Механизмы регулирования активности Н+-АТФазы хлоропластов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Жесткова, Инна Матвеевна

• Жесткова, Инна Матвеевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Жесткова, Инна Матвеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Современные представления о механизме фотосинтетического фосфорилирования

2. Сопрягающий фактор (СФ-j-) Н+-АТФазного комплекса хлоропластов . . I

2.1. Физико-химические свойства молекулы

2.2. Четвертичная структура

2.3. АТФ-гидролазная активность фермента; способы ее индуцирования.

2.4. Ключевая роль в регулировании сопряжения между транспортом электронов и синтезом АТФ. Модификация активности природными соединениями

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава I. УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ СОПРЯГАЮЩЕГО

ФАКТОРА ИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРИТЕРИЯ ГОМОГЕННОСТИ

1.1. Выделение и очистка СФ1.

1.2. Флуоресцентные свойства и флуоресцентный критерий чистоты фермента

1.3. Эффективность очистки на Сефадексе Г-200.

1.4. Кинетические характеристики гомогенного препарата

1.5. Влияние ингибиторов

Глава П. ХАРАКТЕРИСТИКА ВЛИЯНИЯ КВЕРЦЕТИНА И БИКАРБОНАТА

НА ИЗОЛИРОВАННЫЙ СФХ

ПЛ. Влияние кверцетина на АТФ-гидролазную активность

П.2. Комплекс кверцетин-металл как взаимодействующая с сопрягающим фактором форма флавоноида.

П.З. Кверцетин-индуцируемые изменения конформациопного состояния C<£j

П.4. Зависимость АТФазной активности от концентрации бикарбоната и эффект совместного действия кверцетина и ионов НСО^"".

Глава Ш. ИНДИВИДУАЛЬНОЕ И СОВЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФЛАВОНОИДА

И БИКАРБОНАТА НА ПРОЦЕСС Ф0Т0Ф0СФ0РИЛИР0ВАНИЯ

Глава 1У. РЕГУЛИРОВАНИЕ СКОРОСТИ ФОТОСИНТЕЗА В ИНТАКТНЫХ

ХЛОРОПЛАСТАХ И ЦЕЛЫХ КЛЕТКАХ КВЕРЦЕТИНОМ И БИ

КАРБОНАТОМ.■.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы регулирования активности Н+-АТФазы хлоропластов»

Изучение механизмов регулирования функций, процессов и частных реакций в растительном организме представляет собой одну из фундаментальных задач современной физиологии растений, решением которой обусловлена возможность управления его фото-биосинтетической деятельностью. Особое значение имеет познание арсенала средств, используемых фотосинтезирующей клеткой для авторегуляции процесса фотосинтетического фосфорилирования как энергетической оснош ее метаболизма. В процессе фотофосфори-лирования ключевое положение занимает комплекс обратимой Н+~ АТФазы, утилизирующей энергию разности электрохимических потенциалов ионов Н+ в концевую фосфатную связь молекулы АТФ. Это определяет актуальность исследований механизмов эндогенного контроля активности Н+-АТФазы. Вместе с тем, регуляторный аспект ее функционирования еще не подвергнут детальному и систематическому исследованию.

Синтез или гидролиз АТФ осуществляется каталитическим компонентом Н+-АТФазного комплекса,-собственно АТФазой, сопрягающим фактором I, СФ-j-. В силу своей молекулярной организации -сложной четвертичной структуры, наличия пунктов связывания эффекторов, конформационной лабильности,"-СФ2 служит точкой приложения для различных регулирующих агентов. К настоящему времени подтверждена зависимость активности фермента от широкого круга физико-химических факторов внутриклеточной среды. Однако, природа метаболитов, контролирующих его активность, остается неясной.

При экзогенном действии активность СФд- эффективно инги-бируется одной из групп растительных фенолов'- флавоноидньши агликонами, биосинтез которых происходит в хлоропластах и тесно связан с процессом фотосинтеза. Наряду с этим, некоторые органические и неорганические анионы оказывают на COj стимулирующее влияние. Часть из них, такие как бикарбонат, фосфат, малеат постоянно присутствуют в хлоропластах; их концентрация сильно варьирует в зависимости от конкретных условий осуществления фотосинтеза.

Изменение активности сопрягающего фактора в результате действия стимулирующих анионов и флавоноидных агликонов может играть роль регуляторного механизма Н+-АТФазы. Возможность существования подобного механизма не исследована. Поэтому, экспериментальный анализ влияния этих соединений на СФ| и весь комплекс осуществляемых при его участии процессов стал целью настоящей работы.

Исходя из цели работы, была поставлена задача - изучить влияние флавоноида кверцетина и анионов НСОз" на:

- активность и конформационное состояние изолированного сопрягающего фактора;

- процессы синтеза и гидролиза АТФ в изолированных хлоропластах;

- фотосинтез выделенных интактных хлоропластов растений и клеток водорослей.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. Современные представления о механизме фотосинтетического фосфорилирования

Один из основных постулатов биологии гласит, что биологические системы стремятся к состоянию,максимально удаленному в данных условиях от состояния равновесия (Бауэр,1935)• Поддержание их в неравновесном состоянии возможно лишь при условии непрерывного притока энергии из внешней среды. Для фотосинтези-рующих организмов внешним источником свободной энергии служит поток квантов света. Абсорбция световой энергии, преобразование ее в энергию возбужденного электрона и запасание в форме АТФ и НАДФН происходит в результате комплекса различных по природе и скорости реакций - физических, фотохимических и энзиматических - в своей совокупности составляющих процесс фотосинтетического фосфорилирования. Фотофосфорилирование осуществляется в тила-коидных мембранах хлоропластов, в которых локализованы светосо-бирующие пигментные матрицы, реакционные центры, компоненты электронтранспортиых цепей, а также АТФазные комплексы, ответственные за синтез АТФ.

Началом изучения фотосинтетического фосфорилирования следует считать 1954 Г., когда Арнон и др. ( Arnon et al.f 1954) открыли способность изолированных хлоропластов синтезировать на свету АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Поскольку в первых работах скорость реакций фосфорилирования была невелика, возникли сомнения в том, что эти реакции могут иметь отношение к механизму превращения энергии при фотосинтезе. Однако, по мере совершенствования методических разработок на изолированных хлоропластах был достигнут такой уровень активности фосфорилирования, который не только соответствовал энергопотребности природного процесса восстановления COg в интактных листьях, но при некоторых условиях превосходил его.

Уже в ходе первых экспериментальных работ было выдвинуто предположение о связи синтеза АТФ и транспорта электронов, донором которых является молекула возбужденного квантом света хлорофилла ( Arnon et ai., 1954). Допускалось, что испускаемый возбужденной молекулой хлорофилла электрон перемещается по цепи переносчиков обратно к хлорофиллу, выделяя энергию на отдельных стадиях этого процесса, которая аккумулируется в макроэргиче-ских связях молекулы АТФ. Этот процесс получил название циклического фосфорилирования ( Arnon et al., 1954). В дальнейших исследованиях была обнаружена сопряженность синтеза АТФ с индуцируемым светом транспортом электронов от к НАДФ*. Этот тип фосфорилирования был назван нециклическим ( Arnon et al,, 1958).

Проблема сопряжения электронтранспортных реакций с процессами накопления энергии в реакциях фосфорилирования сразу стала предметом интенсивного исследования. Были установлены две стадии в процессе фотофосфорилирования - световая, во время которой возникает первичный высокоэнергетический интермедиат (Хе), и темновая, на протяжении которой энергия Хе используется в реакциях фосфорилирования (Shen, Shen, 1962; Hind, Jagen-dorf, 1963).

В течение длительного времени вопрос о природе Хе и механизме его участия в образовании АТФ решался в рамках "химической" гипотезы энергетического сопряжения (jagendorf, Uribe, 1967). В соответствии с этой гипотезой Хе - нефосфорилированный г» макроэргический интермедиат, являющийся продуктом взаимодействия восстановленного переносчика электронов (ВН2) 0 промежуточными соединениями (I и С), играющими роль факторов сопряжения:

1) БН2 + I —ВН2 - I

2) Ш2 - I + С —>- В - I + СН2

В последующих стадиях переносчик водорода замещается на фосфатную группу, а образующийся интермедиат реагирует с АДФ:

3) В~1 + Р —Р + В

4) 1~Р + АДФ---АТФ + I

Несмотря на упорные усилия,выделить и идентифицировать высокоэнергетические соединения не удавалось. Кроме того, с позиций "химической" гипотезы не поддавался объяснению тот факт, что фосфорилирование обнаруживалось только в препаратах орга-иелл, сохраняющих целостность мембран, ограничивающих объем. Все это стимулировало разработку новых путей для объяснения механизма сопряжения.

Общее признание получила в настоящее время теоретически обоснованная, доказанная экспериментально в своих основных положениях хемиосмотическая теория, сформулированная Митчелом в 196I-1966 гг., сначала применительно к окислительному, а затем к фотосинтетическому фосфорилированию (Mitchell, 1961,1966). В основу теории положен постулат об облигатном сопряжении потока электронов по электрон-транспортной цепи с переносом ионов водорода через мембрану. Возникающий при этом трансмембранный электрохимический потенциал ионов Н+ считается движущей силой для синтеза АТФ. Неоспоримым достоинством хемиосмотической теории стало логичное объяснение структурной ассиметрии мембран и векторности совершаемых в ней процессов* Неравномерное распределение ионов Н+ по обе стороны мембраны обусловлено, согласно Митчелу, ассиметричной организацией редокс-цепи, состоящей из последовательно сменяющих друг друга переносчиков электронов (Пе") и переносчиков водорода (ПН). В пункте взаимодействия Пе~ с ПН происходит поглощение Н+ из среды, а взаимодействие переносчиков Н с переносчиком электронов сопровождается выделением 8+ в среду. Связывание и выделение Н+ в водный раствор эквивалентно переносу их через мембрану, что должно приводить к образованию на ней разности электрохимических потенциалов ионов Н+ ( Л/Чн* ). Его энергия может расходоваться на синтез АТФ при участии АТФ-синтетазы.

Исходя из принятой z -схемы фотосинтеза, основная идея хемиосмотической теории проиллюстрирована схемой, приведенной в обзоре Витта ( Witt, 1979) (рисЛ).

Электрохимический потенциал ионов Н+ включает два энергетически равноценных компонента: трансмембранную разность электрических потенциалов (д^р ) и градиент концентрации свободных ионов Н+ между двумя компартментами, разделенными мембраной ( А РЮ* Хемиосмотический механизм допускает возможность синтеза АТФ за счет энергии любой из этих составляющих, а такие их суммы.

Необходимым условием для осуществления указанной последовательности процессов является высокое электрическое сопротивление сопрягающей мембраны и, соответственно, низкая проницаемость для ионов. В соответствии с теорией Митчела все частные реакции и процессы окислительного и фотосинтетического фосфорилирования обратимы. Применительно к конечному этапу это означает, что использование ДМи+ вызывает синтез АТФ, а гидро

6НЕШНЯЯ ФАЗА i НАйФН-Н+ 1 \ т НАйФХ

МЕМБРАНА ТИЛАКОИДА

ВНУТРЕННЯЯ ФАЗА рис. I. Схема сопряжения транспорта электронов с образованием электрического поля, перемещением протонов и образованием АТФ в мембранах хлоропластов ( по Витту, 1979 ). лиз АТФ генерирует А(ЧН+ (Mitchell, 1966). Последний процесс является АТФазной реакцией, сопряженной с транспортом ионов Н+ против электрохимического градиента. Согласно этой формулировке сопрягающее устройство представляет собой АТФ-движимый протонный насос, действующий обратимо. По аналогии с другими ион-транспортными АТФазами фермент, катализирующий перенос Н+ против электрохимического градиента, был определен как Н+-АТФаза (Скула чев, Коз лов, 1977).

Хемиосмотический принцип энергетического сопряжения в хлоропластах получил в независимых исследованиях экспериментальные подтверждения ( Jagendorf, Uribe, 1966,1967; Kaplan, Jagendorf, 1968; Schwartz, 1968; Gruhnhagen, Witt, 1970).

Сравнение митохондрий и хлоропластов продемонстрировало аналогию принципов организации энерготрансформирующих процессов в этих органеллах и обнаружило, вместе с тем,ряд особенностей, обусловленных противоположной ориентацией сопрягающих мембран относительно окружающей среды. Так, механизм протонного насоса оказался устроенным аналогично, но с одним существенным отличием: транспорт протонов направлен внутрь компартмента и на свету хлоропласты поглощают протоны ( Jagendorf, Heumann, 1965). В основном вследствие сравнительно высокой проницаемости тила-коидных мембран для ионов,отличных от протона, заряд переносимых в тилакоид Н+ почти полностью компенсируется выходом катионов или поступлением внутрь анионов. В результате на ти-лакоидной мембране представлен электронейтральным градиентом протонов, химический потенциал которого трансформируется в АТФ ( Walker, Crofts, 1970). В противоположность митохондриям сопрягающий механизм в хлоропластах локализован на внешней стороне мембраны (Kannangara et al,, 1970) И синтез АТФ реализуется при движении протонов из тилакоидов во внешнюю среду.

Положение хемиосмотической теории об АТФазе как обратимом протонном насосе, несмотря на многочисленные подтверждения ( Jagendorf, Uribe. 1966; McCarty, Raoker, 1967; McCarty, 1979; Скулачев,Козлов,1977) до сих пор оспаривается (Блюмен-фельд,1976; Чернавская,Чернавский,1979). Высказываются соображения о принципиальной невозможности использования мембранного потенциала и градиента рН в качестве взаимозаменяемых источников энергии для синтеза АТФ одним и тем же молекулярным устройством (Блюменфельд,1976; Boyer, 1977). Нет единого мнения по вопросу о том, используется ли для синтеза АТФ энергия трансмембранного градиента Н+ или энергия дегидратированных протонов, поступивших внутрь липидного бислоя ( Williams, 1974, 1978; Кочергинский,1979; Ort, Dilley, 1976 а,Ь ;Prochaska,

Dilley, 1978). На возможность синтеза АТФ в отсутствие трансмембранных градиентов указывают данные об образовании АТФ в реконструированной системе на границе раздела октан - вода (Ягу-жинский и др., В75). Вюказано предположение о возникновении в мембране тилакоидов на свету локальных внутримембранных градиентов рН, энергия которых может быть использована для фосфорилирования ( Ort, Dilley, 1976 а,Ъ ; Prochaska, Dilley, 1978;

Dilley, Backer, 1980). Тем не менее, хемиосмотическая теория продолжает оставаться общепринятой основой в решении вопроса о механизме синтеза АТФ.

Первый вариант механизма утилизации в АТФ с помощью АТФазы допускал образование высокоэнергетического предшественника АТФ (Х^У) при участии факторов ХН и УОН - низкомолекулярных соединений гидрофобной природы, легко подвижных в липидной фазе мембран. Однако, он не нашел экспериментального подтверждения. Впоследствии Митчелл( Mitchell, 1972) и независимо Глаголев и Скулачев (1974) выдвинули гипотезу о том, что стадия обратимой трансформации Aff^t АТФ не требует участия каких-либо высокоэнергетических интермедиатов. Проведенные исследования привели к выводу, что АТФ есть первый и единственный химический продукт в системе мембранного фосфорилирования. В 1973 г. Митчелл ( Mitchell, 1973) рассмотрел альтернативную схему превращения форм энергии на конечном этапе, которая предусматривала, что заряженными группами, перемещающимися в электрическом поле, являются анионы АДФ и фосфата. При этом принималось, что перенос нуклеотидов и фосфата осуществляется АТФ-синтетазой, а гидрофобные компоненты мембраны образуют канал протонной проводимости между водной фазой и активным центром АТФ-синтетазы.

В результате длительных и упорных усилий обратимые Н+-АТФазы выделены иа всех мембран, осуществляющих окислительное (бактерии и митохондрии эукариотов) или фотосинтетическое (фото синтезирующие бактерии и хлоропласты эукариотов) фосфорили-рование. Продемонстрировано сходство их состава и свойств, что предполагает универсальность механизма их функционирования в системе мембранного фосфорилирования. Проведена реконструкция выделенных АТФаз в природные и искусственные мембраны. Результатами исследований установлено, что функциональный комплекс обратимой Н+-АТФазы хлоропластов, подобно АТФазам других источников, представляет собой систему ин двух элементов. Центральным элементом комплекса является высокомолекулярный белок, обладающий АТФ-синтетазной и АТФ-гидролазной активностью. Этот компонент получил название сопрягающего фактора I (СФ^ или растворимой АТФазы. Другой компонент, обозначаемый как СФП, образует олигомер из 3-4 низкомолекулярных гидрофобных полипептидов, которые формируют протонный канал в мембране. Более подробный анализ структуры и функций составных элементов Н+-АТФ-азы можно найти в обзоре Кагавы и др. ( Kagawa et ai., 1979). Несмотря на столь значительные достижения в исследовании Н+~АТФ-•аз остается неизвестным механизм трансформации энергии градиента электрохимического потенциала ионов Н+ в энергию макроэрги-ческих связей молекулы АТФ.

В 1964 г. Бойер (1964) высказал предположение о том, что окисление и фосфорилирование в митохондриях могут быть сопряжены посредством конформационных изменений фермента, участвующего в переносе электронов и (или) энергии. Предполагалось, что выделяемая при окислении субстрата энергия затрачивается на создание напряженной конформации фермента. Последующее возвращение в исходную конформацию сопровождается использованием накопленной энергии для синтеза высокоэнергетического соединения, например тиоэфира, образующегося в результате реакции между карбоксильной и сульфгидрильной группами фермента. Затем происходит перенос энергии на АДФ. В I97I-I972 гг. была опубликована кон-формационная гипотеза (Блюменфельд, Кольтовер,1972; Bennun,

1971), в которой предложена модель сопряжения электрон-транспортных реакций с образованием макрозргических связей АТФ через стадию знеproконформации сопрягающего фактора. Синтез АТФ, согласно этой модели, является результатом конформационной релаксации сопрягающего фактора из энергизованного в деэнергизованное состояние. Одновременно Рири и Ягендорф (Ryrie, Jagendorf,

1972) в тщательно выполненных экспериментах показали, что энер-гизация хлоропластов светом и последующая деэнергизация при добавлении разобщителей сопровождается обратимыми изменениями конформационного состояния сопрягающего фактора. Как показали выполненные ранее работы, СФ2 является анионом, способным к акцептированию протонов и получены данные, свидетельствующие об изменении его злектро-химических свойств при освещении ( Scholeg et ai,, 1969; Lynn, straub, 1969a). Сумма приведенных результатов рассматривается как веский довод в пользу предположения, что энергия, вырабатываемая мембраной, используется для изменения конформации ионизованного компонента АТФ-синтетазы. Этот вариант механизма энергетического сопряжения д (Ч^ч с синтезом АТФ считается в настоящее время наиболее вероятным. Согласно гипотезе Митчела ( Mitchell,1974) поток энергии, создаваемый редокс-цепью, используется для синтеза АТФ без предварительного расходования на изменение конформации сопрягающего фактора. Гипотеза предполагает прямое использование протондвижущей силы, генерируемой на мембране, для синтеза АТФ путем протонирования атомов ки слорода молекул фосфата. Одновременная нуклеофильная атака аденозиндифосфатом активированного фосфата должна привести, по мнению Митчела, к синтезу АТФ. Слейтер ( Slater, 1976) и Бойер ( Boyer, 1974) предложили иной механизм использования сопрягающим фактором, в котором основное внимание обращается на присутствие в его молекуле прочноевязанного АТФ. В результате конформационного изменения СФ£, индуцируемого электрохимическим градиентом протонов, связь О — ф в молекуле АТФ, связанной с ферментом, становится ла* бильной и нуклеотид переходит в раствор. После высвобождения связанного АТФ СФ£ приобретает способность связывать аденин-нуклеотиды из среды и катализировать процесс их превращения. Механизм Бойера-Слейтера согласуется с одним из специфических свойств АТФаз сопрягающих мембран - способностью прочно связывать нуклеотиды и освобождать их при энергизации мембраны. Это свойство используется в настоящее время в качестве фундамента при создании всех схем фосфорилирования.

Мондрианакис и Тиферт (Moundrianakis, Tiefert, 1979) высказали предположение, согласно которому АТФ в хлоропластах образуется в реакции, подобной аденилаткиназной. Основой для такого утверждения стало обнаружение способности СФ£ катализировать превращение связанного АДФ в связанный АТФ и свободный АМФ ( Roy, Moundrianakis, 1971). Скорость процесса трансфосфор и лирования, крайне низкая в условиях дезнергизации ( Cantiey, Hammes, 1975) резко активизировалась при освещении хлоропластов ( Roy, Moundrianakis£971) • По модели механизма фосфорилирования, предложенной Мондрианакисом и Тифертом (Moundrianakis, Tiefert, 1979) в энергизованном состоянии СФ| связывает неорганический фосфат из среды и переходит в конформацшо, благоприятную для взаимодействия связанного фосфата с АМФ. Допускается, что весь цикл синтеза АТФ не требует притока АМФ - он присутствует в каталитических количествах связанным на СФр Образованная таким способом молекула АДФ остается прочносвязанйой с ферментом, который при этом переходив в форму, способствующую связыванию молекулы АДФ из среды в субстратном центре. На следующей стадии происходит обмен р -фосфатной группы между молекулами прочносвязанной и субстратной АДФ. Образованный в результате этого взаимодействия АТФ переходит в среду, а АМФ снова вступает в реакцию. В рамках описанной схемы прочносвязанный АДФ рассматривается как донор фосфорильной группы, а молекула АДФ,сорбируемая в субстратном центре, как ее акцептор. В соответствии с предлагаемой моделью сопрягающий фактор функционирует по флип-флоп механизму: образование донора фосфорила на одной стороне фермента вызывает связывание субстратного АДФ в акцепторном пункте. По мнению авторов энергия необходима для перехода СФ^ в форму, способную связывать нуклеотиды и неорганический фосфат, а также для освобождения синтезированного АТФ. Существует ряд возражений против адекватности модели Мондрианакиса и Тиферта. Вместе с тем, эта модель является предметом пристального внимания специалистов, поскольку учитывает специфику СФ£ как ферментной системы, состоящую в возможности функциониро-" вать как аденилаткиназа. Подобной способностью согласно имеющимся данным, не обладают ни митохондриальная, ни бактериальная АТФазы.

Подводя итог анализа современных представлений о закономерностях трансформации энергии в мембранах хлоропластов, следует отметить, что нерешенность вопроса о принципах функционирования обратимой Н+-АТФазы создает в настоящее время основное препятствие на пути к окончательному решению проблемы аккумуляции энергии в растительной клетке. Фундаментальный вклад в понимание механизма работы Н+-АТФазы должны внести исследования каталитических свойств сопрягающего фактора, механизма сопряжения транслокации протонов с реакциями синтеза и гидролиза АТФ, а также тесно связанное с этим изучение способов и механизмов регулирования его активности.

2. Сопрягающий Фактор ССФ^) Н*-АТФазного комплекса хлоропластов

История изучения сопрягающего фактора хлоропластов начинается С ОПЫТОВ Ягендорфа И Смита ( Jagendorf, Smith, 1962), которые обнаружили, что в хлоропластах, отмытых разбавленным раствором ЭДТА, транспорт электронов и фотофосфорилирование разобщены. Аврону ( Avron, 1963) удалось восстановить фосфорилирование у отмытых хлоропластов добавлением экстракта, полученного с помощью ЭДТА. Впоследствии Вамбутас и Рэкер ( Vambu-tas, Racker, 1965) очистили сопрягающий фактор и показали, что он одновременно является латентной Са -зависимой АТФазой, которая может быть активирована обработкой препарата трипсином. МакКарти и Рэкер ( McCarty, Racker, 1966), используя антитела к СФ|,продемонстрировали участие С а ^-зависимой АТФазы в терминальной стадии фосфорилирования. Сумма этих фактов послужила- поводом для развертывания широких исследований свойств и механизма функционирования сопрягающего фактора. Анализ исследований, имеющих отношение к проблеме регулирования СФ]-,является целью последующего изложения.

2.1. Физико-химические, свойства молекулы

Сопрягающий фактор хлоропластов составляет около 10% от суммы белков тилакоидных мембран. Из состава мембран этот белок извлекается при гипотонической обработке хлоропластов, многократной промывке водой и наиболее полно (до 70%) экстракцией ЭДТА в отсутствии солей при слабо щелочном рН. Пошшение экстра-гируемости при снижении концентрации солей и протонов свидетельствует о ионном характере взаимодействия СФ2 и пунктов его крепления в мембране. Сопрягающий фактор был очищен несколькими методами ( Bennun, Racker, 1969; Howell, Moundrianakis, 1967; Farron, 1970; Lien, Racker, 1971) и определены его физические и химические свойства. Результаты этих исследований показали, что COj представляет собой молекулу белка с коэффициентом седиментации 13,8S , парциальным объемом 0,737, относительной молекулярной массой 325000 и согласно этим параметрам относится к глобуллярным белкам ( Farron, 1970). Очищенный белок содержит прочное вязанные адениннуклеотиды: по данным Харриса и Слейтера ( Harris, siafer, 1975) около одного моля АДФ и АТФ на моль белка, по другим данным - только АДФ в молярном соотношении 1:1 ( Posoreky, Jagendorf, 1976). На электронных микрофотографиях препарата сопрягающего фактора, приготовленного методом негативного контрастирования, обнаруживаются сферические частицы размером 90-95 А0 ( Garber, Steponkis, 1974; Moundrianakis, 1968). Доказано, что аналогичного размера частицы, локализующиеся на наружной поверхности тилакоидов, являются сопрягающим фактором ( Garber, Steponkis, 1974; Moundrianakis, 1968).

Аминокислотный состав фермента фермента характеризуется сравнительно высоким содержанием гидрофобных аминокислот (Раг-ron, 1970; Nelson, 1976). Сопрягающий фактор относится к редкому классу не содержащих триптофана белков. При возбуждении ультрафиолетом флуоресценция гомогенного раствора АТФазы определяется остатками тирозина и имеет характерный спектр ( Lien, Racker, 1971). Берцборн и др. ( Berzborn et al., 1975) ис-.пользовали флуоресцентные свойства АТФазы для оценки ее гомогенности.

СФ| содержит 12 остатков цистеина. У восьми из них SH-группы находятся в восстановленном состоянии, а четыре остатка образуют две s-s связи ( Farron, 1970). Латентный фермент вяло реагирует с Н -этилмалеимидом - щелочным водораствэримым реагентом на SH-группы. Однако, при переходе фермента в активированное состояние его реакционная способность резко возрастает, что объясняется демаскированием sH-rpynn, непосредственно связанных с механизмом функционирования СФ2 ( Cantley, Hammes, 1976). В активном состоянии фермент доступен для действия широкого круга соединений и ионов, взаимодействующих с SH-группами: Hg++, Zn++ , Cd++ ( Lynn, Straub, 1969a; Chang, Kahn, 1968), ПХМБ, парахлорфенилсульфоната, п-оксимеркурийбензоата ( Vambutas, Racker, 1965; Pedersen, 1976).

По разным определениям в составе фермента содержится 74—84- остатка тирозина ( Binder et al., 1978). Согласно результатам кислотно-основного титрования две четверти тирозино-вых остатков локализованы на поверхности белковой молекулы, одна четверть находится вблизи поверхности, а остальная часть погружена в гидрофобную область молекулы ( Lien et al., 1972).

Подобно митохондриальному, сопрягающий фактор хлоропластов инактивируется при понижении температуры ( McCarty, Racker, 1966). Холодовая инактивация сопровождается диссоциацией на субъединицы, образующие четвертичную структуру фермента ( Lien et al., 1972). Присутствие низких концентраций АТФ предохраняет фермент от инактивации. Тот же эффект достигается при рекомбинации извлеченного СФ£ с мембранами тилакоидов или инкубации с липидами хлоропластов ( Benmm, Racker, 1969; Liv-ne, Racker, 1969).

Инкубация хлоропластов или изолированного СФ£ с высокими концентрациями солей также вызывает его инактивацию" (Kamienitz-ку,1Те1аопД975). Инактивация предотвращается добавлением АТФ и в меньшей степени - ГТФ и АДФ (Nelson, Broza, 1976). Наблюдаемые эффекты предполагают важную роль гидрофобных и электростатических взаимодействий в поддержании стабильности структуры белка. По мнению Льена и соавт. ( Lien et al., 1972) связывае-:;": мый в специфических пунктах фермента АТФ является стабилизатором взаимодействия субъединиц.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа кристаллический СФ| представляет собой сферу с радиусом 55 А0. Предполагается, что внутри молекулы расположена область с низкой электронной плотностью, диаметр которой < 20 А0 ( Paradiea et al., 1978)• Вторичная структура сопрягающего фактора исследована методом ИК и КД спектроскопии и по этим данным 80% пептидных цепей образуют <L -спираль (Сухомудренко и др.,1977), благодаря чему обеспечивается высокая устойчивость макромолекулы. СФ-j- имеет сложную четвертичную структуру и этим обусловлена высокая конформационная лабильность фермента и, следовательно, широкие возможности для его регулирования.

2.2. Четвертичная структура

При обработке Na-додецилсульфатом в присутствии мер-каптозтанола COj диссоциирует на субъединицы, которые могут быть обнарузкены' электрофорезом в ПААГ. По данным электрофореза препарат содержит пять полипептидных компонентов - JLt jif yt S и 5 с м.в. 59000, 56000, 37000, 17500 и 13000 соответственно ( Berzborn, Racker, 1972; Nelson et al., 1972a; Nelson et ai*tI973). Сходный суб^единичный состав имеет растворимая АТФаза мембран митохондрий ( Knowies, Penefsky, 1978) и бактерий ( Andrea et al., 1978). Сохранение субъединичной структуры в процессе эволюции свидетельствует о необходимости ее для функционирования Н+-АТФаз.

Стехиометрия субъединичного состава точно не установлена, но наиболее вероятным считается состав, соответствующий формуле pz ^ & . Эта формула принята на основе данных изучения пространственной структуры СФ2 методом ковалентных сшивок соседних полипептидов химическими реагентами (Baird, Hammes, 1976).

Исследование функций индивидуальных субъединиц проводилось различными методами, включая иммунохимические, ингибиторный анализ, метод разборки и реконструкции комплекса.

Подвергнув сопрягающий фактор обработке пиридином, Нельсон и др. ( Nelson et al., 1973) полуяили препарат, который содержал только об , р и у -субъединицы. Лишенный минорных субъединиц препарат сохранял АТФазную активность, но утрачивал способность к восстановлению фосфорилирования в ЭДТА-обработан-ных хлоропластах. Это привело к шводу о формировании об , и у -компонентами основного функционального комплекса.

Той же группой авторов были получены антитела (AT) к индивидуальным субъединицам и изучено их влияние на реакции, осуществляемые при участии СФ| ( Nelson et al., 1973). Показано, что AT против об и If -субъединиц подавляют фосфорилирова-ние и Mg- зависимую светоактивируемую АТФазную активность хлоропластов. AT к об-субъединице ингибировали также свето-зависимую стимуляцию поглощения Н+ хлоропластами в присутствии низких концентраций АТФ, обнаруженную ранее МакКарти и др. (McCarty et al., 1971). Это предполагало существование на об -компоненте АТФ-связывающего пункта. AT против об и р -фрагментов агглютинировали хлоропластные частицы, тогда как AT против меньших субъединиц этой способностью не обладали. Каждый из типов антител, взятый в отдельности, не подавлял АТФазную активность изолированного СФр однако AT против суммы ^ и jf -субъединиц ингибировали активность точно также, как AT к полному СФ|. Результаты этой работы позволили сделать несколько выводов о функциональных взаимоотношениях компонентов сопрягающего фактора, одним из которых стал швод о тесной связи ^ и |f-субъединиц с механизмом синтеза АТФ. Действие AT к ol-субъеди-нице на АТФ-зависимую стимуляцию поглощения протонов хлоропластами дало возможность допустить наличие регуляторного участка на этой субъединице. С другой стороны, допущено включение л -субъединицы в формирование активного центра, поскольку «Л.-AT оказались мощными ингибиторами фосфорилирования и свето-зависи-мого гидролиза АТФ. Впоследствии, при обработке сопрягающего фактора трипсином удалось получить АТФазу, содержащую лишь две- Л и р -субъединицы ( Deters et al,, 1975). Такой препарат не отличался по своим каталитическим свойствам от фермента с полным набором субъединиц. Эти эксперименты не только выявили первостепенное значение Лир -полипептидов для АТФ-азной активности, но и позволили допустить, что активный центр СФ-£ формируется этими типами субъединиц, либо локализуется на одной из них. Мак Эвой и Линн (McEvoy, Lynn, 1973) получили данные, свидетельствующие о необязательности наличия л -субъединицы для АТФазной активности. Авторы обрабатывали фермент трипсином. По мере действия трипсина АТФазная активность увеличивалась и к 90 сек. достигла максимума. К этому времени содержание всех субъединиц кроме |Ъ было резко снижено. Полученный результат согласовался с предположением о расположении каталитического центра на р -субъединице. Детерс и др. ( Deters et al.,I975) обнаружили способность 7-хлор-4-нитро-бензо-2окса-1,3 диазола (НБД-хлорида) - специфического модификатора тиро-зиновых групп белка - ингибировать фосфорилирование, а также АТФазную активность СФ-j- и трипсин-обработанного препарата, состоящего из JL и р -субъединиц. В опытах с использованием радиоактивного НБД-хлорида те же авторы установили специфическое взаимодействие этого ингибитора с р -субъединицей СФр Для инактивации как АТФазной, так и сопрягающей активности было достаточно I эквивалента НБД-хлорида на один эквивалент СФ|. Аналогичные результаты были получены для митохондриальной (Fergusson et al., 1975) И бактериальной АТФазы ( Nelson et al.,1974). Приведенные данные подтверждают участие /3 -субъединицы в формировании каталитического центра, а также предполагают наличие тирозиновых групп в активном центре фермента. Проблема формирования активного центра исследовалась кроме того с применением ковалентно связывающегося с СФ^ аналога АТФ-3/-0 -3-/N (4—ами-до-2 нитрофенил) амино /пропионил/ -АТФ ( earlier et al., 1979). Продемонстрировано ингибирование АТФазной активности сопрягающего фактора этим реагентом. Ингибирование сопровождалось связыванием 1-2 молекул аналога. Объектом атаки ингибитора служила р -субъединица. АТФ защищал СФ£ от ингибирующего действия аналога. Данные этой работы и проведенные в последние годы исследования функциональных групп СФд; другими модифицирующими агентами позволили предположить, что в ферментативной реакции принимают участие помимо тирозиновых лизиноше и аргининовые остатки ( Oliver, Jagendorf,1976; Andreo, Vallejos, 1977; Мальян,1979).

Необходимость участия у -субъединицы в механизме синтеза АТФ была доказана в опытах МакКарти и Фагена ( McCarty,

Fagan, 1973). Согласно результатам этих опытов п-этилмалеи-мид специфически взаимодействует с указанной субъединицей при освещении, ингибируя таким образом фосфорилирование. Функциональная роль у -компонента исследовалась в экспериментах с применением бифункционального о-фенилен бисмалеимида. Было установлено, что в освещаемых хлоропластах реагент связывает между собой две Sн-группы y-субъединицы ( Weiss, McCarty, 1977). В результате подобной модификации фермента происходит ингибирование фосфорилирования и резкое возрастание протонной проводимости тилакоидных мембран. Предположена связь у^-субъединицы с механизмом транслокации протонов к АТФ-синтезирующим центрам фермента. Поддержкой этому предположению служат результаты опытов на протеолипосомах, реконструированных из гидрофобных белков термофильной бактерии вместе с 6 и В -фрагментами. При добавлении к такой системе очищенного препарата у -субъединицы наблюдалось значительное возрастание Непроводимости везикулярных мембран ( Yoshida et al., 1977).

На основании ряда фактов принято, что 6 -субъединица необходима для правильной ассоциации сопрягающего фактора с мембраной. Фермент, лишенный 6 -фрагмента,утрачивает способность рекомбинировать с обедненными СФ| мембранами и катализировать фотофосфорилирование. Эта функция восстанавливается при добавлении фракции £ -субъединицы (Yonis et al., 1975; Nelson, Karny, 1976). £ -субъединица способна ингибировать АТФазную активность изолированного и мембраневязэнного фермента С Nelson et al., 1972а). Ингибирование АТФазной реакции под действием белкового ингибитора имеет неконкурентный по отношению к АТФ характер. Фотофосфорилирование не чувствительно к его действию, в то время как АТФазная реакция обнаруживает крайне высокую чувствительность: для инактивации АИ-гидролазной активности достаточно I эквивалента белка на один эквивалент сопрягающего фактора (Nelson et al., 1972а). На основе этих фактов сформировалось мнение, что £ -субъединица является природным регулятором АТФ-гидролазной функции Н+-АТФазы фаскег-- Gruhnwald, 1974; Nelson et al., 1972Ъ)• Ингибитор получен в чистом виде и изучены его физико-химические свойства (Nelson et al,, 1972b). Обнаружены существенные отличия свэйств ингибитора СФ хлоропластов и митохондрий. Так, ингибитор СФ2 не: содержит в составе аминокислот тирозина, но включает по одному остатку гистидина, метионина и цистеина на моль белка. Ингибитор C<£j не теряет активность при понижении температуры и обнаруживает высокую чувствительность к действию трипсина. Ингибитор СФ£ отличается высокой гидрофобноетью и шеоким сродством к ферменту. В хлоропластах он прочно связан с сопрягающим фактором и удаляется из его состава только при тепловой обработке препарата в присутствии дигитонина. Белковый ингибитор митохондрий является сравнительно гидрофильным белком и отделяется от фермента во время его фракционирования. По мнению Рекера (Рекер,1979) свойствами ингибитора СФ£ обусловлена затрудненная обратимость процесса фосфорилирования в хлоропластах.

Совокупность данных о взаимодействии СФ^- с антителами позволила построить топографическую схему СФ£ й взаимодействия его субъединиц с мембраной (рис.2а). Поскольку <л и р -субъединицы легко доступны для соответствующих антител, агглютинирующих хлоропласты, они располагаются по этой схеме с периферической стороны мембраны, у -субъединица располагается близко к мембране, в положении, трудно доступном для антител на том основании, что AT к этой субъединице не агглютинируют хлоропласты. 6 -субъединица также труднодоступна, так как 6 -AT не агглютинируют хлоропласты и локализуется по этому признаку вблизи мембраны. На близость -субъединицы к мембране указывает также утрата способности СФ£ к взаимодействию с мембраной после удаления минорных компонентов трипсином ( Deters et al., 1975). AT к X-субъединице препятствуют взаимодействию СФ2 с £ -субъединицей. Предполагается поэтому возможность ее контактирования с активным центром вблизи у -субъединицы.

Однако, метод перекрестных сшивок полипептидов показал, что у -субъединица не прилегает так тесно к мембране, как это мембрана рис. 2. Модель субъединичной структуры сопрягающего фактора хлоропластов. А ) по данным о взаимодействии C<£>j с антителами ( Nelson et al., 1973 ), Б ) по данным метода перекрестных сшивок полипептидов ( Baird, Harames, 1976 ) и переносу энергии между флуоресцирующими хромофорами ( Holowka, Hammes, 1977 ). В варианте ( Б ) показан вид сверху, поэтому субъединица не просматривается. следует из экспериментов с антителами. Модель строения СФ|,составленная по данным этого метода (рис<,2б) предполагает расположение у -компонента в центре комплекса, в окружении d и р -субъединиц. Ингибитор (£ ) взаимодействует с одной из копий оС и р а также с у -субъединицами, & -субъединица, как и в предыдущей модели, осуществляет связь комплекса с мембраной.

Головка и Хаммес ( Hoiowka, Hammes, 1977), пометив различные субъединицы флуоресцентными метками, по переносу энергии определили расстояние между ними. Созданная на основе этих данных схема строения фермента полностью идентична шше-описанной.

Таким образом, исходя из: экспериментальных результатов, ответственный за синтез АТФ в хлоропластах фермент представляет собой комплекс из пяти типов субъединиц, функции между которыми распределены следующим образом:

Л - связывает адениннуклеотиды, р - катализирует процесс их превращения, у - непосредственно взаимодействуя с СФ0, образует единый Н+-проводящий путь к активному центру АТФазы, £ - контролирует АТФ-гидролазную функцию, £ - обеспечивает связь сопрягающего фактора с мембраной.

Последовательность взаимодействия субъединиц в процессе функционирования сопрягающего фактора не установлена. Наличие двух копий <JL и р -субъединиц, а также достаточность одного эквивалента НБД-хлорида для блокирования каталитической активности рассматривается как основание считать димер л- р функциональной единицей фермента ( Moundrianakis, Tiefert, 1979).

2.3. АТФ-гидролазная активность фермента; способы ее индуцирования

Характерным свойством обратимых Н+-АТФаз сопрягающих мембран является латентное состояние АТФ-гидролазной функции. АТФазную активность в препарате сопрягающего фактора хлоропластов удается обнаружить только после обработки его трипсином ( Vambutas, Racker, 1965), нагреванием ( Vambutas, Racker, 1965; Farron, 1970) или инкубации с шсокими концентрациями сульфгидрильного дитиольного соединения дитиоэритрита (ДТЕ) ( McCarty, Racker, 1968). Анализ процесса активации показал, что при термообработке препарата СФ2 происходит разрыв связи между ферментом и белком-ингибитором ( £ -субъединицей) (Nelson et al., 1972b). Ингибитор служит также объектом атаки при кратковременном действии трипсина на сопрягающий фактор ( Nelson et al.,1972а). Сумма этих данных позволила заключить, что в состоянии ассоциации с ингибитором сопрягающий фактор не активен как АТФ-гидролаза.

• Индуцируемая прогревом в интервале 50-65° АТФазная активность резко стимулируется низкими (1-5 мМ) концентрациями ДТЕ и с ее появлением утрачивается способность катализировать реакцию образования АТФ. Сравнение нативного и термоактивированного энзима не шявило каких-либо различий в гидродинамических свойствах их молекул, но нагревание фермента увеличивало количество титруемых иодацетамидом sH-групп, хотя общее число их оставалось постоянным ( Farron, Racker, 1970); Совокупность этих наблюдений привела к шводу, что появление АТФ-гидролазной активности у сопрягающего фактора является результатом конформационного перехода, обусловленного восстановительным расщеплением и внутримолекулярной передислокацией s-s связей . Впоследствии этот вывод подтвердился экспериментами с применением it (1-этил-2-%)-малеимида, где было зарегистрировано восстановление дисульфидных групп до дитиолов при нагревании сопрягающего фактора в присутствии ДТЕ ( Ravizzini et al., 1980);

Роль высоких (20-50 мМ) концентраций ДТЕ в активации АТФазы до конца не понята. В активировании принимают участие сульфгидрильные группы, так как титрование их ингибиторами предотвращает активацию (McCarty, Racker, 1968). Поскольку после удаления ДТЕ диализом АТФаза вновь становится латентной, предполагается, что он шзывает изменение конформации в области взаимодействия макромолекулы с ингибитором.

Изолированные хлоропласты, в отличие от митохондрий, не обладают АТФазной активностью. Это свойство рассматривалось как свидетельство необратимости реакции трансформации энергии в хлоропластах И'служило доводом против аналогии устройств АТФ-синтетазных механизмов у хлоропластов и митохондрий. Такое мнение существовало до тех пор, пока Петрак и Липман ( Petrack, Lippman, 1961) не обнаружили в хлоропластах латентную Mg зависимую АТФазу, которая активировалась светом в присутствии сульфгидрильных соединений. Предположение о том, что АТФазная активность является обращением реакции фосфорилирования возникло уже в ходе первых работ ( Avron, 1962) . Но окончательно это было установлено после открытия в хлоропластах реакции АТФ-Р^-обмена,; чувствительной к разобщителям и ингибиторам фотофосфо-рилирования ( Oarmeli, Avron, 1966; Carmeli, 1969). Открытие Авроном в 1962 г. ( Avron, 1962) Са-зависимой светоактивируе-мой АТФазы в хлоропластах поставило необходимость соотнести ее с реакцией гидролиза АТФ, требующей активирования ионами магния. Впоследствии, при экстракции хлоропластов ЭДТА был выделен сопрягающий фактор ( Avron, 1963). Экстракция ЭДТА одновременно подавляла Са-зависимую АТФазную активность хлоропластов, что предполагало тождественность ее сопрягающему фактору. В дальнейшем было установлено, что очищенный СФ2 обладает Са-зависимой АТФазной активностью ( Vambutas, Racker, 1965). Но потребовались длительные и всесторонние исследования, включая иммунохимические, чтобы подтвердить идентичность Mg- и Са-зависимых АТФаз С сопрягающим фактором ( McCarty, Racker, 1968; Carmeli, 1969).

Перенос хлоропластов из кислой среды в щелочную эффективен в активации АТФазы в той же степени, что и свет. Это рассматривается как доказательство определяющей роли возникающего на свету трансмембранного градиента рН в активации АТФазы светом ( Kaplan et al., 1967; Kaplan, Jagendorf, 1968). Будучи индуцированной, АТФаза сохраняет активность в темноте в течение длительного времени, если к активированным светом хлоро-пластам немедленно добавляется АТФ. В отсутствии АТФ в темноте АТФаза переходит в латентное состояние (Avron, 1962; Hoch, Martin, J963; Petrack et al., 1965). Релаксация к латентному состоянию стимулируется АДФ и магнием, а фосфат стабилизирует активированное состояние фермента ( Carmeli, 1969;carmeli, Lifshitz, 1972). Из этих данных следует, что СФ| приобретает свойства АТФ-гидролазы лишь после перехода в энерги-зованное состояние.

Латентная АТФаза в хлоропластах может активироваться при кратковременной обработке их трипсином ( Lynn, straub, 1969а; Backer-Gruhnwald, van Dam, 1974). ЭТО позволяет Считать, что переход мембраневязанного сопрягающего фактора в режим работы АТФ-гидролазы сопряжен с диссоциацией ингибиторной субъединицы. Продолжительная инкубация хлоропластов в темноте с шсокими концентрациями дитиоэритрита также активирует АТФазную активность. Активная АТФаза может быть получена в присутствии низких концентраций ДТЕ, если предварительно хлоропласты надержать на свету ( McCarty, Racker, 1968). Совокупность приведенных фактов подтверждает положение о том, что обращение конечной стадии фотофосфорилирования связано с изменениями в структуре сопрягающего фактора, которые в конечном счете сводятся к обратимой диссоциации £ -субъединицы и перегруппировке дисульфидных связей. Согласно мнению МакКарти ( McCarty, 1979) подобные перестройки в четвертичной и, по-видимому, третичной структуре СФ^ могут индуцироваться энергопотенциалом А/Чц+. Действительно, в экспериментах на митохондриях и хлоропластах получены данные, указывающие на энергозависимый характер диссоциации ингибитора (Van de Stadt et al., 1974).

Кофакторами процесса с ветозависимой активации АТФазы наряду с S H-соединениями являются ионы магния, в отсутствии которых АТФаза активируется светом лишь в незначительной степени, Вместе с тем, эти же кофакторы обеспечивают наиболее интенсивное осуществление процесса фотофосфорилирования.

Таким образом, индуцирование АТФ-гидролазной активности происходит в условиях, которые в принципе необходимы для синтеза АТФ и сохранения АТФ-синтетазной активности: при наличии знергопотенциала в форме трансмембранного градиента Н+ на тила-коидной мембране, сульфгидрильных соединений и ионов магния. Это, достаточно парадоксальное явление, получило объяснение в нашей работе (!есткова,Молотковский,1976). Нами обнаружено су

-Заимствование порогового значения дрН для активации гидролиза АТФ в хлоропластах, которое прешшает значение градиента, необходимого для синтеза АТФ в процессе фотофосфорилирования.

Светоактивируемая АТФаза стимулируется низкими концентрациями разобщителей, но высокие концентрации вызывают ее инги-бирование (Mccarty, Racker, 1968). Активированная АТФаза поглощает протоны из среды и переносит их во внутритилакоидное пространство (Carmeli, 1970). Последнее показывает, что мемб-рансвязанный СФ| не только катализирует синтез АТФ и его разложение, но и участвует в обратимой транслокации протонов. Транслокация протонов внутрь тилакоидов приводит к возникновению трансмембранного градиента рН ( Backer-Gruhmvald, van Dam, 1973). За счет образованного АТФазой дрН осуществляется несколько знергозависимых процессов, в том числе: набухание хлоропластов в солях аммония (Racker, Crofts, 1967), поглощение ионов кальция ( Racker, Crofts, 1967), обращение транспорта электронов против редокс потенциала (Rienits et al., 1974).

Все приведенные результаты получены на хлоропластах, у которых внешняя мембрана отсутствует. Для индукции АТФазной активности в интактных хлоропластах не требуется присутствие сульфгидрильных соединений. Необходимым и достаточным условием для активации в этом случае является только свет (Mills, Hind, 1979; Mills et al., 1980). За последние годы получены убедительные доказательства наличия в интактных органеллах растворимого низкомолекулярного белка тиоредоксина, способного стимулировать активность ряда светозависимых ферментов хлоропластов ( Wolosiuk et ai#, 1979). Показана его способность стимулировать АТФазную активность мембраневязанного и изолированного СФ2 ( McKinney, Buchanan, 1978). Установлена аналогия активации тиоредоксином и ДТЕ. Предполагается, что тиоредоксин является природным дитиолом, контролирующим переход латентной АТФ азы в активное состояние в интактных хлоропластах и целых клетках. Возможный механизм контроля: восстановленный с помощью системы ферредоксин-ферредоксин-тиоредоксин редуктаза белок взаимодействует с ^рН-активированной формой Н+-АТФазы, превращая дисульфидные группы СФ^ в сульфгидрильные. В результате приобретается возможность связывать и гидролизовать АТФ. В темноте происходит обратная реакция. Изменение освещенности может сдвинуть в ту или иную сторону соотношение активированной и латентной форм фермента ( strotman, Schurmann, 1983). П0 мнению авторов инактивирование АТФазы в темноте имеет большое значение для предотвращения гидролиза АТФ, поставляемой митохондриями.

Вместе с тем, пока нет достаточных оснований считать процесс обращения конечного этапа фотофосфорилирования естественным и, прежде всего, в силу неясности физиологического смысла появления АТФазной реакции. Если в митохондриях индуцируемый гидролизом АТФ обратный поток электронов может участвовать в восстановлении НАД и НАДФ, то в хлоропластах эти реакции не обнаружены. Возможно, обращение вектора работы Н+-АТФазы есть один из способов регулирования скорости фотофосфорилирования, хотя априорность подобного допущения на фоне имеющихся данных очевидна.

АТФ-гидролазная активность сопрягающего фактора изучается при допущении, что синтез и гидролиз АТФ есть обращение одной и той же реакции. Поэтому, изучение гидролиза АТФ сопрягающим фактором в безмембранной системе рассматривается как важнейший способ выяснения механизма участия фермента в осуществлении синтеза АТФ и его регуляции.

2Л. Ключевая роль в регуляции сопряжения. между транспортом электронов и синтезом АТФ. Модификация активности природными соединениямй

Согласно хемиосмотической теории обратимая Н+-АТФаза сопрягающих мембран осуществляет превращение в АТФ электрохимического трансмембранного градиента протонов, создаваемого работой злектронтранспортной цепи. В хлоропластах трансформации подвергается электронейтральный химический потенциал дрН. Используя для синтеза АТФ энергию дрН, АТФаза вместе с тем представляет собой специфический канал утечки протонов по градиенту электрохимического потенциала. Помимо этого, утечка Н+ может осуществляться в обход мест локализации фермента вследствие дефектов в структуре мембран. В рамках этих представлений после достижения равновесия между свободной энергией дрН и перепадом энергии между компонентами ЭТЦ в пункте переноса Н+ транспорт электронов должен прекратиться. В действительности этого не происходит, так как всегда существует утечка Н+ через мембраны, которая возрастает пропорционально ДрН. В результате, в отсутствие фосфат-акцептирующей системы устанавливается равновесие между скоростью утечки протонов и транспорта электронов. Уровень транспорта электронов, определяемый утечкой Н+, получил название базального или основного транспорта электронов ( izawa, Good, 1978). При наличии АДФ и фосфата с внешней стороны мембраны открывается мощный канал сопряженного с фосфорилированием АДФ потока протонов через СФр вследствие чего возникает так называемый сопряженный или фо'сфорилирующий поток электронов, скорость которого эквивалентна скорости синтеза АТФ ( izawa, Good, 1968). Ингибирование в этих условиях

АТФ-синтетазной активности СФ£ должно пошшать величину дрН. Действительно, специфическая блокировка сопрягающего фактора антителами или ингибиторами переноса энергии - флоридзином, Дио-9 - вызывает повышение дрН ( McCarty, Racker, 1966;

Scholes et al., 1969; Melandri et al., 1970). Как естественный результат, отмечается снижение скорости транспорта электронов до уровня, определяемого неспецифической утечкой Н+, и прекращение синтеза АТФ ( Papa et al., 1970). Напротив, удаление СФ£ из мембран открывает неконтролируемый канал диффузии для протонов, что приводит к максимальной интенсификации электрон-транспортных реакций, а в итоге - ингибированию фосфорилирования (Молотковский и др.,1977). Очевидно, что между этими двумя состояниями возможно зависящее от изменения свойств СФ2 существование ряда промежуточных состояний с различной степенью сопряжения между транспортом электронов и синтезом АТФ. Столь существенное значение состояния сопрягающего фактора для знерготрансформиругощей активности мембран предполагает наличие у этого фермента регуляторных функций. Согласно приведенным в предыдущих разделах данным, СФ| обладает способностью к изменению своих свойств и активности в зависимости от суммы условий, создающихся в окружающей среде: являясь анионным белком, способным к акцептированию протонов ( scholes et al, 1969); СФ£ изменяет электрохимические свойства с изменением рН среды ( Lynn, Straub, 1969b ; Bennun, 1971); его СВЯЗЬ С мембраной зависит от концентрации солей и рН среды ( Avron, 1963; McCarty, Racker, 1967) и опосредована через лабильные полярные липиды ( Livne, Racker, 1969); активность фермента изменяется под влиянием SH-соединений, тяжелых металлов и двухвалентных катионов ( Vambutas, Ranker, 1965; McCarty,

Racker, 1968; Farron, Racker, 1970),

По сумме приведенных фактов C<£j рассматривается как фермент, занимающий ключевое положение в регулировании сопряжения между транспортом электронов и синтезом АТФ. Учитывая ясно выраженную функциональную поливалентность C®j, можно полагать, что его регуляторное действие может быть двояким. Независимым образом могут регулироваться: уровень протонного градиента в результате чисто структурного влияния на утечку протонов и степень сопряжения существующего градиента с синтезом АТФ в зависимости от сохранения активности самого СФ|. Эта двойственная роль предполагается на протяжении ряда лет ( McCarty, Racker, 1966), но пока обстоятельно не исследована.

Выдвижение C®j на роль ключевого фермента потребовало разрешения широкого круга вопросов, связанных с его регуляцией и,в первую очередь, вопроса об эндогенных факторах, контролирующих функциональную активность.

Известно, что активность сопрягающего фактора Н+-АТФаз различных источников меняется под влиянием ряда соединений, в том числе природных. Эффективными стимуляторами растворимой и мембраневязанной АТФазы сопрягающих мембран являются некоторые анионы слабых органических и неорганических кислот. Способность к изменению активности под влиянием анионов относится к числу фундаментальных свойств Н+-АТФаз. Исследованию механизма действия анионов посвящено значительное количество публикаций.

По данным различных работ стимулирующее действие на активность растворимых АТФаз оказывают такие анионы как бикарбонат ( Pedersen et al., 1974; Webster et al., 1975; Ebel,

Lardy, 1975; Caterall, Pedersen, 1974), борат, малеат, сульфит И бисульфит ( Caterall, Pedersen, 1974.; Webster et al., 1975), хромат ( Ebel, Lardy, 1975), фосфат ( Moyle, Mitchell, 1975)v Цитрат, сульфат, нитрат (. Grubineyer,

Spencer, 1979), а также тиоцианат, CI", Br" ( Ryrie» 1975; Ebel, Lardy, 1975) обладают ингибирующим эффектом. Отмечено значительное увеличение активности растворимой АТФазы хлоропластов под влиянием таких анионов как бикарбонат, сульфит, малеат ( Nelson et al., 1972а; Мальян,Акулова,1978). В присутствии анионов существенно изменяются кинетические характеристики АТФазной реакции. Результаты экспериментов, посвященных изучению влияния стимулирующих анионов на кинетические параметры реакции гидролиза АТФ показали, что бикарбонат и сульфит всегда повышают максимальную скорость гидролиза АТФ (Fe-dersen, 1976; Ebel, Lardy, 1975)♦ В присутствии активирующих анионов наблюдалось как увеличение (Federsen, 1976; Ebel, Lardy, 1975), так и уменьшение ( Hochmann, Carmeli, 1981) Кц для АТФ.

В ряде работ исследован характер влияния ингибирующих анионов на АТФазу. Так показано, что оксицианат и азид ингиби-руют растворимую АТФазу митохондрий конкурентно по отношению к ионам HCO^" и неконкурентно - к Mg-АТФ (Ebel, Lardy, 1975). Из приведённых данных следовало, что ингибируюие и стимулирующие анионы оказывают влияние на фермент конкурентно по отношению к друг другу.

Установлена способность анионов смещать рН-оптимум АТФазы. Например, наблюдалось смещение рН-оптимума Mg-АТФазной активности в хлоропластах с рН 8,0 и рН 7,2 в присутствии ионов бикарбоната ( Cohen, Mac-Peeck, 1980). Аналогичное явление на

-соблюдалось на АТФазе митохондрий ( Fanestiel et al«, 1963). Б присутствии НСО^" или других анионов рН-оптимум АТФазы, как правило, смещается в область кислых значений рН. В некоторых случаях не отмечено существенной зависимости рН-оптимума АТФазной активности от наличия ионов бикарбоната.

Показано, что двухвалентные катионы, и в первую очередь, магний, необходимы для проявления стимулирующего действия анионов на АТФазу ( Tyler, Webb, 1979). В экспериментах Мойл и Мнтяела ( Moyle, Mitchell, 1975) с изолированной АТФазой митохондрий наблюдалась реактивация гидролиза АТФ, подавленного избытком ионов магния, при добавлении в среду анионов сульфита и фосфата. Расчетные данные кинетических характеристик показали, что при этом увеличивается количество молекул фермента, находящихся в активном состоянии.

Предпринимались неоднократные попытки выяснить механизм влияния анионов на активность Н+-АТФаз. К настоящему времени сформировалось две точки зрения на суть действия анионов на АТФазу. В первом случае анионам отводится роль регуляторов кон-формационного состояния фермента, в другом - предполагается непосредственное влияние анионов на процесс катализа. Однако,сторонники той и другой точки зрения едины в том, что стимуляция каталитической активности является результатом взаимодействия анионов с определенными участками молекулы фермента.

По мнению Педерсена ( Pedersen, 1976) анионы участвуют в каталитическом акте в качестве обобщенных льюисовских оснований. При этом важная роль отводится структуре аниона. Существует, однако, целый ряд реагентов, отвечающих требованиям, предъявляемым к структуре аниона и не обладающих стимулирующим действием (селенат, теллурат) ( Ebel, Lardy, 1975). Мальян и Акулова (1978) изучили влияние соединений различного рода на Mg -зависимую АТФазную активность СФ£ хлоропластов и показали, что стимулирующий эффект возрастает при увеличении их гидрофобно-сти. Все исследованные соединения в условиях эксперимента легко отдавали и принимали Н+, а их максимальная эффективность достигалась при рН среды, близком к рК соответствующей кислоты, Предположено, что механизм дейстшя стимулирующих соединений на АТФазу заключается в увеличении скорости лимитирующей стадии транслокации протонов ферментом, сопряженной с каталитическим актом гидролиза АТФ,

Иное объяснение механизма действия анионов приведено в работе Адольфсена И Мондрианакиса ( Adolfsen, Moundrianakis, 1978). Так, стимулирующий эффект анионов сульфита на АТФазу бактерий авторы объясняют взаимодействием их с магнием, который может ингибировать АТФазу связываясь с ней в регуляторном пункте. Сульфит, образуя комплекс с магнием, предотвращает угнетение активности фермента. Кроме того, предполагается, что анионы существенно изменяют константу диссоциации магния с ферментом и тем самым дополнительно активируют АТФазу,'

Сантъяго и др. (Santiago et al,, 1979) представили свой вариант механизма стимулирующего действия анионов. По предположению авторов фермент имеет не менее двух каталитических и трех регуляторных центров. Один из регуляторных центров обладает специфичностью для бикарбоната и,воздействуя на него, анионы НС03" оказывают стимулирующее влияние на активность фермента. Взаимодействием анионов с регуляторным центром фермента объясняют активацию АТФазной активности и другие авторы (Reck-tenwald, Hess, 1977).

По мнению Мойл и Митчела ( Moyle, Mitchell, 1975) АТФаза всегда представлена популяцией молекул, находящихся в двух ионформационных состояниях - активном и неактивном. От соотношения этих форм зависит общая активность препарата. Анионы проявляют стимулирующее действие путем перевода молекулы АТФазы в активную форму. С тех же позиций объясняется Вебстером и др. ( Webster et а1., 1977) действие сульфита, селенита и хромата на активность растворимой АТФазы хроматофоров Rhode* spirillum rubrum.

Показано, что ионы бикарбоната в несколько раз повышают скорость фосфорилирования в хлоропластах ( Punnet, Iyer, 1964; Batra, Jagendorf, 1965; Murai, Akazowa, 1972; Cohen, Mac-Peeck, 1980; Ценова,1978), что можно рассматривать как отражение чувствительности АТФ-синтетазы к ионам НС0^~.

В отличие от анионов, флавоноиды - одна из групп растительных фенолов - являются ингибиторами раствэримых и мембран-связанных АТФаз. В диапазоне концентраций 10 М, который считается физиологическим (Волынец, Прохорчик, 1983), эти соединения подавляют активность изолированного СФ| (Мальян и др., 1977; Shoshan et ai., 1980) и ингибируют Mg -АТФазную активность и фосфорилирование в хлоропластах по типу ингибиторовпе-реноса энергии ( Stenlid, 1970; Arntzen et al., 1974; Schneider, 1973,1974; Музафаров и др.,1978). При этом по эффективности действия эти вещества значительно превэсходят другие соединения, известные как ингибиторы фотофосфорилирования. Наиболее активным и широко распространенным является кверцетин и действие флавоноидов на биоэнергетические реакции часто рассматривается на его примере.

Шошан и др. ( Scoshan et al., 1980) показали, что действие кверцетина на хлоропласты сходно с действием дициклогексил-карбодиимида (ДЦКД) - реагента, специфически взаимодействующего с СФ0-компонентом АТФазного комплекса. Помимо ингибирования энергозависимого АТФ-Р^2-обмена и Са-зависимой АТФазной активности термоактивированного СФ| кверцетин, подобно ДЦКД восстанавливал поглощение Н+ в ЭДТА-обработанных хлоропластах. Как и ДЦКД, кверцетин ингибировал обмен связанных нуклеотидов. Во всех случаях действие этих соединений отличалось тем, что эффект кверцетина достигался почти мгновенно (в пределах нескольких сек.) и был обратим, тогда как действие ДЦКД развивалось медленно и было необратимо. Авторы полагают, что кверцетин взаимодействует как с сопрягающим фактором, так и с СФ0. Но, поскольку стимуляция Н+-поглощения в ЭДТА-обработанных хлоропластах наблюдалась лишь после подавления активности сопрягающего фактора, взаимодействие кверцетина с ферментом является, по их мнению, основной причиной ингибирования фотофосфорилирования.

Исследовано влияние кверцетина на АТФазную и АТФ-синте-тазную активность мембране вязаиного СФ2 (Мальян и др.,1977; Mukohata et al., 1978). Показано, что в реакционной среде, содержащей ионы двухвалентных металлов (Са++, Mg++) кверцетин существует в двух формах - свободной и связанной в комплексе с металлом. Свободный кверцетин снимает ингибирование АФТазной реакции АДФ и подавляет реакцию фосфорилирования. Комплекс Me "-кверцетин резко ингибирует гидролиз АТФ и менее резко -его синтез. На основании этих данных предположено, что влияние флавоноидов на АТФазную и АТФ-синтетазную активность СФ2 имеет аллостерическую природу. Согласно данным экспериментов Мукохата и др. ( Mukohata et al., 1978) кверцетин подавляет фотофосфорилирование конкурентно с АДФ, но не конкурентно по отношению к фосфату. Фотофосфорилирование подавлялось по сиг-моидной кривой. Расчет константы Хилла дал величину п=2, что свидетельствует о связывании флавонола в двух пунктах молекулы сопрягающего фактора. Детерс и др. ( Deters et al.,I975) обнаружили, что кверцетин ингибирует АТФазную активность комплекса, состоящего из двух - d и р -субъединиц и, таким образом, пункты его связывания локализуются в пределах этих субъединиц. Кантли и Хаммес ( Cantley, Hammes, 1976) предприняли попытку идентифицировать кверцетин-связывающие центры на молекуле СФ£ методом переноса энергии и также выявили два пункта с константами диссоциации 19,5 и 35 мкмоль. Ни один из этих пунктов не совпадает с каталитическим, поскольку связывание не менялось в присутствии НБД-хлорида - ингибитора реакционного центра Связывание кверцетина происходило очень быстро: по данным йетода остановленного потока и оптическим изменениям скорость его ассоциации с ферментом составляет {=. 8 мсек ( Cantley, Hammes, 1976).

Ланг и Рекер ( Lang, Racker, 1974) впервые продемонстрировали ингибирование сопрягающего фактора митохондрий квер-цетином и обнаружили аналогию в действии флавоноида и белкового ингибитора на АТФ-зависимые реакции в субмитохондриальных частицах. По мнению этих авторов, механизм действия флавоноидов на сопрягающий фактор тот же, что и у белкового ингибитора. Существенно, что ингибирующий эффект флавоноидов в полной мере проявлялся при действии агликонов на изученные системы и полностью отсутствовал при действии гликозидов. Флавоноидные аг-ликоны характеризуются чрезвычайно высокой реакционной способностью и большим разнообразием реакций, в которые они вступают. Эти качества определяются главным образом количеством и расположением ОН-групп в молекуле. Блокирование ОН-групп при образовании гликозидных связей сопровождается снижением реакционной способности и биологической активности. Это проявляется и при действии флавоноидов на систему фотофосфорилирования -с переходом в форму гликозидов ингибирующее влияние агликонов полностью утрачивается или значительно ослабляется (Музафаров и др.,1978).

Флавэноиды наряду с другими группами фенольных соединений повсеместно распространены в растениях. Синтез флавоноидов является характерным свойством высших растений и признается универсальным процесс фотосинтетического образования их в клетке (Запрометов,Колонкова,1967; Saito, 1974). Флавоноиды - свободная форма и гликозиды, обнаружены в хлоропластах раствг ний самых различных систематических групп ( Weisenbock, Schneider, 1974; Saunders, McClure, 1976; Кефели,Турецкая,1966; Волынец,Прохорчик,1974; Нуритдинова,Имамалиев,1976). Содержание их в хлоропластах невелико - не более 5% от общего содержания в клетке (Запрометов,1974; Weisenbock, Schneider, 1974). Качественный состав ограничен 1-2, реже 3-4 представит елями. В хлоропластах большинства растений флавоноидные аг-ликоны представлены кверцетином, кемпферолом, иногда мерицити-ном. Несмотря на значительное количество проведенных исследований метаболическая роль этих соединений в хлоропластах не установлена. Характер действия на механизм фотосинтетического фосфорилирования позволил предположить участие флавоноидов в регулировании биоэнергетических процессов в хлоропластах (Акулова, 1977).

В одной из работ Рекера ( Racker, 1975) было установлено обращение ионами бикарбоната ингибирующего влияния кверцетина на АТФазу митохондрий животных клеток, однако не было предпринято дальнейших экспериментов для объяснения сути этого явления.

Результаты рассмотренных в литературном обзоре работ можно суммировать в виде следующих общих положений.

Комплекс обратимой Н+-АТФазы является ключевым участком динамической структуры энергопреобразующих мембран хлоропластов. В зависимости от его состояния может изменяться степень сопряжения между транспортом электронов и синтезом АТФ, величина трансмембранного электрохимического градиента протонов, скорость транспорта электронов.

Каталитический компонент Н+-АТФазного комплекса - сопрягающий фактор I, СФ2 служит точкой приложения регулирующих факторов, что обусловлено его молекулярной организацией - оли-гомерной структурой, наличием пунктов связывания эффекторов, жшформационной лабильностью.

Флавоноидные агликоны и стимулирующие анионы оказывают специфическое действие на СФ|, вызывая противоположное по знаку изменение его каталитической активности. Анионы предотвращают ингибирование флавоноидами функционально равноценного комплекса Н+-АТФазы митохондрий.

Хлоропласты служат местом локализации флавэноидов и их образования, которое индуцируется светом и строго зависит от его интенсивности и качества. Ряд стимулирующих анионов - бикарбонат, фосфат, малеат - является нормальными метаболитами хлоропластов, содержание которых может сильно варьировать в зависимости от конкретных условий осуществления фотосинтеза.

В этих положениях по существу заложено предположение, о том, что для контроля активности сопрягающего фактора6клеткв используется набор флавоноидов и анионов, конкуренция между которыми составляет основу механизма регулирования работы Н+-АТФ-азного комплекса хлоропластов. Эти соединения являются единственно известными в настоящее время метаболитами хлоропластов, способными к модификации активности COj в условиях in vitro При поиске средств и способов управления процессом образования АТФ в фотосинтезирующих клетках выяснение природы этого эффекта приобретает особую актуальность. Однако, многие аспекты влияния как той, так и другой группы веществ, остаются неясными. Исследования ведутся односторонне, без попытки рассматривать их как систему регуляторов.

Все это определило необходимость проведения настоящей работы, задачей которой мы поставили изучение действия флавоноидов и анионов на сопрягающий фактор и осуществляемые при его участии процессы, на примере флавоноида кверцетина и анионов . бикарбоната.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом служили изолированные хлоропласты бобов ( Vicia fata ) сорта "Русские черные". Элитные семена после замачивания и проращивания на фильтровальной бумаге насаживали в почду. Проростки шращивали в условиях полукондиционируемой оранжереи фитотрона. В зимнее время проводилось дополнительное освещение люминесцентными или ксеноношми лампами. Для опытов брали сформированные листья двух средних Урусов 12-16-дневных проростков.

Вдделение хлоропластов без оболочки производили дифференциальным центрифугированием гомогената, полученного после измельчения листьев в гомогенизаторе типа Уоринга. Все операции по выделению провэдили на холоду. Промытые водопроводной, а затем дистиллированной водой листья обсушивали фильтровальной бумагой, измельчали ножницами и гомогенизировали в среде выделения: 200 мМ сахароза, 100 мМ KCI, 25 мМ трис-HCI рН 7,9 в течение 15 с при скорости вращения пропеллера 12000 об/мин. Гомогенат отжимали через шесть слоев батиста и осаждали центрифугированием при 800g в течение 7 мин. Полученный осадок хлоропластов суспендировали в сахарозной среде (350 мМ) и повторно осаждали. Исходная для последующих экспериментов густая суспензия хлоропластов (2-3 мг хлорофилла на мл) в растворе 350 мМ сахарозы без буфера хранилась на льду. Электронно-микроскопический контроль не обнаружил в полученных подобным способом препаратах хлоропластов примеси митохондрий или ядер. Суспензия, содержащая пластиды типа В и С по номенклатуре Халла ( Hail, 1972), применялась в экспериментах по определению скорости фосфорилирования и свето-активируемого гидролиза

АТФ, а также для экстрагирования сопрягающего фактора.

Интактные хлоропласты получали из листьев 3-4-недельных растений шпината, сорт "Виктория". Растения выращивали в почве на коротком дне в оранжерее с освещением ксеноношми лампами при температуре 20°. Выделение хлоропластов проводили на холоду по методу Хебера в модификации Поярковой и др. (1978). Навеску листьев (10-15 г) гомогенизировали в течение 5-7 с со средой наделения "А", содержащей: 0,33 М сорбита, I мМ MgCl2, I мМ МпС12 , 2 мМ ЭДТА, 10 мМ ИаСЬ , 0,5 мМ KgHPO^, 50 мМ МЕС-буфера рН 6,1. Перед употреблением в среду добавляли 3 мМ цистеина и 2 мМ аскорбата натрия. Гомогенат отжимали через два слоя ткани и центрифугировали при 1600 q в течение 45-50 с. Полученный осадок осторожно ресуспендировали в 50 мл среды "А" и вновь центрифугировали 40-45 с. Осадок вторично промывали средой "Б" (буфер ХЕПЕС рН 6,7 с теми же добавками за исключением цистеина и аскорбата). После осаждения центрифугированием (40 с при 1600 q ) осадок хлоропластов ресуспендировали в 1-1,5 мл среды "Б". Пробирка с суспензией хранилась на льду в течение всего эксперимента.

Дважды промытые хлоропласты были свободны от пероксисом, о чем судили по положительной реакции на добавление каталазы. Целостность полученных хлоропластов проверяли по шделению кислорода в присутствие феррицианида ( Heber, Santarius, 1970). Получаемые препараты содержали 70-75% целых хлоропластов. Препарат интактных хлоропластов использовали для определения интенсивности фотосинтеза. Для тех же целей применяли суспензию клеток одноклеточной водоросли эвглены.

Эвглена ( Euglena gracilis, Klebs, 1224 - 5/25, штамм z) из коллекции Мартин-Лютер Университета Галле, ГДР, культивировали в факторостатной камере при температуре 24° в условиях постоянного чередования свето-темновых периодов (12:12 ч, освещенность 5000 лк) в специальных трехлитрошх кюветах (20х20х х500 мм). Культуру снимали на седьмой день, когда прекращался прирост численности клеток. Клетки на культуральной жидкости осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 200 g ♦ Густая суспензия клеток в 10 мМ трис-HCI рН 7,6 с содержанием хлорофилла 1-2 мг/мл сохранялась при комнатной температуре в качестве исходной для эксперимента.

Определение скорости фотофосфорилирования производили по предложенному Нишимура и др. ( Hishimura et al.f 1962) по-тенциометрическому методу, который основан на учете поглощения протонов в ходе реакции:

АДФ + Рн + п.н+---- АТФ + Н20

Величину n s Н*/АТФ рассчитывали по уравнению, предложенному авторами.

Изменение концентрации протонов в среде регистрировали с помощью стеклянного электрода, рН-метра 1ПУ-01 и регистрирующего потенциометра ez-2 . Реакционная смесь (100 мМ сахароза, 100 мМ KCI, I мМ АДФ, 3 мМ К2НР0^, 2 мМ MgCl2 , 2 мМ трис-HCI рН 7,9) в круглой кювете перемешивали магнитной мешалкой. Реакцию проводили в течение 1,0-1,5 мин. Количество поглощаемых в ходе реакции протонов определяли обратным титрованием после шключения света. Поскольку скорость фотофосфо-рилирования и значение п заметно зависит от величины рН, количество хлоропластов в реакционной среде подбирали таким образом, чтобы перепад уровня концентрации протонов до и после освещения не превышал 0,1 единицы рН. Оптимальные концентрации компонентов фосфат-акцептирующей системы были подобраны после ряда предварительных экспериментов. В качестве кофактора транспорта электронов использовали феназинметасульфат (ФМС) в концентрации 20 мкМ. Скорость фотофосфорилирования приводится в мкмолях синтезированной АТФ на мг хлорофилла за час.

Активация латентной АТФазы хлоропластов достигалась освещением суспензии в течение 2 мин в среде, содержащей: 100 мМ сахарозы, 100 мМ KCI, 5 мМ MgCl2 , 5 мм дитиоэритрита, 20 мкМ ФМС, 2 мМ трис-HCI рН 7,9. Активность фермента определяли по-тенциометрическим методом ( Nishimura et al., 1962). АТФ вносился в момент выключения света до конечной концентрации 5 мМ. Скорость АТФазной реакции выражена в мкмолях гидролизованной АТФ на мг хлорофилла за час.

При всех измерениях светозависимых реакций хлоропластов освещение суспензии проводили через водный экран и светофильтр КС-Ю при интенсивности 1,5 эрг/см""2»с""*.

Экстракцию сопрягающего фактора раствором ЭДТА осуществляли по Аврону (Avron, 1963), Хлоропласты, суспендированные в слабо забуференном растворе 0,2 М сахарозы до концентрации 1,0-1,5 мг хлорофилла/мл среды, инкубировали с 0,8 мМ раствором ЭДТА рН 8,0 в течение 20 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость, содержащую фермент, отделяли центрифугированием при 15000 g в течение 30 мин.

Для экстрагирования СФ2 хлороформом применяли модифицированный нами метод Бичи и др. ( Beechey et al., 1975). Удаление примесей из хлороформ-экстракта достигалось за счет фильтрации на колонке (2x100 см) с Сефадексом Г-200.

Степень чистоты фермента определяли двумя способами: а) а) гель-электрофорезом в 7,5^ полнакриламиде по Девису (Davis, 1964), б) по отношению интенсивности флуоресценции раствора препаратов при 305 нм и 350 нм (I305/350)* Белок пеРеД электрофорезом растворяли в 10 мМ трис-HCI рН 7,9. На каждый столбик геля наносили 180 мкг белка в объеме 0,1 мл. Электрофорез проводили при 4°, силе тока 2,2 мА на гель в течение 2 часов. Белок в геле окрашивали 1% раствором кумасси в присутствии 12,5% ТХУ 30 мин. Полосы белка регистрировали на сканирующем денситометре Jouce - Loeble . Спектрофлуорометрические измерения проводили на спектрофлуориметре MPF-4 ( Hitachi ) при возбуждении 280 нм. Ширина щели возбуждения и эмиссии - 4 нм. Перед эмиссионным монохроматором ставили отсекающий фильтр uv -29, устраняющий попадание на фотоприемник рассеянного возбуждающего луча.

Латентный изолированный фермент активировали обработкой трипсином или прогревом по Льену и Рёкеру ( Lien, Racker, 1971). Процедура активации трипсином сводилась к следующему: в реакционную среду, содержащую 2 мМ трис-HCI рН 7,9, 5 мМ АТФ и 5 мМ СаС12 (или 4 мМ АТФ и 2 мМ MgCl2 ), 30-40 мкг очищенного фермента или грубого ЭДТА - экстракта, вносился раствор трипсина в I мМ HCI до концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубировалась 30 сек при комнатной температуре. Действие трипсина останавливалось добавлением двукратного количества соевого ингибитора трипсина.

Для активации прогревом препарат энзима (1,5-2,0 мг) вносили в раствор, содержащий 10 мМ АТФ, 5 мМ дитиоэритрита и 20 мМ трис-HCI рН~ 7,9. Смесь помещали на водяную баню с температурой 60° на 2 мин, после чего переносили в сосуд с водой комнатной температуры. Оптимальная температура и время прогрева были определены в результате предварительных экспериментов.

Са- и Mg -зависимую АТФазную активность изолированного фермента измеряли потенциометрически ( Hishinmra et al., 1962) или по приросту неорганического фосфата.

В первом случае реакционная среда объемом 5 мл включала следующие компоненты: 2 мМ трис-HCI рН 8,0, 5 мМ CaCIg и 5 мМ АТФ (или 2 мМ Mg0l2 и 4 мМ АТФ), 30-40 мкг белка. Реакция проводилась при температуре 26°.

При определении активности фермента по приросту неорганического фосфата инкубационная среда (объемом 1,8 мл) содержала: 15 мМ трис-HCI рН 7,9, 5 мМ АТФ и 5 мМ СаС12 (или 2,0 мМ MgCi2 и 4 мМ АТФ). Реакция останавливалась после 15 мин инкубации при 26°. Содержание Рн определялось по Скулачеву (1962).

Интенсивность фотосинтеза интактных хлоропластов и клеток эвглены регистрировали по количеству наделенного кислорода. Концентрацию кислорода в реакционной среде определяли полярографическим методом на установке, состоящей из полярогра-фа ЕР-7, термостатирующей ячейки с электродами и регистрирующего потенциометра ez -ю. В установке использовался закрытый электрод Кларка. Катодом служил платиновый электрод, изготовленный из платиновой проволоки. В качестве электрода сравнения (анода) использовалось металлическое серебро, покрытое хлоридом серебра. Для разделения электродного пространства и опытного раствора применялась пленка из фторопласта-4 толщиной 5 мк.

Для измерения скорости газообмена интактными хлоропла-стами использовалась ячейка, конструкция которой описана в работе Гришиной и др. (1966).

Все добавки вносились перед началом определения. Перемешивание осуществляли плексигласовой мешалкой, приводимой в движение мотором. Скорость вращения мешалки 500-600 об/мин.

Реакционная среда содержала: 0,33 М сорбита, I мМ МпС12, I мМ MgCl2 2 мМ ЭДТА, 10 мМ Nad , 50 мМ буфера ХЕПЕС рН 7/6, Оптимальная концентрация неорганического фосфора (КН2Р0^), определенная в предварительных экспериментах, составила 0,2 мМ. Для подавления поглощения 02 на свету в среду вносилась катала-! лаза в количестве 2000 ед.на мл. Ячейка, используемая в экспериментах с суспензией клеток эвглены, изготовляли согласно описанию, приведенному Островским и Гельман (1962). Конструкция ячейки допускала введение добавок в ходе определения. Перемешивание среды в измерительной камере осуществляли магнитной мешалкой. Реакционная среда объемом 4 мл включала только 10 мМ трис-HCI рН 7,6.

Освещение суспензии хлоропластов ш клеток проводили диапроектором ЛЭТЙ с лампой накаливания мощностью 400 ватт через красный светофильтр KC-I3. Интенсивность света насыщаю*^:.о щая.

Содержание хлорофилла определяли после экстракции хлоропластов 80% ацетоном и его концентрацию (С) рассчитывали после измерения на спектрофотометре согласно формуле, предложенной Бруинсма (Bruinsma, 1968);

Са+б = 20,2 A6Zf5 + 8,02 А6б5 = 27,8 Аб52

Количество белка определяли согласно методу Лоури и др. ( Lowry et al., 195I). Калибровочную кривую строили по водному раствору кристаллического альбумина. Для расчета содержания сопрягающего фактора в препарате использовали коэффициент 0,74 ( Hartig et al., 1977).

Конформационные переходы фермента оценивали по изменению поляризации флуоресценции остатков тирозина. Поляризацию измеряли на спектрофотометре Hitachi MPF-4 (Япония) при 20°С. Возбуждение и эмиссия флуоресценции при 270 и 305 нм соответственно. Для предотвращения попадания на фотоумножитель возбуждающего света в результате светорассеяния, перед эмиссионным монохроматором ставили отсекающий светофильтр JJV -29 и все измерения наполняли при ширине цепей 3 нм. В этих условиях вклад светорассеяния составлял не более 5%.

Поляризацию флуоресценции (Р) рассчитывали согласно уравнению:

Р = (1и - Gi^ ) / (I„ -Gix ), где

1ц - интенсивность эмиссии поляризованной параллельно, a - интенсивность эмиссии, поляризованной перпендикулярно к горизонтально поляризованному возбуждающему лучу.

Фактор коррекции g на неравное прохождение через монохро . * матор различно поляризованного света равен 1ц / Ijl » когда возбуждающий луч поляризован в вертикальном направлении. Каждое определение проводили не менее 15 раз и статистическую обработку данных осуществляли по стандартным программам, прилагаемым к калькулятору Hewlett - Packard 97 (США).

Дифференциальные спектры поглощения получали на двухвол-новом спектрофотометре Hitachi 557 (Япония). Для устранения ошибок, связанных с объемным разбавлением был использован метод тандемного расположения кювет. На пути измерительного луча помещали две кюветы (оптический путь каждой I см) раздельно заполненные исходными растворами веществ и суммарный спектр двух индивидуальных компонентов вводили в оперативную память прибора. Затем содержимое юовет сливали шесте, после тщательного перемешивания смесью двух веществ заполняли обе кюветы и снимали дифференциальный спектр смеси относительно суммарного спектра индивидуальных компонентов. На пути луча сравнения ставили кюветы, заполненные средой.

Реактивы. Дитиоэритрит (ДТЕ), АТФ, АДФ, кверцетин фирмы Serva (ФРГ). Кверцетин употребляли без очистки, поскольку хроматографический анализ не показал наличия органических примесей. Рутин фирмы Chemapol (ЧССР) содержал примеси кверцетина, от которых избавлялись хроматографией метанолово-го раствора реагента на колонке с полиамидом. После элюирова-ния 50% этанолом рутин отделяли центрифугированием и высушивали с помощью целита. КНСО^ - отечественного производства, квалификации о.ч.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Жесткова, Инна Матвеевна

ВЫВОДЫ

I. Предложен усовершенствованный метод изолирования сопрягающего фактора хдоропластов (C<Sj), позволяющий при флуо-ресценщшм контроле гомогенности получать в две стадии препарат не менее 95% чистоты.

2. Ф1павоноид кверцетин подавляет АТФ-гидролазную функцию изолированного СФ| как ингибитор смешанного типа с Kj = 18 мкМ.

3. Свойствами ингибитора обладает комплекс флавоноида с двухвалентным металлом. Свободный кверцетин не связывается ферментом и не активен в качестве ингибитора.

4. В присутствии кверцетина и ионов магния уменьшается подвижность молекулы СФ^. в области тирозиновых остатков. Сделан вывод об аллостерическом механизме действия комплекса кверцетин-магний.

5. Ионы бикарбоната стимулируют АТФазную активность изолированного СФ£, не влияя на мобильность тирозинилов. Повышение концентрации бикарбоната обращает влияние кверцетина на активность и конформацию фермента. Защитный эффект бикарбоната обусловлен снижением концентрации в среде комплекса кверцетин-магний, а также активированием не связанного с ингибитором фермента.

6. Кверцетин вызывает параллельное подавление фосфорилирования и свето-активируемого гидролиза АТФ в хлоропластах. Влияни е кверцетина обращается при снижении его концентрации в среде. Наблюдается стимуляция фосфорилирования ионами бикарбоната. Процесс, подавленный предварительным добавлением кверцетина, реактивируется при возрастании концентрации ионов НСО^ в среде. Кверцетин и бикарбонат влияют на фотофосфорилирование на основе конкурентных отношений.

7. Кверцетин обладает эффективным ингибирующим действием на фотосинтез в изолированных интактных хлоропластах шпината и целых клетках эвглены. Бикарбонат в низких концентрациях стимулирует фотосинтез органелл и клеток. Ингибирующее действие кверцетина на фотосинтез обращается и предотвращается ионами НСО^"".

8. Полученные результаты согласуются с предположением о том, что флавоноида и анионы контролируют активность сопрягающего фактора в физиологических условиях. Предложена схема регулирования фотофосфорилирования в клетке, отражающая ключевую роль сопрягающего фактора и учитывающая регуляторное действие флавоноидов и анионов на его активность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной задачей настоящей работы было экспериментальное обоснование возможности регулирования активности Н+-АТФ-азы хлоропластов с помощью флавэноидных агликонов и стимулирующих анионов. В ходе выполнения работы проведен анализ экзогенного действия кверцетина и бикарбоната, как наиболее распространенных в растениях представителей этих групп соединений, на системы возрастающей сложности - изолированный сопрягающий фактор, лишенные оболочки и интактные хлоропласты, целые клетки.

В проведенных экспериментах отчетливо проявилась способность исследованных метаболитов оказывать регуляторное влияние на АТФазную активность изолированного СФ|. Действие метаболитов обнаруживалось в достаточно узком диапазоне концентраций, легко обращалось при снижении их значения, а временной интервал ответной реакции не превышал сек. Кверцетин индуцировал конформационные изменения молекулы СФ£, приводящие к уменьшению ее лабильности. Это позволяет заключить, что регуляция АТФазной активности СФ2 под действием кверцетина определяется аллостерическим механизмом. Полученные результаты не дают основания объяснять аллостерическим взаимодействием влияние би- I карбоната - в пределах возможности использованного метода не зарегистрировано изменений в пространственной структуре СФ2 под влиянием КНСО3. Однако, в пользу этого свидетельствуют приводимые шше литературные данные, указывающие на способность ионов НСО^" к образованию комплекса с ферментом ( Pedersen, 1976) и изменению его конформации ( Cohen, Mac-Peeck, 1980).

Как показали опыты, ингибирующее действие кверцетина на выделенный СФ^ обращается при повышении концентрации бикарбоната. Даже при достаточно высокой концентрации флавоноида, вызывающей близкое к максимальному ингибирование активности, добавлением бикарбоната удавалось восстановить исходное состояние фермента. Реактивирующий эффект бикарбоната обусловлен связыванием свободных ионов магния, приводящим к уменьшению концентрации в среде комплекса кверцетин-магний, и по-существу предопределен, поскольку комплекс флавоноида с металлом является истинным ингибитором фермента. Следовательно, регулирование СФ2, функционирующего в присутствии кверцетина и бикарбоната, не сводится лишь к прямому действию эффекторов на его молекулу, а вызывается также осуществляемой в среде конкуренцией за ионы магния.

На хлоропластах исследованные метаболиты проявляли себя как ингибитор и стимулятор скорости фотофосфорилирования. При этом ионы НС03" действовали антагонистично по отношению к квер-цетину, обращая его эффект. Повышение их концентрации на фоне флавоноида могло обеспечить переход хлоропластов из состояния крайнего минимума активности к полной активации.

Влияние кверцетина и бикарбоната распространялось и на фотосинтез. Варьирование концентрации метаболитов в реакционной среде вызывало широкий диапазон изменений его скорости как на уровне интактных хлоропластов, так и целых клеток. Добавле-ниее бикарбоната - частично в случае интактных хлоропластов шпината и полностью в случае клеток эвглены, - снимало вызываемое кверцетином торможение фотосинтеза. Кроме того, эффект ингибитора заметно снижался предварительным введением стимулятора в суспензию клеток.

Таким образом, обнаружена аналогия закономерностей действия метаболитов на изолированный С<1>2, фотофосфорилирование и фотосинтез. Это можно интерпретировать как подтверждение их способности модифицировать активность мембрансвязанного сопрягающего фактора. Установление регуляторного влияния кверцетина и бикарбоната на СФ2 явилось принципиальным доказательством возможности их участия в эндогенном регулировании Н+-АТФазного комплекса, а следовательно - фотофосфорилирования и фотосинтеза в целом. На основании полученных результатов и излагаемых ниже соображений нами предложена схема эндогенного механизма регулирования, представленная на рис.26. За счет специфического взаимодействия сопрягающего фактора с комплексом кверцетин-магний осуществляется его аллостерическое ингибирование, приводящее к блокированию активности Н*-АТФазы. Колебания в концентрациях кверцетина в строме хлоропластов периодически смещают равновесие между активной и неактивной формами Н+-АТФазы, что сопровождается соответствующими изменениями в количестве синтези руемой АТФ и интенсивности фотосинтеза. Ионы бикарбоната, связывая магний и вызывая диссоциацию комплекса кверце-тин-магний, способствуют восстановлению доли свободного фермента и в конечном счете - повышению уровня фосфорилирующей и фотосинтетической активности хлоропластов. Помимо этого, фосфо-рилирование и фотосинтез могут интенсифицироваться за счет стимуляции ионами HCO^" не связанных с ингибитором молекул СФ|. Амплитуда функциональных изменений, производимых комплексом кверцетин-магний и бикарбонатом определяется концентрацией каждого из компонентов и их соотношением.

Вместе с тем, приведенная схема не исключает возможность реализации регуляторного действия ионов НСО^" в результате прягликозидирое» ание рис. 26. Схема регулирования Н+-д.ТФазы и дэотофосфоршшрова-ния кверцетином ( Кв ) и бикарбонатом ( НСО^"" ). I - оболочка хлоропластов, 2 - тилакоид. мою влияния на СФ£, снижающего его сродство к комплексу кверцетин-магний. 0 допустимости подобного пути регулирования свидетельствуют непрямые доказательства влияния стимулирующих анионов на конформацию СФ2 ( Pedersen, 1976; Cohen, Mac-Peeck, 1980). Однако, его реальность может быть подтверждена или опровергнута лишь с установлением молекулярного механизма стимулирования активности фермента ионами НСО^"". Оба компонента предполагаемой системы регулирования присутствуют в хлоропластах In situ ; их концентрации - показатель чрезвычайно вариабельный, зависящий от внешних и внутренних условий и контролируемый клеткой.

Помимо кверцетина аналогичным по механизму и эффективности ингибирующим действием на АТФазу и фосфорилирование обладают и другие агликоны флавоноидов - мирицетин, морин, кемл-т1; ферол, лютеолин и др. ( Lang, Racker, 1974). Низкое значение константы ингибирования, определенное нами для кверцетина, свидетельствует о высоком сродстве флавоноидов к сопрягающему фактору, а благодаря аллостерическому способу действия для модификации его активности достаточно присоединения нескольких молекул ингибитора. Поэтому процесс синтеза АТФ, столь значительный по количеству запасаемой энергии, может контролироваться при помощи очень небольших количеств флавоноидов.

По ориентировочным данным суммарная концентрация агли-конов в хлоропластах колеблется в пределах 10"^ М (Волынец, Прохорчик,1983), что достаточно для* подавления фотофосфорили-рования в клетке в отсутствие бикарбоната на 50-90%. Уровень содержания свободной формы флавоноидов определяется соотношением скоростей их синтеза и дальнейших превращений - окисления, гликозилирования при\участии соответствующих ферментов.

Концентрация бикарбоната в строме хлоропластов находится ~ в прямой зависимости от интенсивности фотосинтеза, рН стромаль-ного пространства ( Епэеп, НеЪег, 1980) и активности карбо-ангидразы ( Werdan, Heldt, 1977). Важным донором ионов бикарбоната в клетке может быть дыхание, при функционировании которого наделяется достаточное для предотвращения ингибирующего действия флавоноидов количество СО^ ( Racker, 1979),

Как установлено Мальяном с соавт. (1977) и подтверждено нами в настоящей работе, АТФаза связывает не свободный кверцетин^ а его комплекс с двухвалентными катионами и наличие их в среде необходимо щя реализации действия'флавоноида. В наших экспериментах обнаружена посредническая роль ионов магния во вз а шло действии флавоноида и анионов НСО^"". Все это дает основание рассматривать ионы магния как третий компонент эндогенной системы регулирования Н+-АТФазы. Уровень концентрации свободного магния в строме хлоропластов также крайне лабильная вег:~; личина, зависящая от освещения, величины трансмембранного градиента рН на тилакоидной мембране ( Portia, Heldt, 1976, Barber, 1971; Portis, Archie, 1981). Ее максимальные значения достаточны для образования комплекса кверцетин-магний с ■ ~ * учетом рассчитанных констант его устойчивости (Мальян и др., 1977).

В силу многоступенчатости контроля эндогенной концентрации компонентов предполагаемая система регулирования должна обеспечивать высокую степень соответствия уровня активности Н+-АТФазы потребностям клетки в АТФ в каждый данный момент ее существования. Как неоднократно подчеркивалось, кверцетин -лишь один из представителей группы флавоноидов, обладающих ингибирующим действием на АТФазу хлоропластов и фотофосфорилирование, а наряду с бикарбонатом в качестве стимуляторов j АТФазы эффективны такие физиологические анионы как фосфат и малеат. Это допускает возможность регулирования работы Н+-АТФ-азы при участии достаточно широкого круга флавоноидов и анионов. В проведенных нами экспериментах получены данные, указывающие на способность анионов фосфата модифицировать влия- ( ние кверцетина на СФ2, которое осуществляется, по-видимому, по иному, в сравнений с бикарбонатом, механизму. Обнаружив защитный эффект анионов НР0^~ мы не предпринимали экспериментов в подтверждение способности этой пары метаболитов регулировать фотосинтез, поскольку не существует возможности экзогенными воздействиями уверенно контролировать или изменять уровень содержания фосфата в интактных хлоропластах или целых клетках. В результате анализа собственных данных и имеющихся в литературе представляется реальным, что с помощью флавоноидов, анионов и двухвалентных катионов процесс фотосинтетического фосфорилирования подключен к единой системе контроля метаболизма в фотосинтезирующих клетках.

Полученные результаты могут быть использованы для развития исследований в области молекулярных механизмов эндогенной регуляции фотосинтеза и адаптивных свойств фотосинтезирующих клеток, а также при поиске средств к разработке методов экспериментального регулирования фотобиосинтетических процессов растений и водорослей.

Приношу глубокую благодарность своему руководителю'-доктору биологических наук Ю.Г.Молотковскому - за помощь, советы, руководство. Выражаю также глубокую признательность

B.C. Дзюбенко - за помощь в измерении дифференциальных спектров поглощения, Н.П. Поярковой - за помощь при выделении ин-тактных хлоропластов и проведении экспериментов, А.Д. .Володарскому - за предоставление суспензии эвглены, а также Н.П. Воскресенской, М.Н. Запрометову, в.И. Кефели, Э.И. Выскребенцевой, Л.И. Беллу - за интерес к работе, обсуждение полученных результатов, и всему коллективу лаборатории - за постоянную помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Жесткова, Инна Матвеевна, 1984 год

1. Блюменфельд Л.А. О некоторых физических аспектах внутриклеточной трансформации энергии. Биофизика, 1976, т.21, № 5, с.946-957.

2. Блюменьфельд Л.А., Кольтовер В.К. Трансформация энергии и кон-формационные переходы в митохондриальных мембранах как релаксационные процессы. Молек.биол., 1972, т.6, № I, с.161-165.

3. Бойер П.Д. Новые гипотезы о механизмах фосфорилирования и передачи энергии в мышцах и митохондриях. В кн.: Молекулярная биология. Проблемы и перспективы. М.: Наука, 1964, 227 с.

4. Бурштейн Э.А. Люминесценция белка. Природа и применение. Молекулярная биология (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1973, т.З, 280 с.

5. Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка (Природа и применение). Биофизика (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1977, т.7, 189 с.

6. Бауэр Э.С. Теоретическая биология. М.: Изд-вэ ШЭМ, 1935. 206 с.

7. Волынец А.П., Прохорчик Р.А. Фенольные соединения хлоропластов надосадочной жидкости и целых листьев желтого люпина и льна-долгунца. Докл.АН БССР, В74, т.18, № 3, с.263-266.

8. Волынец А.П., Прохорчик Р.А. Ароматические соединения продукты и регуляторы фотосинтеза, Минск: Наука и техника, 1983, 157 с.

9. Глаголев А.Н., Скулачев В.П. О действии олигомицина и механизме АТФазной реакции в митохондриях. Биохимия, В74, т.39, № 3, с.614-618.

10. Гришина Г.С., Белл Л.Н., Букина Г.С. Применение амперометриче-ского метода для исследования обмена кислорода на свету. Физиол.раст., 1966, т.13, № 6, с.737-744.

11. Детерман Г. Гельхроматография. М.: Мир, 1970, 249 с.

12. Жесткова И.М., Молотковский Ю.Г. Предполагаемый механизм активации и регулирования Mg ^+-АТФазы хлоропластов. Физиол.раст., 1976, т.23, № 6, C.II08-II96.

13. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа, 1974, 213 с.

14. Запрометов М.Н., Колонкова С.В. О биосинтезе фенольных соединений в хлоропластах. Докл.АН СССР, 1967, т.176, № 2, с.470-472.

15. Игнатова Л.К. Ингибирующее действие углекислоты на ^-зависимое выделение 0^ протопластами листьев гороха. Физиол. раст., 1983, т.30, № 5, с.950-954.

16. Кефели В.И.,Турецкая Р.Х. Локализация природных фенольных ингибиторов в клетках листьев иш. Докл.АН СССР, 1966, т.170, № 2, с.472-475.

17. Конев С.В. Электронно-возбужденные состояния биополимеров. Минск: Наука и техника, 1965, 176 с.

18. Кочергинский Н.М. Липиды как возможные переносчики протона от дыхательной цепи к АТФ-синтетазе и механизм окислительного фосфорилирования. Биофизика, 1979, т.24, ffe 3, с.954-958.

19. Мальян А.Н., Акулова Е.А. 0 механизме стимуляции растворимой АТФазы хлоропластов. Биохимия, 1978, т.43, № 7, с.1206-1211.

20. Мальян А.Н., Акулова Е.А., Музафаров Е.Н. Кверцетин аллосте-рический регулятор активности сопрягающего фактора фотофосфорилирования СФ£. - Биоорган.химия, 1977, т.З, № 5, с.639-645.

21. Мальян А.Н., Макаров А.Д. Исследование кинетики и механизмагидролиза АТФ растворимой АТФазой хлоропластов (СФ.0 в присутствии ионов Mg Биохимия, 1976, т.41, й 6, с.1087-1093.

22. Мальян А.Н. Об участии карбоксильной группы в активном центре СФ-j- АТФазы хлоропластов. - Докл.АН СССР£ 1979, т.247, N2 4, с.993-996.

23. Молотковский Ю.Г.,Дзюбенко B.C., Тимонина В.Н. Светоиндуцируе-мое разобщение фотофосфорилирования в хлоропластах неорганическим фосфатом. Исследование эффекта. Физиол. раст., 1977, т.24, № 3, с.478-485.

24. Музафаров Е.Н., Акулова Е.А., Иванов Б.А., Рузиева Р.Х^ Ингибирование кверцетином электронного транспорта и фотофосфорилирования в хлоропластах. Молек.биол., В78, т.12, № I, с.100-107.

25. Нуритдинова Ф.Р., Имамалиеъ А.И. Выделение и физиологические свойства некоторых фенольных соединений хлопчатника. В кн.: Тез.докл.I Всесоюзн.симп. по фенольным соединениям. Тбилиси, 1976, 37 с.

26. Островский Д.Н., Гельман Н.С. Определение концентрации кислорода в биологических жидкостях методом полярографии с неподвижными электродами. Биохимия, Э62, т.27, № 3,с.532-537.

27. Пояркова Н.М., Гришина Г.С., Вийль Ю.А., Воскресенская Н.П.

28. Образование гликолата в изолированных хлоропластах шпината на красном и синем свету. Физиол.раст., 1978, т.23, № б, C.III5-II2I. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: ноше взгляды. - М.: Мир, 1981, 216 с.

29. Andreo C.S., Vallejos R.H. An essential arginyl residue in the soluble chloroplast ATPase.- FEBS lett., 1977, v.78, IT 2, p. 207-210

30. Andreu J.M., Albendea J.,Munoz E. Membrane adenosine triphosphatase of Micrococcus lysodeiktius. Molecular properties of the purified enzyme unstimulated by trypsin.- Europ.J.Bio-chom., 1973, v.37, IT 3, p. 505-515.

31. Arnon J.I., Allen M.B., Whatley F.R. Photosynthesis by isolated chloroplast.- Nature, 1954, v. 174, N 24, p. 394-396

32. Arnon D.I., Whatley P.R., Allen M.B. Photosynthetic phosphorylation by isolated chloroplasts in coupled with ТРП reduction.- Science, 1958, v.127, IT 3305, p. 1026-1034

33. Arntzen C.J., Palkenthal S.V., Bobick S. Inhibition of photo-phosphorylation by kaempferol.- Plant physiol., 1974, v.53, IT 2, p. 304-306

34. Avron M. Light-dependent adenosine triphosphatase in chloroplasts J.Biol.Chem., v.237, N 6, p. 2011-2017

35. Avron M. A coupling factor in phosphorylation.-Biochim.et biophys. acta, 1963, v.77, IT 6, p. 699-702

36. Bakker-Gruhnwald Т., van Dam K.The energy level associated with2+the light-triggered Mg -dependent ATPase in spinach chloroplasts.- Biochim. et biophys.acta, 1973, v.292, IT 3, p. 808-814.

37. Bakker-Gruhnwald Т., van Dam K. On the mechanism of activation of the ATPase in chloroplasts.- Biochim. et biophys. acta, 1974, v. 347, N 2, p. 290-298.

38. Baird B.A., Hammes G.G. Chemical cross-linking studies ofchloroplast coupling factor 1. J.Biol.Chem., 1976, v.251, IT 22, p. 6953-6982

39. Boyer P.D. Conformational coupling in biological energy transductions.- Inj Dyn. energy-transducting membranes. Amsterdam et al., 1974, p. 289-301.

40. Boyer P.D. Coupling mechanism in capture, transmission and use of energy.- Ann.Rev.Biochem., v.46, Palo Alto ,Calif.,1977, p. 957-966.

41. Bruinsma J. A comment of the spectrophotometry determination of chlorophyll.- Biochim. et biophys. acta, 1961, v. 52, N 3, p. 576-578.

42. Cantley L.C., Hammes G.G. Characterization of nucleotide binding sites on chloroplast coupling factor 1.- Biochemistry, 1975, v.14, N 13, p. 2968-2975.

43. Cantley L.C., Hammes G.G. Characterization of sulfhydryl groupson chloroplast coupling factor 1 exposed by heat activation.-Biochemistry, 1976, v.15, IT 1, p. 9-15.

44. Cantley L.C., Hammes G.G. Investigation of quercitin bindingsites on chloroplast coupling factor 1.- Biochemistry, 1976,v.15, N 1, p. 1-8.

45. Carlier M.-F.,Holowka D.A., Gordon G. Interaction of photoreac-tive and fluorescent nucleotides with chloroplast coupling factor.- Biochemistry, 1979, v.18, IT 16, p. 3452-3457.

46. Carmeli C. Proton translocation induced by ATPase activity in chloroplasts.- PEBS lett., 1970, v.7, H 3, p. 297- 300.

47. Carmeli C. Properties of ATPase in chloroplasts.- Biochim. et Biophys. acta, 1969, v. 189, IT 2, p. 256-266.

48. Carmeli C., Avron M. A light- triggered ATP-P exchange activity in chloroplasts.- Biochim. Biophys.Res.Communs., 1966, v.24, IT 6, p. 923-927.

49. Carmeli С., Lifschitz Y. Effects of P^^ and ADP on ATPase activity in chloroplasts.- Biochim. et biophyg. acta, 1972, v. 267, IT 1, p. 86-95.

50. Oarmeli C.,Lifschitz Y.,Gutman M. Control of kinetic changes in ATPase activity of soluble coupling factor 1 from chloroplasts.- PEBS lett., 1978, v.89, IT 2, p.211-214.

51. Chang I.C., Kahn J.C. Isolation of a possible coupling factor for photophosphorylation from chloroplasts of Euglena gracilis. Arch.Biochim. et Biophys., 1966, v.117, IT 2, p. 282288.

52. Chetverin А.В., Venyaminov S.Yu., Emelyanenko V.J., Burstein

53. E.A. Lack of gross protein structure changes in the working cycle of (Na+, K+)- dependent adenozinetriphosphatase.-Evidence from infrared and intrinsic fluorescence spectroscopic date.- Eur.J.Biochem., 1980, v.108, IT 1, p. 149156.

54. Chaver E., Cuellar A. ATP complexes with the ATPase inhibitor quercetin.- Life Sci.,1980, v.27, N 16, p. 1477-1482.

55. Cohen W.S., Mac-Peeck W.A. A proposed mechanism for the stimulatory effect of bicarbonate ions on the ATP synthesis in isolated chloroplasts.- Plant Physiol., 1980, v.66, N 2, p. 242-245.

56. Caterall W.A*, Pedersen P.L. Structural and catalytic properties in mitochondrial adenosine triphosphatase.- Biochem. Soc. Spec. Publ., 1974, v.4,p. 63-88.

57. Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins.- Ann.Hew York Acad.Sci.,1964, v.121, p.404-427.

58. Deters D.W.,Racker E., Nelson N., Nelson H. Partial resolution of the enzymes catalizing photophosphorylation. XV.Approaches to the active 3ite of coupling factor 1.- J.Biol. Chem. v. 250, N 3, p. Ю41-Ю47.

59. Dilley R.A., Backer G.M. A photosystem II specific intramembra-ne domain in chloroplast thylakoid membranes.- In: Plant membrane Transp.: Curr.Concept. Issues Proc. Int. Workshop, Toronto. 1979. Amsterdam et al., 1980, p. 447-448.

60. Di Pietro A., Godinot C., Bouillant M.-L.,Gautheron D.C. Pig heart mitochondrial ATPase: properties of purified and membrane-bound enzyme. Effects of flavonoids. -Biochimie, 1975, v. 57, N 8, p. 959-967.

61. Ebel R.E., Lardy H.A. Stimulation of rat liver mitochondrial adenosine triphosphatase by anions.- J.Biol.Chem., 1975, v.250, N 1, p. 191- 196.

62. Enser U., Heber U. Metabolic regulation by pH gradients. Inhibition of photosynthesis by indirect proton transfer across the chloroplast envelope.- Biochim. et biophys. acta, 1980, v. 592, N 3, p. 577-591.

63. Panestiel D.D., Hastings А.В., Mahowald T.A. Environmental C02 stimulation of mitochondrial adenosine triphosphatase activity. -J.Biol.Chem., 1963, v. 238, N 2, p. 836-842.

64. Farron P. Isolation and properties of a chloroplast coupling factor and heat-activated adenosine triphosphatase.-Biochemistry, 1970, v.9, N 19, p. 3832-3828.

65. Farron F.,Racker E. Studies of mechanism of the conversion of coupling factor 1 from chloroplasts to an active adenosine triphosphatase.- Biochemistry, 1970, v.9, N 19,p. 3829-3836.

66. Fergusson S.J., Lloyd W.J., Radda G.K. The mitochondrial ATPase. Selective modification of a tyrosine residue inthe ! subunit. -Europ. J.Biochem., 1975, v.54, N 1,i'.p.127-133.

67. Findenegg G.R, Inorganic carbon transport in microalgae. II. Uptake of HCO^ ions during photosynthesis of five microalgae species.- Plant.Sci.Letters, 1980, v.18, N 3, p. 269-297.

68. Garber M.P., Steponkis P.L. Identification of chloroplast coupling factor by freeze-etching and negative staining techniques.- J.Cell Biol., 1974, v. 63, N 1, p. 24-34.

69. Grubineyer C., Spencer M. Effects of anions on a soluble ATPase from mitochondria of pea cotyledons,- Plant and Cell Physiol., 1979, v. 20, N 1, p. 83-91.

70. Gruhnhagen H.H., Witt H.T. Primary events in the functional membrane of photosynthesis. Umbelliferrone as indicator for the pH changes in one turn-over.- Z. Naturforsch., 1970, 25b, s. 373-386.

71. Gomez-Puyou M.T., Gomez-Puyou A. A simple method of purification of a soluble oligomycin-insensitive mitochondrial ATPase.- Arch.Biochim. and Biophys., 1977, v. 182, N1, p. 82- 86.

72. Gould J.M. Inhibition by triphenyltin chloride of a tightlybound membrane component involved in photophosphorylation.-Eur.J.Biochem., 1976, v.62, N 3, p. 567-575.

73. Hall D.O. nomenclature for isolated chloroplasts.- Nature new biology, 1972, v.235, N 56, p. 125-126.

74. Hanstein W.G. Uncoupling of oxidative phosphorylation.- Biochim. et biophys. acta, 1976, v. 456, N 2, p.129- 148.

75. Harris D.A. ,Slater E.C. Tightly bound nucleotides of the energy transducing ATPase of chloroplasts and their role in pho-tophosphorylation.- Biochim. et biophys.acta, 1975, v.387, IT 2, p. 335-348.

76. Hartig P.R.,Bertrand IT.J. ,Sauer K. 5-iodoacetamidofluorescein-labelled chloroplast coupling factor 1: conformational dynamics and labelling-site characterization.- Biochemistry, 1977, v. 16, IT 19, p. 4275-4282.

77. Heber U., Santarius K.A. Direct and indirect transfer of

78. ATP and ADP асгоэз the chloroplast envelope.- Z.Naturforsch., 1970, 27b, s. 718-728.

79. Heldt H.W., Werdan K., Milovancew M., Geller G. Alkalizationof the chloroplast stroma caused by light-dependent proton flux into the thylakoid space.-Biochim. et biophys.acta, 1973, v. 314, IT 2, p. 224-241.

80. Hind G., Jagendorf A. Separation of light and dark stages inphotophosphorylation.- Proc.Wat.Acad.Sci. USA, 1963, v.49, II 5, p. 715-722.

81. Hoch G., Martin I. Photo-potentiation of adenosine triphosphate hydrolysis.- Biochim. Biophys. Res.Communs., 1963, v.12, Ж 3, p. 223-228.

82. Hochmann Y., Caraieli C. Modulation by bicarbonate,phosphate and maleate of the kinetics of adeno3inetriphosphatase activity and of the binding of manganese ions to chloroplast coupling factor 1.- Biochemistry,1981, v.20, IT 22, p.6293-6297.

83. Hochmann Y., Lanir A., Carmeli C. Relations between divalentcation-binding and ATPase activity in coupling factor from chloroplast,- FEBS lett., 1976, v.61, N 2, p. 255-259.

84. Holowka D.A., Hammes G.G. Chemical modification and fluorescence studies of chloroplast coupling factor.- Biochemistry, 1977, v.16, N 25, p. 5538-5545.

85. Howell S.H., Moundrianakis E.N. Hill reaction site in chloroplast membranes: non-precip&tation of the quantosome particle in photoreductions.- J.Mol.Biol.,1967, v.27, N 2, p.323-333.

86. Jagendorf A.T. Acid-base transitions and phosphorylation by chloroplasts.- Federat.Proceed., 1967, v.26, H 5, p. 1361-1369.

87. Jagendorf A.T., Smith M. Uncoupling phosphorylation in spinach chloroplasts by absence of cation.- Plant Physiol., 1962, v.37, N 1, p. 135-141.

88. Jagendorf A.T., Heuman J. Effect of uncouplers on the light-induced pH rise with spinach chloroplasts.- J.Biol.Chem., 1965, v.240, N 7, p. 3210-3214.

89. Jagendorf A.T., Uribe E. Photophosphorylation and the chemiosmo-tic hypothesis.- In: Energy conversion by the photosynthese apparatus. Brookhaven Symposia on Biol., Washington , N 19, 1967, p. 215-245.

90. Kagawa Y., Sone N., Hirata H., Yoshida M. Structure and function H+-ATPase.- J.Bioenerg. and Biomembr., 1979, v.11, N 3-4, p. 39-78.

91. Kamienietzky A., Nelson A. Preparation and properties of chloroplasts , depleted of chloroplast coupling factor by sodium bromide treatment.- Plant Physiol., 1975, v.55, N 2, p.282-287.

92. Kannangara O.C., van Wyk D., Menke W. Immunological evidence for2+the presence of latent Ca dependent ATPase and carboxy-dismutase on the thylakoid surface.- Z. Naturforsch., 1970, 25b, s. 613-618.

93. Kaplan J.H., Jagendorf A.T. Further studies on chloroplast adenozine triphosphatase activation by acid -base transition.-J.Biol.Chem., 1968, v.243, N 5, p. 972-979.

94. Kaplan J.H., Uribe E., Jagendorf A.T. ATP hydrolysis caused byacid-base transition of spinach chloroplasts.- Arch.Biochem. and Biophys., 1967, v.120, N 2, p.365-375.

95. Kasahara M., Penefsky H.S. High affinity binding of monovalent P^ by beef heart mitochondrial adenosine triphosphatasea-J.Biol.Chem., 1978, v.253, N 12, p. 4180-4187.

96. McCarty R.E. Roles of a coupling factor for phosphorylation in chloroplasts.- Ann.Rev.Plant Physiol., v.30. Palo Alto, Calif., 1979, p. 79-104.

97. McCarty R.E., Racker E. Partial resolution of the enzymescatalizing pho&ophosphorylation. II. The inhibition andtstimulation of photophosphorylation by N,N dycyclohexyl-carbodiimide.- J.Biol.Chem., 1967, v.242, N 15, p. 34353439.

98. McCarty R.E., Pagan J.Light-stimulated incorporation of N-ethylma-leimide into coupling factor 1 in spinach chloroplasts.-Biochemistry, 1973, v. 12, IT 8, p. 1503-1507.

99. McCarty R.E., Fuhrman J.S., Tsuchiya Y. Effects of adenine nucleotides on hydrogen-ion transport in chloroplasts.- Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 1971, v.68, N 10, p. 2522-2526.

100. McEvoy P.A., Lynn W.S. The peptides of chloroplast membranes. I.2+

101. The soluble coupling factor ( Ca -ATPase).- Arch.Biochem. and Biophys., 1973, v. 158, N 1, p. 335-341.

102. McKinney D.W., Buchanan B.B., Wolosiuk R.A. Activation of chloroplast ATPase by reduced thioredoxin.- Phytochemistry, 1978, v.17, N 4, p. 794-795.

103. Melandri B.A., Baccarini-Melandri A., San Pietro A., Gest H.

104. Role of phosphorylation coupling factor in light-dependent proton translocation by Rhodopseudomonas capsulata membrane preparations.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1970, v.67, N 2, p. 477- 484.

105. Mills J.D., Hind G. Light-induced Mg2+ -ATPase activity of coupling factor in intact chloroplasts.- Biochim. et biophys. acta, 1979, v. 547, N 3, p.455-462.

106. Mills J.D., Mitchell P., Schurmann P. Modulation of coupling factor ATPase activity in intact chloroplasts. The role of the thioredoxin system.- PEBS lett., 1980, v.112, N 2, p. 173-177.

107. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transport by a chemiosmotic type of mechanism.-Nature, 1961, v.191, N 4784, p. 144-148.

108. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthe-tic phosphorylation.- Biol. Rev. ( of the Cambridge Philosophical Society ), 1966, v.41, N 3, p. 445-502.

109. Mitchel P. Chemiosmotic coupling in energy transduction: a logical development of biochemical knowledge.- J.Bioenerg., 1972, v.3, N 1-2, Spec.Issue: Mech.biol.energy transduc., p. 5-24.

110. Mitchell P. Cation translocating adenosine triphosphatase models: how direct is the participation of adenosine triphosphate and its hydrolysis products in cation translocation.-FEBS lett., 1973, v.33, N 3, p. 267-274.

111. Mitchell P. A chemioosmotic molecular mechanism for protontranslocating adenosine triphosphates.- PEBS lett., 1974, v.43, N 2, p. 189-194.

112. Moundrianakis E.N. Structural and functional aspects of photo-synthetic lamellae.- Fed. Proc., 1968, v.27, p. 1180-1185.

113. Moundrianakis E.N., Tiefert M.A. Stability of bound ADPfunctioning as a phosphoryl donor in ATP synthesis by chloroplasts." J.Biol.Chem., 1979, v. 254, N 19, p.9509-9517

114. Moyle J., Mitchell P. Active/inactive transitions of mitochond2+rial ATPase molecules influenced by Mg ,anions and aurovertin.- FEBS lett., 1975, v.56, N 1, p.55-61.

115. Mukohata Y., Nakabayashi S., Higashida M. Quercetin, an energy transfer inhibitor in phosphorylation.- FEBS lett., 1978, v.85, N 2, p. 215-218.

116. Murai Т., Akazawa Т. Bicarbonate effect on the phosphorylation catalyzed by chromatophores isolated from Chromatium strain D. XIII.Structure and function of chloroplast proteins.-Plant Physiol., 1972, v.50, N 5, p. 568-571.

117. Nelson N. Structure and function of chloroplast ATPase .- Biochim.et biophys.acta, 1976, v. 456, N 3-4, p. 314-338.

118. Nelson N., Nelson H., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalizing photophosphorylation .XII. Purification and properties of as inhibitor isolated from chloroplast coupling factor 1. -J.Biol.Chem., 1972 b, v.247, N 23, p. 7657-7662.

119. Nelson N., Broza R. Salt inactivation as a mechanismic probe of membrahe-bound chloroplast coupling,factor 1.-Eur. J. Biochem., 1976, v.69, N 1, p. 203-208.

120. Nelson N., Karny 0. The role of £ subunit in the coupling activity of coupling factor 1.- PEBS lett., 1976, v.70, N 1, p. 244-253 •

121. Nelson N., Deters W.D., Nelson H., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalizing photophosphorylation. XIII. Properties of isolated subunits of coupling factor 1 from spinach chloroplasts.- J.Biol. Chem., 1973, v.248, N 6, p. 2049- 2055.

122. Nelson N., Kanner B.I., Gutnick D.L. Purification and properties of Mg2+ -Ca2+ ATPase from Escherichia coli.- Proc.Nat. Acad.Sci. USA, 1974, v.71, N 7, p. 2720-2724.

123. Nischimura M., Ito Т., Chance B. Studies of bacterial photophosphorylation. III. A sensetive and rapid method of determination of photophosphorylation.- Biochim. et biophjrs. acta, 1962, v.59, N 1, p. 177-182.

124. Oliver D., Jagendorf A. Exposure of free amino groups in the coupling factor of energized spinach chloroplasts.- J. Biol.Chem., 1976, cv. 251, N 22, p. 7168-7175.

125. Ort D.R., Dilley R.A., Good N.E. Photophosphorylation as a function of illumination time. II. Effects of permeant buffers.- Biochim.et biophys.acta, 1976a, v.449, N 1, p. 108-124.

126. Ort D.R. ,Dilley R.A. Photophosphorylation as a function of illumination time. I.Effects of permeant cations and permeant anions.

127. Packer L., Crofts A. The energized movement of ions and water by chloroplasts.- In: Current topics in bioenergetics, New York-London, 1967, v.2, p. 24-64.

128. Paradies H.H.,Zimmerman J., Schmidt U.D. The conformation ofchloroplast coupling factor 1 from spinach in solution.-J.Biol.Chem., 1978, v.253, N 24, p. 8972-8979.

129. Papa S., Querrieri P., Bernard!■ L.R., Tager J.M. Effect of oli-gomycin on proton translocation in submitоchondrial particles." Biochim.et biophys.acta, 1970, v.197, N 1, p.100-108.

130. Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from rat liver mitochond-ria-evedence for a mercurial-sensitive site for the activating anion bicarbonate.- Biochim. and Biophys.Res.Communs., 1976, v.71, IT 4, p.1182-1188.

131. Pedersen P.L. ATP-dependent reactions catalyzed by inner membrane vesicles of rat liver mitochondria. Kinetics, substrate specificity and bicarbonate sensitivity.- J.Biol.Chem., 1976, v.251, IT 4, p. 934-940.

132. Pedersen P.L.,Le Vine H., Cinton N. Activation and inhibition of mitochondrial ATPase of rat liver mitochondria.- Ins Membrane proteins transport and phosphorylation. Amsterdam, 1974, p. 43-54.

133. Penefsky H.S. Reversible binding of P^ beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase.- J.Biol.Chem., 1977, v. 252, N 9, p. 2891-2899.

134. Penin P., Godinot C.,Godinot C., Goutheron D.C. Optimization of the purification of mitochondrial P^-adenosine triphosphatase.- Biochim.et biophys.acta, 1978, v.548, N 1, p. 63-71.

135. Petrack B.,Lippman P. Photophosphorylation and photohydrolysis in cell-free preparations of blue-green algae.- Ini Light and Life, Baltimore, 1961, p. 621-630.

136. Petrack В., Graston A., Sheppy P., Farron P. Studies on the hydrolysis of adenosine triphosphate by spinach chloroplasts.- J.Biol.Chem., 1965, v.240, N 2, p. 906-912.

137. Portis A.A., Heldt H.W. Light-dependent changes of Mg2+ con2+centration in the stroma in relation of the Mg «dependency of CO2 fixation in intact chloroplasts.-Biochim.et biophys.acta ,1979, v.449, N 3, p. 434-444.

138. Portis Js., Archie R. Evidence of a low stromal Mg concentration in intact chloroplasts in the dark. I. Studies with the ionophore A 23187. -Plant Physiol., 1981, v.67, N5, p. 985-989.

139. Posorske L., Jagendorf A.T. Nucleotide and metal interactions affecting inactivation of spinach chloroplast coupling factor by NaCl in the cold.- Arch. Biochem. and Biophys., 1976, v. 177, N 1, p. 276-283.

140. Prochaska L.J., Dilley R.A. Site specific interaction of protons liberated from photosystem II oxidation. With a hydrofobic membrane component of the chloroplast membrane.- Biochim. and Biophys. Res.Communs., 1978, v.83, N 2, p. 664-672.

141. Punnet Т., Iyer R.V., The enhancement of photophosphorylation and the Hill reaction by carbon dioxide.- J.Biol.Chem., 1964, v. 239, N 7, p. 2335-2339.

142. Racker E. Reconstitution, mechanism of action and control ofion pumps.- Biochem. Soc. Trans., 1975, v.3, N 4, p.786-800

143. Recktenwald D., Hess B. Allosteric influence of anions onmitochondrial ATPase of yeast.- FEBS lett., 1977, v.76, N 1, p. 25-28.-

144. Rienita K.D., Hardt H., Avron M. ATP driven revearse electron transport in chloroplasts.- FEBS lett., 1973, v.33, N 1, p. 28-31.

145. Roy H., Moundrianakis E.N. Interaction between ADP and the coupling factor of photophosphorylation.- Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1971, v.68, N 2, p. 464-468.

146. Ryrie I.J. Purification and characterization of the oligomycin-sensitive ATPase from yeast mitochondria.- Archiv.Biochim. Biophys. 1975, v.168, N 2, p. 712-719.

147. Ryrie I.J., Jagendorf A.T. Correlation between a conformational change in the coupling factor protein and the high energy state in chloroplasts.- J.Biol.Chem., 1972, v. 247, N14, p. 4453-4459.

148. Saito K. Possible site of flavonoid synthesis in the photosynthe-tic apparatus.- Biochem.J., 1974, v.144, N 2, p. 431- 432.

149. Santjago E., Iriarte A.J., Lopez-Labelza M.J., Lopez-Moratalla N. Effect of free ATP, citrate and bicarbonate on rat liver mitochondrial ATPase.- Archiv.Biochim.Biophys., 1979,v.196, N 1, p. 1-6.

150. Saunders J.A., McClure J.W. The distribution of flavonoids in chloroplasts of twenty five species of vascular plants.-Phytochemistry, 1976, v.15, N 5, p. 809-810.

151. Schneider V. In vitro inhibition of photophosphorylation bykaempferol. -Z.Pflanzenphysiol., 1973, v.70, N1, p.88-92.

152. Schneider V. Einfluss verschiedener flavonole auf lamellaesystem der chloroplasten in vitro.- Z.Pflanzenphysiol., 1974, v.72, N 1, p. 36-51.

153. Scholes P., '„Mitchell P.,Moyle J. The polarity of proton translocation in some photosynthetic microorganism .-Eur. J. Biochem., 1969, v.8, N 3, p. 450-454.

154. Schwartz M. The relation of ion transport to phosphorylation.-Ann.Rev.Plant Physiol., 1971, v.22, p. 469-484.

155. Shen Y.K., Shen G.M. Studies on photophosphorylation. The "light intensity effect" and intermediate steps on photophosphorylation.- Scien&La Sinica, 1962, v.11, N 8, p.1097-1115.

156. Shoshan V., Shavit M., Chipman D.M. Kinetics of nucleotide binding to chloroplast coupling factor ( CP^).- Biochim. et biophys.acta, 1978, v.504, N 1, p. 108-122.

157. Shoshan V., Shahak Y., Shavit N. Quercetin interaction with the chloroplast ATPase complex.- Biochim. et biophys.acta, 1980, v. 591, N 2, p. 421-433.

158. Slater E.C. Energy metabolism and biomembranes. The role ofmitochondrial and chloroplast ATPase in oxidative and photosynthetic phosphorylation.- J.Biochem.,1976, v.79, N 4, -45p.

159. Stenlid G. Plavonoids as inhibitors of the formation of adenosine triphosphate in plant mitochondria.- Phytochemistry, 1970, v.9, N 1, p. 2251- 2256.

160. Strotman H., Schumann J. Structure,function and regulation of chloroplast ATPase.- Physiol.,plantarum, 1983, v.57, N 3, p. 375-382.

161. Tyler D.D., Webb P.R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.- Biochem.J., 1979,v.178,N2,p. 289-297.

162. Viale A., Vallejos R., Jagendorf A. Hydrogen exchange into soluble spinach chloroplast coupling factor during heat activation of its ATPase.- Biochim. et biophys. acta,1978, v.463, IT 3, p. 498-503.

163. Walker D.A., Crofts A.R. Photosynthesis.- In: Ann.Rev.Bioche-mistry, 1970, v.39, p. 389-423.

164. Webster G.D., Edwards P.A., Jackson J.B. Interconversion of two kinetically distinct states of the membrane-bound and solubilised H+-translocating ATPase from Rhodospirillum rubrum.-FEBS lett., 1977, v.76, N 1, p. 29-35.

165. Weiss M.A., McCarty R.E. Cross-linking within a subunit of coupl-ling factor 1 increases the proton permeability of spinach chloroplasts thylakoids.- J.Biol.Chem. ,1977, v. 252, Ж 22, p. 8007-8012.

166. Williams R.J.P. The separation of electrons and protons during electron transfer:* . :the distinction between membrane potentials and transmembrane gradients.- Ann. N.Y.Acad. Sci., 1974, v. 227, p. 98- 107.

167. Winget G.D., Izawa S., Good N.E. The inhibition of photophosphorylation by phlorizine and closely related compounds.-Biochemistry, 1969, v.8, N5, p, 2067-2074.

168. Witt H.T. Energy conversion in the functional membrane of photosynthesis.- Analysis by light pulse and electric pulse method.- The central role of the electric fields .-Biochim. et biophys. acta, 1979, v.505, N 3-4, p. 355427.

169. Wolosiuk R.A., Crawford TT.A.,Yee B.C., Buchanan B.B. Isolation of three thioredoxins from spinach leaves.- J.Biol.Chem. 1979, v. 254, N 5, p. 1627-1632.

170. Werdan K., Heldt H.W., Geller G. Accumulation of bicarbonatein intact chloroplast following a pH-gradient.- Biochim. et biophys.acta, 1972, v. 283, N 3, p. 430- 441.

171. Yonis H.M., Winget G.D., Racker .JE. Requirement of the sub-unit of chloroplast coupling factor for photophosphorylation.-J.Biol.Chem. , 1977, v.252, IT 5, p. 1814-1818.

172. Yoshida M.f Okamoto H., Sone IT., Hirata H., Hagawa Y, Reconstitution of thermostable ATPase capable of energy coupling from its purified subunits.-Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1977, v. 74, N 3, p. 936-940.