.E., Smith L.T., Feldman R.E. An unifying hypothesis for ADP participation in catalysis and control of F^ ATPase. Abstr. Second Eur. Bioenerg. Conf., 1982, Lyon, France, p. 23-24.

31. Bragadin M., Dell'Antone P., Pozzan Т., Volpato 0., Azzone G.F. ESR determination of Mn++ uptake and binding in mitochondria. FEBS Lett., 1975, v. 60, N 2, p. 354-355.

32. Bragg P.D., Hou G. Subunit composition, function and spatial2+ 2 +arrangement in the Ca -and Mg -activated adenosine triphosphatases of E.coli and Salmonella typhimurium. Arch. Biochem. Biophys., 1975, v. 167, N 3, p. 311-321.

33. Brierley G.P. Uptake and extrusion of monovalent cations by isolated heart mitochondria. Molecular and Cell Biochem., 1976, v. 10, N 1, p. 41-62.

34. Budker V.G., Koziov I.A., Kurbatov V.A., Milgrom Ya.M. The interaction of mitochondrial ATPase with an alkylating ATP-analog. FEBS Letters, 1977, v. 83, N 1, p. 11-14.

35. Bulychev A.A., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. Micro-electrode measurements of the transmembrane potential of chloro-plasts and its photoinduced changes. Nature, 1972., v. 236,1. N 5343, p. 175-176.

36. Cafiso D. and Hubbell W. Estimation of transmembrane pH gradients from phase equilibria of spin-labelledamines. Biochemistry, 1978, v. 17, N 18, p. 3871-3877.

37. Cannon В., Vogel G. The mitochondrial ATPase of brown adipose tissue. Purification and comparison with the mitochondrial ATPase from beef heart. FEBS Lett., 1977, v. 76, N 2, p. 284-289.

38. Carmeli C., Lifshitz Y., Gutman M. Control of kinetic changesin ATPase activity of soluble coupling factor 1 from chloroplasts. FEBS Lett., 1978, v. 89, N 1, p. 211-214.

39. Casadio R., Baccarini-Melandri A. Melandri B.A. On the determination of the transmembrane pH difference in bacterial chroma-tophores using 9-aminoacridine. Eur. J. Biochem., 1974, v. 47,1. N 1, p. 121-128.

40. Cattell K.J., Knight I.G., Lindop C.R., Beechey R.B. The isolation of dicyclohexylcarbodiimide-binding proteins from mitochondrial membranes. Biochem.J., 1970, v. 117, N 5, p. 1011-1013.

41. Cattell K.J., Lindop C.R., Knight I.G., Beechey R.B. The identification of the site of action of N,N'-dicyclohexylcarbodiimide as a proteolipid in mitochondrial membranes. Biochem.J., 1971, v. 125, N 1, p. 169-177.

42. Catterall W.A., Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 1971, v. 246, N 16, p. 49874994.

43. Catterall W.A., Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from rat liver mitochondria. II. Interaction with adenosine diphosphate. J. Biol. Chem., 1972, v. 247, N 24, p. 7969-7976.

44. Chance В., Mela L. Hydrogen ion concentration changes in mitochondrial membranes. J. Biol. Chem., 1966, v. 241, N 20,p. 4588-4599.

45. Chang T.-M., Penefsky H.S. Aurovertin, a fluorescent probe of conformational change in beef heart mitochondrial ATPase.

46. J. Biol. Chem., 1973, v. 248, N 8, p. 2746-2754.

47. Chernyak B.V., Chernyak В.Ya., Gladysheva T.B., Kozhanova Z.E., Kozlov I.A. Structural rearrangements in soluble mitochondrial ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 635, N 2, p. 552-570.

48. Crane F.L., Glenn J.L., Green D.E. Studies on the electron transfer system. IV. The electron transfer particles. Biochim. Biophys. Acta, 1956, v. 22, N 3, p. 475-488.

49. Criddle R.S., Packer L., Shien P. 01igomycin-dependent ionophoric protein subunit of mitochondrial ATPase. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1977, v. 74, N 8, p. 4306-4310.

50. Crofts A.R. Amine uncoupling of energy transfer in chloroplasts.

51. Relation to ammonium ion uptake. J. Biol. Chem., 1967, v. 242, N 14, p. 3352-3359.

52. Cross R.L., Kohlbrenner W.E. The.mode inhibition of oxidative phosphorylation by efrapeptin (A23871). Evidence for an alternating site mechanism for ATP synthesis. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, N 14, p. 4865-4873.

53. Cross R.L., Nalin P.H. Adenine nucleotide binding sites of beef heart F^-ATPase. Evidence for three exchangeable sites that distinct from three non-catalytic sites. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N 6, p. 2874-2881.

54. Deamer D.W., Prince R.C., Crofts A.R. The response of fluorescent amines to pH gradients across liposome membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 274, N 2, p. 323-335.

55. Dell'Antone P., Volpato 0. H+ gradient in submitochondrial par2 +tides generated by an electroneutral H /Мп -exchange. FEBS Lett., 1977, v. 81, N 2, p. 243-248.

56. Deters D.N., Racker E., Nelson N., Nelson H. Partial resolution of the enzymes catalyzing photophosphorylation. XV. Approaches to the active site of coupling factor 1. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, N 3, p. 1041-1047.

57. Di Pietro A., Godinot C., Bouillant M.L., Gautheron D.C. Pig heart mitochondrial ATPase: properties of purified and membrane-bound enzyme. Effects of flavonoides. Biochemistry, 1975, v. 57, N 5, p. 959-967.

58. Ebel R., Lardy H. Stimulation of rat liver mitochondrial adenosine triphosphatase by anions. J. Biol. Chem., 1975, v. 250,1. N 1, p. 191-196.

59. Enns R., Criddle R.S. Investigation of the structural arrangement of the protein subunits of mitochondrial ATPase. Arch. Biochem.

60. Biophys., 1977, v. 183, N 2, p. 742-752.

61. Esch F.S., Allison W.S. Identification of a tyrosine residueat a nucleotide binding site in the jj -subunit of the mito14chondrial ATPase with p-Fluorosulfonyl- C.-benzoyl-5'-adenosine. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, N 17, p. 6100-6106.

62. Ferguson S.J., Lloyd W.J., Radda G.K. An unusual and reversible chemical modification of soluble beef heart mitochondrial ATPase. FEBS Lett., 1974, v. 38, N 2, p. 234-236.

63. Ferguson S.J., Lloyd W.J., The mitochondrial ATPase. Selective modification of a nitrogen residue in the ^ -subunit. Eur. J. Biochem., 1975, v. 54, N 1, p. 127-133.

64. Ferguson S.J., Lloyd W.J., Radda G.K., Slater E.C. On the role of the essential tyrosine residue in the mitochondrial ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 430, N 1, p. 189-193.

65. Fernandez-Moran H. Cell-membrane ultrastructure, low-temperature electron microscopy and X-ray diffraction components in lamellar system- Circulation, 1962, v. 26, N 5, p. 1039-1065.

66. Fillingame R.H. Biochemistry and genetics of bacterial ^-translocating ATPase++. Curr. Top. Bioenerg., 1981, v. 11, p. 35-100.

67. Fitin A.F., Vasilyeva E.A., Vinogradov A.D. An inhibitory high affinity site for ADP in the oligomycin-sensitive ATPase of beef heart submitochondrial particles. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1979, v. 86, N 1, p. 434-439.

68. Fleischer S., Fleischer В., Stocckenius W. Fine structure of lipid-depleted mitochondria. J. Cell Biol., 1967, v. 32,1. N 1, p. 193-208.

69. Frigeri L., Galante У.М., Hanstein W.G., Hatefi Y. Effects of arginine binding reagents on ATPase and ATP-P^ exchange activities of mitochondrial ATP synthetase complex (complex V).

70. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, N 10, p. 3147-3152.

71. Frigeri L., Galante Y.M., Hatefi Y. Interaction of complex V14and F^-ATPase with C.-phenylclyoxal. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, N 24, p. 8935-8940.

72. Gaensslen R.E., McCarthy R. Amine uptake in chloroplasts. Arch. Biochem. Biophys., 1971, v. 147, N 1, p. 55-65.

73. Garlid K.D. Unmasking the mitochondrial K/H exchanger: swelling-induced K+-loss. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, v. 83,1. N 4, p. 1450-1455.

74. Garlid K.D. Unmasking the mitochondrial K/H exchanger: tetraethyl-ammonium-induced K+-loss. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1979, v. 87, N 3, p. 842-847.

75. Gay N.J., Walker J.E. The ATP operon: nucleotide sequence of the region encoding the & -subunit of Escherichia coli ATP-synthase. Nucl. Acids Res., 1981a, v. 9, N 9, p. 2187-2194.

76. Gay N.J., Walker J.E. The ATP operon: nucleotide sequence of promotor and genes for the membrane proteins, and the 5"-sub-unit of Escherichia coli ATP-synthase. Nucl. Acids Res., 1981b, v. 9, N 16, p. 3919-3926.

77. Gear A.R., Rossi C.S., Reynafarje В., Lehninger A.L. Acid-base exchanges in mitochondria and suspending medium during respiration-linked accumulation of bivalent cations. J. Biol. Chem., 1967, v. 242, N 5, p. 3403-3413.

78. Girault G., Galmiche J.M. Further study of nucleotide-binding site on chloroplast coupling factor 1. Eur. J. Biochem., 1977, N 2, p. 501-510.

79. Girault G., Galmiche J.M. Chlortetracycline as a fluorescent probe of the first nucleotide binding site of the coupling factor CF1 of Spinach chloroplasts. FEBS Lett., 1978, v. 95, N 1, p. 135-139.

80. Gornall A.G., Bardawill Ch.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem. 1949, v. 177, N 2, p. 751-767.

81. Griniuviene В., Chmieliauskaite V. , Grinius L. Energy-linked transport of permeaht ions in Escherichia coli cells: Evidence for membrane potential generation by proton-pump. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1974, v. 56, N 1, p. 206-213.

82. Grubmeyer C., Cross R.L., Penefsky H.S. Mechanism of ATP hydrolysis by beef heart mitochondrial ATPase. Rate constants for elementary steps in catalysis at a single site. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N 20, p. 12092-12100.

83. Gunter Т.Е., Puskin J.S., Russell P.R. Quantitative magnetic resonance studies of manganese uptake by mitochondria. Biophys.J., 1975, v, 15, N 4, p. 319-333.

84. Hackney D.D. Photodynamic action of bilirubin on the inner mitochondrial membrane. Implications for the organization of the mitochondrial ATPase. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1980,v. 94, N 3, p. 875-880.

85. Hammes G.G., Hilborn D.A. Study state kinetics of soluble and membrane-bound mitochondrial ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1971, v, 233, N 3, p. 580-590.

86. Hansen M., Smith A.L. Studies of the mechanism of oxidative phosphorylation. VII. Preparation of a submitochondrial particles (ETP) which is capable of fully coupled oxidative phosphorylation. Biochim.Biophys.Acta, 1964, v. 81, N 2, p. 214-221.

87. Harris D.A. The interactions of coupling ATPase with nucleotides. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 463, N 3/4, p. 245-273.

88. Harris D.A., Radda G.K., Slater E.C. Tightly bound nucleotides of the energy-transducing ATPase, and their role in oxidative phosphorylation. II. The beef heart mitochondrial system. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 459, N 3, p. 560-572.

89. Henderson P., McGivan J., Chappell J. The action of certain antibiotics on mitochondrial, erythrocyte and artificial phospholipid membranes. Biochem. J., 1969, v. 111, N 4, p. 521-535.

90. Hilborn D.A., Hammes G.G. Equilibrium binding of nucleotides to beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase. Biochemistry, 1973, v. 12, N 5, p. 983-990.

91. Hoppe J., Sebald W. Amino acid sequence of the DCCD-binding ATPase proteolipid from the thermophillic bacterium PS-3.1. "Membrane bioenergetics". International workshop in honour of Prof. E. Racker, 1979, Abstracts, p. 20.

92. Horstman L.L., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalysing oxidative phosphorylation. XXII. Interaction between mitochondrial ATPase inhibitor and mitochondrial adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 1970, v. 245, N 6, p. 1336-1344.

93. Houstek J., Drahota Z. Purification and properties of mitochondrial adenosine triphosphatase of Hamster brown adipose tissue. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 484, N 1, p. 127-139.

94. Kagawa Y. Reconstitution of the energy transformer gate and channel subunit reassembly crystalline ATPase and ATP-synthesis.

95. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 505, N 1, p. 45-93.

96. Kagawa Y. Reconstitution of transport systems using thermophille biomembranes: crystalline ATPase and role of subunits. Xl-th International congress of biochemistry, 1979, Abstracts, p. 420.

97. Kagawa Y., Sone N., Hirata H., Okamoto H. Structure and function of H+-ATPase. J. Bioenerg. Biomembr., 1979, v. 11, N 3/4,p. 39-78.

98. Kagawa Y., Sone N., Yoshida M., Hirata H., Okamoto H. Proton translocating ATPase of a thermophilic bacterium. Morphology, subunits and chemical composition. J. Biochem. (Tokyo), 1976, v. 80, N 1, p. 141-151.

99. Kanazawa H., Kayano Т., Kiyasu Т., Futai M. Nucleotide sequence of the genes coding for and £ subunits of the proton-translocating ATPase from Escherichia coli, Biochem. Biophys. Res. Communs., 1982a, v. 105, N 3, p. 1257-1264.

100. Kanazawa H., Kayano Т., Mabuchi K., Futai M. Nucleotide sequence of the genes coding for o(, jj and "5* subunits of the proton-translocating ATPase of Escherichia coli, Biochem. Biophys. Res. Communs., 1981, v. 103, N 2,p. 604-612.

101. Kanner B.I., Serrano R., Kandrash M.A., Racker E. Preparation and characterization of homogeneous coupling factor 6 from bovine heart mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1976, v. 69, N 3, p. 1050-1056.

102. Knight I.G., Holloway С.Т., Roberton A.M., Beechey R.B. The chemical nature of the site of action of dicyclohexylcarbodii-mide in mitochondria. Biochem.J., 1968, v. 109, N 3, p. 27. Proceedings of the Biochemical Society.

103. Knowles A.F., Penefsky H.S. The subunit structure of beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase. Physical and chemical properties of isolated subunits. J. Biol. Chem., 1972,v. 247, N 20, p. 6624-6630.

104. Кода P.G. and Cross R.L. Pyridoxylation of essential lysine residues of mitochondrial adenosine triphosphatase. Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 679, N 2, p. 269-278.

105. Kozlov I.A., Kondrashin A.A., Kononenko V.A., Metelsky S.T. The role of the minor subunits of the mitochondrial ATPase. J. Bioenerg., 1976, v, 8, N 1, p. 1-7.

106. Kozlov I.A., Mikkelsaar H.N. On the subunit structure of soluble mitochondrial ATPase. FEBS Lett., 1974, v. 43, N 2, p. 212-214.

107. Kozlov I.A., Milgrom Ya.M. The noncatalytic nucleotide-binding site of mitochondrial ATPase is localized on the o<-subunits of factor F.J. Eur. J. Biochem., 1980, v. 106, N 3, p. 457-462.

108. Kozlov I.A., Schalamberidse M.V., Novikoval.Yu., Sokolova N.I., Schabarova Z.A. Mixed anhydrides of nucleotides and mesitylen-carboxylic acid as new specific inhibitors of mitochondrial ATPase. Biochem.J., 1979, v. 178, N 1, p. 339-343.

109. Kornberg R., McConnell H. Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes. Biochemistry, 1971, v. 10, N 7, p. 1111-1120.

110. Kumar G., Kalra V.K., Brodie A.F. Affinity labeling of couplingfactor-latent ATPase from Mycobacterium phlei with 2*,3'-dial dehyde derivatives of adenosine-51-triphosphate and adenosines-diphosphate. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, N 6, p. 19641971.

111. Lam K.W., Josern В., Warshaw J.B., Sanadi D.R. The mechanism of oxidative phosphorylation. VI. Purification and properties ofa second transfer factor 1. Arch. Biochem. Biophys. 1967, v. 119, N 1-3, p. 477-484.

112. Lambeth D.O. Purification and properties of rat-liver mitochondrial adenosine triphosphatase. Eur. J. Biochem., 1971, v. 22,1. N 3, p. 355-363.

113. Lardy H., Reed P., Chien-Ho Chiu Lin. Antibiotic inhibitors of mitochondrial ATP synthesis. Federation Proc., 1975a, v. 34,1. N 8, p. 1707-1710.

114. Lardy H.A., Shuster S.M., Ebel R.E. Exploring sites on mitochondrial ATPase for catalysis, regulation and inhibition. J. Supramol. struct., 1975, v. 3, N 1, p. 214-221.

115. Laris P.C., Bahr D.P., Chaffee R.R. Membrane potentials in mitochondrial preparations as measured by means of a cyanine dye. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 376, N 3, p. 415-425.

116. Laris P.C., Pershadsingh H.A. Estimations of membrane potentials in Streptococcus faecalis by means of a fluorescent probe. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1974, v. 57, N 3, p. 620-626.

117. Lien S., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalysing photophosphorylation. VIII. Properties of silicotungstate-treated subchloroplast particles. J. Biol. Chem., 1971, v. 246,1. N 13, p. 4298-4307.

118. Lowe P.N., Beechey R.B. MgATP-induced inhibition of the adenosine triphosphatase activity of the chloroform-released mitochondrial adenosine triphosphatase. Biochem.J., 1981, v. 196, N 1,p. 433-442.

119. Lowe P.N., Beechey R.B. Interactions between the mitochondrial ATPase and periodate-oxidized adenosine-51-triphosphate, an affinity label for ATP b.s. Biochemistry, 1982, v. 21, N 7,p. 4073-4081.

120. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurements with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, N 1, p. 265-276.

121. Ludwig В., Prochaska L., Capaldi R.A. Arrangement of oligomy-cin-sensitive adenosine triphosphatase in the mitochondrial inner membrane. Biochemistry, 1980, v. 19, N 7, p. 1516-1523.

122. Lunardi J., Lauquin G., Vignais P. Interaction of azidonitro-phenylaminobutyryl-ADP, a photoaffinity ADP analog, with mitochondrial adenosine triphosphatase. Identification of the labeled subunits. FEBS Lett., 1977, v. 80, N 2, p. 317-323.

123. MacLennane D.H., Tzagoloff A. Studies on the mitochondrial adenosine triphosphatase system. IV. Purification and characterization of the oligomycin sensitive protein. Biochemistry, 1968, v. 7, N 3, p. 1603-1610.

124. Maloff B.L., Scordilis S.P., Reynolds C., Tedeschi H. Membrane

125. Potential s and resistances of giant mitochondria. Metabolicdependence and the effects of valinomycin. J. Cell Biology, 1978a, v. 78, N 1, p. 199-213.

126. Maloff B.L., Scordilis S.P., Tedeschi H. Assays of the metabolic viability of single giant mitochondria. Experiments with intact and impaled mitochondria. J. Cell Biology, 1978b, v. 78, N 1,p. 214-226.

127. Marcus F., Schuster S.M., Lardy H.A. Essential arginyl residues in mitochondrial adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 1976, v. 251, N 6, p. 1775-1780.

128. Merchant S., Shaner S.L., Selman B.R. Molecular weight and sub-unit stoichiometry of the chloroplast coupling factor 1 from Chlamydomonas reinhardi . J. Biol. Chem., 1983, v. 258, N 2,p. 1026-1031.

129. Minkov I.В., Fitin A.F., Vasilyeva E.A., Vinogradov A.D.2 +

130. Mg -induced ADP-dependent inhibition of the ATPase activity of beef heart mitochondrial coupling factor F^. Biochem.Biophys. Res. Communs., 1979, v. 89, No 3, p. 1300-1306.

131. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature, 1961, v. 191, No 4784, p. 144-148.

132. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthe-tic phosphorylation. Biol. Rev., 1966, v. 41, N 3, p. 445-502.

133. Mitchell P., Moyle J. Acid-base titration across the membrane system of rat liver mitochondria. Catalysis by uncouplers. Biochem.J., 1967, v. 104, N 2, p. 588-600.

134. Mitchell P., Moyle J. Estimation of membrane potential and pH difference across the cristae membrane of rat liver mitochondria. Eur. J. Biochem., 1969, v. 7, N 4, p. 471-484.

135. Moyle J., Mitchell P. Active/inactive state transitions ofmitochondrial ATPase molecules influenced by Mg2+ anionsand aurovertin. FEBS Lett., 1975, v. 56, N 1, p. 55-61.

136. Nelson N. Chloroplast coupling factor. In: Photosynthesis.

137. Photosynthetic electron transport and photophosphorylation. A. Trebst and M. Avron, eds.). Springer Verlag, Berlin-Heidelberg - New York, 1977, p. 393-404.

138. Nelson N., Eytan E., Notsani В., Sigrist H., Sigrist-Nelson K., Gilter C. Isolation of a chloroplast N,N'-dicyclohexylcarbo-diimide-binding proteolipid, active in protone translocation. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1977, v. 74, N 5, p. 2375-2378.

139. Nieto M., Munoz E., Carreira J., Andreu J.M. Conformational and molecular responses to pH variation of the purified membrane adenosine triphosphatase of Micrococcus lysodeikticus. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 413, N 3, p. 394-414.

140. Nishimura M., Ito Т., Chance B. Sensitive measurements of hydrogen ion concentration- Biochim, Biophys. Acta, 1962, v. 52, N 1, p. 177-185.

141. Okamoto H., Sone N., Hirata H., Yoshida M., Kagawa Y. Purified proton conductor in proton translocating ATPase of thermophy-lic bacterium. J.Biol.Chem., 1977, v. 252, N 17, p. 61256131.

142. Padan E., Rottenberg H. Respiratory control and the proton electrochemical gradient in mitochondria. Eur. J. Biochem., 1973, v. 40, N 2, p. 431-437,

143. Palmieri F., Quagliariello E., Klingenberg M. Quantitative correlation between the distribution of anions and the pH difference across the mitochondrial membrane. Eur. J. Biochem., 1970, v. 17, N 2, p. 230-238.

144. Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from rat liver mitochondria: separate sites involved in ATP hydrolysis and inthe reversible, high affinity binding of ADP. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1975, v. 64, N 2, p. 610-616.

145. Pougeois R., Satre M., Vignais P.V. N-ethoxycarbonyl-2-etoxy-1,2-dihydroquinoline, a new inhibitor of the mitochondrial

146. F^-ATPase. Biochemistry, 1978, v. 17, N 6, p. 3018-3023.

147. Pougeois R., Satre M., Vignais P.V. Reactivity of mitochondrial F^-ATPase to dicyclohexylcarbodiimide. Inactivation and binding studies. Biochemistry, 1979, v. 18, N 8, p. 1408-1413.

148. Pozzan Т., Bragadin M., Azzone G. The effect of endogenous2 + 2 + phosphate on the H /Мп ratio and the state of Mn in themitochondrial matrix. Eur. J. Biochem., 1976, v. 71, N 1,p. 93-99.

149. Pressman B.C. Biological applications of ionophores. Ann. Rev. Biochem., 1979, v. 45, N 2, p. 501-530.

150. Pullman M.E., Penefsky H.S., Datta A., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.

151. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimu-lated adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 1960, v. 235, N 11, p. 3322-3329.

152. Puskin J.S. and Gunter Т.Е. Ion and pH gradients across thetransport membrane of mitochondria following Mn uptake in the presence of acetate. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1973, v. 51, N 3, p. 797-803.

153. Quagliariello E., Genchi G., Palmieri F. Respiration-dependent anion uptake by rat liver mitochondria. FEBS Letters, 1971,v. 13, N 5, p. 253-257.

154. Quintanilha А.Т., Mehlhorn R.J. pH gradients across thylakoid membranes measured with a spin-labeled amine. FEBS Lett., 1978, v. 91, N 1, p. 104-108.

155. Recktenwald D., Hess B. A slow conformational change in the transient state kinetics of soluble ATPase of yeast mitochondria. FEBS Lett., 1977, v. 80, N 1, p. 187-189.

156. Reed P.W., Lardy H.A. A23187: a divalent cation ionophore. J. Biol. Chem., 1972, v. 247, N 21, p. 6970-6977.

157. Rosing J., Harris D.A., Kemp A.J., Slater E.C. Nucleotide—binding properties of native and cold-treated mitochondrial ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 376, N 1, p. 13-26.

158. Rottenberg H. ATP synthesis and electrical membrane potential in mitochondria. Eur. J. Biochem., 1970, v. 15, N 1, p. 22-28.

159. Rottenberg H. The mechanism of energy-dependent ion transport in mitochondria. J. Membrane Biol., 1973, v. 11, N 2, p. 117137.

160. Rottenberg H. The measurement of membrane potential and pH in cells organelles and vesicles. Methods Enzymology, 1979, v. 55, N 2, p. 547-569.

161. Rottenberg H., Grunwald Т., Avron M. Direct determination of ДрН in chloroplasts, and its relation to the mechanisms of photoinduced reactions. FEBS Letters, 1971, v. 13, N 1, p.41-44.

162. Rottenberg H., Grunwald Т., Avron M. Determination of ДрН14in chloroplasts. 1. Distribution of C.Methylamine. Eur. J. Biochem., 1972, v. 25, N 1, p. 54-63.

163. Rottenberg H., Lee C.-P. Energy dependent hydrogen ion accumulation in submitochondrial particles. Biochemistry, 1975, v. 14,1. N 12, p. 2675-2680.

164. Rottenberg H., Scarpa A. Calcium uptake and membrane potential in mitochondria. Biochemistry, 1974, v. 13, N 23, p. 4811-4817.

165. Saraste M., Gay N.J., Eberle A., Runswick M.J., Walker J.E. The ATP operon: nucleotide sequence of the genes for the o< ,and £ subunits of Escherichia coli ATP synthase. Nucleic Acids Res., 1981, v. 9, N 25, p. 5287-5296.

166. Satre M., Klein G., Vignais P.V. Structure of beef heart mitochondrial F^-ATPase. Arrangement of subunits as disclosed by cross-linking reagents and selective labeling by radioactive ligands. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 453, N 1, p. 111-120.

167. Schneider D.L., Kagawa Y., Racker E. Chemical modification of the inner mitochondrial membrane. J.Biol.Chem., 1972, v. 247, N 12, p. 4074-4079.

168. Schuldiner S., Padan E., Rottenberg H., Gromet-Elhanan Z., Avron M. ApH and membrane potential in bacterial chromatophores. FEBS Lett., 1974, v. 49, N 2, p. 174-177.

169. Sebald W., Hoppe J., Wachter E. In"Function and molecular aspects of biomemebrane transport" (Quagliariello E. et al., eds.), 1979, p. 63-74. Elsevier, Amsterdam.

170. Senior A.E. On the relationship between the oligomycine sensitivity conferring protein and other mitochondrial coupling factors. J. Bioenerg., 1971, v. 2, N 1, p. 141-150.

171. Senior A.E. Relationship of cysteine and tyrosine residues to adenosine triphosphate hydrolysis by mitochondrial adenosine triphosphatase. Biochemistry, 1973, v. 12, N 19, p. 3622-3627.

172. Senior A.E. The structure of mitochondrial ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1973a, v. 301, N 2, p. 249-277.

173. Senior A.E. Mitochondrial adenosine triphosphatase. Location of sulfhydryl groups and disulfide bonds in the soluble enzyme from beef heart. Biochemistry, 1975, v. 14, N 4, p. 660-664.

174. Senior A.E. Secondary and tertiary structure of membrane proteins involved in proton translocation. Biochim. Biophys. Acta, 1983, v. 726, N 2, p. 81-95.

175. Sierra M.F., Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrial membrane system. Purification of a mitochondrial product of the ATPase. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1973, v. 70, N 6, p. 31553159.

176. Spitsberg V.L., Blair J. Evidence supporting the identity of beef heart mitochondrial chloroform released adenosine triphosphatase (ATPase) with coupling factor 1. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 460, N 1, p. 136-141.

177. Sternweis P.C., Smith J.B. Characterization of the purified membrane attachment ( "5") subunit of the proton translocating ATPase from E.coli. Biochemistry, 1977, v. 16, N 18, p. 40204025.

178. Sugiyama Y., Mukohata Y. Modification of one lysine by pyridoxal phosphate completely inactivates chloroplast coupling factor

179. ATPase. FEBS Lett., 1979, v. 98, N 2, p. 276-280.

180. Tedeschi H. Mitochondrial compartments: a comparison of twoLmodels. "Current topics in membranes and transport", 1971, v. 2, p. 207-231.

181. Tedeschi H. The mitochondrial membrane potential. Biol. Rev.,1980, v. 55, N 2, p. 171-206.

182. Ting L.P., Wang J.H. Functional groups at the catalytic site of F.J adenosine triphosphatase. Biochemistry, 1980, v. 19, N 25, p. 5665-5670.

183. Tondre C., Hammes G,G. A kinetic study of the binding of an

184. ADP fluorescent analog to mitochondrial ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v. 314, N 2, p. 245-249.

185. Tsuprun V.L., Mesyanzhinova I.V., Kozlov I.A., Orlova E.V., Shubnicov A.V. Electron microscopy of beef heart mitochondrial F^-ATPase. FEBS Lett., 1984, v. 167, N 2, p. 285-290.

186. Tupper J., Tedeschi H, Microelectrode studies on the membrane properties of isolated mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1969a, v. 63, N 2, p. 370-377.

187. Tupper J., Tedeschi H. Microelectrode studies on the membrane properties of isolated mitochondria. II. Absence of a metabolic dependence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1969b, v. 63, N 3,p. 713-7.17.

188. Tyler D.D., Webb P.R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochem.J., 1979, v. 178, N 2, p. 289-297.

189. Van Der Meulen D.L., Govindje J. Binding of modified adenine nucleotides to isolated coupling factor from chloroplasts as measured by polarization of fluorescence. Eur. J. Biochem., 1977, v. 78, N 2, p. 585-598.N

190. Verheijen J.H., Postma P.W., Van Dam K. Specific labeling of2+ 2 +the (Ca -Mg )-ATPase of Escherichia coli with 8-azido-ATP and 4-chloro-7-nitrobenzofurazan. Biochim. Biophys. Acta,1978, v. 502, N 3, p. 345-353.

191. Verschoor G., Van der Sluis P.R., Slater E.C. The binding of aurovertin to isolated ^ subunit of F^ (mitochondrial ATPase) Stoichiometry of j3 subunit in F^ . Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 462, No 2, p. 438-449.

192. Wagenvoord R.J., Van der Kraan J., Kemp A. Localization of adenosine nucleotide binding sites on beef heart mitochondrial ATPase by photolabelling with 8-azido-ADP and 8-azido-ATP. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 548, N 1, p. 85-95.

193. Waggoner A. Optical probes of membrane potential. J. Membrane Biol., 1976, v. 27, No 4, 317-334.

194. Wakabayashi Т., Kubota M., Yoshida M., Kagawa Y. Structure of ATPase (coupling factor TF^) from Thermophilic bacterium. J. Mol. Biol., 1977, v. 117, N 2, p. 515-519.

195. Walker J.E., Eberle A., Gay N.J., Runswick M.J., Saraste M. Conservation of structure in proton-translocating ATPaseof Escherichia coli and mitochondria. Biochem. Soc. Trans., 1982, v. 10, N 2, p. 203-206.

196. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem., 1969, v. 244, N 16, p. 4406-4412.

197. Weiner M.W. Mitochondrial permeability to chloride ion, Amer. J. Physiology, 1975, v. 228, N 1, p. 122-126.

198. Wrigglesworth J.M., Packer L., Branton D. Organization of mitochondrial structure as revealed by freeze-etching. Biochim.Biophys.Acta, 1970, v. 205, N 2, p. 125-135.

199. Yoshida M., Sone N., Hirata H., Kagawa Y. Reconstitution of adenosine triphosphatase of thermophilic bacterium from purified individual subunits. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, N 10, p. 3480-3485.

200. Yoshida M., Sone N., Hirata H., Kagawa Y. Evidence for three CX subunits in one molecule of F^-ATPase from thermophylic bacterium PS-3. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1978,v. 84, N 1, p. 117-122.

201. Выражаю искреннюю благодарность Игорю Анатольевичу Козлову за руководство и постоянное внимание к работе.