Механизмы сопряжения и регуляции протон-зависимой АТФ-синтазы бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Фенюк Борис Александрович

• Фенюк Борис Александрович
• доктор наук
• 2022

Оглавление диссертации доктор наук Фенюк Борис Александрович

Оглавление

Оглавление

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Физиологическая роль FoFi -АТФ-синтазы

2.2. Структура FoFi -АТФ-синтазы

2.2.1. Общая структура фермента

2.2.2. Структура ион-транслоцирующего комплекса Fo 27 2.2.2.1. Стехиометрия с-субъединиц

2.2.3. Структура каталитического субкомплекса Fi 36 2.2.3.1. Структура каталитического сайта

2.3. Гены, кодирующие субъединицы АТФ-синтазы

2.3.1. Гены АТФ-синтазы эубактерий

2.3.2. Гены АТФ-синтазы хлоропластов и митохондрий

2.4. Каталитический механизм

2.4.1. Общие принципы ротационного катализа

2.4.2. Термодинамика синтеза/гидролиза АТФ

2.4.3. Механизм синтеза/гидролиза АТФ субкомплексом Fi

2.4.3.1. Субстратная специфичность FoFi

2.4.3.2. Связывание/высвобождение фосфата

2.4.3.3. Схема ротационного катализа при гидролизе АТФ

2.4.4. Механизм ионного транспорта 59 2.4.4.1. Исследования роли в ионном транспорте отдельных аминокислотных остатков субъединиц a и с фермента E. coli с помощью сайт-направленного мутагенеза

2.4.4.2. Особенности ионного транспорта у №+-транслоцирующих

ферментов

2.5. Регуляция активности АТФ-синтазы

2.5.1. Влияние рН и концентрации магния

2.5.2. Регуляторная роль Дцн+ и Фн

2.5.3. АДФ-ингибирование

2.5.3.1. АДФ-ингибирование фермента хлоропластов

2.5.3.2. АДФ-ингибирование митохондриального фермента

2.5.3.3. АДФ-ингибирование бактериального фермента

2.5.3.4. Усиление АДФ-ингибирования азидом

2.5.3.5. Аминокислотные остатки, участвующие в АДФ-ингибировании

2.5.3.6. Роль некаталитических сайтов в АДФ-ингибировании FoFi

2.5.3.7. Влияние детергента LDAO на АТФазную активность FoFi

2.5.3.8. Роль Дцн+ в активации FoFi, ингибированного АДФ

2.5.4. Субъединица 8 бактериальной и хлоропластной АТФ-синтазы

2.5.5. Редокс-регуляция активности хлоропластной АТФ-синтазы

2.5.6. Митохондриальный белок IF1

2.5.7. Прочие регуляторные механизмы

3. Материалы и методы

3.1. Культивирование микроорганизмов

3.1.1. Культивирование Rhodobacter capsulatus

3.1.2. Культивирование и сбор клеток Escherichia coli 101 3.2 Получение СБЧ и очищенных ферментов

3.2.1. Получение суббактериальных частиц с помощью Френч-пресса

3.2.2. Получение хроматофоров Rb. capsulatus с помощью обработки ультразвуком

3.2.3. Получение хроматофоров Rb. capsulatus, лишенных субкомплекса F1

3.2.4. Получение СБЧ термофильной Bacillus sp. PS3, лишенных субкомплекса F1

3.2.5. Измерение размеров суббактериальных частиц (хроматофоров) Rb. capsulatus с помощью электронной микроскопии. i03

3.2.6. Выделение и очистка субкомплекса Fi термофильной Bacillus sp. PS3 после гетерологической экспрессии в E. coli i04

3.2.7. Выделение и очистка FoFi термофильной Bacillus sp. PS3 после гетерологической экспрессии в E. coli i04

3.2.8. Встраивание FoFi Bacillus sp. PS3 в липосомы i05

3.2.9. Введение флуоресцентных меток в субъединицы у и s. i05

3.2.10. Реконструкция флуоресцентно меченного субкомплекса Fi с СБЧ из Bacillus sp. PS3, лишенных нативного Fi i07

3.3. Измерение активности FoFi i08

3.3.1. Регистрация изменений А'ф на СБЧ (хроматофорах) из Rb. capsulatus i08

3.3.2. Измерение количества ФРЦ в препаратах хроматофоров Rb. capsulatus ii0

3.3.3. Регистрация изменений ApH на СБЧ из Rb. capsulatus iii

3.3.4. Измерение синтеза АТФ хроматофорами Rb. capsulatus iii

3.3.5. Регистрация изменений ApH на СБЧ из E. coli и в протеолипосомах ii2

3.3.6. Измерение АТФазной активности в АТФ-регенерирующей системе ii2

3.3.7. Измерение АТФазной активности в отсутствие фосфата ii3

3.3.8. Измерение АТФ-зависимого вращения субъединицы у на единичных молекулах Fi из Bacillus sp. PS3 ii3

3.3.9. Вращение субъединицы у на единичных молекулах Fi из Bacillus sp. PS3 с помощью оптического пинцета ii4

3.4. Прочие биохимические методы ii4 3.4.2. Измерение концентрации бактериохлорофилла ii5

3.5. Генно-инженерные методы ii5

3.5.1. Получение штамма Rb. capsulatus с мутацией yMet23Lys в FoFi ii5

3.5.2. Мутагенез ферментов Bacillus sp. PS3 и E. coli ii6

4. Результаты и обсуждение ii6

4.1. Хроматофоры Rb. capsulatus как система для функциональных

исследований FoFi ii6

4.1.1. Измерение Д^ и ионного транспорта на СБЧ из Rb. capsulatus

4.1.2. Регистрация протонного транспорта через F0F1 Rb. capsulatus с помощью специфических ингибиторов фермента

4.1.3. Хроматофоры Rb. capsulatus содержат в среднем около 1 молекулы F0F1 на мембранную частицу

4.2. Исследование свойств протонного транспорта через Fo

4.2.1. Характеристика трансмембранного ионного транспорта в хроматофорах Rb. capsulatus, лишенных F1

4.2.2. Влияние рН и величины Дф на протонный транспорт через Fo и изотопный эффект

4.2.3. Оценка величины протонной проводимости через единичный Fo

4.2.4. Измерения протонного транспорта через F0 с помощью рН-индикаторов

4.2.5. ДрН как движущая сила протонного транспорта через Fo

4.3. Протонный "слип" в F0F1 Rb. capsulatus: возникновение и свойства

4.3.1. Индукция протонной проводимости через F0F1 в ответ на освещение хроматофоров в отсутствие нуклеотидов

4.3.2. Определение порогового значения Дци+ для индукции "слипа"

4.3.3. Зависимость индукции "слипа" от присутствия нуклеотидов

4.3.4. Индукция "слипа" сопровождается высвобождением связанного с ферментом АДФ

4.3.5. Зависимость "слипа" от величины Дф

4.3.6. Зависимость "слипа" от рН; сравнение с протонным транспортом

через Fo

4.4. Исследование влияния мутации yMet23Lys на регуляцию активности АТФ-синтазы Rb. capsulatus

4.4.1. Влияние мутации yMet23Lys на активацию FoF1 Rb. capsulatus

4.4.2. Влияние мутации yMet23Lys на протонный транспорт через FoF1

4.4.3. Синтез АТФ FoF1 с мутацией yMet23Lys

4.4.4. Влияние мутации yMet23Lys на АДФ-ингибирование

4.5. Исследование влияния аминокислотного остатка в позиции ß259 на АДФ-ингибирование FoFi Bacillus sp. PS3

4.5.1. Влияние мутации ßQ259L на АТФазную активность

FoFi Bacillus sp. PS3

4.5.2. Влияние мутации ßQ259L на синтез АТФ FoFi Bacillus sp. PS3

4.5.3. Исследование эффектов мутации ßQ259L единичных молекулах фермента

4.6. Исследования механизма ингибирования АТФазной активности F0F1 субъединицей

4.6.1. Влияние С-концевого домена субъединицы 8 на АТФазную активность F0F1 Bacillus sp. PS3

4.6.2. Роль фосфата в активации гидролиза АТФ F0F1 Bacillus sp. PS3

4.6.3. Влияние С-концевого домена субъединицы 8 на активацию гидролиза АТФ F0F1 Bacillus sp. PS3 пре-энергизацией мембраны

4.7. Исследования влияния субъединицы 8 на АДФ-ингибирование F1 Bacillus sp. PS3 на единичных молекулах

4.7.1. Влияние С-концевого домена субъединицы 8 на активацию гидролиза АТФ ферментом Bacillus sp. PS3 в ответ на механическое вращение субъединицы у

4.7.2. Сравнение механической жесткости фермента Bacillus sp. PS3 в условиях АДФ-ингибирования и ингибирования субъединицей

4.8. Гипотетическая схема регуляции АТФазной активности

F0F1 Bacillus sp. PS3

4.9. Факторы, индуцирующие конформационный переход субъединицы 8 в ферменте Bacillus sp. PS3

4.9.1. Конформационный переход С-концевого домена субъединицы 8 в ферменте Bacillus sp. PS3 вызван АТФ

4.9.2. Влияние мутаций в области ßDELSDED и в С-концевом домене субъединицы 8 на конформационный переход этого домена в ферменте Bacillus sp. PS3

4.10. Гипотеза о роли регуляторных механизмов FoFl в контроле величины

мембранного потенциала

5. Заключение

5.1. Итоги выполненного исследования

5.2. Выводы

5.3. Перспективы дальнейшей разработки темы

6. Благодарности

7. Список цитируемой литературы

8. Приложение

Список сокращений.

A«h+ - трансмембранная разность электрохимических потенциалов H+

дф - трансмембранная разность электрических потенциалов

A^Na+ - трансмембранная разность электрохимических потенциалов Na+

ACMA - 9-амино-6-хлор-2-метоксиакридин

AMP-PNP - аденозин-5'-ф,у-имидо)-трифосфат

FRET - Förster resonance energy transfer, резонансный перенос энергии

GTA - агент переноса генов (gene transfer agent)

HEPES - №2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота

LDAO - лаурилдиметиламиноксид

MES - 4-морфолинпропансульфоновая кислота

MESG - 2-амино-6-меркапто-7-метилпурин рибозид

MOPS - 3-(№морфолино)пропансульфоновая кислота

mPTP - митохондриальная пора, mitochondrial permeability transition pore

NBD-Cl - 4-хлоро-7-нитробензо-2-окса- 1,3-диазол

Ni-NTA - никель-нитрилотриацетат

TID - 3-(трифторметил)-3-(ж-йодофенил) диазирин

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФ - 1,1'-диметилферроцен

ДТТ - дитиотреитол

ДЦКД - ^№-дициклогексилкарбодиимид

МБН - минимальное блокирующее напряжение

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

РСА - рентгеноструктурный анализ

СБЧ - суббактериальные инвертированные мембранные частицы

СМЧ - субмитохондриальные инвертированные мембранные частицы

ТМПД - тетраметилфенилендиамин

ТНФ-АТФ - 2',3'-О-(2,4,6-тринитрофенил)аденозин 5'-трифосфат

Трицин - №трис(гидроксиметил)метилглицин

Фн - неорганический фосфат

ФЕП - фосфоенолпируват

ФРЦ - фотосинтетический реакционный центр

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

В данной работе также использованы следующие стандартные сокращения:

- единиц измерения метрической системы СИ,

- названий нуклеотидов,

- названий аминокислот (в однобуквенном и трехбуквенном кодах)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы сопряжения и регуляции протон-зависимой АТФ-синтазы бактерий»

1. Введение

Протон-зависимая роторная АТФаза F-типа (АТФ-синтаза, комплекс V митохондрий, БоБ^ является ключевым ферментом биоэнергетики эукариот и большинства бактерий. Она осуществляет синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата, используя для этого энергию трансмембранной разности электрохимических потенциалов протонов (Д«н+). У некоторых бактерий также обнаружен №+-зависимый фермент, использующий для синтеза АТФ трансмембранную разность электрохимических потенциалов ионов натрия (ДОДа+).

АТФ-синтаза представляет собой мембранный фермент, состоящий из двух мультисубъединичных субкомплексов — погруженного в липидный бислой Fо, осуществляющего ионный транспорт, и гидрофильного Б1, катализирующего синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата (Фн). Следует отметить, что фермент также способен катализировать и обратную реакцию — осуществлять протонный или натриевый транспорт через мембрану за счет энергии гидролиза АТФ. У некоторых бактерий эта функция FоFl является основной.

Протонный транспорт осуществляется ферментом за счет энергии А^н+ и сопряжен с синтезом АТФ ротационным механизмом — в результате Н+-транспорта субкомплекс из ряда субъединиц FоFl ("ротор") вращается относительно остальной части фермента ("статора"), что вызывает конформационные изменения в Fl, приводящие к синтезу АТФ.

Изучение каталитического механизма работы фермента и его регуляции актуально не только для понимания фундаментальных принципов работы биологических наномашин и биоэнергетики клетки, но также представляет значительный прикладной интерес. Ряд заболеваний человека связан с дефектами в генах субъединиц FоFl; возможность влиять на активность фермента в ситуации де-энергизации митохондрий (например, в состоянии ишемии) может позволить предотвратить гибель клеток при инфарктах и инсультах; различия в структуре и особенностях регуляции бактериального и эукариотического ферментов делают FоFl перспективной потенциальной мишенью для новых антибиотиков. Наконец, понимание и возможность влияния на механизм преобразования энергии АТФ-синтазой представляет важность для биоинженерных задач — получения высокоэффективных микробных штаммов-продуцентов, а также растений, способных более продуктивно использовать энергию света.

В настоящее время имеется большой массив экспериментальных данных о структуре и каталитическом механизме синтеза/гидролиза АТФ у FoFi из разных организмов. Применение методов криоэлектронной микроскопии позволило в последнее десятилетие получить ряд структурных моделей ферментов митохондрий, бактерий и хлоропластов и на атомарном уровне изучить строение каталитических и регуляторных сайтов. Большой массив данных имеется в литературе и по исследованию механизма протонного транспорта и его сопряжения с синтезом/гидролизом АТФ, однако по этому направлению есть целый ряд незакрытых вопросов. Механизмы регуляции активности FoFi также активно изучаются; в настоящий момент открыто и охарактеризовано in vitro несколько таких механизмов для ферментов из разных организмов. При этом физиологическое значение этих механизмов in vivo в значительной степени остается неясным.

Объект и предмет исследования

Объектом и предметом исследования являлась протон-зависимая АТФ-синтаза бактерий, как в выделенном чистом виде, так и в составе нативных и искусственных мембранных частиц, а также ее отдельные субъединицы и их субкомплексы

Целью настоящей работы являлось исследование характеристик Н+-транспорта и его сопряжения с синтезом и гидролизом АТФ у бактериального FoFi, а также механизмов регуляции его АТФазной активности и их возможной роли in vivo. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику количественного измерения Н+-транспорта бактериального FoFi и прояснить влияние гидрофильного каталитического субкомплекса Fi на транспорт протонов через Fo.

2. Исследовать влияние мутации yMet23Lys на сопряжение Н+-транспорта и синтеза/гидролиза АТФ у FoFi Rhodobacter capsulatus и на регуляторные механизмы, подавляющие АТФазную активность фермента.

3. Прояснить механизм активации бактериального FoFi в ответ на энергизацию мембраны и роль в этом механизме неорганического фосфата (Фн); предложить схему, объясняющую наблюдаемые эффекты АДФ, Д«н+ и Фн на АТФазную активность FoFi.

4. Найти отдельные аминокислотные остатки, влияющие на выраженность одного из основных механизмов регуляции АТФазной активности бактериального FoFi — неконкурентного ингибирования комплексом MgАДФ (АДФ-ингибирования), и исследовать влияние мутаций в этих остатках на активность фермента.

5. Исследовать характеристики ингибирования АТФазной активности FoF1 Bacillus sp. PS3 субъединицей 8 и его влияния на АДФ-ингибирование; установить факторы, вызывающие конформационный переход С-концевого домена субъединицы 8, приводящий к ингибированию.

6. Проанализировать возможную физиологическую роль АДФ-ингибирования и ингибирования субъединицей 8 бактериальной АТФ-синтазы в контроле величины A^h+ на сопрягающей мембране.

В ходе решения вышеописанных задач в данной работе применялись классические методы генной инженерии (ПЦР, клонирование, точечный мутагенез, секвенирование ДНК), биохимии (выделение и очистка рекомбинантных белков, встраивание их в липосомы, измерение ферментативной активности с помощью спектрофотометрических, флуориметрических и люминометрических методов), биофизики (измерение электрического мембранного потенциала, импульсная спектрофотометрия, анализ поведения единичных молекул и манипуляции ими), и биоинформатики (анализ трехмерных структур ферментов, построение и анализ множественных выравниваний аминокислотных последовательностей, компьютерное моделирование ионного транспорта через липидную мембрану).

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе работы установлено, что суббактериальные частицы (хроматофоры), получаемые из клеток Rb. capsulatus, содержат в среднем одну молекулу АТФ-синтазы на мембранную частицу. Это позволяет использовать хроматофоры для исследования характеристик Н+-транспорта через фермент на ансамбле синхронизированных единичных молекул. В этой системе впервые охарактеризованы количественно параметры Н+-транспорта через FO-субкомплекс бактериальной АТФ-синтазы в отсутствие субкомплекса F1. Также на бактериальной АТФ-синтазе обнаружено и охарактеризовано явление индукции "слипа" — не сопряженной с синтезом АТФ протонной проводимости, свойства которой отличаются от таковой через FO-субкомплекс, лишенный субкомплекса F1. Впервые обнаружены точечные мутации в бактериальном FoF1, усиливающие или ослабляющие АДФ-ингибирование — наиболее распространенный механизм регуляции АТФазной активности фермента. Охарактеризована роль регуляторного С-концевого домена субъединицы 8 в модуляции АДФ-ингибирования, прояснены факторы, вызывающие конформационный переход этого домена. Предложена новая физиологическая роль для регуляторных механизмов,

подавляющих АТФазную активность FоFl, которая объясняет их присутствие не только в бактериальных АТФ-синтазах, но также в ферментах митохондрий и хлоропластов. С практической стороны прояснение механизмов работы и регуляции FоFl является необходимым шагом на пути к разработке новых подходов в терапии. Ряд заболеваний человека связан с дефектами в генах субъединиц FоFl; возможность влиять на активность фермента в ситуации де-энергизации клетки (например, в состоянии ишемии) может позволить предотвратить гибель клеток при инфарктах и инсультах. Исследование свойств бактериальных FоFl необходимо для выявления различий в структуре и особенностях регуляции прокариотического и митохондриального ферментов, на основании которых возможна разработка новых антибиотиков, мишенью которых является бактериальная АТФ-синтаза. Этот подход уже увенчался успехом в случае фермента туберкулезной палочки — новый антибиотик бедаквилин, селективно ингибирующий ее АТФ-синтазу, применяется в клинике для лечения туберкулеза. Кроме того, понимание механизма преобразования энергии АТФ -синтазой и возможность влияния на него представляет важность для биоинженерных задач — получения высокоэффективных микробных штаммов-продуцентов, а также растений, способных более продуктивно использовать энергию света.

Положения, выносимые на защиту:

- В суббактериальных частицах (хроматофорах) КИоёоЪа^вг capsulatus инактивация субкомплекса Fl полностью подавляет утечку Н+ через Fo, т.е. наблюдается 100% эффективность сопряжения между синтезом АТФ и Н+-транспортом.

- Н+-проводимость через субкомплекс Fо КЪ. capsulatus в отсутствие Fl подчиняется закону Ома; Н+-селективность Fo по сравнению с Li+, №+ и К+ составляет не менее 107; скорость Н+-транспорта при протондвижущей силе в 200 мВ составляет 13000 Н+/с. При синтезе АТФ ферментом скорость Н+-транспорта меньше почти на порядок и ограничивается каталитическими событиями в субкомплексе Fl.

- При энергизации мембраны хроматофоров КЪ. capsulatus в отсутствие нуклеотидов появляется высокая Н+-проводимость через Fo ("слип"), которая не связана с диссоциацией Fl и характеристики которой отличаются от таковых Н+-транспорта через изолированный Fo.

- Мутация yMet23Lys не нарушает сопряжение Н+-транспорта и синтеза/гидролиза АТФ у FоFl КЪ. capsulatus, но приводит к значительному ускорению инактивации фермента, вызванной неконкурентным ингибированием АДФ (АДФ-ингибированием).

- A^h+ противодействует АДФ-ингибированию FoF1 Bacilllus sp. PS3 двояко. Во-первых, высокая A^h+ вызывает высвобождение АДФ и активацию фермента из состояния АДФ-ингибирования. Во-вторых, A^h+ умеренной величины (ниже, чем необходимо для синтеза АТФ) в присутствии Фн препятствует переходу FoF1 в АДФ-ингибированное состояние.

- Мутация ßQ259L резко ослабляет АДФ-ингибирование F0F1 Bacillus sp. PS3.

- С-концевой домен субъединицы 8 обуславливает низкую начальную АТФазную активность FoF1 Bacillus sp. PS3. АДФ-ингибирование усиливается в результате взаимодействия этого домена с субъединицей ß.

- АДФ-ингибирование, ингибирующее действие субъединицы 8, а также другие механизмы подавления АТФазной активности FoF1 могут выполнять роль регулятора A^h+, препятствуя колебаниям ее величины в ответ на изменение активности первичных генераторов A^h+ (ферментов фотосинтетической и дыхательной цепи).

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов, описанных в данной работе, обеспечивается комплексным использованием различных современных методов исследований и анализа; многократными повторами (в том числе биологическими) экспериментов, статистической обработкой полученных данных, сравнением полученных результатов с литературными данными.

Описанные в настоящей работе результаты были доложены на ряде международных и российских конференций, а также опубликованы в рецензируемых международных научных журналах.

Диссертация была апробирована на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова 11 октября 2021 г.

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе работы установлено, что суббактериальные частицы (хроматофоры), получаемые из клеток Rhodobacter capsulatus, содержат в среднем одну молекулу АТФ-синтазы на мембранную частицу. Это позволяет использовать хроматофоры для исследования характеристик Н+-транспорта через фермент на ансамбле синхронизированных единичных молекул. В этой системе впервые охарактеризованы количественно параметры Н+-транспорта через FO-субкомплекс бактериальной АТФ-синтазы в

отсутствие субкомплекса Fl. Также на бактериальной АТФ-синтазе обнаружено и охарактеризовано явление индукции "слипа" — не сопряженной с синтезом АТФ протонной проводимости, свойства которой отличаются от таковой через Fо-субкомплекс, лишенный субкомплекса Fl. Впервые обнаружены точечные мутации в бактериальном FоFl, усиливающие или ослабляющие АДФ-ингибирование — наиболее распространенный механизм регуляции АТФазной активности фермента. Охарактеризована роль регуляторного С-концевого домена субъединицы 8 в модуляции АДФ-ингибирования, прояснены факторы, вызывающие конформационный переход этого домена. Предложена новая физиологическая роль для регуляторных механизмов, подавляющих АТФазную активность FоFl, которая объясняет их присутствие не только в бактериальных АТФ-синтазах, но также в ферментах митохондрий и хлоропластов. С практической стороны прояснение механизмов работы и регуляции FоFl является необходимым шагом на пути к разработке новых подходов в терапии. Ряд заболеваний человека связан с дефектами в генах субъединиц FоFl; возможность влиять на активность фермента в ситуации де-энергизации клетки (например, в состоянии ишемии) может позволить предотвратить гибель клеток при инфарктах и инсультах. Исследование свойств бактериальных FоFl необходимо для выявления различий в структуре и особенностях регуляции прокариотического и митохондриального ферментов, на основании которых возможна разработка новых антибиотиков, мишенью которых является бактериальная АТФ-синтаза. Этот подход уже увенчался успехом в случае фермента туберкулезной палочки — новый антибиотик бедаквилин, селективно ингибирующий ее АТФ-синтазу, успешно применяется в клинике для лечения туберкулеза. Кроме того, понимание механизма преобразования энергии АТФ-синтазой и возможность влияния на него представляет важность для биоинженерных задач — получения высокоэффективных микробных штаммов -продуцентов, а также растений, способных более продуктивно использовать энергию света.

Личный вклад соискателя

Основные результаты диссертационной работы получены лично автором. Некоторые работы выполнены при участии студентов и аспирантов МГУ имени М.В.Ломоносова, а также сотрудников Токийского института технологий (Е.-И. Сайта, Т. Сузуки, А.С. Лапашиной, А.С. Приходько).

Публикации

Основные результаты диссертационной работы отражены в печати, в том числе, в 18 статьях в журналах, индексируемых в международных системах цитирования Web of Science или Scopus, а также двух главах в книгах. Материалы диссертации были также представлены в виде тезисов на конференциях, в том числе международных.

Список статей, результаты которых вошли в диссертацию:

1. Feniouk B.A. et al. Coupling of proton flow to ATP synthesis in Rhodobacter capsulatus: F0F1-ATP synthase is absent from about half of chromatophores // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1506, № 3. P. 189-203.

2.Feniouk B.A. et al. Chromatophore Vesicles of Rhodobacter capsulatus Contain on Average One F0F1-ATP Synthase Each // Biophys. J., 2002. Vol. 82, № 3. P. 1115-1122.

3. Cherepanov D.A. Feniouk B.A., Junge W., Mulkidjanian A.Y. Low dielectric permittivity of water at the membrane interface: effect on the energy coupling mechanism in biological membranes // Biophys. J., 2003. Vol. 85, № 2. P. 1307-1316.

4. Feniouk B.A. et al. The proton-driven rotor of ATP synthase: ohmic conductance (10 fS), and absence of voltage gating // Biophys. J., 2004. Vol. 86, № 6. P. 4094-4109.

5. Feniouk B.A., Junge W. Regulation of the F0F1-ATP synthase: The conformation of subunit s might be determined by directionality of subunit y rotation // FEB S Lett. 2005. Vol. 579, № 23. P. 5114-5118.

6. Feniouk B.A., Mulkidjanian A.Y., Junge W. Proton slip in the ATP synthase of Rhodobacter capsulatus: induction, proton conduction, and nucleotide dependence // Biochim. Biophys. Acta. Elsevier, 2005. Vol. 1706, № 1-2. P. 184-194.

7. Feniouk B.A., Suzuki T., Yoshida M. The role of subunit epsilon in the catalysis and regulation of F0F1-ATP synthase // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1757, № 5-6. P. 326-338.

8. Suzuki T., Ozaki Y., Sone N., Feniouk B.A., and Yoshida M. The product of unci gene in F1F0-ATP synthase operon plays a chaperone-like role to assist c-ring assembly // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007. Vol. 104, № 52. P. 20776-20781.

9. Feniouk B.A., Suzuki T., Yoshida M. Regulatory interplay between proton motive force, ADP, phosphate, and subunit epsilon in bacterial ATP synthase // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282, № 1. P. 764-772.

10. Feniouk B.A. et al. Met23Lys mutation in subunit gamma of F0F1-ATP synthase from Rhodobacter capsulatus impairs the activation of ATP hydrolysis by protonmotive force // Biochim. Biophys. Acta. 2007. Vol. 1767, № 11. P. 1319-1330.

11. Saita E.-I. Iino, R.; Suzuki, T.; Feniouk B.A.; Kinosita Jr, K.; Yoshida M. Activation and stiffness of the inhibited states of F1-ATPase probed by single-molecule manipulation // J. Biol. Chem., 2010. Vol. 285, № 15. P. 11411-11417.

12. Feniouk B.A. et al. Conformational transitions of subunit epsilon in ATP synthase from thermophilic Bacillus PS3 // Biophys. J., 2010. Vol. 98, № 3. P. 434-442.

13. Lapashina A.S., Feniouk B.A. ADP-Inhibition of H+-FoF1-ATP Synthase // Biochemistry (Mosc.). 2018. Vol. 83, № 10. P. 1141-1160.

14. Suzuki T., Wakabayashi C., Tanaka K., Feniouk B.A., Yoshida M. Modulation of nucleotide specificity of thermophilic F0F1-ATP Synthase by epsilon-subunit // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, № 19. P. 16807-16813.

15. Lapashina A.S. Prikhodko A.S., Shugaeva T.E., Feniouk B.A. Residue 249 in subunit beta regulates ADP inhibition and its phosphate modulation in Escherichia coli ATP

synthase // Biochim. Biophys. Acta Bioenerg. 2019. Vol. 1860, № 3. P. 181-188.

16. Lapashina A.S., Shugaeva T.E., Kholina T.D., Feniouk B.A. Amino Acid Residues ß139, ß189, and ß319 Modulate ADP-Inhibition in Escherichia coli H+-FoFi-ATP Synthase // Biochemistry (Mosc.). 2019. Vol. 84, № 4. P. 407-415.

17. Lapashina A.S., Feniouk B.A. Mutation Q259L in subunit beta in Bacillus subtilis ATP synthase attenuates ADP-inhibition and decreases fitness in mixed cultures // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2019. Vol. 509, № 1. P. 102-107.

18. Zubareva V.M. Lapashina A.S., Shugaeva T.E., Litvin A.V., Feniouk B.A. Rotary Ion-Translocating ATPases/ATP Synthases: Diversity, Similarities, and Differences // Biochemistry (Mosc.). 2020. Vol. 85, № 12. P. 1613-1630.

Главы в книгах:

1. Feniouk B.A., Yoshida M. Regulatory mechanisms of proton-translocating F0F1-ATP synthase // Results Probl. Cell Differ. 2008. Vol. 45. P. 279-308.

2. Feniouk B.A., Junge W. Proton Translocation and ATP Synthesis by the FoF1-ATPase of Purple Bacteria // The Purple Phototrophic Bacteria / ed. Hunter C.N. et al. Dordrecht: Springer Netherlands, 2009. P. 475-493.

2. Обзор литературы

Н+-FоFl-АТФ-синтаза (другие названия: Н+-АТФаза F-типа, FоFl-комплекс, комплекс V митохондрий) представляет собой мультисубъединичный мембранный фермент. У эукариотических организмов фермент обнаружен в митохондриальной внутренней мембране и в тилакоидной мембране хлоропластов; у бактерий FоFl-комплекс находится в цитоплазматической мембране. У подавляющего большинства архебактерий, а также у ряда бактерий, не обнаружено АТФ-синтаз F-типа. Их функцию выполняют ферменты А-типа [1-3], имеющие некоторое сходство с F-АТФ-синтазами [4], но гораздо более похожие на вакуолярные эукариотические Н+-транслоцирующие мембранные АТФазы (У-АТФазы). Предположительно, ферменты F-типа возникли в ходе эволюции бактерий, в то время как ферменты V- и А-типа являются продуктами эволюции архебактерий [5,6]. Эта гипотеза хорошо согласуется с эндосимбиотической теорией происхождения эукариот [7,8]: в хлоропластах и митохондриях, происходящих от цианобактерий и альфа-протеобактерий, присутствует фермент F-типа, в то время как в вакуолях, унаследованных от сходного с архебактериями предка эукариотической клетки [9], обнаруживается фермент А/У-типа.

FоFl-комплекс катализирует синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата (Фн) за счет энергии трансмембранной разности электрохимических потенциалов протона (Д«н+). При этом протоны из водной фазы с положительно заряженной стороны мембраны (Н+п) переносятся в водную фазу с отрицательно заряженной стороны (Н+о).

АДФ + Фн + ПН+п ^ АТФ + Шо + ПН+о

Однако в ряде эубактерий основной функцией АТФ-синтазы является обратная реакция — выкачивание Н+ из клетки за счет энергии гидролиза АТФ. Таким образом бактерии контролируют рН цитоплазмы [10-14], а также создают А^н+, необходимый для вращения жгутика [15], транспорта ионов и низкомолекулярных соединений через мембрану и т.п. [16].

Оперон АТФ-синтазы является "удобным" материалом для горизонтального переноса генов [17], т.к. фермент "автономен" и для его работы не требуется специфических взаимодействий с другими белками — достаточно лишь наличия А^н+ и субстратов. В этой связи неудивительно, что многие бактерии обладают одновременно ферментами и Т-, и А/У-типа, а некоторые, получив архебактериальную АТФ-синтазу, потеряли в ходе

эволюции F-АТФ-синтазу (например, представители типа Deinococcus-Thermus [18]). По неясным пока причинам, горизонтальный перенос оперона АТФ-синтазы в обратную сторону встречается гораздо реже, и примеров архебактерий, у которых, помимо Л/У-АТФ-синтазы, есть фермент F-типа, известно немного. При этом, делеция F-оперона в этих архебактериях не оказывала заметного влияния на жизнеспособность, что указывает на отсутствие жизненно важной функции в них у фермента F-типа [19]. Архебактерий, у которых присутствует только F-АТФ-синтаза, пока не обнаружено вовсе.

Как было отмечено выше, помимо протон-транслоцирующей F-АТФ-синтазы, существуют также ферменты, сопрягающие синтез/гидролиз АТФ и трансмебранный транспорт ионов натрия [20]. Они были обнаружены у некоторых эубактерий [21-24] и позволяют синтезировать АТФ, используя вместо А^н+ энергию трансмембранной разности электрохимического потенциала ионов натрия (Дода+), или могут выполнять роль АТФ-зависимых №+-насосов, контролирующих концентрацию натрия в цитоплазме. Согласно классфикации ЕС, они относятся к группе 7.2.2.2 (натриевая транслоказа), в то время как Н+-транслоцирующие ферменты относятся к группе 7.1.2.2 (протонная транслоказа).

2.1. Физиологическая роль FoFl -АТФ-синтазы.

БоЕ1-комплекс способен катализировать как синтез АТФ за счет энергии А^н+, так и обратную реакцию — генерацию А^н+ за счет гидролиза АТФ. В эукариотических организмах основную роль играет синтетазная активность фермента. Так, в организме человека за день митохондриальным FоFl синтезируется порядка 50 килограммов АТФ (и столько же затем гидролизуется клетками в ходе реакций, требующих энергии) [25]. У растений в условиях высокой потребности в АТФ для фиксации СО2 основную часть цитоплазматического АТФ также поставляет митохондриальный FоFl. Напротив, в условиях стресса, когда фиксация СО2 подавлена, синтезированный хлоропластным БоР1 АТФ накапливается в строме и экспортируется в цитозоль. Таким образом, в зависимости от условий, основную часть цитоплазматического АТФ у растений может поставлять как митохондриальная, так и хлоропластная АТФ-синтаза [26]. Аналогичным образом, функция синтеза АТФ является превалирующей для FоFl из аэробных и фотосинтетических бактерий. В ряде прокариот, не способных осуществлять кислородное дыхание и фотосинтез, FоFl также играет роль основного поставщика АТФ,

а необходимая для синтеза A/wh+ генерируется за счет сопряжения окислительно-восстановительных реакций с трансмембранным протонным транспортом (редокс-петля).

Важным преимуществом синтеза АТФ за счет энергии A^h+ является возможность сопряжения этого синтеза с реакциями, энергетический выход которых значительно ниже, чем энергия фосфодиэфирной связи АТФ [20]. В случае субстратного фосфорилирования, использование таких "низкоэнергетических" реакций невозможно по термодинамическим соображениям, т.к. в этом случае энергетический выход реакции, за счет которой синтезируется АТФ, должен превышать энергию фосфодиэфирной связи. Таким образом, наличие АТФ-синтазы позволяет бактериям использовать широкий спектр реакций (например, путь Вуда-Льюнгдаля [27]) для получения энергии и существовать в экологических нишах, где организмы, опирающиеся исключительно на субстратное фосфорилирование, не могут выжить в принципе [28]. Однако существуют бактерии, у которых полностью отсутствуют системы АТФ-независимой генерации A^h+, и в таких организмах основной функцией FoFi является создание A^h+ за счет энергии гидролиза АТФ. Следует отметить, что A^h+ необходима для таких важных функций, как вращение жгутика и подвижность бактерий, транспорт ионов и низкомолекулярных веществ через клеточную мембрану и др. Кроме того, АТФазная активность FOF1 необходима ряду бактерий для контроля внутриклеточного pH [29]. Выживание многих ацидофильных и ацидотолерантных бактерий, в том числе патогенных, при низких значениях pH полностью зависит от функциональности FoFi, который выкачивает из клетки ионы H+ и предотвращает тем самым закисление цитоплазмы [13,14,30-32]. Экспрессия фермента в таких бактериях стимулируется в ответ на закисление внешней среды [33,34].

В митохондриях АТФазная активность FoFi также играет важную физиологическую роль, в первую очередь — в условиях аноксии. Следует отметить, что в митохондриях млекопитающих FoFi составляет до 20% от общего количества мембранного белка [35,36]. При этом максимальная скорость гидролиза АТФ митохондриальным составляет сотни АТФ за секунду и выше. В этой связи неудивительно, что в клетках млекопитающих FoFi играет большую роль в снижении концентрации АТФ в условиях ишемии [37-39]. В качестве более экзотического случая можно отметить также, что у трипаносом Trypanosoma brucei и Trypanosoma evansi в той стадии цикла, когда паразиты живут в кровотоке животного-хозяина и окислительного фосфорилирования в

их митохондриях не происходит, АТФ-синтаза играет жизненно важную роль, поддерживая А^н+ на внутренней митохондриальной мембране [40]. Примечательно, что, помимо синтеза/гидролиза АТФ, митохондриальный FоFl отвечает еще за несколько важных функций. Отличительной чертой этого фермента, не свойственной его бактериальным аналогам, является способность к димеризации, обнаруженная у FоFl из митохондрий дрожжей [41,42], водорослей [43,44], высших растений [45] и, наконец, позвоночных [46]. Димеры FоFl образуют протяженные ряды [47] и обеспечивают формирование крист, располагаясь вдоль складок внутренней митохондриальной мембраны [48,49]. Подавление экспрессии субъединиц фермента, необходимых для димеризации, приводило в культуре клеток человека к патологическим изменениям в морфологии митохондрий и снижению как синтеза АТФ, так и активности ферментов дыхательной цепи [50].

Еще одна важная, хотя и спорная, функция митохондриального FоFl — это участие в образовании так называемой "митохондриальной поры" (тРТР). Хорошо известно, что в ответ на ряд стрессовых факторов, например увеличение концентрации Са2+ или высокий уровень активных форм кислорода, во внутренней митохондриальной мембране собирается белковый комплекс, образующий пору, пропускающую молекулы массой до 1,5 кДа. Это вызывает коллапс А^н+, набухание митохондрий, выход в цитоплазму митохондриальных белков и запуск каскада программируемой клеточной гибели [51]. Ряд экспериментальных исследований указывает, что FоFl играет важную роль в формировании тРТР [52,53]. Однако прямые эксперименты, в которых исследовалось влияние делеции генов субъединиц FоFl, предположительно вовлеченных в процесс формирование тРТР, противоречат этой гипотезе [54,55]. Таким образом, неясно, является ли FоFl необходимым компонентом для образования тРТР. В заключение следует упомянуть функции №+-транслоцирующих ферментов. Они обнаружены лишь у прокариот, причем нередко в одном организме Ка+-транслоцирующий FоFl обнаруживается вместе с протонной АТФ-синтазой F- или Л-типа [3]. В последнем случае наиболее вероятной функцией фермента является АТФ-зависимая откачка натрия из клетки. Однако в ряде прокариот №+-транслоцирующий FоFl является единственным ферментом такого рода, и осуществляет синтез АТФ за счет энергии А,ода+.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Фенюк Борис Александрович, 2022 год

- - de d

E ATR

area daah dvdy dkdy d i df dtd i drei dkd i RQK I rqaq TkIe l krqk e rsv e rva

120

ae iq i r i eа aeaaiqvev ps vadaaak aqas ae l ak lrhkraler krae lalkr rrae lalqr as tqk a l qd avtqks lqe iqaeqawkr iqatkafkr veaklalrr ieanlalrr rgtmak l e s rsalsrlea

130

nealv|ale----

l e n lqs v l к----

ml aomea lg s h i n a iaqlrv i e ltkk aevrlqvans ks -amn r ls v а e mk - -

alnrldvagk---

altkvr i aeqyr -altkvriaeqymh ar ar yqaaggfvq ararfqaagglv-ar irveavnwipp artrveasntis5 s f i r - r yme l к he g mv r-rfadlqrp

146

138 132 am 139 135 132 132 134

137

138 164 137 134 134

mp 136

С-концевая ц-спираль №1

С-крнцевзя о спираль №2

Рисунок 26. Множественное выравнивание частей последовательностей субъединиц s из разных организмов. Нумерация сверху соответствует последовательности из фермента E. coli. Разные типы аминокислотных остатков окрашены в разные цвета; интенсивность цвета отражает степень консервативности остатка. Последние 2 последовательности, обведенные в рамку, относятся к N-АТФазам. Снизу помечены области N-концевого структурного домена и двух С-концевых а-спиралей. Звездочками помечены остатки, которые в субъединице s фермента Bacillus sp. PS3 участвуют в связывании АТФ.

АТФазная активность ферментов а-протеобактерий (ЯЬ. capsulatus, Р. ёвиНпАсат) и митохондрий, видимо, практически не подвержена ингибированию субъединицей 8 [327]. Более того, у ряда бактерий С-концевой домен субъединицы 8 вообще отсутствует или сильно укорочен. Наконец, далеко не у всех бактерий, у

которых присутствует двуспиральный С-концевой домен субъединицы 8, в этом домене обнаруживаются остатки, необходимые для связывания этим доменом АТФ. Резюмируя этот раздел, можно предположить, что у бактериальных АТФ-синтаз С-концевой домен субъединицы 8, судя по всему, представляет собой весьма вариабельный и быстро эволюционирующий фрагмент, который служит для достаточно тонкой настройки регуляции АТФазной активности фермента в ответ на изменения величины фосфорильного потенциала в цитоплазме и связанного с этим потенциалом уровня Д«н+.

2.5.5. Редокс-регуляция активности хлоропластной АТФ-синтазы

Субъединица у АТФ-синтазы хлоропластов высших растений содержит небольшую дополнительную петлю, несущую пару остатков цистеина, способных при окислении образовывать дисульфидный мостик. Образование мостика вызывает изменение конформации субъединицы у, что приводит к резкому падению скорости гидролиза АТФ [354-356]. Благодаря этой особенности, в темноте, когда поток электронов через фотосистемы останавливается, и пул ферредоксина и тиоредоксина окисляется, тиоредоксин окисляет цистеины субъединицы у, и хлоропластная АТФ-синтаза в течение нескольких десятков минут переходит в инактивированное состояние [357,358]. Если после этого возобновить освещение, фермент активируется в течение 20 миллисекунд и начинает синтезировать АТФ [359], однако как скорость синтеза, так и скорость гидролиза АТФ после выключения освещения еще некоторое время остаются заметно ниже максимальных значений [355]. Но уже через несколько секунд непрерывного освещения происходит восстановление ферредоксина, который, в свою очередь, восстанавливает тиоредоксин и в результате происходит восстановление БН-групп субъединицы у тиоредоксином и полная активация фермента [360-362]; см. рис. 27 ниже. Следует отметить, что такая активация происходит даже при относительно низком уровне интенсивности освещения (менее 1 Вт/м2, что на 3 порядка меньше, чем освещенность в солнечный день) [357]. При этом другие ферменты биоэнергетики хлоропластов, также регулируемые тиоредоксинами (например, фруктозо-1,6-бисфосфатаза или НАДФ-малатдегидрогеназа) требуют для полного восстановления заметно более высокой мощности освещения [355].

Рисунок 27. Схема редокс-регуляции активности хлоропластной АТФ-синтазы. Ночью SS-мостик окислен, тилакоидная мембрана де-энергизована, и фермент неактивен (1). После восхода солнца фотосинтетическая цепь энергизует мембрану, и фермент начинает синтез АТФ, но с низкой скоростью (2). Затем происходит восстановление SS-мостика, и скорость синтеза АТФ возрастает (3). На закате мембрана де-энергизуется, и фермент начинает гидролизовать АТФ (4), а затем происходит окисление SS-мостика, и фермент инактивируется. Адаптировано из [363].

In vitro восстановления SH-групп субъединицы у можно легко достичь добавлением дитиотреитола или других восстанавливающих тиоловых реагентов. Предполагаемое физиологическое значение этого регуляторного механизма заключается в том, что в темноте АТФ-синтаза не расходует впустую АТФ в хлоропластах. Однако следует отметить, что в случае Arabidopsis thaliana мутация, нарушающая данный регуляторный механизм и препятствующая инактивации хлоропластной АТФ-синтазы в результате образования SS-мостика в субъединице у, не вызвала заметных негативных эффектов, в том числе и при длительной инкубации

трансгенных растений в темноте [364]. Более того, парадоксальным образом у мутантного растения с "неотключаемым" гидролизом АТФ снизилась скорость распада белков фотосинтетического аппарата во время длительной инкубации в темноте. Таким образом, простое объяснение инактивации АТФ-синтазы как способа сберечь АТФ в темноте не подтвердилось экспериментально, и вопрос о физиологической роли редокс-регуляции АТФазной активности хлоропластного фермента по-прежнему остается открытым.

2.5.6. Митохондриальный белок IF1

Исторически ингибирование АТФазной активности митохондриальной АТФ-синтазы при связывании белка IF1 (Inhibitory Factor 1) [365] было первым открытым механизмом регуляции скорости гидролиза АТФ ферментом. В экспериментах на митохондриях из сердца быка было обнаружено, что этот небольшой (14 кДа), богатый лизинами и аргининами белок способен связываться с субкомплексом F1 в соотношении 1:1 [366368] и подавлять его АТФазную активность. Дальнейшие исследования выявили, что в митохондриях млекопитающих ингибирующее действие IF1 зависит от кислотности среды. В нормальных условиях, когда pH митохондриального матрикса составляет около 8, IF1 образует тетрамер и не подавляет АТФазную активность фермента. Однако при повышении кислотности среды до рН ниже 6,5, как происходит, например, в условиях аноксии [369,370], тетрамер IF1 диссоциирует на димеры [371], которые ингибируют гидролиз АТФ ферментом [372].

Структурно IF 1 представляет собой вытянутый альфа-спиральный белок; в димеризации участвуют С-концевые участки спирали, а N-концевые способны связываться с субкомплексом F1, проникая внутрь аэРэ-гексамера и блокируя вращение субъединицы Y внутри него (Рис. 28).

Рисунок 28. Ингибирование митохондриального субкомплекса F1 белком IF1. А — общий вид а3в3-гексамера со стороны мембраны; Б — показана только одна субъединица в и субъединица у; В — сайт связывания IF1 между субъединицами а и р.

Повышение a/wh+ при возобновлении дыхания приводит к диссоциации IF1, и, после небольшой лаг-фазы, фермент активируется и начинает синтез АТФ [373,374]. Следует отметить, что в клетках карциномы человека, метаболизм которых, как и в случае многих других видов рака, сдвинут в сторону активации гликолиза, наблюдалась повышенная экспрессия IF1 [375].

2.5.7. Прочие регуляторные механизмы

Среди бактериальных АТФ-синтаз обнаруживаются достаточно разнообразные специфические механизмы регуляции АТФазной активности фермента. Так, у F0F1 Micrococcus luteus АТФазная активность ингибируется субъединицей 5, первичная структура которой заметно отличается от таковой у большинства других бактерий и имеет фрагмент, гомологичный началу С-концевого ингибиторного домена субъединицы s E. coli [376,377].

У а-протеобактерии P. denitrificans обнаружен небольшой (11 кДа) белок Z, ингибирующий АТФазную активность фермента [378]. При этом, как и в митохондриальном F0F1, в ферменте из P. denitrificans субъединица s не способна ингибировать гидролиз АТФ [379]. Механизм ингибирования F0F1 белком Z, вероятно, сходен с таковым митохондриального IF1 и бактериальной субъединицы s, несмотря на отсутствие заметного сходства в первичной структуре этих белков. Компьютерное моделирование и косвенные экспериментальные данные позволяют предположить, что

а-спиральный N-концевой домен белка Z входит в зазор между субъединицами a/ß и субъединицей у, тем самым блокируя вращение последней и ингибируя гидролиз АТФ [380]. Гомологичные Z белки были обнаружены в геномах других а-протеобактерий [379]. В свете эндосимбиотической теории происхождения митохондрий от a-протеобактерий было высказано предположение, что Z-подобный белок мог быть эволюционным предшественником митохондриального IF1; способность IF1 ингибировать АТФазную активность FoFi P. denitrificans также является косвенным аргументом в пользу данной гипотезы [380].

Еще один вариант подавления АТФазной активности FoFi был обнаружен у микобактерий. На ферменте из Mycobacterium smegmatis показано, что ингибирование гидролиза АТФ частично обусловлено субъединицей у, в структуре которой присутствует дополнительная петля [381]. Делеция данной петли привела к увеличению АТФазной активности на 34%. Кроме того, недавно было обнаружено, что субъединица а фермента микобактерий также содержит дополнительный фрагмент, делеция которого увеличивает скорость гидролиза АТФ [382].

3. Материалы и методы

3.1. Культивирование микроорганизмов 3.1.1. Культивирование Rhodobacter capsulatus

В экспериментах использовался штамм В10 (дикий тип) Rb. capsulatus, любезно предоставленный доктором А. Мулкиджаняном (Университет г. Оснабрюка, Германия). Клетки выращивались по методике Ласцеллеса [383] в микроаэробных условиях фотогетеротрофно в среде RCV, содержавшей 0,4% малата,10 мМ КН2РО4, 0,1% [NH4]2SO4, 0,2 г/л MgSO4-7H2O, 0,075 г/л СаСЬ2ШО, 0,02 г/л ЭДТА, 0,012 г/л FeSO4-7H2O (0,0059 г/л FeSO4 безводн.), 1,59 мг/л MnSO4, 2,8 мг/л Н3ВО3, 0,04 мг/л Cu(NO3)2'8H2O, 0,75 мг/л NaMoO4'2H2O, 0,1 мг/л биотина,1 мг/л тиамина и 1 мг/л никотиновой кислоты. Значение рН среды составляло 6,8. Витамины стерилизовались с помощью бактериального фильтра с диаметром пор 0,22 мкМ, остальные компоненты среды автоклавировались при 0,5 атм., 110°С в течение 30 минут. Клетки выращивали в плоских стеклянных бутылках (объем 0,5 л), налитых "под горло", при 30°С. Для освещения использовались люминесцентные лампы дневного света без светофильтров.

Интенсивность света на поверхности бутылок составляла 18 Вт/м2. Клетки выращивались до логарифмической фазы роста, после чего осаждались центрифугированием (7000g, 35 мин, 4°С). Осажденные клетки ресуспендировали в 500-700 мл буфера, содержащего 10% сахарозы, 2 мМ MgCh, 50 мМ КС1, 30 мМ HEPES, рН 7,4, и вновь осаждали центрифугированием (7000g, 35 мин., 4°С), после чего либо немедленно использовали для получения суббактериальных частиц, либо замораживали и хранили при -80°С.

3.1.2. Культивирование и сбор клеток Escherichia coli

Для экспрессии АТФ-синтазы в клетках E. coli использовался штамм DK8 (bglR, thi1, relA1, HfrPO1, AuncBEFHAGDC, ilv::Tn10) [384] с делецией по оперону АТФ-синтазы. Клетки трансформировались плазмидой, несущей кассету устойчивости к ампициллину и оперон АТФ-синтазы Bacillus sp. PS3 (плазмида pTR19-ASDS [385]) или оперон фермента E. coli (плазмида pFV2 [386]). Культивация проводилась в течение 20 часов при 37°C в аэробных условиях в среде 2*YT, содержащей 1,6% триптона, 1% дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl в присутствии ампициллина (100 мг/л); рН среды был 7,0 ± 0,2. Клетки осаждали центрифугированием (8500g, 15 мин, 4°С), суспендировали в 280 мл буфера, содержащего 10 мМ HEPES-KOH, 5 мМ MgCl2 и 10% глицерина, pH 7,5, и вновь осаждали при тех же условиях. Полученный осадок либо немедленно использовали для получения суббактериальных частиц, либо замораживали и хранили при -80°С.

3.2 Получение СБЧ и очищенных ферментов

3.2.1. Получение суббактериальных частиц с помощью Френч-пресса

Клетки бактерий (Rb. capsulatus или E. coli) ресуспендировали в 25-30 мл буфера, содержащего 10 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 5 мМ MgCh, 10% глицерина, добавляли несколько крупинок ДНКазы I, и разрушали с помощью двух последовательных пассажей на Френч-прессе, устанавливая давление на уровне 68 атм. (1000 PSI). Разрушение клеток и все последующие манипуляции выполнялись при 4°С или на льду. В случае получения СБЧ из клеток Rb. capsulatus процедуры проводились в темноте. Неразрушенные клетки и крупные обломки осаждали центрифугированием при 13700 g, 30 мин, 4°C, и отбрасывали. Супернатант, содержащий СБЧ, центрифугировали при 250000-390000 g в течение 1 ч при 4°C. Затем осадок СБЧ повторно суспендировали в

25 мл буфера, содержащего 10 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 5 мМ MgCl2, 10% глицерина, и снова центрифугировали при тех же условиях. Отмытые таким образом СБЧ ресуспендировали в 1-1,5 мл того же буфера. Полученный препарат разделяли на аликвоты по 30 -60 мкл, замораживали с помощью жидкого азота и хранили при -80°C. Концентрация белка в суспензии СБЧ составляла 10-80 мг/мл.

3.2.2. Получение хроматофоров Rb. capsulatus с помощью обработки ультразвуком

Клетки Rb. capsulatus разрушали обработкой ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора W-250 Branson (Branson, Soest, Нидерланды); относительная выходная мощность была установлена на уровне 35%. Образец подвергался ультразвуковой обработке в течение 20 с пятикратно с интервалами в 1 мин. Процедура проводилась на льду. Крупный клеточный дебрис удаляли центрифугированием (20000 g, 20 мин, 4°C). Супернатант собирали и вновь центрифугировали (180000 g, 90 мин, 4°C). Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мМ глицилглицин-КОН (pH 7,4), 5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 10% сахарозы, до концентрации бактериохлорофилла 0,3-1,0 мМ. Полученные таким образом хроматофоры замораживали в аликвотах по 100 мкл в жидком азоте и хранили при -80°C. Все вышеописанные процедуры проводились в темноте.

3.2.3. Получение хроматофоров Rb. capsulatus, лишенных субкомплекса Fi

Процедура удаления субкомплекса F1 в хроматофорах Rb. capsulatus осуществлялась путем обработки ультразвуком в отсутствие магния [387,388]. Суспензию хроматофоров, полученных из клеток с помощью Френч-пресса или ультразвуковой обработки, размораживали, разбавляли в 25 раз раствором 1 мМ ЭДТА и титровали КОН до pH 8 при дневном свете. Затем суспензию подвергали серии обработок ультразвуком (W-250 Branson, относительный выход мощности 35%), пять раз по 20 с каждый, с минутной паузой на льду, и центрифугировали при 180000 g, 90 мин, 4°C. Осадок ресуспендировали в среде, содержащей 20 мМ глицилглицин-КОН (pH 7,4), 5 мМ MgCh, 50 мМ KCl, до конечной концентрации бактериохлорофилла 0,3-1,0 мМ. Для регистрации изменений pH в результате протонного транспорта через Fq осадок хроматофоров ресуспендировался в такой же среде, но без глицилглицина. Полученную суспензию хроматофоров, лишенных субкомплекса F1, замораживали в аликвотах по 100 мкл в жидком азоте и хранили при -80°C.

3.2.4. Получение СБЧ термофильной Bacillus sp. PS3, лишенных субкомплекса Fi

Клетки Bacillus sp. PS3 (G. thermoleovorans), выращенные по методике, разработанной Йошидой и соавторами [160], были любезно предоставлены доктором Н. Соне (Токийский Институт Технологии, Япония). Клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора Astrason XL (Misonix, Фармингдейл, Нью-Йорк). Ультразвуковая обработка велась наибольшим наконечником; выходная мощность была установлена на 7. Обработку ультразвуком проводили на льду, 4 раза по 1 мин с интервалом 3 мин. Буфер содержал 2 мМ EDTA и 2 мМ сукцината натрия (pH 8,0); 10-12 г клеток (сырой вес) суспендировались в 50 мл буфера. После обработки ультразвуком суспензию центрифугировали (190000 g, 60 мин, 4°C), осадок ресуспендировали в 2 мМ EDTA (pH 8,0) и процедуру повторяли дважды. Затем мембраны ресуспендировали в буфере, содержащем 10 мМ HEPES-KOH, 5 мМ MgCh, 10% глицерин (pH 7,5). Эффективность удаления субкомплекса F1 подтверждали измерением АТФ-зависимого протонного транспорта с помощью флуоресцентного зонда ACMA при 45°C (см. методику ниже). Остаточная АТФазная активность приготовленных таким образом СБЧ составляла 10-25% от таковой СБЧ без обработки ЭДТА и ультразвуком.

Чтобы избавиться от этой остаточной АТФазной активности, вызванной неполным удалением F1 дикого типа, СБЧ дополнительно обрабатывали 400 мкМ NBD-Cl, который ковалентно связывается с ферментом и ингибирует его, по методике Ахмада и Сениора [389]. После обработки избыток NBD-Cl удаляли гель-фильтрацией через колонку NAP-10. Остаточная АТФазная активность после такой процедуры не превышала 1,5% от начальной активности СБЧ без обработки ЭДТА и ультразвуком.

3.2.5. Измерение размеров суббактериальных частиц (хроматофоров) Rb. capsulatus с помощью электронной микроскопии.

Хроматофоры суспендировали в среде, содержавшей 100 мМ KCl, 20 мМ глицилглицина, 5 мМ MgCl2, pH 8,0. Конечная концентрация бактериохлорофилла составляла 5 мМ. Каплю суспензии наносили на покрытую углеродом решетку для электронной микроскопии, окрашивали 3% раствором уранилацетата, промывали водой, высушивали и исследовали в просвечивающем электронном микроскопе Zeiss 902 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).

3.2.6. Выделение и очистка субкомплекса Fi термофильной Bacillus sp. PS3 после гетерологической экспрессии в E. coli

Клетки E. coli, экспрессирующие F0F1 Bacillus sp. PS3 (с His-тэгом на субъединице ß) c плазмиды pTR19-ASDS [385], культивировали и собирали, как описано выше. Для экспрессии использовали клетки E. coli DK8 с делецией оперона F0F1 в геноме. Суспензию клеток разрушали Френч-прессом и нагревали до 65°С на 10 минут, в результате чего большинство белков E. coli денатурировали и выпадали в осадок, а растворимый термофильный F1 Bacillus sp. PS3 оставался в растворе. Затем клеточный лизат центрифугировали 10 мин при 20000 g, 25°С, и супернатант, содержащий фермент, наносили на колонку Ni-NTA Superflow (Qiagen), уравновешенную буфером, содержащим 50 мМ имидазола (pH 7,0) и 100 мМ NaCl. Колонку промывали десятикратным объемом буфера, содержащего 100 мМ имидазол (pH 7,0) и 100 мМ NaCl, а затем фермент элюировали буфером, содержащем 500 мМ имидазола (pH 7,0) и 100 мМ NaCl. Полученный F1 отмывали от имидазола и переводили в буфер, содержащий 100 мМ KCl, 2,5 мМ MgCh, 20 мМ HEPES-KOH (pH 7,8), и 10% глицерина, на колонке для гель-фильтрации NAP-10, концентрировали на концентраторах Amicon Ultra 100k и, если не использовали немедленно, замораживали в жидком азоте в небольших аликвотах и хранили при -80°C.

3.2.7. Выделение и очистка F0F1 термофильной Bacillus sp. PS3 после гетерологической экспрессии в E. coli

СБЧ, полученные из клеток E. coli, экспрессирующих F0F1 Bacillus sp. PS3, растворяли в 120 мл буфера, содержащего 10 мМ HEPES-KOH, pH 7,5, 5 мМ MgCh, 10% глицерина, 2% Triton X-100 и 1% холата натрия, и подвергали ультразвуковой обработке в течение 2 минут при комнатной температуре в ультразвуковой ванне Elmasonic S15. Затем образец центрифугировали (140000 g, 15 мин, 25°С) и супернатант, содержавший солюбилизированный F0F1, разбавляли в 3 раза буфером М (20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, 100 мМ KCl), содержащим 20 мМ имидазола, и наносили на колонку с Ni-NTA (Qiagen, Германия). После промывки 10 объемами буфера МТ (буфер М с добавлением 0,5% Тритона Х-100) F0F1 элюировали буфером МТ, содержащим 200 мМ имидазола. Затем элюированную фракцию осаждали сульфатом аммония в присутствии 1% холата натрия по методике Соне и соавторов [390], постепенно добавляя сухой сульфат аммония до конечной концентрации 210 мг/мл. Фермент хранили в виде осадка

под сульфатом аммония при 4°C. Перед использованием белок осаждали центрифугированием и растворяли в небольшом объеме 50 мМ Трис/HCl, рН 8,0. Выход очищенного F0F1 составлял около 10 мг из 1 литра культуры бактерий.

3.2.8. Встраивание F0F1 Bacillus sp. PS3 в липосомы

Встраивание F0F1 Bacillus sp. PS3 в липосомы проводили по методу Фишер и соавторов [391]. Фосфатидилхолин (Sigma S-II) ресуспендировали до конечной концентрации 44 мг/мл в буфере, содержащем 10% глицерина, 5 мМ MgCh и 10 мМ HEPES-K0H, pH 7,5. Суспензию перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем обрабатывали ультразвуком при максимальной мощности с помощью ультразвукового жидкостного дезинтегратора Astrason XL2020 (Misonix) в течение 15 с на льду. Затем липосомы делили на аликвоты по 1 мл, замораживали в жидком азоте и хранили при — 80°C. Для встраивания в липосомы фермента их размораживали и разводили до концентрации липида 8 мг/мл в буфере, содержащем 10 мМ трицин, 80 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2 и 0,8% Тритон X-100, pH 8,0. Очищенный F0F1 добавляли до конечной концентрации 0,1-0,15 мг/мл, после чего образец инкубировали 1 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Затем добавляли предварительно замоченную в воде смолу BioBeads (Bio-Rad) до концентрации 320 мг/мл, и образец инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании. После этого BioBeads удаляли фильтрацией, а полученные протеолипосомы использовали немедленно или оставляли на ночь при комнатной температуре и использовали на следующий день.

3.2.9. Введение флуоресцентных меток в субъединицы у и s.

Очищенный aзßзy5-комплекс Bacillus sp. PS3 с мутацией Ser3Cys в субъединице у обрабатывали в течение 1 часа 2 мМ дитиотреитолом при 42°C. После этого образец пропускали через колонку для гель-фильтрации NAP-10, уравновешенную буфером, содержащим 100 мМ KCl, 20 мМ K2HP04, 2,5 мМ EDTA, pH 6,6. Затем образец разбавляли до 4 мг/мл белка тем же буфером и добавляли Cy3 -малеимид до конечной концентрации 100 мкМ из 5 мМ раствора в ^^диметилформамиде. После 2 ч инкубации в темноте при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением DTT до 2 мМ.

Рисунок 29. Схема введения флуоресцентных меток Cy3 и Cy5 в a3ß3y58-KOMnneKC из Bacillus sp. PS3

Для реконструкции флуоресцентно меченного aзßзy5-комплекса с субъединицей 8 4 г (сырой вес) клеток E. coli, экспрессирующих субъединицу 8 Bacillus sp. PS3 с добавленным на C-конец остатком 134Cys, суспендировали в 70 мл буфера, содержащего 10% глицерина, 20 мМ HEPES-KOH (pH 7,5) и 2,5 мМ MgCh, дважды пропускали через Френч-пресс и смешивали с 3 мл aзßзy5-комплекса, меченного Су3-малеимидом. Смесь нагревали до 57°C в течение 10 минут и центрифугировали при 190000 g при 4°C в течение 1 часа. Супернатант наносили на колонку с Ni-NTA и очищали субкомплекс Fi (с Cy3-меченой субъединицей и немеченой субъединицей 8), как описано выше, а затем коньюгировали с Cy5-малеимидом по той же методике, что использовалась для aзßзy5-комплекса. Схема вышеописанных процедур представлена на Рис. 29.

Полученный субкомплекс Fi, меченный флуорофором Cy3 по остатку y3Cys и флуорофором Cy5 по остатку 8134Cys, концентрировали, как указано выше, и избыток Cy5 удаляли на колонке NAP-10, уравновешенной буфером, содержащим 10% глицерина, 20 мМ HEPES-KOH (pH 7,5), и 2,5 мМ MgCh. Эффективность мечения, измеренная по спектру поглощения [з47], составляла 50-60% для субъединицы у и 95%

для субъединицы 8. После очистки белок концентрировали до 2 мг/мл, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.

3.2.10. Реконструкция флуоресцентно меченного субкомплекса Fi с СБЧ из Bacillus sp. PS3, лишенных нативного Fi.

СБЧ Bacillus sp. PS3, лишенные Fi, получали обработкой ультразвуком как описано выше. При реконструкции полученные СБЧ смешивали с избытком очищенного флуоресцентно меченного Fi, нагревали в течение 5 минут до 60°C и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Избыток Fi удаляли удаляли двумя последовательными центрифугированиями (190000 g, 45 мин, 4°C), отбрасывая супернатант и ресуспендируя осадок СБЧ в том же буфере. Реконструированные мембраны в небольших аликвотах замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.

рекомбинантный F FqFI ^

Bacillus sp. PS3

Рисунок 30. Схема реконструкции флуоресцентно меченного субкомплекса Fi с СБЧ из Bacillus sp. PS3, лишенных нативного Fi. Синяя и красная точки обозначают флуоресцентные метки, введенные в Fi. Подробности см. в тексте выше.

3.3. Измерение активности FoFl

3.3.1. Регистрация изменений Х'ф на СБЧ (хроматофорах) из ЯЬ. capsulatus

Регистрация изменений Дф на СБЧ (хроматофорах) из ЯЬ. capsulatus в ответ на короткие вспышки возбуждающего света осуществлялась путем измерения электрохромного сдвига каротиноидных пигментов [392-394]. При облучении образца короткой вспышкой красного света происходило возбуждение фотосинтетических реакционных центров (ФРЦ) и разделение зарядов в них, что приводило к возникновению скачка Дф на мембране и сдвигу максимума поглощения каротиноидных пигментов светособирающих комплексов (Рис. 31). Образовавшийся в результате срабатывания ФРЦ хинол окислялся затем цитохром-Ьс1-комплексом, что приводило к дополнительной генерации Дф и электрохроомному сдвигу поглощения каротиноидов.

Рисунок 31. В результате переноса заряженных частиц (электронов или протонов) через мембрану СБЧ возникает Дф, и максимум поглощения каротиноидных пигментов светособирающих комплексов сдвигается. Регистрируя оптическую плотность при длине волны, соответствующей "плечу" пика поглощения, можно регистрировать изменения Дф с максимальным отношением сигнал/шум.

Измерения проводили на импульсном спектрофотометре, сконструированном согласно схеме, разработанной В. Юнге [395] (Рис. 32).

Длина волны

Осциллограф

Рис. 32. Схема импульсного спектрофотометра, использованного для регистрации вызванных вспышкой красного света изменений Д^ на СБЧ из Rb. capsulatus. См. подробное описание в тексте ниже.

Луч света для измерения оптической плотности образца (мониторный свет) обеспечивался галогенной лампой мощностью 200 Вт, проходил через фильтр KG 2 (SCHOTT, Майнц, Германия), отсекаюший инфракрасную область спектра, и через интерференционный фильтр с максимумом пропускания 522 нм и полушириной пика пропускания 11 нм (SCHOTT, Майнц, Германия). Перед кюветой с образцом была установлена шторка (затвор), открывавшаяся только в момент измерения, чтобы избежать возбуждения фотосинтетических белков в образце в период перед регистрацией сигнала. Интервал между открытием шторки и вспышкой возбуждающего света составлял 400 мс.

Вспышки возбуждающего света обеспечивались ксеноновой лампой (полуширина импульса 10 мкс) с установленным на ней красным оптическим фильтром (RG 780, SCHOTT). Плотность энергии излучения на поверхности кюветы составляла 12 мДж/см2); интенсивность света была насыщающей (уменьшение интенсивности в 2 раза не влияло на величину ответа ФРЦ).

Несмотря на короткую длительность ксеноновой вспышки, нельзя было исключить вероятность более чем однократного срабатывания ФРЦ. Чтобы прояснить этот момент, картина электрохромного ответа на вспышку ксеноновой лампы была сопоставлена с таковой в ответ на насыщающую вспышку рубинового лазера (полуширина импульса

60 нс, что гарантирует однократное срабатывание ФРЦ). Возбуждение ксеноновой вспышкой давало на 8-11% больший электрохромный ответ ФРЦ, чем насыщающий лазерный импульс длительностью 100 нс. Это свидетельствует о двукратном срабатывании в 10% RC, что было учтено в количественных расчетах трансмембранного переноса заряда.

Изменения интенсивности проходящего света (I) регистрировались фотоумножителем (9801B, Thorn EMI, Ruislip, UK), который был защищен от вспышки возбуждающего света двумя синими фильтрами (BG 39/2, SCHOTT). Выходной сигнал постоянного тока от фотоумножителя до срабатывания вспышки возбуждающего света выводился на величину 1 В путем изменения тока, выдаваемого источником питания фотоумножителя. Выход фотоумножителя был подключен к положительному входу дифференциального усилителя (AM502, Tektronix, Beaverton, OR). Перед срабатыванием вспышки возбуждающего света сигнал регистрировался и удерживался дополнительным самостоятельно сконструированным усилителем, подключенным к отрицательному входу дифференциального усилителя. Разность сигналов (AI) усиливалась дифференциальным усилителем в 100 раз, оцифровывалась и сохранялась на осциллографе (Pro 10, Gould Nicolet, Erlensee, Германия). Таким образом, итоговый регистрируемый сигнал электрохромных сдвигов представлял собой отношение изменения интенсивности проходящего света к исходной интенсивности (AI/I) при длине волны 522 нм. Аналоговая полоса пропускания составляла 3 кГц; время интеграции на 1 точку составляло 200 мкс. Оптический путь как для возбуждающего, так и для мониторного света составлял 1 см. Конечная концентрация бактериохлорофилла в кювете составляла от 8 до 12 мкМ.

Для увеличения отношения сигнал-шум регистрировалось восемь сигналов с частотой повторения 0,08 Гц, которые затем усреднялись. Время адаптации к темноте между вспышками (12 с) было выбрано так, чтобы произошло практически полная диссипация A^, возникшей в хроматофорах после предыдущей возбуждающей вспышки. Электрогенный протонный транспорт через FoF1 измерялся путем вычитания кривых до и после добавки специфических ингибиторов фермента.

3.3.2. Измерение количества ФРЦ в препаратах хроматофоров Rb. capsulatus

Все импульс-спектрофотометрические измерения проводились в условиях, когда часть ФРЦ содержала семихинон, а часть — хинон. В таких условиях в ответ на вспышку возбуждающего света происходило разделение зарядов во всех ФРЦ, и в результате из

одних ФРЦ высвобождался хинол (и затем связывался хинон), а в других образовывался семихинон. Концентрация ФРЦ определялась по изменению поглощения при 604 нм в ответ на короткую (полуширина импульса 60 нс) вспышку возбуждающего света рубинового лазера [396]. Коэффициент молярной экстинкции — 8604 = 25000. Для блокирования быстрого восстановления активного димера бактериохлорофилла цитохромом c в этих опытах bci-комплекс

ингибировался миксотиазолом (1 мкМ). Для устранения вклада сдвига поглощения каротиноидов при 604 нм в пробу добавлялся грамицидин D; при этом наблюдалась практически полная диссипация Дф за 1 мс.

3.3.3. Регистрация изменений ApH на СБЧ из Rb. capsulatus

Изменения рН внутри хроматофоров (ДрНвнутр) регистрировались по изменениям поглощения амфифильного рН-индикатора нейтрального красного при 545 нм [397,398]. В этих экспериментах 0,3% БСА использовали в качестве не проникающего через мембрану рН-буфера для подавления изменений pH в среде снаружи хроматофоров. Изменения рН в среде снаружи хроматофоров (ДрШнеш) регистрировались путем измерения поглощения гидрофильного pH-индикатора крезолового красного при 575 нм [399] и калибровались в единицах pH путем добавки аликвот щелочи или кислоты известной концентрации.

Как в случае измерения ДpHвнутр, так и для измерений ДpHвнеш, в качестве контроля регистрировались сигналы, измеренные в том же образце, но без добавления рН-индикатора. Эти сигналы затем вычитались из кривых, измеренных в пробе с рН-индикатором.

3.3.4. Измерение синтеза АТФ хроматофорами Rb. capsulatus

Синтез АТФ хроматофорами Rb. capsulatus в ответ на вспышки возбуждающего света измеряли в том же спектрофотометре, который использовался для измерения электрохромных сдвигов поглощения каротиноидов, путем регистрации хемолюминесценции в люциферин-люциферазной системе [400]. Измерения проводились в том же образце, который использовался для измерения изменений Дф. Фотоумножитель был защищен от вспышки возбуждающего света стопкой из трех синих фильтров (BG 39, SCHOTT); возбуждающий свет давался вспышкой ксеноновой лампы с установленным на ней красным фильтром (RG 780, SCHOTT). Калибровка осуществлялась добавками в кювету аликвот свежеприготовленного 0,5 мМ раствора

АТФ до конечной концентрации 2 мкМ. Линейные калибровочные кривые были получены в пределах от 0,05 до 2 мкМ АТФ. Среда для измерения (если не указано иное) содержала 20 мМ глицилглицина, 100 мМ ацетата калия, 5 мМ ацетата магния, 2 мМ K4[Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ, 2 мМ KCN, 0,2 мМ люциферина и 10 ед/мл люциферазы; pH составлял 7,9.

3.3.5. Регистрация изменений ApH на СБЧ из E. coli и в протеолипосомах

Изменения рН внутри СБЧ из E. coli проводились с помощью флуоресцентного индикатора 9-амино-6-хлор-2-метоксиакридина (ACMA). Согласно модели, впервые представленной Шульдинером и соавторами в 1972 г. [401], предполагается, что флуоресцентные амины, в нейтральной форме свободно проходящие через липидные мембраны, распределяются между внутренним и внешним водными компартментами мембранных замкнутых везикул в соответствии с pH внутри и снаружи везикул. Если pH внутри везикул ниже, чем в среде снаружи, то будет происходить накопление зонда во внутреннем водном компартменте, и при достаточно высокой концентрации зонда будет происходить тушение флуоресценции. Эта модель хорошо согласуется с большим массивом экспериментальных результатов, подтверждающих, что флуоресценция падает при закислении внутреннего объема мембранных везикул и восстанавливается до исходного уровня, когда трансмембранный ApH рассеивается разобщителями-протонофорами или в результате добавки специфических ингибиторов протонных насосов, создававших ApH [402].

Закисление внутреннего объема СБЧ из E. coli и протеолипосом регистрировалось по тушению флуоресценции ACMA (0,3 мкг/мл; возбуждение 410 нм; испускание 480 нм) в буфере, содержащем 2,5 мМ HEPES-KOH, pH 8,0, 100 мМ KCl, 2,5 мМ MgCh, 2,5 мМ фосфата калия и 10% глицерина (если не указан иной состав буфера) при комнатной температуре.

3.3.6. Измерение АТФазной активности в АТФ-регенерирующей системе

Гидролиз АТФ, ферментативно сопряженный с рефосфорилированием образующегося АДФ и окислением НАДН, измерялся по методике Пульмана и соавторов [57]. Концентрацию НАДН измеряли оптически при 340 нм в буфере, содержащем 10 мМ HEPES-KOH, 10% глицерин, 100 мМ KCl, 2,5 мМ MgCh, 2,5 мМ фосфата калия, 200 мкМ НАДН, 3 мМ фосфоенолпирувата (соль трициклогексиламмония), 0,1 мг/мл пируваткиназы и 0,1 мг/мл лактатдегидрогеназы. Коэффициент молярной экстинкции

НАДН при 340 нм был принят за 6200 единиц оптической плотности на 1 М на 1 см. Конечный pH составлял 8,0-8,1, если не указано иное. Реакцию инициировали добавлением АТФ (до 1 мМ, если не указано иное). 3 мМ KCN присутствовало при измерениях с суббактериальными инвертированными мембранными частицами для предотвращения окисления НАДН ферментами дыхательной цепи.

3.3.7. Измерение АТФазной активности в отсутствие фосфата

Измерение скорости гидролиза АТФ в отсутствие Фн в реальном времени осуществлялось колориметрически по методу Вебба [403] с помощью набора EnzCheck Phosphate Assay kit (Invitrogen). Образцы содержали 270 мкМ MESG, 2 единицы/мл пуриновой нуклеотидфосфорилазы, 2,5 мМ HEPES, 100 мМ KCl, 2,5 мМ MgCh и 10% глицерина, pH 8,0. Метод основан на том, что неорганический фосфат, образующийся в результате гидролиза АТФ, вступает в реакцию с MESG с образованием рибозо-1-фосфата и 2-амино-6-меркапто-7-метилпурина. Это ферментативное преобразование MESG приводит к сдвигу максимума поглощения с 330 нм для субстрата до 360 нм для продукта. Скорость реакции измерялась в реальном времени по изменению оптической плотности при 360 нм (коэффициент молярной экстинкции при 360 нм был принят за 11000 единиц оптической плотности на 1 М на 1 см).

3.3.8. Измерение АТФ-зависимого вращения субъединицы у на единичных молекулах Fi из Bacillus sp. PS3

Для анализа вращения субъединицы у на единичных молекулах F i в ходе гидролиза АТФ использовалась методика, разработанная в группе проф. Йошиды, Токио [274]. Белок биотинилировали по введенной в субъединицу у сайт-направленным мутагенезом паре остатков цистеина (yS107C/yE165C). Осажденный в 70% сульфате аммония образец растворяли в буфере, содержащем 100 мМ фосфат калия (pH 7,0), 2 мМ EDTA и 10 мМ дитиотреитола, и пропускали через колонку Superdex 200 HR, уравновешенную 100 мМ фосфатом калия (pH 7,0) и 2 мМ EDTA. К элюату добавляли 5-10 молярный избыток биотинмалеимида (Sigma), и смесь инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Свободный реагент удаляли, пропуская через колонку Superdex 200, уравновешенную 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ KCl и 0,5 мМ EDTA. Затем белок разбавляли до концентрации 50 пМ в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ KCl и 2 мМ MgCl2, и вводили в камеру для наблюдения, состоящую из предметного стекла, покрытого Ni-NTA, и покровного стекла без покрытия,

разделенных 50-микронными спейсерами. Перед введением раствора фермента камера для наблюдения инкубировалась в течение 1 часа с раствором 20 мг/мл БСА. Через 30 секунд после введения раствора с ферментом, свободный F1 отмывали 10 объемами того же буфера, содержащего систему поглощения кислорода (8 мг/мл D-глюкозы,

1 мг/мл глюкозооксидазы, 0,04 мг/мл каталазы и 1% 2-меркаптоэтанол).

Затем в камеру для наблюдения вводился коллоидный раствор покрытых стрептавидином микрочастиц (полистироловых гранул диаметром 200 нм или магнитных частиц (MG-SA, Seradyn)). Через 20 мин не связавшиеся с ферментом микрочастицы отмывали буфером, содержащим 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ KCl,

2 мМ MgCh, систему поглощения кислорода и желаемую концентрацию АТФ. Изображения вращающихся микрочастиц регистрировались на инвертированном микроскопе IX70, Olympus, с помощью камеры CCD (CCD-300-RC, Dage-MTI) со скоростью 30 кадров/с. Записанные изображения анализировали на ПК с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Celery) и программы обработки данных, написанной Р. Ясудой (Duke University).

3.3.9. Вращение субъединицы у на единичных молекулах Fi из Bacillus sp. PS3 с помощью оптического пинцета

Магнитный пинцет, сконструированный ранее в лаборатории проф. Йошиды, Япония, состоял из двух расположенных друг напротив друга пар электромагнитов и располагался на 10 мм выше предметного столика микроскопа [275]. Направление и напряженность магнитного поля контролировались изменением электрического напряжения, подаваемого на пары электромагнитов, что осуществлялось с помощью программного обеспечения (Celery) с ПК. Сила магнитного поля была пропорциональна приложенному напряжению, а максимальное магнитное поле составляло 100 гаусс в зоне наблюдения. Сила магнитного пинцета была стабильной во время экспериментов и постоянной во время вращения на 360°.

3.4. Прочие биохимические методы 3.4.1. Измерение концентрации белка

Концентрацию белка определяли с использованием набора BCA Protein Assay Kit (Pierce), используя БСА в качестве стандарта.

3.4.2. Измерение концентрации бактериохлорофилла

Концентрация бактериохлорофилла в клетках и в хроматофорах Rb. capsulatus измерялась по методу Клайтона [404] с небольшими модификациями. Бактериохлорофилл из 25 мкл образца экстрагировали в 5 мл смеси ацетон:метанол (7:2); экстракт пропускали через фильтровальную бумагу для удаления взвеси и измеряли поглощение при длине волны 772 нм. Концентрацию бактериохлорофилла вычисляли, используя коэффициент молярной экстинкции 8772 = 75000.

3.5. Генно-инженерные методы

3.5.1. Получение штамма Rb. capsulatus с мутацией yMet23Lys в FoFi

Плазмида pRCATl была сконструирована из плазмиды pRCA50 (несущей оперон Fi Rb. capsulatus, вставленный в вектор pTZ18R [405]) путем разрезания последнего с помощью эндонуклеазы рестрикции EcoRI и лигирования фрагментов размером 7,6 т.п.н. с помощью ДНК-лигазы Т4. Мутацию вводили в плазмиду pRCATl с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChange (Stratagene), используя следующие олигонуклеотиды для ПЦР: 5'-CAAGATCACGAAAGCGAAGCAGATGGTCGCGG-3 ' и 5'-GTTCTAGTGCTTTCGCTAGTC-3'.

Успешное введение было подтверждено анализом фрагментов, полученных в результате разрезания конструкции эндонуклеазой HpyCH4V, которая давала фрагмент l600 п.н. в мутированной плазмиде вместо фрагментов ~900 п.н., ~700 п.н. в pRCATl. Затем мутировавший оперон Fi был клонирован в плазмиду pRK415 [406] с широким кругом хозяев, несущую устойчивость к тетрациклину, как описано в работе [405]. Новая плазмида была названа pRCA51.23K и впоследствии была введена в Rb. capsulatus Bi00 путем тройной конъюгации, с модификациями, описанными в работе [405]. С помощью этой процедуры была удалена хромосомная копия оперона, кодирующего субъединицы Fi дикого типа, и вместо нее была введена кассета устойчивости к канамицину с помощью GTA (gene transfer agent) [407], и одновременно была проведена трансформация плазмидой pRCA51.23K, несущей мутантный оперон Fi. Штамм псевдодикого типа был сконструирован параллельно с помощью той же процедуры, но трансформация была проведена плазмидой pRCA51 (несущей оперон Fi дикого типа); этот штамм использовали в качестве контроля FoFi дикого типа во всех экспериментах

с мутантным штаммом yMet23Lys. Параллельные опыты со штаммом Rb. capsulatus B 100 дикого типа без плазмид не выявили различий в свойствах между штаммами дикого типа и псевдодикого типа.

3.5.2. Мутагенез ферментов Bacillus sp. PS3 и E. coli.

Введение точечных замен и иных мутаций в гены субъединиц АТФ-синтазы Bacillus sp. PS3 в плазмиде pTR19-ASDS [385] осуществлялось с помощью метода мегапраймеров [408]. Сначала, используя данную плазмиду в виде матрицы, проводилась ПЦР с праймерами, один из которых нес необходимую замену и дополнительный сайт рестрикции; в результате получался олигонуклеотид (мегапраймер) длиной 150-550 н.п., содержащий замену и ближайший к ней сайт рестрикции, уникальный для плазмиды pTR19-ASDS. Затем проводилась вторая ПЦР, в ходе которой полученный мегапраймер удлиняли, используя третий праймер; в результате получался фрагмент ДНК, в котором мутация была фланкирована двумя уникальными для плазмиды pTR19-ASDS сайтами рестрикции. ПЦР-продукт обрабатывали соответствующими рестриктазами, после чего продукты рестрикции разделяли электрофорезом в агарозном геле; фрагмент с мутацией вырезали из геля, очищали и лигировали с pTR19-ASDS, из которой теми же рестриктазами был вырезан соответствующий фрагмент. Последовательности областей, амплифицированных с помощью ПЦР, подтверждали секвенированием по Сэнгеру.

Для введения точечных замен в гены субъединиц АТФ-синтазы E. coli использовался тот же подход, но в качестве вектора использовалась плазмида pFV2 [386].

4. Результаты и обсуждение

4.1. Хроматофоры Rb. capsulatus как система для функциональных исследований FoFi

4.1.1. Измерение Аф и ионного транспорта на СБЧ из Rb. capsulatus

Клетки Rb. capsulatus, выращенные на свету в анаэробных условиях, содержат хроматофоры — везикулярные инвагинации цитоплазматической мембраны, содержащие белки фотосинтетического аппарата и FOF1. При разрушении клеток с помощью Френч-пресса или ультразвука цитоплазматическая мембрана рвется, и

образуются замкнутые инвертированные суббактериальные мембранные частицы, состав которых соответствует таковому хроматофоров. В этой связи СБЧ, полученные из ЯЬ. сараи1а1иа и других фотосинтетических альфа-протеобактерий, в литературе обычно также называют хроматофорами.

АТФ-синтаза

Рисунок 33. Схематическое изображение хроматофора (инвертированной суббактериальной частицы) из ЯЬ. сараи1а1иа и сопряжения протонного транспорта и синтеза АТФ в нем. Квант света поглощается светособирающим комплексом; возбуждение передается на фотосинтетический реакционный центр; восстановленный в нем хинол ^Ш) окисляется Ьс1-комплексом. В результате из среды внутрь суббактериальной частицы переносятся ионы водорода, и создается Дф (плюс внутри) и ДрН (закисление внутреннего объема), за счет которых происходит протонный транспорт через FoFl и синтез АТФ. Модифицировано из [409].

Хроматофоры ЯЬ. сараи1а1иа оказались удобным объектом для исследования ион-проводящих свойств АТФ-синтазы. Возбуждение хроматофоров короткими вспышками света вызывает разделение зарядов и восстановление хинона до хинола в ФРЦ; последующее окисление образовавшегося хинола Ьс1-комплексом сопровождается электрогенным переносом электронов и выбросом протонов с положительно заряженной стороны мембраны (внутрь хроматофора). В результате этих реакций, в

ответ на вспышку возбуждающего света на мембранах хроматофоров происходит ступенчатое повышение А^н+, возникновение которой в присутствии Mg2+, АДФ и Фн приводит к синтезу АТФ, катализируемому F0F1. Химическую компоненту А^н+ (ApH) можно измерять с помощью рН-индикаторов, а электрическую (А^) — посредством измерения электрохромных сдвигов оптического поглощения каротиноидов (см. Материалы и методы).

Для количественной интерпретации измерений электрохромного сдвига было необходимо установить зависимость между величиной изменения оптического поглощения и А^. Для этого хроматофоры получали в среде, содержавшей 45 мМ KCl, 205 мМ NaCl, 5 мМ MgCh, 20 мМ глицилглицин-NaOH, pH 7,9, а затем помещали в буфер того же состава, за исключением концентрации KCl и NaCl (их количество варьировалось, но при этом суммарная концентрация обеих солей оставалась постоянной, 250 мМ). Добавка калиевого протонофора валиномицина приводила к трансмембранному транспорту ионов K+ и к возникновению диффузионного электрического потенциала на мембране (см. раздел «Термодинамика синтеза/гидролиза АТФ» на стр. 50 выше), который, в свою очередь, вызывал электрохромный сдвиг поглощения каротиноидных пигментов. Зависимость величины электрохромного сдвига от концентрации K+ в среде представлена на Рис. 34.

I I I I I I—I | I-1 I I I I I I | I I

—I-1-I-1—I—I—I—|-1-1-1-г-I—I—I—I—|-I-I-

3 10 30 100 300

Концентрация KCl, мМ

Рисунок 34. Зависимость сдвига поглощения каротиноидов (относительного изменения интенсивности света при длине волны 522 нм, прошедшего сквозь суспензию хроматофоров) в ответ на добавку валиномицина при разных концентрациях К+. Модифицировано из [410].

Согласно уравнению Нернста, возникающий в таких условиях диффузионный электрический потенциал равен

где Я — универсальная газовая постоянная, Т — абсолютная температура, Снаружн и Свнутр — концентрации иона К+ снаружи и внутри хроматофоров, соответственно, 2 — заряд иона ^ (+1), ^ — постоянная Фарадея, Дф — величина возникающего диффузионного потенциала на мембране. Таким образом, величина Дф при постоянной концентрации ^ внутри хроматофоров линейно зависит от логарифма концентрации К+ в среде. В свою очередь, результаты экспериментов, приведенные на Рис. 34, говорят о линейной зависимости величины электрохромного сдвига поглощения каротиноидов от логарифма концентрации К+ в среде. Таким образом, электрохромные сигналы, регистрируемые при 522 нм, линейно отражают изменения величины Дф и могут быть использованы для количественных измерений ее величины. К таким же выводам на основании сходных экспериментов ранее пришли Кларк и Джексон [392]. При переносе заряда через мембрану хроматофора происходит изменение величины Дф, которое количественно описывается уравнением изменения разности потенциалов на пластинах конденсатора:

где Дд — величина перенесенного заряда, ё — расстояние между пластинами конденсатора (т.е. толщина липидного бислоя), 80 — электрическая постоянная, S — площадь пластин. Так как все эти величины, кроме Ад, остаются неизменными в случае хроматофора, изменения Дф будут линейно зависеть от суммарного количества перенесенных через мембрану зарядов. Таким образом, регистрируя электрохромный сдвиг каротиноидных пигментов, можно не только регистрировать изменения Дф, но и измерять количество перенесенных через мембрану зарядов. Следует, однако, отметить, что в случае одновременного переноса через мембрану одноименных зарядов в противоположных направлениях (как, например, происходит в сопрягающих мембранах, когда генераторы выбрасывают протоны наружу, а затем АТФ-синтаза пропускает их обратно внутрь), изменения Дф будут пропорциональны разнице между количеством зарядов, перенесенных в одну и в другую сторону.

Типичная картина изменений оптического поглощения суспензии хроматофоров при 522 нм в ответ на вспышку возбуждающего света приведены на Рис. 35.

Рисунок 35. Картина электрохромных сдвигов поглощения света при длине волны 522 нм в суспензии хроматофоров в ответ на 2 последовательные вспышки возбуждающего света до (черная кривая) и после добавки миксотиазола и валиномицина (зеленая и фиолетовая кривые, соответственно). Красная кривая (получена путем вычитания зеленой кривой из черной, т.е. до/после добавки миксотиазола) отражает электрогенный транспорт H+ ^-комплексом. Вспышки возбуждающего света обозначены стрелками. Среда содержала 100 мМ ацетата калия, 2 мМ ферроцианида калия, 15 мкМ ТМПД, 2 мМ KCN, 10 мМ глицилглицина (pH 7,9). Миксотиазол добавлялся до концентрации 3 мкМ, валиномицин — до концентрации 1 мкМ. Концентрация бактериохлорофилла в кювете составляла 10 мкМ.

На Рис. 35 видно, что в ответ на вспышку возбуждающего света на мембране

хроматофоров возникала Aip, причем кинетика роста была двухкомпонентной. Первая,

быстрая компонента, отражала разделение зарядов в ФРЦ, и имела характерное время

менее 1 мкс; ее разрешение лимитировалось постоянной времени регистрирующей

аппаратуры. Вторая компонента имела характерное время около 10 мс и отражала

электрогенный перенос электронов в ¿с1-комплексе; ее можно было визуализировать

путем вычитания кривых до и после добавки миксотиазола (Рис. 35, красная кривая).

Если давалось несколько вспышек с небольшим интервалом по времени, то после второй

и третьей вспышки медленная компонента роста Аф значительно уменьшалась.

Вероятным объяснением такого феномена является замедление работы ¿с1-комплекса

при высоких значениях Аф. На рис. 35 также показаны изменения поглощения при

522 нм в ответ на вспышки после добавки валиномицина. В этом случае появлявшаяся

Дф быстро (характерное время около 3 мс) диссипировала за счет тока калия через мембрану. Следует отметить, что после добавки валиномицина в ответ на вспышку возбуждающего света наблюдались небольшие (5-10%) остаточные изменения поглощения при 522 нм, не зависящие от Д^, но зависящие от концентрации редокс-медиатора в среде. В этой связи в случаях, когда требовалось точное количественное измерение величины Дф, при обработке электрохромных сигналов делалась соответствующая поправка.

4.1.2. Регистрация протонного транспорта через FoFl ЯЬ. capsulatus с помощью специфических ингибиторов фермента

При добавлении субстратов (АДФ + фн) и специфических ингибиторов FoFl картина электрохромных сдвигов поглощения при 522 в ответ на вспышки возбуждающего света изменялась (Рис. 36).

Рисунок 36. Электрохромный сдвиг в суспензии хроматофоров Rb. capsulatus в ответ на одиночную вспышку возбуждающего света; влияние субстратов и ингибиторов АТФ-синтазы. Величина скачка ДМ при 522 нм, вызванного разделением зарядов в ФРЦ, принята за единицу.

1 — исходная кривая до добавок (черная); затем в образец последовательно добавлялись: АДФ до 400 мкМ (кривая 2, красная); эфрапептин до 200 нМ (кривая 3, розовая); вентурицидин до 200 нМ (кривая 4, синяя). Черная кривая 3-2 получена вычитанием кривой 2 из кривой 3 и отражает электрогенный транспорт протонов через АТФ-синтазу. Вспышка возбуждающего света обозначена стрелкой. Среда измерения содержала 2 мМ K2HPO4, 2 мМ K4[Fe(CN)6]6, 5 мкМ ДМФ, 2 мМ KCN, 5 мМ MgCh, 50 мМ KCl, 0.3% БСА, pH 7.9. Концентрация бактериохлорофилла в кювете составляла 10 мкМ. Модифицировано из [411]

После добавки АДФ в присутствии 2 мМ Фн наблюдалось ускорение спада Д^, а последующая добавка эфрапептина, пептидного ингибитора АТФ-синтазы, связывающегося с Fl внутри аэРэ-гексамера [412] и блокирующего как гидролиз [413,414], так и синтез АТФ [415], полностью обращала это ускорение (см. Рис. 36, кривые 1, 2 и 3). Если после эфрапептина добавлялся вентурицидин или олигомицин, ингибиторы протонного транспорта через Fo [399], это не приводило к заметным изменениям картины спада Дф (см. Рис. 36, кривые 3 и 4). Если вентурицидин или олигомицин добавлялись к хроматофорам в присутствии АДФ и ФН, итоговая кривая также не отличалась от кривой, полученной после добавки эфрапептина (данные не приведены).

Появление в ответ на добавку АДФ и Фн новой компоненты спада Дф и ее чувствительность к ингибиторам АТФ-синтазы позволяет предположить, что эта новая компонента отражает протонный транспорт через FoFl, сопряженным с синтезом АТФ. Эту компоненту можно было визуализировать путем вычитания экспериментальной кривой в присутствии АДФ и Фн из кривой, полученной в присутствии эфрапептина (Рис. 36, кривая 3-2).

Прямые измерения с помощью люциферин-люциферазной системы подтвердили, что в ответ на вспышку возбуждающего света действительно наблюдается синтез АТФ (27,1 ± 2,5 нМ в ответ на единичную вспышку при концентрации бактериохлорофилла в кювете 10 мкМ). В связи с медленным (характерное время около 100 мс) ответом люциферазной системы кинетический анализ реакции синтеза АТФ был невозможен, однако итоговое количество синтезированного АТФ в ответ на вспышку можно было оценить с хорошей точностью. Синтез АТФ не наблюдался в отсутствие АДФ или Фн, а также полностью исчезал в присутствии специфических ингибиторов АТФ-синтазы эфрапептина, вентурицидина или олигомицина.

Возвращаясь к данным на Рис. 36: следует отметить, что ингибиторы, блокирующие Fl, и ингибиторы, подавляющие протонный транспорт через Fo, вызывали в присутствии АДФ и Фн одинаковый эффект; картина генерации и спада Дф после добавления всех этих ингибиторов мало отличалась от таковой в отсутствие АДФ и Фн. Это означает, что если каталитический субкомплекс Fl не может функционировать из-за отсутствия нуклеотидов или из-за блокировки в результате связывания эфрапептина, то и субкомплекс Fo также полностью неактивен и не пропускает протонов, т.е. в

хроматофорах ЯЬ. capsulatus наблюдается 100% сопряжение и полное отсутствие не сопряженной с синтезом АТФ протонной проводимости через интактный FoFl.

4.1.3. Хроматофоры ЯЬ. capsulatus содержат в среднем около 1 молекулы FoFl на мембранную частицу.

Важным параметром, влияющим на картину изменений Дф в результате протонного транспорта через БоР1, является количество молекул фермента на 1 хроматофор. Если на 1 хроматофор приходится несколько молекул FoFl, то кинетические параметры регистрируемого протонного транспорта будут зависеть от их количества (так, например, в хроматофоре с двумя АТФ-синтазами при заданном Дф протонный транспорт будет вдвое быстрее, чем в хроматофоре с одной молекулой фермента, а в экспериментах будет наблюдаться усредненная картина).

Много АТФ-синтаз на 1 частицу

время

Одна АТФ-синтаза на 1 частицу

Рисунок 37. Схема, иллюстрирующая различное изменение кинетики и амплитуды протонного транспорта через FoFl в хроматофорах в ответ на добавку ингибитора в зависимости от количества молекул FoFl на 1 мембранную частицу. Красными стрелками показан протонный транспорт, овалом обозначен генератор Дни+ (ФРЦ+Ьс1-комплекс). Модифицировано из [416].

Чтобы оценить этот параметр, были поставлены опыты по титрованию вызванных вспышками возбуждающего света электрохромных сдвигов ингибиторами FoFl. Если на 1 хроматофор приходится несколько FoFl, частичное ингибирование фермента должно приводить к замедлению кинетики протонного транспорта, но не должно изменять его амплитуду. Если же на 1 хроматофор приходится одна молекула FoFl, то частичное ингибирование должно было бы привести к сохранению кинетических характеристик протонного транспорта, но при этом вызвать падение его амплитуды (Рис. 37).

Интактные хроматофоры (Р0Р-|)

время, мс время, мс амплитуда протонного транспорта, %

Хроматофоры, обработанные ЭДТА (Р0)

^-т-1-I-т-I-1-I-1-1-|-----Ц-.-|-.-.---1-,-I-1-1-.-. и Ч-•-1-•-1-•-1->-I-'-1-1

О 200 400 0 200 400 0 20 40 60 80 100

время, мс время, мс амплитуда протонного транспорта, %

Рисунок 38. Титровка протонного транспорта через FoFl и Fo в хроматофорах ЯЬ. сар:^^1а1-иа ингибиторами (эфрапептином и вентурицидином, соответственно). А-В — интактные хроматофоры; Г-Е — хроматофоры, в которых субкомплекс Fl был удален обработкой ультразвуком в присутствии ЭДТА (см. Материалы и методы). А и Г — исходные кривые электрохромных сдвигов в ответ на вспышки возбуждающего света. Б и Д — результат вычитания из кривой с избытком ингибитора кривой с нулевой (красный) или субнасыщающей (все остальные цвета) концентрацией ингибитора. Концентрации ингибиторов отмечены рядом с кривыми. В и Е — характерное время экспоненциальной функции, которой аппроксимировался протонный транспорт в ответ на первую вспышку в зависимости от относительной амплитуды этого транспорта (рассчитано из кривых на Б и Д).

Условия измерения — как в экспериментах на Рис. 36. Вспышки возбуждающего света обозначены стрелками.

Опыты были поставлены на хроматофорах, полученных с помощью ультразвуковой дезинтеграции клеток — как на интактных, так и на тех, у которых субкомплекс F1 был удален обработкой ЭДТА в отсутствие ионов магния (см. Материалы и методы). В первом случае для титровки использовался эфрапептин, блокирующий фермент в результате связывания с Fl; во втором случае был взят вентурицидин, ингибирующий непосредственно Fo. Результаты титровки представлены на Рис. 38. Оказалось, что и титровка протонного транспорта через FoFl эфрапептином, и титровка на лишенных субкомплекса Fl хроматофоров вентурицидином приводила к снижению амплитуды транспорта (Рис. 38. Б, Д), но не оказывала заметного влияния на его кинетику (Рис. 38. В, Е). Таким образом, было установлено, что полученные с помощью ультразвуковой дезинтеграции клеток хроматофоры ЯЬ. сараи1а1иа содержат в среднем около 1 молекулы АТФ-синтазы на частицу. Такой результат вполне согласуется с малым размером хроматофоров, полученных ультразвуковой дезинтеграцией (типичный диаметр от 30 до 60 нм; см. Рис. 39).

Кажущийся диаметр, нм

Рисунок 39. Распределение размеров хроматофоров ЯЬ. capsulatus, полученных обработкой клеток ультразвуком, по результатам трансмиссионной электронной микроскопии. Следует отметить, что повторная обработка хроматофоров ультразвуком приводила к дополнительному снижению их среднего кажущегося диаметра (до 25-30 нм).

Если предположить, что количество молекул АТФ-синтазы на 1 хроматофор описывается распределением Пуассона, то при среднем, равном 1 ферменту на

мембранную частицу, количество хроматофоров вообще без единой АТФ-синтазы будет около 37%.

Еще один способ оценить размер фракции хроматофоров, лишенных АТФ-синтазы, заключается в анализе кривых, полученных на препаратах с удаленным Fl. Как видно на Рис. 38 Д, скорость протонного транспорта через субкомплекс Fo, лишенный Fl, весьма высока, и транспорт прекращается примерно через 100 мс после вспышки возбуждающего света. В такой ситуации можно было бы ожидать, что если субкомплекс Бо присутствует во всех хроматофорах, то через 100 мс Дф должен падать в них до нуля как после первой, так и после второй вспышки. Однако на Рис. 38 Г (красная кривая) видно, что это не так — электрохромный сигнал не падает до нуля, и его уровень выше после второй вспышки. Такая картина может наблюдаться, когда образец хроматофоров представляет собой смесь из частиц без АТФ-синтазы и частиц, содержащих фермент (Рисунок 40).

Рисунок 40. Кривая электрохромных сдвигов, регистрируемых в гетерогенном образце хроматофоров в ответ на вспышку возбуждающего света (А), представляет собой сумму электрохромных сдвигов в хроматофорах, содержащих Бо, где Дф после вспышки падает до нуля за десятки миллисекунд (Б), и в хроматофорах, лишенных Fо, где спад Дф медленный, и его уровень снижается в секундной шкале (В). Модифицировано из [411].

Чтобы дополнительно проверить это предположение и сделать количественную оценку фракции хроматофоров, не содержащих АТФ-синтазы, были поставлены опыты на хроматофорах, у которых Fl был удален обработкой ЭДТА в отсутствие ионов магния

(см. Материалы и методы). Образец возбуждался двумя последовательными вспышками с интервалом 240 мс до и после добавки вентурицидина, блокирующего протонный транспорт через Fo. На Рис. 41 А видно, что электрохромный сигнал до добавки вентурицидина не падает до близкого к нулю уровня, а остаточный сигнал различается после первой и второй возбуждающей вспышки (кривая 1, пунктирные линии). Согласно вышеизложенной гипотезе, это объясняется тем, что определенная фракция хроматофоров в образце не содержит Fo, и в ней картина электрохромных сдвигов должна совпадать с таковой на всем образце в присутствии вентурицидина, когда протонный транспорт через Fo заблокирован. Исходя из предположения, что во фракции хроматофоров, содержащих активный Fo, сигнал за 240 мс должен падать до одинакового, близкого к нулю уровня, был сделан расчет вклада в электрохромный сигнал от фракции хроматофоров без Fo.

Рисунок 41. Оценка доли хроматофоров, в которых отсутствует Fo, по электрохромным сдвигам поглощения в ответ на две вспышки возбуждающего света с интервалом 240 мс. (А) Кривые электрохромных сдвигов в хроматофорах, у которых был удален, до (кривая 1) и после добавки вентурицидина до 200 нМ (кривая 2). (Б) Реконструкция кинетики спада Дф во фракции Fo-содержащих хроматофоров. Кривая 1 (та же, что и в А) может быть представлена как сумма кривых электрохромного сдвига в лишенных Fo хроматофорах (кривая 2а = кривая 2, умноженная на 0,42; см. подробности в тексте) и в хроматофорах, содержащих Fo (кривая 1-2а, результат вычитания кривой 2а из кривой 1). Среда содержала 2 мМ сукцината, 2 мМ фумарата, 5 мкМ ДМФ, 2 мМ КС^ 5 мМ MgCh, 50 мМ КС1, 2 мМ К2НРО4, 0,3% БСА, рН 8,0. Вспышки возбуждающего света обозначены стрелками. Модифицировано из [411].

Оказалось, что суммарный регистрируемый сигнал можно представить суммой двух кривых, одна из которых представляет собой записанный после добавки вентурицидина сигнал, домноженный на 0,42 (Рис. 41 Б, кривая 2а), и отражает электрохромный сдвиг в хроматофорах, где нет протонного транспорта через Fo, а другая (Рис. 41 Б, кривая 1-2а) отражает электрохромный сдвиг во фракции хроматофоров, содержащих Fo. Полученная таким образом оценка фракции хроматофоров без Fo в 42% не является точной, поскольку сдвиги поглощения при 522 нм в ответ на вспышки возбуждающего света включают небольшую (менее 10%, см. Рис 35) компоненту, которая не зависит от Д^. Вероятно, эта компонента объясняет, почему рассчитанная кривая электрохромного сдвига в хроматофорах с Fo не спадает до нулевого уровня сигнала через 240 мс после вспышки (Рис. 41 Б, кривая 1 -2а). Тем не менее, следует отметить, что эта оценка достаточно хорошо совпала с полученным альтернативным, более точным методом, значением в 37% (см. выше), и можно достаточно уверенно утверждать, что в используемых в данной работе препаратах хроматофоров ЯЬ. capsulatus лишь около 60% частиц содержали АТФ-синтазу, в то время как в ~40% хроматофоров фермент отсутствовал.

Физиологически такое небольшое количество АТФ-синтаз на хроматофор не имеет значения для клетки, где все хроматофоры образуют непрерывную, электрически и химически сопряженную мембранную систему.

Обнаружение в препаратах выделенных хроматофоров значительной фракции частиц, в которых отсутствует АТФ-синтаза, объясняет более раннее наблюдение, что суспензия хроматофоров, обедненная Fl, все еще была способна поддерживать относительно высокий уровень ДрН [387] и Дф [417] при освещении возбуждающим светом. Кроме того, присутствие такой фракции объясняет интересное наблюдение Крими и соавторов [418], что электрохромный сдвиг каротиноидов, индуцированный гидролизом АТФ, в хроматофорах ЯЬ. capsulatus оказывается намного меньше (70 мВ по калибровке К+/валиномицином), чем пороговое значение Дф для активации АТФ-синтазы (100-150 мВ по той же калибровке). Между тем, именно такого результата можно было бы ожидать, если бы около половины всех хроматофоров вообще не содержали фермента. Так как наблюдаемый сдвиг полосы поглощения каротиноидов является усредненной величиной по гетерогенному ансамблю мембранных частиц, при добавке АТФ электрохромный ответ будет давать только фракция хроматофоров, содержащих БоБ1, и поэтому амплитуда сигнала в этом случае будет составлять лишь около

половины от таковой при таких калибровке К+/ валиномицином или освещении, которые вызывают генерацию Дф и электрохромный сдвиг в 100% частиц.

Помимо объяснения ряда плохо интерпретированных ранее данных, полученный в настоящей работе результат имеет важное значение для дальнейших экспериментов по изучению протонного транспорта через FoFl в хроматофорах ЯЬ. capsulatus. Исходя из предположения, что распределение молекул FoFl в частицах описывается статистикой Пуассона, можно заключить, что если в образцах 37% хроматофоров не содержат фермента, то еще 37% частиц содержат одну, 18% две и 6% три молекулы фермента, т.е. около 60% хроматофоров, в которых есть АТФ-синтаза, содержат 1 молекулу фермента на частицу. Таким образом, кривые протонного транспорта через FoFl в ответ на короткую вспышку возбуждающего света представляют собой в первом приближении сигнал от синхронизированного ансамбля одиночных молекул, и кинетические характеристики этих кривых можно напрямую использовать для описания свойств протонного транспорта через единичную молекулу АТФ-синтазы.

4.2. Исследование свойств протонного транспорта через F о

4.2.1. Характеристика трансмембранного ионного транспорта в хроматофорах ЯЬ. capsulatus, лишенных

Для детального изучения механизма протонного транспорта через АТФ-синтазу и сопряжения этого транспорта с синтезом/гидролизом АТФ, необходимо было сначала охарактеризовать протонный транспорт через субкомплекс Fo. Для этого использовались хроматофоры, полученные обработкой ультразвуком в присутствии ЭДТА и в отсутствие ионов магния (см. Материалы и методы). Следует отметить, что повторная обработка ультразвуком позволила получить хроматофоры чуть меньшего диаметра (около 30 нм), чем описанные в предыдущем разделе. В таких хроматофорах фракция частиц, содержавших Fo, составляла 26%. При условии, что распределение молекул субкомплекса по мембранным частицам описывается статистикой Пуассона, можно предположить, что 74% частиц не содержали Fo, 22% содержали единственную молекулу Fo, а 4% содержали 2 и более. Таким образом, фракция хроматофоров с Fo содержала в основном частицы с одной молекулой субкомплекса на хроматофор (таких было 85% от всех хроматофоров, содержащих Fo).

Была также произведена количественная оценка среднего числа молекул ФРЦ на 1 хроматофор. Для этого была измерена величина скачка Дф в результате разделения

зарядов в ФРЦ в ответ на вспышку, которая (по калибровке К+/ валиномицином, см. Рис. 34) оказалась равна 70 ± 15 мВ. Из этого значения можно было оценить количество ФРЦ на 1 хроматофор. При переносе заряда через мембрану хроматофора происходит изменение величины Д^, которое количественно описывается уравнением изменения разности потенциалов на пластинах конденсатора:

п во = 5 С Дф

где п — количество ФРЦ на 1 хроматофор, во — величина элементарного заряда 1,602-10-19 Кл, 5 — площадь мембраны, С — удельная электрическая емкость мембраны, Дф — разность электрических потенциалов. Значение удельной электрической емкости биологических мембран варьирует в узком диапазоне и составляет около 1 мкФ/см2 [419-421]; среднюю площадь мембраны хроматофора можно вычислить из среднего радиуса хроматофоров (14 ± 6 нм, определен с помощью ТЭМ). Из этих величин по формуле выше получается в среднем 11 молекул ФРЦ на 1 хроматофор, что соответствует поверхностной плотности в 7,3-10-9 моль/м2, и неплохо согласуется с полученной ранее оценкой в 5,3-10-9 моль/м2 [420].

Чтобы изучить детально кинетические характеристики протонного транспорта через Fo, активность ¿с1-комплекса блокировалась с помощью миксотиазола. Таким образом можно было избежать одновременного протекания электрогенных реакций в ¿с1-комплексе и транспорта протонов через Fo. Электрогенные реакции в ¿с1-комплексе после вспышки возбуждающего света протекают в миллисекундной шкале, и делают количественный анализ активности Fo практически невозможным. Во-первых, Fo пропускает протоны немного быстрее, чем происходит генерация Дф ^-комплексом, и в результате происходит искажение (замедление) наблюдаемой кинетики протонного транспорта через Fo. Во-вторых, активность самого ¿с1-комплекса зависит от величины Дф, которая заметно выше в присутствии ингибиторов Fo. В результате сигнал, получаемый путем вычитания из кривой с ингибитором исходной кривой, отражает не только электрогенный протонный транспорт через Fo, но также и уменьшение активности ¿с1-комплекса в результате повышения Дф. Наконец, при подавлении активности ¿с1-комплекса отсутствует генерация ДрН в ответ на вспышку возбуждающего света. В этих условиях единственной движущей силой для транспорта протонов через Fo является Дф, величину которой можно количественно определять по электрохромному сдвигу поглощения каротиноидов.

Картина электрохромных сдвигов в хроматофорах, лишенных Fl, в которых активность ¿с1-комплекса была подавлена миксотиазолом, представлена на Рис. 42 ниже.

Рисунок 42. Кривые электрохромных сдвигов в хроматофорах, лишенных Fl, до (кривая 1) и после добавки олигомицина до 3 мкМ (кривая 2). Кривая 3 записана после добавки в образец валиномицина (1 мкМ). Кривая 2-1 представляет собой результат вычитания кривой 1 из кривой 2 и отражает электрогенный протонный транспорт через Fo. Среда содержала 5 мкМ ДМФ, 2 мМ КС^ 5 мМ ацетата магния, 100 мМ КС1, 20 мМ глицилглицина-КОН (рН 7,9), 3 мкМ миксотиазола. Вспышка возбуждающего света обозначена стрелкой. Концентрация бактериохлорофилла в пробе составляла 12 мкМ. Модифицировано из [410].

Без активного ^-комплекса хроматофоры представляют собой практически идеальную систему для исследования протонного транспорта через Fo. В ответ на короткую вспышку возбуждающего света в результате разделения зарядов в ФРЦ в них возникает скачок Дф известной величины, амплитуда которого не зависит от присутствия ингибиторов АТФ-синтазы, от рН в диапазоне значений от 5 до 10, от ионного состава среды и ряда других факторов. В таких условиях вычитание электрохромного сигнала, полученного до добавки ингибитора Fo, из сигнала, полученного после добавки, позволяет в чистом виде получить компоненту спада Д^, обусловленную протонным транспортом через Fo (кривая 2-1 на рис. 42).

4.2.2. Влияние рН и величины Аф на протонный транспорт через Ео и изотопный эффект

На рис. 43 показана зависимость константы скорости электрогенного протонного транспорта через Fo от pH (в обычной воде) и от pD (в тяжелой воде; pD измеряли обычным pH-метром с поправкой плюс 0,4 единицы [422]).

Рисунок 43. Константа скорости протонного транспорта через Fo как функция pH и изотопного состава среды (H2O: белые символы, D2O: черные символы). Среда содержала 20 мМ глицилглицина, 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ MES, 20 мМ глицина, 50 мМ KCl, 2 мМ K4 [Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ, 2 мМ KCN, 3 мкМ миксотиазола. Сплошная линия была рассчитана с помощью кинетической модели проводимости Fo. Модифицировано из [410].

Наибольшее значение константы скорости протонного транспорта (350 с-1) наблюдалась при pH 8. Неожиданным и примечательным результатом оказалось постоянство этого значения в широком диапазоне pH от 6,5 до 9,5. Падение константы скорости примерно в три раза наблюдалось как при закислении до pH ниже 6, так и при защелачивании выше 10. Это падение было обратимым: если препарат после инкубации в течение часа при кислом (5,5) или щелочном (10,5) pH оттитровывали до нейтрального диапазона pH, константа скорости возвращалась к величине около 300 с-1.

При этом амплитуда протонного транспорта через Fo не зависела от pH в пределах экспериментальной ошибки на всем исследованном диапазоне (см. Рис. 51 А ниже).

Изотопный эффект Ш0/020 был равен двум при рН ниже 7,5 и отсутствовал при рН выше 8. Появление изотопного эффекта в кислой области и его отсутствие в щелочной можно объяснить протонированием группы с рК около 7-8. Возможным кандидатом на эту титруемую группу может быть Glu61 е-субъединицы. В ферменте Е. евИ значение рКа ее аналога (карбоксила cAsp61) составляет около 8 [423]. Альтернативным объяснением могут быть вторичные изотопные эффекты: общая конформация фермента может несколько меняться в зависимости от рН, а изотопный Н/О эффект может быть присущ только конформации, характерной для низкого рН.

Чтобы охарактеризовать зависимость кинетики протонного транспорта через Fo от величины Д^, были поставлены опыты с уменьшенной энергией вспышки возбуждающего света. При среднем количестве в 11 ФРЦ на везикулу (см. раздел "Характеристика трансмембранного ионного транспорта в хроматофорах КЬ. еapsulatus, лишенных на стр. 129 выше), начальный уровень Дф можно было таким образом уменьшить на один порядок величины.

1 .2 -1-1-1-1-1-1-1-1-т-т-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-

л =г

I

СО

СО

^

О

о.

[=

< 0.0

2 _1_1_1_1_1_1_1_1_1_1_1_1_'_1_1_1_1_1_1_I_1_1_1_1_

-5 0 5 10 15 20 25

Время, мс

Рисунок 44. Кинетика протонного транспорта через Fo в ответ на вспышку возбуждающего света разной интенсивности в присутствии 3 мкМ ингибитора цитохрома Ьс1 миксотиазола. Шумная сплошная линия - сигнал, полученный при величине начальной Д^=20 мВ, белые кружки - Дф=Ю мВ. Электрохромные сигналы были отнормированы по амплитуде ответа ФРЦ. Модифицировано из [410].

На рис. 44 показаны два разностных сигнала ( ± олигомицин, см. кривую 2-1 на рис. 42), отражающие перенос заряда через Fo. Один сигнал был получен при насыщающей интенсивности вспышки, второй — при ослабленной вспышке, когда электрохромный

ответ ФРЦ составлял около 30% от максимального. Сигналы были отнормированы на величину электрохромного ответа ФРЦ и наложены друг на друга. Видно, что и относительная амплитуда, и кинетика протонного транспорта через Fo практически идеально совпадают при разных значениях начального скачка Д^; сигнал при ослабленной вспышке отличается только большим уровнем шума. Кинетика была моноэкспоненциальной и не зависела от начального скачка напряжения, даже если вспышка была уменьшена так, что генерируемый ФРЦ скачок Дф составлял 10% от максимального (данные не приведены). Отсутствие зависимости кинетики протонного транспорта через Fo от напряжения говорит о том, что процесс описывается уравнением разряда конденсатора через омическое сопротивление, т.е. протонная проводимость Fo подчиняется закону Ома, и для нее не наблюдается порогового значения Дф, ниже которого протонный транспорт блокируется (или это пороговое значение крайне мало и не превышает несколько мВ).

4.2.3. Оценка величины протонной проводимости через единичный Fо

Зная средний радиус хроматофоров (14 ± 6 нм) и удельную электрическую емкость биологических мембран, 1 мкФ/см2 [419-421], и принимая во внимание тот факт, что большая часть хроматофоров содержала не более 1 молекулы Fo на частицу, можно было количественно оценить проводимость единичного Fo по формуле

5С

в = 7'

где S — средняя площадь мембраны хроматофора, С — удельная электрическая емкость мембраны, т = 2,3 мс — характерное время экспоненты, описывающей протонный транспорт через Fo в ответ на скачок Дф. Полученная таким образом оценка электрической проводимости единичного Fo составила 10,5 фСм, что соответствует скорости протонного транспорта в ~6500 ^/с при Дф = 100 мВ (и ~13000 ^/с при Дф = 200 мВ). Данная характеристика практически не зависела от рН в диапазоне 6,59,5 и от концентраций ионов натрия и калия до 150 мМ (данные не приведены).

4.2.4. Измерения протонного транспорта через Fо с помощью рН-индикаторов

Вышеописанные эксперименты позволили детально охарактеризовать электрогенный транспорт ионов через Fo, однако следует отметить, что их результаты не дают оснований предполагать, что транспортируемыми ионами были протоны и только протоны. Чтобы прояснить этот момент, были сделаны измерения вызванных вспышками возбуждающего света изменений рН как в среде снаружи хроматофоров (с помощью гидрофильного индикатора крезолового красного, не способного проходить

через мембрану и проникать внутрь хроматофоров), так и внутри (с помощью амфифильного индикатора нейтрального красного в присутствии БСА в качестве непроникающего рН-буфера).

Рисунок 45. Перенос протонов через Fo, измеренный с помощью индикаторов рН, отражающих изменение кислотности в среде снаружи хроматофоров (крезоловый красный, 90 мкМ, при длине волны 575 нм, А, Б) и внутри них (нейтральный красный, 26 мкМ; 0,3% БСА, при 545 нм, В, Г). Кривые A и В регистрировались в отсутствие, а кривые Б и Г — в присутствии валиномицина (2 мкМ; при этом Аф диссипировала за несколько миллисекунд, см. Рис. 42, кривая 3). В последнем случае движущей силой для протонного транспорта через Fo являлась трансмембранная АрН. Высвобождение в среду протонов ôd-комплексом было медленнее в присутствии валиномицина. Среда содержала 50 мМ KCl, 5 мМ MgCh, 2 мМ K4[Fe(CN)6], 2 мМ KCN, 5 мкМ ДМФ; рН 7,9. Кривые до и после добавки 3 мМ олигомицина обозначены цифрами 1 и 2, соответственно; кривые 2-1 представляют собой результат вычитания соответствующих сигналов. Вспышки возбуждающего света отмечены стрелками; черные полосы на А и Б соответствуют 0,002 единиц рН. Модифицировано из [410].

Опыты ставились без добавки миксотиазола, т.к. присутствие активного ¿с1-комплекса было необходимо, чтобы происходил захват протонов из среды и выброс их внутрь хроматофора. Результаты представлены на рис. 45 выше.

Было установлено, что в ответ на вспышку возбуждающего света происходит захват протонов из внешней среды, сопровождающийся ее защелачиванием, как в присутствии, так и в отсутствие Дф (Рисунок 45, А и Б, соответственно). Быстрая фаза защелачивания объясняется захватом протонов в ФРЦ, дальнейшее, более медленное защелачивание — захватом протонов ¿d-комплексом. Также было установлено, что параллельно происходит закисление внутреннего объема хроматофоров в результате выброса туда протонов ¿с1-комплексом. Амплитуда и тех, и других сигналов значительно возрастала после добавки ингибиторов Fo, что говорило о наличии через него протонного транспорта в обратном по отношению к ¿с1-комплексу направлении. Вычитание из кривых, полученных после добавки олигомицина, исходных кривых позволило выявить протонный транспорт через Fo, но наблюдаемая кинетика была искаженной из-за медленной работы ¿с1-комплекса (см. обсуждение перед Рис. 42). Игнорируя сложную кинетику этих разностных сигналов, можно, однако, утверждать, что основным ионом, переносимым Fo при pH окружающей среды 7,9 на фоне 100 мМ KCl, был протон. Аналогичные результаты наблюдались с NaCl и LiCl (данные не показаны). Таким образом, протонная селективность Fo по сравнению с Li+, Na+ и K+ была не менее 107

4.2.5. ApH как движущая сила протонного транспорта через Fo

Еще один вопрос, требовавший прямого экспериментального доказательства, касался того, может ли химическая компонента A^h+ (ApH) работать как единственная движущая сила для транспорта протонов через Fo в отсутствие электрической компоненты (Дф).

Ранее эксперименты в группе П. Димрота показали, что для синтеза АТФ как натриевым ферментом P. modestum, так и протонной АТФ-синтазой E. coli одной ApH недостаточно, даже если ее величина превышает термодинамический порог для образования фосфодиэфирной связи, и что наличие Дф определенной величины является необходимым условием для синтеза АТФ [424,425]. С другой стороны, для фермента из Rhodospirillum r^rum [426], из Bacillus sp. PS3 [91] и из хлоропластов шпината [232] результаты экспериментов указывали на кинетическую эквивалентность обеих компонент A^h+ и подтверждали возможность синтеза АТФ только за счет ApH, без Дф.

Результаты, приведенные на Рис. 45 (Б и Г) однозначно указывают, что на хроматофорах R¿. capsulatus протонный транспорт через Fo сохраняется даже после того, как Дф рассеивается в течение 3-4 мс в присутствии валиномицина. Также не обнаруживалось признаков пороговой величины ApH, ниже которой траспорт протонов через Fo прекращался бы (данные не приведены). В этой связи можно предположить, что наблюдаемое пороговое значение А'ф для синтеза АТФ ферментами из E. coli и P. modestum, вероятно, связано с влиянием F1 на Fo.

Скорость синтеза АТФ ферментом E. coli может достигать 270 молекул АТФ в секунду [218], для фермента R¿. capsulatus эту величину можно оценить в 250 АТФ/с (рассчитано из экспериментально измеренной величины в 900 ммоль/мг бактериохлорофилла в час [427], и оценке в 1 молекулу АТФ-синтазы на 1000 молекул бактериохлорофилла [420]). Принимая во внимание стехиометрию Н+/АТФ, которая у ферментов из разных организмов варьирует в диапазоне от 2,7 до 5,7 (см. раздел «Стехиометрия с-субъединиц» на стр. 34 выше), это означает, что скорость протонного транспорта через целый, сопряженный FoF1 при синтезе или гидролизе АТФ не превышает 1700 Н+/с. Эта скорость почти на порядок ниже, чем полученные в данной работе значения для Fo, лишенного Fi (13000 Н+/с при Дф = 200 мВ). Можно заключить, что более низкие значения скорости протонного транспорта через целый фермент связаны с влиянием F1, каталитические события в котором лимитируют скорость вращения субъединицы у и тем самым ограничивают и скорость вращения с-кольца и протонного транспорта. Полученные в данной работе кинетические характеритики протонной проводимости Fo были использованы Д. Черепановым для построения модели, описывающей работу Fo как роторного протонного переносчика [410]. В основу модели легла концепция о наличии двух протон-проводящих полуканалов, осуществляющих связь между кольцом из 10-14 копий субъединицы c и соответствующими водными фазами с той и с другой стороны мембраны. Наблюдаемая омическая проводимость означает, что химические группы, присоединение и высвобождение протонов которыми лимитирует скорость работы Fo, "чувствуют" лишь очень небольшую часть трансмембранной разности электрического потенциала и, стало быть, расположены вблизи границы мембрана/водная фаза. Незначительное изменение проводимости в широком диапазоне pH указывает на большую разницу между рКа этих групп (в результате моделирования были получены значения 6 и 10, соответственно).

4.3. Протонный "слип" в FoFi Rb. capsulatus: возникновение и свойства

Если все процедуры по выделению хроматофоров проводились в темноте, как предписывает методика, то в экспериментах по измерению электрохромного сдвига в ответ на вспышки возбуждающего света не обнаруживалось чувствительной к олигомицину компоненты спада Дф в отсутствие нуклеотидов (Рис. 36 и 46, А и В).

Рисунок 46. Индукция «слипа» в хроматофорах Rb. capsulatus.

Среда содержала 100 мМ KCl, 20 мМ глицина, 20 мМ глицилглицина, 20 мМ MES, 20 мМ Na2HPÜ4, 5 мМ MgCh, 2 мМ KCN, 2 мМ K4[Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ; pH 8,0. Вспышки возбуждающего света обозначены стрелками. A — интактные хроматофоры, без нуклеотидов, без предварительного освещения, присутствует 3 мкМ миксотиазола; Б — интактные хроматофоры предварительно освещали в течение 40 с в отсутствие нуклеотидов; затем был добавлен миксотиазол до концентрации 3 мкМ. В — то же, что и A, но без миксотиазола. Г — то же, что и Б, но без миксотиазола. Модифицировано из [429]

Однако, если препарат хроматофоров перед опытом подвергался интенсивному освещению красным светом в отсутствие нуклеотидов, это приводило к появлению быстрой компоненты спада Aip, которая полностью блокировалась ингибиторами протонного транспорта через Fo — олигомицином (рис. 46 Б и Г), вентурицидином и ДЦКД (данные не приведены). При этом данная компонента была нечувствительна к эфрапептину — ингибитору, блокирующему F1 [414], и наблюдалась в отсутствие АДФ и Фн. Сходное явление было описано ранее для F0F1 хлоропластов и было названо протонным "слипом" (от английского "slip" — проскальзывать) [428]. Чтобы определить, не является ли "слип" следствием вызванной энергизацией мембраны диссоциации F1 от Fo, хроматофоры после индукции "слипа" были отделены ультрацентрифугированием от среды. В супернатанте не обнаружилось ни АТФазной активности, ни F1, а ре-суспендированный в новой среде осадок хроматофоров сохранил те же характеристики "слипа", что и исходный образец. Таким образом, было установлено, что "слип" является следствием неких изменений в целом F0F1 и не связан с диссоциацией F1 от Fo.

4.3.1. Индукция протонной проводимости через F0F1 в ответ на освещение хроматофоров в отсутствие нуклеотидов

Было обнаружено, что индукция "слипа" требовала освещения насыщающим красным светом в течение относительно длительного времени: полумаксимальный эффект наблюдался при освещении в течение ~ 3,5 с. Освещения в течение 40 с было достаточно для достижения максимального эффекта; более длительное освещение не приводило к увеличению амплитуды "слипа". Поэтому в последующих экспериментах для его индукции было использовано освещение в течение 40 с.

Как отмечалось выше, A^h+, создаваемая ФРЦ и ^-комплексом в ответ на освещение хроматофоров красным светом, является суммой химической (ApH) и электрической (A^) компонент. Чтобы уточнить, является ли одна из этих компонент необходимой для индукции "слипа", или же любая из них достаточна для его возникновения, были использованы электронейтральный К+/И+-обменник нигерицин для рассеивания ApH и валиномицин — электрогенный переносчик K+ для рассеивания A^. Эффективность диссипации ApH нигерицином проверяли путем отслеживания изменений поглощения амфифильного pH-индикатора нейтрального красного при 545 нм.

В используемых экспериментальных условиях нигерицин в концентрации 1 мкМ подавлял 95% ответа нейтрального красного в течение 40 секунд постоянного возбуждающего освещения, которое обычно использовали для индукции "слипа". Эффективность 1 мкМ валиномицина как средства гашения Дф проверялась с помощью измерения электрохромного сдвига поглощения каротиноидов при 522 нм; во время 40-секундного насыщающего возбуждающего освещения в присутствии валиномицина наблюдалось 93% подавление электрохромного сигнала.

Таблица 2. Среда измерения содержала 100 мМ KCl, 20 мМ глицина, 20 мМ MES, 20 мМ глицилглицина, 20 мМ Na2HPO4, 5 мМ MgCh, 2 мМ KCN, 2 мМ Kt[Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ. Если не указано иное, pH составлял 8,1. Каждый образец освещался в течение 40 с насыщающим красным светом; затем добавлялся миксотиазол для блокирования èd-комплекса. Относительную амплитуду "слипа" измеряли как величину чувствительной к олигомицину фазы спада Дф (А ± Олигомицин на Рис 46, Б), деленную на величину Дф, генерируемой ФРЦ в ответ на единичную вспышку.

Экспериментальные условия Относительная амплитуда "слипа", %

Контроль: освещение и измерение при рН 8,0 100

освещение в присутствии 200 нМ эфрапептина 86 ± 10

освещение в присутствии 1 мкМ нигерицина 112 ± 6

освещение в присутствии 1 мМ АМБ^^ (негидролизуемый аналог АТФ) 4 ± 4

освещение в присутствии 3 мкМ миксотиазола 37 ± 9

освещение, затем пауза 2 часа перед измерением 82 ± 5

освещение при рН 8,1, инкубация 2 часа с 1 мМ АДФ перед измерением 24 ± 2

освещение при рН 8,1, инкубация 2 часа с 1 мМ АТФ перед измерением 37 ± 7

освещение при рН 8,1, измерение при рН 6,8 38 ± 11

освещение при рН 8,1, инкубация 5 мин при рН 6,4, измерение при рН 8,1 (единичный опыт) 113

освещение при рН 8,1, инкубация 2 часа при рН 5,6, измерение при рН 8,1 (единичный опыт) 112

Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что освещение в отсутствие нуклеотидов легко вызывало "слип" в присутствии 1 мкМ нигерицина. Ингибитор ¿с1-комплекса миксотиазол значительно снижал эффективность индукции "слипа", что наиболее вероятно связано с заметно меньшей Д«н+, генерируемой в таких условиях. Когда после индукции "слипа" в образец добавляли АДФ или АТФ, наблюдалось значительное уменьшение амплитуды "слипа". Однако около 25% от исходной величины амплитуды сохранялось даже после 2 часов инкубации с нуклеотидами , что позволяет предположить, что изменения, приводящие к появлению "слипа", обратимы лишь частично.

Освещение индуцировало "слип" также в присутствии валиномицина. Следует отметить, что в присутствии валиномицина невозможно было измерять "слип" по электрохромным сдвигам каротиноидов на длине волны 522 нм, так как появлявшаяся в результате вспышки Дф моментально диссипировалась валиномицином. В этих экспериментах единственной движущей силой для транспорта протонов была ДрН, генерируемая ¿сь-комплексом; измерения проводились с помощью рН-индикаторов нейтрального красного (рНвнутр) и крезолового красного (рНвнешн) в среде без рН-буферов. Оказалось, что освещение в присутствии 1 мкМ валиномицина также индуцировало протонный "слип" (Рис. 47). Следует отметить, что в такой постановке опыта небольшая олигомицин-чувствительная компонента спада ДрН наблюдалась и в образцах, которые не подвергались освещению красным светом перед измерениями. Вероятно, это связано с тем, что в ходе отмывки хроматофоров от рН-буферов перед измерениями ДрН происходило частичное повреждение FoFl и появлялась фракция Fo, не сопряженных с Бь Однако освещение красным светом значительно увеличивало амплитуду олигомицин-чувствительной компоненты (Рис. 47, В, Г).

Таким образом, было установлено, что протонный "слип" может возникать как под действием ДрН, так и под действием Дф.

Рисунок 47. Индукция "слипа" трансмембранным ДрН. Хроматофоры суспендировали в 100 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 2 мМ KCN, 2 мМ К4[Бе(СК)б], 1 мкМ валиномицина, 5 мкМ ДМФ, рН 8,0, до концентрации бактериохлорофилла 10 мкМ. (А и В) измерения рНснаружи с помощью крезолового красного (15 мкМ) при 575 нм. Черная полоса соответствует 0,002 единиц рН. (А) без предварительного освещения; (В) 40-секундное насыщающее освещение перед измерениями. (Б и Г) изменения рНвнутр с помощью нейтрального красного (26 мкМ) при 545 нм. 0,3% БСА присутствовал в виде непроникающего рН-буфера. (Б) без предварительного освещения; (Г) 40-секундное насыщающее освещение перед измерениями.

Соответствующие контрольные сигналы в образцах без индикатора вычитались из сигналов, полученных с индикатором. Контрольные кривые регистрировались непосредственно перед добавлением олигомицина (конечная концентрация 3 мкМ), а кривая "+ Олигомицин" записывалась через 4 минуты; кривая "Д ± Олигомицин" получена вычитанием кривой "Контроль" из кривой "+ Олигомицин. Модифицировано из [429]

4.3.2. Определение порогового значения Л^ии+ для индукции "слипа"

Следующим шагом в изучении условий возникновения протонного "слипа" была количественная оценка порогового значения необходимой для его индукции.

"Слип" индуцировали в присутствии 1 мкМ нигерицина, чтобы вся создаваемая была в форме Д^, т.к. количественная оценка трансмембранной ДpH технически сложно реализуема и менее точна. Для индукции "слипа" использовали освещение в течение 40 с красным светом различной интенсивности, а величину генерируемой при этом Дф количественно измеряли с помощью электрохромного сдвига каротиноидов при 522 нм. Затем измерялась амплитуда "слипа" в ходе возбуждения короткими вспышками красного света, как в эксперименте на рис. 46. На рисунке 48 показана зависимость амплитуды "слипа" от Дф, возникавшей на мембране в течение 40 с освещения. Зависимость оказалась довольно плавной; аппроксимация данных функцией Хилла (Рис. 48, сплошная линия) дала значение 150 ± 10 мВ как величину Дф для полумаксимальной эффективности индукции "слипа".

Рисунок 48. Зависимость амплитуды "слипа" в хроматофорах ЯЬ. сараи1а1иа от величины Дф при его индукции. Варьировалась мощность возбуждающего освещения; для каждого опыта Дф, генерируемая во время освещения, измерялась в присутствии 3 мкМ олигомицина (ось абсцисс, каждая точка представляет собой среднее значение трех измерений). После 40-секундного освещения к образцам добавляли миксотиазол до 3 мкМ, и измеряли амплитуду "слипа" как в эксперименте на Рис. 46, Б. Для каждой точки обозначено стандартное отклонение. Сплошная линия — аппроксимация данных функцией Хилла. Модифицировано из [429]

4.3.3. Зависимость индукции "слипа" от присутствия нуклеотидов

В присутствии высоких АДФ и АТФ в концентрациях выше 100 мкМ индукция "слипа" при освещении красным светом не наблюдалась. Чтобы количественно охарактеризовать влияние этих нуклеотидов на индукцию "слипа", были проделаны эксперименты в присутствии разных концентраций АДФ и АТФ (Рис. 49).

Т—I I I 11 11-1-1—I I I 1111-1-1—I II I 111-1-1—I I I I |||-1-1—I I I I I 11 I I—I I I I 111-1—г

Т—I ГТТТТ|-1-1—I ГТТП]-1-1—I ГТТТТ]-1-1—I I I I II]-1-1—I I I I I 11-1-1—I I I I I 1|-1-г

1СГ8 1СГ7 1(1® 1СГ5 1СГ4 1СГ3 Концентрация нуклеотида, М

Рисунок 49. Зависимость индукции "слипа" от присутствия АТФ и АДФ. Нуклеотиды добавляли к хроматофорам, суспендированным в среде, содержащей 100 мМ KCl, 5 мМ ацетат магния, 20 мМ глюкозы, 20 мМ глицилглицина, 20 мМ Na2HPÜ4, 2 мМ KCN, 2 мМ K4[Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ, pH 8,0, и освещали насышающим красным светом в течение 40 с; миксотиазол (до 3 мкМ) и эфрапептин (до 250 нМ) добавляли сразу после 40 с освещения. Гексокиназа (5 единиц/мл) присутствовала в экспериментах с АДФ, чтобы убрать следы АТФ; 7,4 единиц/мл пируваткиназы и 0,5 мМ фосфоенолпирувата присутствовали в экспериментах с АТФ для удаления АДФ. Амплитуду "слипа" измеряли как в эксперименте на Рис. 46, Б. Для каждой точки обозначено стандартное отклонение. Амплитуда "слипа", индуцированного в отсутствие нуклеотидов, принималась за единицу. Сплошные линии соответствуют аппроксимациям данных функцией Хилла (подробности см. в тексте). Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех экспериментов. Модифицировано из [429]

Чтобы гарантировать, что наблюдаемый эффект одного нуклеотида не был вызван примесью другого, в экспериментах с АДФ в среде присутствовали глюкоза и гексокиназа, а во время измерений с АТФ в образец добавлялись пируваткиназа и фосфоенолпируват (см. подпись к рис. 49). Экспериментальные данные аппроксимировались с помощью функции Хилла. Полученные значения кажущихся констант диссоциации оказались ~ 5 х 10-6 М для АТФ и ~ 5,01 х 10-7 М для АДФ.

Коэффициент Хилла был близок к единице для обоих нуклеотидов, а именно 0,8 ± 0,2 для АДФ и 1,2 ± 0,2 для АТФ. Более низкая аффинность для АТФ обусловлена, вероятно, присутствием фосфата, который также может связываться в каталитических сайтах фермента после появления A^h+ и препятствовать связыванию АТФ, но не АДФ. Следует отметить, что индукцию "слипа" также эффективно предотвращал AMP -PNP, негидролизуемый аналог АТФ (см. Таблицу 2 на стр. 140 выше). Это позволяет предположить, что именно связывание, но не гидролиз АТФ, необходимо для предотвращения возникновения "слипа".

4.3.4. Индукция "слипа" сопровождается высвобождением связанного с ферментом

АДФ

Чтобы прояснить вопрос, связана ли индукция "слипа" с высвобождением нуклеотидов, опыт по освещению хроматофоров насыщающим возбуждающим светом (40 с) был поставлен в присутствии люциферин-люциферазной системы. Данные, представленные в таблице 3, показывают, что освещение хроматофоров приводит к умеренному высвобождению АТФ (около 25 пМ АТФ на 1 мкМ бактериохлорофилла). В присутствии АТФ-регенерирующей системы, превращающей АДФ в АТФ, сигнал увеличился примерно в 10 раз. Таким образом, можно сделать вывод, что в результате индукции "слипа" в хроматофорах происходило высвобождение около 0,27 нмоль АДФ+АТФ в соотношении 10:1 на 1 мкмоль бактериохлорофилла. В присутствии олигомицина не наблюдалось появления АТФ в ответ на освещение (в том числе и в присутствии АТФ-регенерирующей системы, см. таблицу 3), что указывает на АТФ-синтазу как источник высвобождавшихся нуклеотидов.

Таблица 3. Высвобождение нуклеотидов при индукции "слипа" в хроматофорах Rb. capsulatus. Среда содержала 100 мМ ацетата калия, 5 мМ ацетата магния, 20 мМ глюкозы, 20 мМ Na2HPO4, 2 мМ KCN, 2 мМ K4[Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ, 20 мМ глицилглицина, 7,4 ед.акт./мл пируваткиназы, 10 ед.акт/мл люциферазы и 0,2 мМ люциферина; pH 8,0.

Добавлено в среду перед индукцией "слипа" Высвобожденный АТФ, нМ/мкМ бактериохлорофилла

нет добавок 0,025 ± 0,007

0,5 мМ фосфоенолпирувата (ФЕП) 0,249 ± 0,048

0,5 мМ ФЕП + 3 мкМ олигомицин -0,028 ± 0,026

Учитывая, что на 1000 моль бактериохлорофилла в хроматофорах приходится примерно 1 моль АТФ-синтазы [420], можно предполагать, что при индукции "слипа" высвобождалось около 0,25 молекул АТФ+АДФ на 1 молекулу АТФ-синтазы.

4.3.5. Зависимость "слипа" от величины кф

Еще одним важным аспектом "слипа" была зависимость его скорости и амплитуды от величины Дф. Чтобы выяснить, существует ли некое пороговое значение Д^, ниже которого "слип" не происходит или значительно замедляется, использовали оптические нейтральные фильтры для ослабления возбуждающей вспышки.

Рисунок 50. Отсутствие пороговой величины кф для "слипа" через FoFi. В хроматофорах индуцировали "слип", затем добавляли миксотиазол до 3 мкМ. Среда содержала 100 мМ KCl, 20 мМ глицилглицина, 20 мМ Na2HPO4, 5 мМ ацетата магния, 2 мМ KCN, 2 мМ K4[Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ, 1 мкМ нигерицина, pH 8,0. Концентрация бактериохлорофилла была 5 мкМ. Вспышки возбуждающего света обозначены стрелками. (A) Кривые электрохромных сдвигов в ответ на насыщающую (1 и 2) и ослабленную (1а, 2а) вспышку возбуждающего света. Кривые 1-2 и 1a-2a представляют собой результат вычитания кривых, записанных до и после добавки олигомицина. (Б) Кривые из панели А были нормализованы по амплитуде быстрого скачка Аф, генерируемого ФРЦ (кривые 1а, 2а и 2а-1а были домножены на коэффициент 6,27).

Как и в случае изучения кинетических характеристик протонного транспорта через Fo, при исследовании кинетических характеристик "слипа" активность ¿с1-комплекса блокировалась с помощью миксотиазола (см. Рис. 46 для сравнения кривых с миксотиазолом и без него).

Как видно на Рис. 50 А, скачок Д^, возникающий после одиночной вспышки, снизился более чем в шесть раз при снижении интенсивности вспышки. Когда кривые с насыщающей и с ослабленной вспышкой были масштабированы, чтобы соответствовать друг другу по величине скачка Дтр, генерируемого ФРЦ, не наблюдалось никаких значительных изменений ни в кинетике, ни в относительной амплитуде кривых ± олигомицин (Рис. 50 Б). Этот результат означает, что пороговая величина Дф для "слипа" отсутствует или очень невелика, а кинетика "слипа" мало зависит от величины Дф. Таким образом, можно предположить, что "слип" представляет собой утечку протонов через FoFl, не сопряженную с какой-либо работой.

4.3.6. Зависимость "слипа" от рН; сравнение с протонным транспортом через Fo.

На рис. 51 показаны зависимости скорости и относительной амплитуды протонного транспорта в условиях "слипа" от рН. Суспензию хроматофоров освещали в отсутствие нуклеотидов при рН 8, чтобы вызвать "слип"; после этого рН был доведен до желаемого значения, добавлялся миксотиазол и проводились измерения электрохромных сдвигов в ответ на вспышку. Константа скорости чувствительной к олигомицину компоненты спада Дф в случае "слипа" практически не зависела от pH в интервале от 5,5 до 9,5; ее значение достигало примерно 185 с-1 при рН выше 7,5 и постепенно снижалось до 75 с-1 в более кислой среде (Рис. 51, Б). Эта картина напоминала рН-зависимость константы скорости протонного транспорта через Fo после удаления Fl, описанную выше (Рис. 43), хотя абсолютное значение константы скорости "слипа" было примерно вдвое ниже, чем константа скорости протонного транспорта через Fo. Зависимость относительной амплитуды слипа от рН заметно отличалась от таковой для протонного транспорта через Fo (Рис. 51, А). Падение более чем на 60% наблюдалось при переходе от рН 9,5 до 5,5, в отличие от рН-независимой амплитуды транспорта протонов через Fo, лишенный Fl. Аппроксимация экспериментальных точек функцией Хилла дала кажущееся значение рК = 6,8 ±0,1 при п = 1,6 ±0,5. Ингибирование "слипа" при низком рН было обратимым: когда образцы, освещенные при рН 8, инкубировали при рН 5,5, а затем снова титровали до рН 8, уменьшения относительной амплитуды "слипа" не наблюдалось (Таблица 2, стр. 140).

Рисунок 51. Сравнение рН-зависимостей параметров протонного транспорта через Fo и "слипа". Условия измерения как на Рис. 50. Модифицировано из [429]

Подводя итог вышеописанным экспериментам по изучению индукции и свойств протонного "слипа" на FoF1 Rb. capsulatus, можно сказать следующее: 1) впервые было показано, что в отсутствие АТФ или АДФ энергизация мембраны (^ = 150 мВ и выше) вызывает появление протонной проводимости, чувствительной к ингибиторам Fo; 2) при индукции этой проводимости с помощью A^h+ происходит высвобождение нуклеотидов (в основном АДФ) из F0F1; 3) для этой проводимости не наблюдается пороговой величины A^h+, а также зависимости кинетических характеристик этой проводимости от A^h+; 4) эта проводимость частично блокируется в результате инкубации с АДФ или

АТФ; 5) этой проводимости не возникает, если энергизация мембраны происходила в присутствии АТФ или АДФ в концентрации 100 мкМ и выше; 6) скорость этой проводимости ниже, чем скорость протонного транспорта через fo, лишенный F1; 7) при рН < 7 эта проводимость заметно снижается, в отличие от протонного транспорта через FO, лишенный F1.

Последние 2 пункта однозначно указывают, что "слип" не является свободной протечкой протонов через fo, потерявший связь с F1. Возможно, при появлении на мембране достаточно высокой a^h+ происходит вращение с-кольцевого олигомера и связанной с ним субъединицы у, что, в свою очередь, приводит к переходу каталитического сайта, изначально содержавшего связанный с высокой аффинностью АДФ, в открытую конформацию. Следует также подчеркнуть, что пороговое значение a^h+ для высвобождения этого АДФ и последующей индукции "слипа" весьма высоко и, вероятно, превышает пороговое значение a^h+ для синтеза АТФ. По всей видимости, в результате энергизации мембраны в отсутствие нуклеотидов F0F1 принимает некую особую конформацию, в которой возможно свободное вращение субъединицы у и связанного с ней с-кольцевого олигомера без "сопротивления" F1. Возможно, в этой ситуации все субъединицы в принимают "открытую" конформацию, характерную для опубликованных структур F1 с пустым каталитическим сайтом. У субъединицы в в такой конформации С-концевой домен удален от субъединицы у, и потеря взаимодействия между ними может быть причиной исчезновения механической связи между событиями в каталитических сайтах F1 и протонным транспортом в fo.

В заключение этого раздела следует отметить, что вышеописанная индукция "слипа" вряд ли играет какую-то значимую физиологическую роль in vivo, т.к. величина концентрации как АТФ, так и АДФ в цитоплазме бактерий в норме превышает 100 мкМ. Но явление индукции "слипа" следует учитывать при выделении и очистке мембранных препаратов, содержащих F0F1, т.к. если эта процедура проводится в отсутствие нуклеотидов, то возможна частичная индукция "слипа" и, как следствие, повышение протонной проводимости мембраны (особенно в случае фотосинтетических бактерий и хлоропластов, где такая энергизация возможна при случайном освещении образцов).

4.4. Исследование влияния мутации yMet23Lys на регуляцию активности АТФ-синтазы Rb. capsulatus

Исследование на ферменте E. coli показало, что введение остатка лизина в положение 23 субъединицы у увеличивает энергию взаимодействия между субъединицами у и ß за счет возникновения дополнительных электростатических взаимодействий между yLys23 и ßGlu381 в сегменте ßDELSEED [430,431], а также уменьшает сродство каталитического сайта к фосфату при синтезе АТФ и влияет на сопряжение между гидролизом АТФ и транспортом протонов, при этом не вызывая значительных изменений в характеристиках катализа [168,432]. Эксперименты на единичных молекулах субкомплекса F1 из E. coli показали, что характеристики АТФ-зависимого вращения у-субъединицы были одинаковыми для мутанта и для фермента дикого типа; это подтвердило вышеупомянутые наблюдения; авторы также предположили, что мутация нарушает сопряжение [433]. Однако, учитывая, что электростатические взаимодействия положительно заряженных аминокислот C-концевого домена субъединицы 8 и отрицательно заряженных остатков в сегменте ßDELSEED обуславливают ингибирование гидролиза АТФ у фермента из термофильной бактерии Bacillus sp. PS3 [343], была выдвинута альтернативная гипотеза [434], согласно которой мутация влияет не на сопряжение, а на регуляторные механизмы, подавляющие АТФазную активность фермента в условиях низкой A^h+ (в первую очередь — АДФ-ингибирование). Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты, описанные ниже.

4.4.1. Влияние мутации yMet23Lys на активацию F0F1 Rb. capsulatus

Ранее было показано, что A^h+ активирует гидролиз АТФ в хроматофорах Rb. capsulatus [262]. Для исследования влияния мутации на процесс активации были поставлены опыты в условиях, когда сначала происходит энергизация мембраны освещением в течение 30 с, а затем A^h+ ликвидируется добавкой разобщителя. В таких условиях фермент остается активированным в течение некоторого времени, но при этом A^h+ не ограничивает скорость гидролиза АТФ, сопряженного с протонным транспортом. Результаты опыта представлены на Рис. 52.

Рисунок 52. Активация гидролиза АТФ в ответ на А^и+ в хроматофорах КЬ. capsulatus дикого типа и мутанта yMet23Lys. За изменениями концентраций АТФ следили по поглощению фенолового красного, как описано в разделе «Материалы и методы». Суспензию хроматофоров (10 мкМ бактериохлорофилла) в кювете освещали в течение 30 с красным светом. На 25 секунде освещения был добавлен 1 мМ АТФ (первая стрелка); еще через 5 секунд (вторая стрелка) свет выключали и в то же время добавляли разобщители (нигерицин и валиномицин, 0,4 мкМ каждого). Сигналы были скорректированы на разбавление и на небольшое изменение поглощения после изменения рН из-за добавления АТФ. (А) Кривая а — хроматофоры дикого типа, без ингибиторов; кривая Ь — хроматофоры дикого типа, олигомицин 20 мкг/мл; кривая с — хроматофоры yMet23Lys, без ингибиторов; кривая d — хроматофоры yMet23Lys, олигомицин 20 мкг/мл. Каждая кривая представляет собой среднее значение двух измерений. (Б) Для выявления активности, чувствительной к олигомицину, кривые, полученные в присутствии олигомицина, вычитали из кривых, полученных без ингибитора. Кривая а-Ь — дикий тип; кривая с^: yMet23Lys. Сплошные линии — биэкспоненциальная аппроксимация экспериментальных данных. Начальные скорости для дикого типа и yMet23Lys составляли 134 и 88 ммоль АТФ х моль-1 бактериохлорофилла х с-1, соответственно. На врезке в Б показаны те же данные в увеличенном масштабе. Модифицировано из [435].

Чтобы рассчитать скорость гидролиза АТФ сопряженным ферментом, кривые, полученные с олигомицином, вычитали из кривых, записанных без ингибитора (панель Б на Рис. 52). Начальная АТФазная активность сопряженного фермента составила 134 мМ АТФ х м- 1 бактериохлорофилла х с -1 (панель Б, кривая а-Ь); через 28 с она снижалась до половины этого значения. Мутант yMet23Lys также обладал достаточно высокой начальной активностью (88 мМ АТФ х М- 1 бактериохлорофилла х с -1, панель Б, кривая с^), но скорость снижения активности была заметно выше (полувремя 5 с). Эти данные сведены в Таблицу 4 ниже вместе со скоростями гидролиза АТФ, измеренными в темноте без предварительного освещения, и со скоростями синтеза АТФ, измеренными при непрерывном освещении, как описано в разделе «Материалы и методы».

Таблица 4. Скорости синтеза и гидролиза АТФ, катализируемых хроматофорами ЯЬ. сараи1а1иа дикого типа и мутанта yMet23Lys. Все значения приведены в ммоль АТФ х моль-1 бактериохлорофилла х с-1

Образец АТФазная активность до освещения, без разобщителей Начальная АТФазная активность после освещения и добавки разобщителей Скорость синтеза АТФ, измеренная при постоянном освещении возбуждающим светом

хроматофоры дикого типа 13 ± 3 134 ± 14 175 ± 7

хроматофоры мутанта yMet23Lys 4 ± 1 88 ± 12 97 ± 5

Полученные результаты указывают, что мутантный фермент может эффективно катализировать не только синтез, но и гидролиз АТФ, однако время жизни активированного состояния у него значительно короче, чем в случае FoFl дикого типа. Этот вывод был подтвержден дальнейшими наблюдениями (см. ниже). Также можно отметить, что скорость гидролиза АТФ активированным ферментом дикого типа была в 10 раз выше, чем до освещения, а в случае мутанта наблюдалась активация в 22 раза (см. Таблицу 4).

Опыты, описанные выше, показали, что FoFl с мутацией yMet23Lys эффективно катализирует синтез АТФ; АТФазная активность мутантного фермента была чувствительна к ингибитору Fo олигомицину и стимулировалась ДОД+. Это означает, что сопряжение между Fo и Fl не было серьезно нарушено мутацией yMet23Lys, поэтому было решено исследовать характеристики протонного транспорта этого фермента в условиях синтеза АТФ, используя короткую вспышку света для энергизации мембраны.

4.4.2. Влияние мутации yMet23Lys на протонный транспорт через FoFl

На рис. 53 показаны индуцированные вспышкой изменения Дф и электрогенный протонный транспорт в хроматофорах с FoFl дикого типа и с мутантным ферментом yMet23Lys. В хроматофорах с FoFl дикого типа одиночная вспышка в присутствии АДФ и Фн индуцировала вполне заметный протонный транспорт (рис. 53 А); его амплитуда составляла -15% от общего индуцированного вспышкой переноса заряда (см. кривые + эфрапептин и ± эфрапептин). В отличие от хроматофоров дикого типа, в случае мутанта yMet23Lys в тех же условиях протонного транспорта через FoFl не наблюдалось (Рис. 53 Б). Тот же результат получался и при использовании олигомицина вместо эфрапептина (данные не приведены), что исключает нечувствительность к эфрапептину как возможный эффект мутации yMet23Lys.

Если, помимо АДФ и Фн, в среде также присутствовал АТФ в конечной концентрации 2 мМ, амплитуда протонного транспорта через FoFl увеличивалась как у дикого типа, так и у мутанта (Рис. 53, панели В и Г). Следует отметить, что поскольку на 1 хроматофор в среднем приходилось менее одной активной АТФ-синтазы, возрастание амплитуды протонного транспорта отражало увеличение фракции активного фермента. Таким образом, наблюдаемый в присутствии АТФ эффект, вероятно, был связан с активацией, а не с изменением скорости оборота активного фермента.

Рисунок 53. Электрохромные сдвиги поглощения каротиноидов, индуцированные вспышкой возбуждающего света, в хроматофорах с FoFi дикого типа и с мутантным yMet23Lys. Среда содержала 20 мМ глицилглицина, 20 мМ Na2HPO4, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 2 мМ KCN, 2 мМ K4[Fe(CN)6], 5 мкМ ДМФ и 200 мкМ АДФ; pH составлял 7,9. В опытах на панелях В и Г также присутствовало 2 мМ АТФ. После записи контрольной кривой добавляли эфрапептин до конечной концентрации 200 нМ. Кривые ± эфрапептин, отражающие протонный транспорт через FoFi, получали вычитанием контрольных кривых из кривых, записаных после добавки эфрапептина. Концентрация бактериохлорофилла составляла 15 мкМ. Вспышки возбуждающего света обозначены стрелками. Модифицировано из [435].

Чтобы дополнительно охарактеризовать этот эффект, была исследована зависимость амплитуды протонного транспорта от концентрации АТФ (Рис. 54).

Рисунок 54. Зависимость относительной амплитуды протонного транспорта через FoFl от концентрации АТФ. Среда для измерений такая же, как на рис. 53. Светлые кружки — хроматофоры с FoFl дикого типа; серые квадраты — хроматофоры yMet23Lys; черные ромбы— хроматофоры yMet23Lys, но вместо АТФ был добавлен негидролизуемый аналог АМР-РКР. Амплитуда сигнала ±эфрапептин (см. Рис. 53) была разделена на амплитуду индуцированного вспышкой электрохромного ответа ФРЦ; значение при 1 мМ АТФ было принято за единицу. Для каждой концентрации АТФ было проведено не менее трех экспериментов. Стандартное отклонение обозначено черточками. Модифицировано из [435].

Следует отметить, что даже когда к образцу не добавляли АТФ, некоторое количество АТФ (~0,5 мкМ) все еще присутствовало из-за примеси последнего в АДФ, а также появлялось вследствие аденилаткиназной активности хроматофоров. Удаление этого остаточного АТФ добавкой глюкозы и гексокиназы дополнительно уменьшало амплитуду индуцированного вспышкой сопряженного транспорта протонов в ферменте дикого типа (данные не приведены). Заметное увеличение относительной амплитуды переноса протонов с увеличением концентрации АТФ наблюдалось как для фермента дикого типа, так и для мутантного фермента yMet23Lys (Рис. 54). В отличие от АТФ, 1 мМ АМР-РКР (негидролизуемый аналог АТФ) не увеличивал амплитуду сигнала, т.е. для наблюдаемого эффекта необходимо было не просто связывание АТФ, а его гидролиз. Полученные результаты явно противоречили термодинамическим соображениям: предполагалось, что увеличение концентрации продукта реакции (АТФ) скорее

подавляет, чем стимулирует реакцию. С другой стороны, это хорошо согласуется с выдвинутой выше гипотезой о том, что мутация yMet23Lys ускоряет инактивацию фермента. Полученные результаты можно объяснить тем, что Д«н+, создаваемая ферментом за счет гидролиза АТФ при инкубации в темноте между вспышками во время накопления сигналов, препятствовала этой инактивации. Чтобы проверить эту гипотезу, время темновой адаптации между вспышками (в отсутствие АТФ) для фермента дикого типа было увеличено, чтобы дать больше времени для деактивации. Данные, представленные на Рис. 55, показывают, что амплитуда протонного транспорта через дикого типа снижалась до нуля при увеличении времени инкубации в темноте между вспышками.

Рисунок 55. Зависимость амплитуды индуцированного вспышкой протонного транспорта через FоFl в хроматофорах ЯЬ. capsulatus дикого типа от времени инкубации в темноте между вспышками. Среда измерения была такой же, как на Рис. 53. Кривые усреднялись с разными временными интервалами инкубации (12-200 с, это время отложено по оси абсцисс). Относительная амплитуда кривой ±эфрапептин, полученная при интервале 12 с между записью усредненяемых кривых, была взята за 100%. Модифицировано из [435].

Результаты на Рис. 55 указывают, что разница между FоFl дикого типа и yMet23Lys в экспериментах, результаты которых представлены на Рис. 53, заключалась в ускоренной инактивации гидролиза АТФ в мутантном ферменте. Характерное время инактивации для FоFl дикого типа составило около 10 с и было заметно больше характерного времени

спада Ду (~3 с). Таким образом, при интервале между вспышками в 12 с значительная фракция фермента дикого типа не успевала инактивироваться, в то время как в мутанте yMet23Lys уже происходила практически полная инактивация.

4.4.3. Синтез АТФ FoFl с мутацией yMet23Lys

Чтобы прояснить роль мутации уМе123ЬуБ в инактивации БоР1 и исследовать Дезактивацию гидролиза АТФ, были поставлены опыты по измерению синтеза АТФ и последующего гидролиза АТФ в ответ на серии из 1 -20 вспышек с интервалом 60 мс.

Рисунок 56. Синтез АТФ и активация гидролиза АТФ в хроматофорах КЬ. capsulatus дикого типа и мутанта yMet23Lys в ответ на серии вспышек возбуждающего света с интервалом 60 мс (начало серии обозначено стрелками). За изменениями концентрации АТФ следили с помощью люциферин-люциферазы, как указано в разделе Материалы и методы. Концентрация АТФ составляла ~1 мкМ. Концентрация бактериохлорофилла составляла 18 мкМ в образце дикого типа и 15 мкМ в образце мутанта yMet23Lys. А — дикий тип, 1-5 вспышек; Б — yMet23Lys, 1-5 вспышек; В — дикий тип, 1-20 вспышек; Г — yMet23Lys, 1-20 вспышек. Модифицировано из [435].

Концентрация АТФ перед вспышками составляла ~1 мкМ; Концентрация АДФ составляла 200 мкМ. Как видно на Рис. 56 (панели А и В), в хроматофорах дикого типа скорость гидролиза АТФ, будучи незначительной после одной вспышки, заметно увеличивалась по мере роста количества вспышек. Напротив, в мутанте yMet23Lys (панели Б и Г) даже серия из 20 вспышек не активировала гидролиз АТФ, хотя наблюдался значительный синтез АТФ. Выход АТФ в расчете на 1 вспышку в серии из 20 вспышек, был практически одинаковым у дикого типа и у мутанта yMet23Lys: 0,173 ± 0,035 ммоль АТФ х моль-1 бактериохлорофилла на вспышку в случае дикого типа и 0,206 ± 0,066 ммоль АТФ х моль-1 бактериохлорофилла на вспышку для мутанта. На Рис. 56 видно, что в условиях, когда концентрация АДФ была более чем на 2 порядка выше концентрации АТФ (200 против 1 мкМ), возникновение скачка Д^н+ приводило к активации FоFl дикого типа, который затем сохранял способность гидролизовать АТФ в течение нескольких минут, несмотря на высокое отношение АДФ/АТФ и малую концентрацию АТФ. У мутанта yMet23Lys, напротив, не наблюдалось гидролиза АТФ ни в одном опыте, даже после того как фермент синтезировал значительное количество АТФ (и, соответственно, был в активном состоянии). Этот результат указывает, что скорость инактивации мутантного FоFl в таких условиях была очень высока; фактически, фермент "выключался" практически сразу после снижения Д^н+ ниже уровня, необходимого для синтеза АТФ.

Чтобы оценить индивидуальную роль электрической и химической компоненты Д^н+ в активации FоFl ЯЬ. capsulatus, были использованы нигерицин и валиномицин в присутствии ионов калия для избирательного рассеивания ДрН и Дф, соответственно. В качестве меры активации фермента принимали разницу между скоростью гидролиза АТФ до и после серии вспышек. Как можно увидеть на Рис. 57 ниже, никаких серьезных изменений в степени активации фермента дикого типа не происходило при диссипации ДрН 1 мкМ нигерицином. Этот результат хорошо соответствовал более раннему исследованию, где было показано, что в присутствии гилицилглицина генерация ДрН ЯЬ. capsulatus в ответ на вспышку возбуждающего света практически не наблюдается [398]. Контрольный эксперимент с амфифильным индикатором рН нейтральным красным подтвердил эти результаты (данные не приведены).

Рисунок 57. Активация гидролиза АТФ в ответ на А^н+. Активацию измеряли как абсолютное увеличение начальной скорости гидролиза АТФ (измеренной люциферин -люциферазой, как на Рис. 56) после серии вспышек возбуждающего света с интервалом 60 мс. Минимум три измерения были выполнены для каждой серии вспышек (стандартное отклонение нанесено на каждый столбец). (А) Без разобщителей. (Б) В присутствии 1 мкМ нигерицина. Модифицировано из [435].

В присутствии 1 мкМ валиномицина никакой активации не наблюдалось даже после серии из 50 вспышек. Увеличение числа вспышек в присутствии валиномицина до 100 или 200 привело к ускорению гидролиза АТФ в хроматофорах дикого типа, но, как и в экспериментах на Рис. 57, не вызвало активации FoFl с мутацией yMet23Lys (данные не приведены). Контрольные эксперименты с амфифильным индикатором рН нейтральным красным показали, что при таком большом количестве вспышек образовывалась значительная АрН даже в присутствии 20 мМ глицилглицина и 20 мМ фн, как в хроматофорах дикого типа, так и в мутанте. Этот результат показал, что АрН также может эффективно способствовать активации гидролиза АТФ в ферменте дикого типа, а в мутанте активации не наблюдалось.

Данные, представленные на Рис. 57, показывают, что А^н+, генерируемой одной вспышкой, было недостаточно для достижения полной активации гидролиза АТФ в хроматофорах дикого типа, что указывает на относительно высокий порог активации А^н+. При этом максимальное значение Аф при возбуждении серией вспышек с частотой 16,7 Гц (интервал 60 мс) составляло -170 мВ (согласно калибровке на Рис. 34) и достигалось после 5-6 вспышек. Более высокая скорость гидролиза АТФ при увеличении количества вспышек с 5 до 10 и 20 указывает на то, что активация FoFl

дикого типа была медленным процессом и требовала относительно длительного (то есть сотни миллисекунд) воздействия Д«н+.

4.4.4. Влияние мутации yMet23Lys на АДФ-ингибирование

Как уже было отмечено выше, активации гидролиза АТФ в FoFl с мутацией yMet23Lys в экспериментах на Рис. 57 не наблюдалось вовсе, что скорее всего было связано с высокой скоростью инактивации мутантного фермента (т.к. синтез АТФ катализировался им практически так же эффективно, как FoFl дикого типа). Наиболее вероятной причиной инактивации как фермента дикого типа, так и мутанта, было АДФ-ингибирование. Чтобы проверить эту гипотезу, были поставлены опыты по измерению АТФазной активности фермента в присутствие пируваткиназы и фосфоенолпирувата (ФЕП), что приводило к быстрому удалению АДФ, образовавшегося при гидролизе АТФ, из среды. Как видно на Рис. 58 ниже, увеличение активности пируваткиназы приводило к стимуляции скорости гидролиза АТФ как в хроматофорах дикого типа, так и мутанта yMet23Lys, хотя АТФазная активность последнего была ниже при всех опробованных концентрациях пируваткиназы.

Рисунок 58. Зависимость АТФазной активности в хроматофорах дикого типа и мутанта yMet23Lys от концентрации пируваткиназы. Среда содержала: трицин 10 мМ, KCl 50 мМ, MgCl2 4 мМ, янтарную кислоту 0,2 мМ, лактатдегидрогеназу 25 ед/мл, KCN 2,5 мМ, ФЕП 2 мМ, ШШРО4 1 мМ, антимицин 5 мкМ, НАДН 0,15 мМ, АТФ 0,6 мМ. В опытах без пируваткиназы АТФазную активность измеряли с помощью фенолового красного в буфере, содержащем трицин 1 мМ, NaHoP04 1 мМ, KCl 50 мМ, MgCl2 4 мМ, янтарную кислоту 0,2 мМ, феноловый красный 100 мкМ. Во всех экспериментах pH составлял 8,0. Хроматофоры добавляли до конечной концентрации 10 мкМ бактериохлорофилла. Модифицировано из [435].

АТФазная активность, измеренная у дикого типа в отсутствие пируваткиназы составила 17 ± 3 ммоль АТФ х моль-1 бактериохлорофилла х с-1 (среднее значение 3 опытов). Более высокое значение по сравнению со значением, указанным в таблице 4, обусловлено присутствием 1 мМ фн, который, как известно, стимулирует гидролиз АТФ хроматофорами Rb. capsulatus (см., например, [436]). Для мутантного фермента, АТФазная активность в присутствии фн составляла 4 ± 1 ммоль АТФ х моль-1 бактериохлорофилла х с-1 (среднее значение 3 определений), что также несколько выше значения в таблице 4 (стр. 152).

Важно отметить, что разница в скорости гидролиза АТФ ферментом дикого типа и мутантным F0F1, измеренная в отсутствие пируваткиназы, составляла около 400%, а в случае эффективного удаления АДФ из среды пируваткиназой падала до ~50% (Рис. 58). Этот результат указывал, что АДФ-ингибирование F0F1 заметно усиливалось мутацией yMet23Lys.

Подводя итог по исследованиям влияния мутации yMet23Lys на активность F0F1 из Rb. capsulatus, можно сделать следующие заключения:

1) Выдвинутое ранее на основании экспериментов с F0F1 из E. coli предположение, что мутация yMet23Lys нарушает сопряжение протонного транспорта и синтеза/гидролиза АТФ [433,437] не верно по отношению к ферменту Rb. capsulatus: в нем мутация не оказывала значительного влияния на скорость синтеза АТФ и на АТФ-сопряженный протонный транспорт. Не исключено, что и в F0F1 из E. coli вывод о нарушении сопряжения был ошибочен, т.к. АТФазная активность в этих работах в большинстве случаев измерялась в АТФ-регенерирующей системе, и АДФ в среде практически отсутствовал, в то время как АТФ-зависимый протонный транспорт измерялся без АТФ-регенерирующей системы, и его низкий уровень или отсутствие могли объясняться повышенным АДФ-ингибированием фермента по сравнению с опытами по измерению гидролиза АТФ.

2) Мутация yMet23Lys в F0F1 Rb. capsulatus приводит к значительному ускорению инактивации фермента, вызванной АДФ-ингибированием. Это достаточно неожиданное наблюдение, на первый взгляд, сложно объяснить, т.к. остаток

yMet23 расположен далеко от каталитических сайтов фермента. Однако эксперименты на FoF1 из E. coli показали, что негативный эффект мутации на активность фермента был связан с электростатическим взаимодействием yLys23 с первым глутаматом в области ßDELSEED [431]. Возможно, что такое взаимодействие затрудняло вращение субъединицы у и тем самым увеличивало вероятность перехода фермента из активного в АДФ-ингибированное состояние. В соответствии с этим предположением, удаление АДФ с помощью ФЕП и пируваткиназы приводило к значительно более выраженному увеличению активности в мутанте yMet23Lys Rb. capsulatus (8-кратному против 4-кратного у дикого типа, рис. 35). Более выраженное АДФ-ингибирование в результате мутации yMet23Lys наблюдалось и в опытах на комплексе a3ß3y из Bacillus sp. PS3 [438]: стимуляция АТФазной активности мутантного фермента детергентом LDAO, ослабляющим АДФ-ингибирование, вдвое превышала таковую для фермента дикого типа.

3) Полученные результаты позволяют предположить, что активация гидролиза АТФ FoF1 Rb. capsulatus вызвана Дм^-зависимым вращением субъединицы у, приводящим к высвобождению ингибиторного прочно связанного АДФ из каталитического сайта, а инактивация — со связыванием (или сбоем высвобождения) АДФ и последующим переходом фермента в АДФ-ингибированное состояние, и мутация yMet23Lys приводит к ускорению последнего процесса.

Если посмотреть на структуры F1, то можно заметить, что ß-субъединица, у которой сегмент DELSEED расположен рядом с остатком у23, несет на себе каталитический сайт, занятый прочно связанным АДФ. Согласно данным, полученным в опытах на единичных молекулах F1 из Bacillus sp. PS3, угловое положение субъединицы у в АДФ-ингибированном состоянии (которому соответствуют упомянутые выше структуры F1), отличается на 40° от состояния «ожидания АТФ», наблюдаемого в активном ферменте при субмикромолярных концентрациях АТФ [274]. Это означает, что электростатическое взаимодействие между yLys23 и первым Glu во фрагменте

ßDELSEED стерически невозможно, если фермент находится в активном состоянии «АТФ-ожидания».

В этой связи вероятным объяснением вышеописанных результатов на ферменте yMet23Lys Rb. capsulatus может быть сокращение времени жизни активного состояния «ожидания АТФ» из-за стабилизации углового положения субъединицы у, которое соответствует состоянию АДФ-ингибирования. В рамках этой гипотезы можно также объяснить и несоответствие между выраженными эффектами мутации yMet23Lys в Fl из E. coli в биохимических экспериментах [431,437] и отсутствием какого-либо заметного эффекта на характеристики АТФ-зависимого вращения субъединицы у в опытах на единичных молекулах того же фермента [433]. Так как при АДФ-ингибировании блокируется вращение субъединицы у [274], а спонтанная реактивация в отсутствие A^h+ обусловлена стохастическим вращательным броуновским движением у-субъединицы [275], стабилизация АДФ-ингибированного состояния в мутанте yMet23Lys предположительно должна приводить просто к более частым и продолжительным паузам вращения субъединицы у, но не к значительному снижению генерируемого крутящего момента или скорости вращения. Пока фермент не находится в состоянии АДФ-ингибирования, в рамках этой гипотезы можно было бы ожидать, что он будет катализировать гидролиз АТФ с эффективностью, близкой к таковой F1 дикого типа, что и наблюдалось в эксперименте [433].

Следует отметить, что альтернативное объяснение ингибирующего действия мутации yMet23Lys было предложено по результатам экспериментов с комплексом a3ß3y из Bacillus sp. PS3. Было высказано предположение, что не электростатические взаимодействия, а разрушение гидрофобного кластера, расположенного на субъединице у в непосредственной близости от ßDELSEED, ответственны за нарушение катализа [438]. Однако, поскольку мутация, как было показано на ферменте E. coli, изменяет энергию активации гидролиза АТФ [432], а замена первого глутамата ßDELSEED на Ala, Gln и Asp приводила к значительной реверсии эффекта yMet23Lys, гипотеза об электростатическом взаимодействии y23Lys с первым Glu в ßDELSEED кажется более вероятной.

Невозможно не заметить параллели между вышеописанным предполагаемым механизмом подавления АТФазной активности в мутанте yMet23Lys и механизмом

ингибиторного действия субъединицы 8. Для нее в опытах на ферменте из Bacillus sp. PS3 было показано, что замены ряда положительно заряженных аминокислот в ее C-концевом домене, а также отрицательно заряженных аминокислот в сегменте ßDELSEED приводят к потере ингибиторного эффекта [343]. В этой связи можно предположить, что субъединица 8 в ингибиторной конформации приводит к стабилизации углового положения субъединицы у за счет электростатических взаимодействий с остатками глутамата и аспартата в сегменте ßDELSEED, тем самым повышая вероятность перехода фермента в АДФ-ингибированное состояние и стабилизируя последнее.

4.5. Исследование влияния аминокислотного остатка в позиции ß259 на АДФ-ингибирование FoFi Bacillus sp. PS3

Как было отмечено в разделе "АДФ-ингибирование бактериального фермента" на стр. 69 выше, у FoF1 из E. coli АДФ-ингибирование выражено слабее, чем у ферментов хлоропластов, митохондрий и ряда бактерий. Чтобы исследовать возможные причины этого, был проведен биоинформатический анализ первичной структуры каталитических субъединиц а и ß из разных организмов. Последовательности субъединиц а и ß из более чем 2000 различных организмов были выровнены с помощью программы Muscle, и в полученном множественном выравнивании были отмечены специфические позиции, аминокислотные остатки в которых не были ни строго консервативными, ни сильно вариабельными. Особое внимание было сосредоточено на позициях, где 1) были обнаружены только два типа остатков; 2) эти остатки были различного типа (т.е. не пары типа Glu/Asp или Leu/Ile и т.п.), и 3) один тип остатков был обнаружен в FoF1 E. coli (слабое АДФ-ингибирование), а другой тип был обнаружен в Bacillus sp. PS3, в митохондриальных и хлоропластных ферментах (сильное АДФ-ингибирование). Анализ множественных выравниваний для субъединиц а и ß показал, что относительно небольшое количество позиций удовлетворяют выбранным критериям. Были выбраны двенадцать позиций, которые показались наиболее перспективными для дальнейшей экспериментальной проверки (таблица 5).

Таблица 5. 12 выбранных позиций в субъединицах а и ß АТФ-синтазы, по типу остатков в которых фермент E. coli отличается от ферментов Bacillus sp. PS3, хлоропластов и митохондрий.

№ Escherichia coli F0F1 Bacillus sp. PS3 F0F1 F0F1 митохондрий быка

1 a340F a329Y a337Y

2 a341V a330I a338I

3 ß139F ß148Y ß146Y

4 ß158N ß167L ß165L

5 ß159M ß168I ß166I

6 ß189F ß198L ß196L

7 ß245Y ß255F ß259F

8 ß247Y ß257F ß261F

9 ß249L ß259Q ß263Q

10 ß307S ß317A ß321A

11 ß319V ß329T ß333T

12 ß371K ß381Q ß385Q

Для ряда позиций из таблицы 5 были сделаны точечные мутации в ферменте из Bacillus sp. PS3, чтобы проверить, влияет ли на АДФ-ингибирование замена остатка, типичного для фермента Bacillus, на остаток, типичный для фермента E. coli. Чтобы избежать интерференции АДФ-ингибирования и эффектов, связанных с С-концевым доменом субъединицы 8, все мутанты были созданы в ферменте с делецией этого домена (sAC). АТФазную активность измеряли в полученных из E. coli СБЧ,, экспрессирующих F0F1 Bacillus sp. PS3, по закислению среды с помощью рН-индикатора фенолового красного (см. Материалы и методы). При этом в ходе реакции концентрация АТФ постепенно снижалась, в то время как концентрации АДФ (и фосфата) постепенно увеличивались. Таким образом, в одном эксперименте можно было сравнить АТФазную активность образца при различных соотношениях АТФ/АДФ и оценить степень выраженности АДФ-ингибирования.

В таких экспериментах не наблюдалось ослабления АДФ-ингибирования при введении мутаций aY329F, PF255Y, pF255Y/pF257Y и pF255Y/pF257Y/aI329V. У всех этих мутантов активность АТФазы была не выше, чем у фермента дикого типа, а снижение скорости гидролиза АТФ при накоплении АДФ в среде было таким же или даже более выраженным, чем в контрольном образце (рис. 59). Однако мутация PQ259L привела к резкому изменению степени АДФ-ингибирования. АТФазная активность СБЧ из мутанта PQ259L была более чем в 10 раз выше, чем в случае СБЧ с ферментом дикого типа.

0 100 200 300 400 500

время, с

Рисунок 59. Гидролиз АТФ, измеренный по закислению среды, в СБЧ из штаммов E. coli, экспрессирующих различные мутантные F0F1 Bacillus sp. PS3. Измерения проводили в среде, содержащей 100 мМ KCl, 2 мМ трицин-КОН, 0,5 мМ MgCl2, 20 мкМ фенолового красного, pH 8,0 при 45°C. Реакцию начинали добавлением АТФ до конечной концентрации 1 мМ (отмечено стрелкой); по мере прохождения реакции концентрация АТФ падала, а концентрация АДФ росла. Концентрация мембранного белка составляла 0,01 мг/мл для СБЧ, содержащих FoFi с мутацией ßQ259L/sAC, и 0,16 мг/мл для всех других образцов.

4.5.1. Влияние мутации ßQ259L на АТФазную активность FoFi Bacillus sp. PS3

Результаты, приведенные на рис. 59, указывали, что из всех исследованных мутаций только замена ßQ259L значительно снизила выраженность АДФ-ингибирования. Поэтому дальнейшие эксперименты проводились только с этим мутантом. На рис. 60 приведены результаты измерений АТФазной активности СБЧ, содержащих FoFi sAC с мутацией ßQ259L и без нее при нескольких отношениях концентраций АТФ/АДФ.

Концентрация АТФ, мкМ 1000 900 800 700 600 500 400

0 100 200 300 400 500 600

Концентрация АДФ, мкМ

Рис. 60. Нормализованная АТФазная активность СБЧ из штаммов E. coli, экспрессирующих FoFi из Bacillus sp. PS3 с мутациями sAC и ßQ259L/sAC. Активность измеряли, как на рис. 59. Начальную активность при 1 мМ АТФ (0,45 ± 0,05 ед./мг в СБЧ sAC и 5,5 ± 0,2 ед./мг в СБЧ ßQ259L sAC) принимали за 100%. По крайней мере 3 измерения были выполнены для каждой точки, где указано стандартное отклонение; точка без стандартного отклонения является средним значением из двух измерений.

Чтобы более детально изучить эффект мутации ßQ259L, из клеток, экспрессирующих мутантные белки ßQ259L/sAC и sAC, были выделен и очищен гидрофильный субкомплекс Fi. На рис. 61 приведены результаты измерения его АТФазной активности в АТФ-регенерирующей системе.

Как видно на рис. 61, мутация ßQ259L значительно увеличила АТФазную активность Fi. При этом стимуляция активности при добавлении детергента LDAO, который снимает ингибирование АДФ в FoFi (см. раздел "Влияние детергента LDAO на АТФазную активность FoFi" на стр. 80 выше), была намного слабее в случае ßQ259L/sAC (менее чем в два раза) по сравнению с более чем 20-кратной стимуляцией у Fi sAC без мутации ßQ259L (см. Таблицу 6).

eAC F1 i

200- ßQ259L sAC F1 i

2 150- К

¡100-

г

о ; 50-

АТФ

0-.............................................................

--1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

0 200 400 600

время, с

Рис. 61. Гидролиз АТФ очищенными субкомплексами F1 eAC и ßQ259L/eAC, измеренный в АТФ-регенерирующей системе по изменению поглощения НАДН при 340 нм. Измерения проводили при 45°C в среде, содержащей 10 мМ HEPES-KOH, 10% глицерина, 100 мМ KCl, 2,5 мМ MgCh, 2,5 мМ фосфата калия, 200 мкМ NADH, 3 мМ фосфоенолпирувата (соль трициклогексиламмония), 0,1 мг/мл пируваткиназы. и 0,1 мг/мл лактатдегидрогеназы; рН = 8. Реакцию инициировали добавлением АТФ до 1 мМ. Концентрация eAC F1 составляла 1,35 мкг/мл, концентрация ßQ259L/eAC F1 составляла 0,35 мкг/мл.

Таблица 6. АТФазная активность, измеренная в АТФ-регенерирующей системе для Fl еДС и PQ259L/8ДC. Условия эксперимента как на рис. 61. Для каждого образца было выполнено не менее 3 измерений; приведено стандартное отклонение.

Образец АТФазная активность, ед. на мг белка АТФазная активность, моль АТФ на моль фермента в секунду

eAC F1 2,5 ± 0.2 16,6 ± 0.9

eAC ßQ259L F1 68 ± 5 437 ± 35